Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phát sinh chủng loài các gen nrlsu nrssu rpb1

Nghiên cứu hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng qua phân tích gen nrlsu, nrssu, rpb1, góp phần vào bảo tồn và phát triển sinh học.

• Tác giả: Nguyễn Hải Châu
• Người hướng dẫn: ThS. Lao Đức Thuận
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Hỗ Trợ Định Danh Các Mẫu Nấm Ký Sinh Côn Trùng Dựa Trên Phân Tích Phát Sinh Chủng Loài Các Gen nrLSU, nrSSU, Rpb1
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ CHI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG
• 1.1. Tổng quan chi nấm Cordyceps
• 1.2. Sơ lược về nấm Cordyceps
• 1.3. Phân loại học
• 1.4. Tình hình nghiên cứu chi nấm Cordyceps ở Việt Nam
• 1.5. Các phương pháp sinh học phân tử
• 1.6. Kỹ thuật PCR
• 1.7. Giải trình tự
• 1.8. Nghiên cứu phát sinh chủng loài
• 1.9. Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh chủng loài
• 1.10. Những bước cơ bản trong nghiên cứu phát sinh chủng loài
• 1.11. Các gen sử dụng trong nghiên cứu phát sinh chủng loài của chi nấm Cordyceps
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Bộ mẫu sử dụng trong thực nghiệm
• 2.4. Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất
• 2.5. Danh mục các phần mềm và công cụ trực tuyến
• 2.6. Tiến trình nghiên cứu
• 2.6.1. Khảo sát in silico
• 2.6.2. Tiến hành thực nghiệm
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Khảo sát in silico các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
• 3.2. Đánh giá mồi trên IDT
• 3.3. Kết quả kiểm tra mồi bằng BLAST, ClustalX2 và Annhyb của các cặp mồi LR0R/LR5, NS1/NS4, CRpb1/Rpb1Cr
• 3.4. Kết quả thực nghiệm
• 3.4.1. Xây dựng và kế thừa quy trình thực nghiệm khuếch đại gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 cho các mẫu nấm ký sinh côn trùng
• 3.4.2. Kết quả hiệu chỉnh trình tự
• 3.4.3. Kết quả định danh phân tử
• 3.4.4. Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu DNA
• 3.4.5. Xây dựng cây phát sinh loài phân tử
• 3.4.6. Kết quả định danh hình thái kết hợp sinh học phân tử
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng, đặc biệt là chi Cordyceps, đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu trong lĩnh vực sinh học phân tử. Việc hỗ trợ định danh các mẫu nấm này dựa trên phân tích gen là một phương pháp hiện đại, giúp giải quyết những khó khăn trong việc phân loại hình thái. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về sự đa dạng loài mà còn mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng nấm trong nông nghiệp và y dược.

1.1. Định nghĩa và vai trò của nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng là những loài nấm sống ký sinh trên cơ thể côn trùng, gây ra nhiều tác động đến sự phát triển và sinh sản của chúng. Chúng đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, giúp kiểm soát số lượng côn trùng gây hại.

1.2. Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng tại Việt Nam

Nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng tại Việt Nam còn hạn chế, mặc dù có nhiều loài nấm quý hiếm. Việc áp dụng công nghệ sinh học và phân tích gen sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc định danh và ứng dụng nấm trong thực tiễn.

II. Thách thức trong việc định danh nấm ký sinh côn trùng

Việc định danh nấm ký sinh côn trùng gặp nhiều thách thức do sự đa dạng và biến đổi hình thái của chúng. Các phương pháp truyền thống dựa vào hình thái không đủ để phân loại chính xác. Do đó, cần có những phương pháp mới, như phân tích gen, để hỗ trợ định danh.

2.1. Khó khăn trong phân loại hình thái

Phân loại hình thái gặp khó khăn do sự biến đổi hình dạng của nấm theo điều kiện môi trường. Điều này làm cho việc xác định loài trở nên phức tạp và không chính xác.

2.2. Sự cần thiết của phân tích gen trong định danh

Phân tích gen giúp cung cấp thông tin chính xác về mối quan hệ phát sinh loài giữa các mẫu nấm. Các gen như nrLSU, nrSSU và Rpb1 là những công cụ hữu ích trong việc xác định loài nấm ký sinh côn trùng.

III. Phương pháp phân tích gen hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng

Phân tích gen là phương pháp hiện đại giúp xác định chính xác các loài nấm ký sinh côn trùng. Các kỹ thuật như PCR và giải trình tự gen đã được áp dụng để thu thập dữ liệu gen cần thiết cho việc định danh.

3.1. Kỹ thuật PCR trong nghiên cứu nấm

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) cho phép khuếch đại các đoạn gen mục tiêu, giúp thu thập đủ mẫu DNA cho việc phân tích. Đây là bước quan trọng trong quy trình định danh nấm.

3.2. Giải trình tự gen và ứng dụng

Giải trình tự gen giúp xác định trình tự nucleotide của các gen mục tiêu. Thông qua đó, các nhà nghiên cứu có thể xây dựng cây phát sinh loài và xác định mối quan hệ giữa các loài nấm.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả từ việc phân tích gen đã cho thấy sự đa dạng loài của nấm ký sinh côn trùng. Những thông tin này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có thể ứng dụng trong nông nghiệp và y dược.

4.1. Kết quả định danh các mẫu nấm

Nghiên cứu đã xác định được nhiều loài nấm ký sinh côn trùng mới, mở ra hướng đi mới trong việc khai thác và ứng dụng chúng trong thực tiễn.

4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp và y dược

Nấm ký sinh côn trùng có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát sinh học và phát triển dược liệu. Việc ứng dụng các loài nấm này có thể giúp nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp và cải thiện sức khỏe con người.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Việc hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích gen là một bước tiến quan trọng trong nghiên cứu sinh học. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp mới để nâng cao độ chính xác trong việc định danh các loài nấm này.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp phân tích gen mới, nhằm nâng cao độ chính xác trong việc định danh nấm ký sinh côn trùng.

5.2. Hướng đi mới trong ứng dụng nấm

Các ứng dụng của nấm ký sinh côn trùng trong nông nghiệp và y dược sẽ tiếp tục được mở rộng, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp và sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Chi nấm Cordyceps (nấm ký sinh côn trùng) thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocreales, lớp Pyrenomycetes, ngành nấm túi (Ascomycota). Chi nấm này có thành phần loài phong phú với khoảng 400 loài đã được ghi nhận trên thế giới, phân bố rộng rãi tại nhiều quốc gia châu Á, trong đó có Việt Nam. Trong tự nhiên, các loài Cordyceps ký sinh trên côn trùng ở nhiều giai đoạn phát triển khác nhau hoặc ký sinh trên các loài nấm khác (như chi Elaphomyces). Về mặt ứng dụng, chi nấm này giữ vai trò quan trọng trong nông nghiệp như một tác nhân kiểm soát sinh học hiệu quả chống lại sâu hại (Beauveria bassiana phòng trừ sâu róm hại thông, Metarhizium anisopliae diệt bọ cánh cứng hại dừa và châu chấu hại ngô). Trong y dược, các hợp chất sinh học từ sinh khối nấm như polysaccharide (chiếm khoảng 3–8% khối lượng), axit cordycepic (D-mannitol), sterol, cùng các nucleoside mang lại hoạt tính điều hòa miễn dịch, kích thích tế bào lympho, tế bào NK, hỗ trợ giải độc gan và ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư.

Tuy nhiên, công tác phân loại học chi Cordyceps gặp nhiều trở ngại lớn. Theo tác giả trình bày, việc định danh theo phương pháp truyền thống dựa trên mối quan hệ với vật chủ ký sinh (Kobayasi, 1982) hoặc giải phẫu hình thái (màu sắc, cấu trúc quả thể, cơ quan sinh sản, hình thái bào tử) bộc lộ nhiều hạn chế. Cấu trúc cơ thể nấm tương đối đơn giản nhưng hình dạng và phương thức sinh sản lại dễ bị biến đổi theo điều kiện nhiệt độ và độ ẩm môi trường. Đặc biệt, nấm tồn tại ở hai pha sinh sản song song: pha vô tính (anamorph) và pha hữu tính (teleomorph), dẫn đến việc cùng một loài nhưng ở hai trạng thái lại bị định danh nhầm vào các chi khác nhau. Do đó, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử trên các gen giữ nhà (house-keeping genes) kết hợp công cụ tin sinh học là hướng tiếp cận cần thiết để hỗ trợ định danh chính xác.

Khóa luận xác định các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Đánh giá in silico đặc tính lý - hóa và độ đặc hiệu của các cặp mồi khuếch đại ba vùng gen nrLSU, nrSSU và Rpb1.
2. Tách chiết và kiểm tra độ tinh sạch DNA tổng số từ các mẫu nấm ký sinh côn trùng thu thập tại thực địa.
3. Kế thừa và tối ưu hóa quy trình khuếch đại PCR ba vùng gen mục tiêu.
4. Hiệu chỉnh, xử lý dữ liệu giải trình tự DNA bằng các phần mềm tin sinh học chuyên dụng.
5. Xây dựng cây phát sinh loài phân tử đơn gen và đa gen bằng các phương pháp toán học khác nhau để xác định quan hệ tiến hóa.
6. Kết hợp dữ liệu sinh học phân tử với đặc điểm hình thái giải phẫu nhằm hỗ trợ định danh các mẫu nấm nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu là 5 mẫu hệ sợi nấm ký sinh côn trùng đã được làm thuần, mang ký hiệu DL0038A, DL0038B, DL0067, DL0069 và DL0075. Về phạm vi không gian, các mẫu nấm được thu thập từ các chuyến khảo sát thực địa tại khu vực núi Langbiang, thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng, do Hội Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. Các thực nghiệm sinh học phân tử được triển khai tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh (cơ sở 68 Lê Thị Trung, phường Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương). Về phạm vi thời gian, đề tài được tiến hành từ ngày 04/03/2016 đến ngày 16/05/2016.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận vận dụng hệ thống phân loại học của Sung và cộng sự (2007). Nghiên cứu đa gen này đã sắp xếp lại chi Cordyceps và họ Clavicipitaceae thành 3 họ riêng biệt dựa trên phát sinh loài phân tử kết hợp hình thái: họ Clavicipitaceae (Metacordyceps, Hypocrella, Torrubiella...), họ Cordycipitaceae (Cordyceps s.s), và họ Ophiocordycipitaceae (Ophiocordyceps, Elaphocordyceps). Bên cạnh đó, tác giả sử dụng các khóa phân loại hình thái truyền thống của Kobayasi (1982) và atlas định danh nấm ký sinh côn trùng của Luangsa-ard và cộng sự (2007, 2009, 2010).

Ba chỉ thị phân tử được lựa chọn phân tích gồm:

• Gen nrLSU (nuclear ribosomal Large Subunit): mã hóa RNA 25S–28S của ribosome, có tính bảo tồn cao xen kẽ các vùng biến động D1/D2/D3, hỗ trợ so sánh phân loại từ cấp họ xuống cấp loài. Cặp mồi sử dụng là LR0R/LR5 (Vilgalys and Sun, 1994).
• Gen nrSSU (nuclear ribosomal Small Subunit): mã hóa 18S rRNA của tiểu phần nhỏ ribosome, tốc độ tiến hóa chậm, phù hợp đánh giá các nhóm sinh vật có quan hệ họ hàng xa ở cấp họ trở lên. Cặp mồi sử dụng là NS1/NS4 (White và cộng sự, 1990).
• Gen Rpb1 (RNA polymerase II largest subunit): mã hóa tiểu phần lớn thứ nhất của enzyme RNA polymerase II, mang chuỗi heptapeptide lặp lại CTD (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-) bảo tồn cao, có một bản sao duy nhất trong tế bào, hữu ích trong phân loại phát sinh loài sâu. Cặp mồi sử dụng là CRpb1/Rpb1Cr (Castlebury và cộng sự, 2004).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

• Nuôi cấy và quan sát vi học: Bào tử túi thu từ mô quả thể được cấy trên môi trường thạch PGA (Potato Glucose Agar) ở nhiệt độ 25 ± 2°C; hình thái hệ sợi và bào tử được chụp ảnh, đo đạc qua kính hiển vi quang học và kính hiển vi soi ngược Rax Vision.
• Tách chiết DNA: Phá vỡ màng tế bào bằng dung dịch ly giải (Tris-HCl 1M, CTAB 10%, NaCl 2,5M, Proteinase K 1 mg/ml) có bổ sung β-mercaptoethanol 99,9%, ủ nhiệt 65°C qua đêm. Tinh sạch qua nhiều lần với phenol:chloroform:isoamyl alcohol (PCI tỉ lệ 25:24:1) và chloroform; kết tủa DNA bằng NaOAc 3M kết hợp isopropanol, rửa tủa bằng ethanol 70% và hòa tan lại trong đệm TE 1X.
• Đo mật độ quang: Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA qua các chỉ số OD260 và OD280 trên máy quang phổ kế Scanning UV/VIS Smart Spec (Bio-Rad) với độ pha loãng mẫu 50 lần.
• Khuếch đại PCR: Phản ứng thực hiện trên máy luân nhiệt My-Cycle Thermal (Bio-Rad) trong thể tích 15 µl gồm Master Mix 2X (7,5 µl), mồi xuôi 10 µM (0,5 µl), mồi ngược 10 µM (0,5 µl), DNA khuôn (1 µl), và nước khử trùng (5,5 µl). Chu trình nhiệt 35 chu kỳ: biến tính ban đầu 95°C (5 phút); lặp lại chu kỳ 95°C (30 giây), nhiệt độ bắt cặp Ta thích hợp (Y giây), 72°C (1 phút); kéo dài kết thúc 72°C (5 phút).
• Điện di sản phẩm PCR: Chạy trên gel agarose 1,5% nhuộm ethidium bromide trong đệm TBE 1X ở điện thế 70 V trong 50 phút, đối chiếu thang chuẩn 100 bp và ghi nhận hình ảnh bằng hệ thống Gel Doc XR (Bio-Rad).
• Giải trình tự và xử lý tin sinh học: Sản phẩm PCR được gửi giải trình tự hai chiều tại Công ty Nam Khoa. Biểu đồ sắc ký huỳnh quang được kiểm tra, xử lý đỉnh tín hiệu bằng Chromas Lite 2.1; sắp gióng cột hai mạch và hiệu chỉnh sai lệch bằng SeaView 4.12 và ClustalX2. Trình tự hiệu chỉnh được phân tích độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên NCBI.
• Phân tích phát sinh loài: Dò tìm mô hình tiến hóa tốt nhất dựa trên chỉ số BIC (Bayesian Information Criterion) và AICc (Akaike Information Criterion) bằng MEGA 6.06. Dựng cây phát sinh loài đơn gen và đa gen bằng 3 phương pháp: Maximum Likelihood (ML), Neighbor-Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) với giá trị lặp bootstrap 1000 lần.

Nguồn dữ liệu đối chiếu được thu thập từ ngân hàng gen GenBank (NCBI) dựa theo danh mục các chủng chuẩn được công bố trong công trình của Sung và cộng sự (2007).

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1. Tổng quan về chi nấm ký sinh côn trùng

Chương này tổng thuật toàn diện các kiến thức về sinh học, phân loại học và giá trị thực tiễn của chi nấm Cordyceps. Tác giả phân tích lịch sử hình thành tên gọi nấm xuất phát từ tiếng Latinh ("cord" là cái dùi, "ceps" là đầu), mô tả vòng đời ký sinh trên ấu trùng bướm đêm (Thitadores) ở vùng núi cao Himalaya để tạo thành "Đông trùng hạ thảo" (Ophiocordyceps sinensis). Về ứng dụng thực tế, chương tài liệu hóa các hoạt chất sinh học (28 axit béo, các vitamin B1, B2, B12, E, K, khoáng vi lượng, các nucleoside) và tiềm năng y học như khả năng gây độc tế bào ung thư của Isaria tenuipes. Tác giả đánh giá tình hình nghiên cứu trong nước, ghi nhận các kết quả phân lập, định danh Isaria cerambycidae, Cordyceps nutans, Cordyceps gunnii, Cordyceps takaomontana, Cordyceps neovolkiana, Cordyceps pseudomilitaris tại Tây Nguyên, Cát Tiên và Langbiang. Đồng thời, chương trình bày chi tiết nguyên lý kỹ thuật PCR, điện di Lorentz, giải trình tự Sanger và quy trình 4 bước dựng phả hệ phân tử; làm rõ cấu trúc phân tử cùng đặc tính tiến hóa của 3 vùng gen chỉ thị nrLSU, nrSSU và Rpb1.

Phần 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và các thông số kỹ thuật. Năm mẫu nấm thu nhận tại Langbiang được xử lý tách mô quả thể, nuôi cấy thu bào tử túi và cấy truyền trên thạch PGA để quan sát các chỉ tiêu hình thái vô tính dưới kính hiển vi quang học và soi ngược Rax Vision. Tác giả thống kê toàn bộ trang thiết bị (máy ly tâm lạnh Hettich, tủ ủ Multitemp III, máy quang phổ kế Bio-Rad, máy luân nhiệt My-Cycle) và danh mục hóa chất tách chiết PCI, CTAB, β-mercaptoethanol. Tiến trình nghiên cứu được thiết kế mạch lạc thành hai hợp phần: khảo sát lý thuyết in silico (đánh giá mồi trên IDT OligoAnalyzer, BLAST NCBI, kiểm tra độ tương đồng trên ClustalX2 và Annhyb) và thực nghiệm trong phòng thí nghiệm (tách chiết DNA, đo mật độ quang, PCR, điện di, gửi giải trình tự, hiệu chỉnh bằng Chromas Lite và dựng cây phả hệ trên MEGA 6.06).

Phần 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương kết quả tập trung trình bày các dữ liệu thu được qua từng bước nghiên cứu:

• Khảo sát in silico: Cả 3 cặp mồi đều đáp ứng các tiêu chuẩn vật lý về chiều dài (17–23 bp), hàm lượng %GC (40,0–52,6%) và nhiệt độ nóng chảy Tm (47,2–54,2°C). Cấu trúc hairpin-dimer và hetero-dimer của các cặp mồi đều có năng lượng tự do ΔG ở ngưỡng an toàn (> -9 kcal/mol). Riêng mồi ngược Rpb1Cr có hiện tượng self-dimer với ΔG = -12,91 kcal/mol, được lưu ý điều chỉnh bằng cách nâng nhiệt độ bắt cặp. Kiểm tra BLAST và Annhyb xác nhận mồi LR0R/LR5 bắt cặp tại vị trí 718–736 và 1629–1645 trên gen nrLSU của Cordyceps militaris, cho kích thước dự kiến 928 bp. Cặp NS1/NS4 bắt cặp tại vị trí 1–19 và 1107–1126 trên Cordyceps taishanensis, kích thước dự kiến 1126 bp.
• Tách chiết DNA và PCR: Bổ sung CTAB và β-mercaptoethanol vào dung dịch ly giải đã loại bỏ hiệu quả hiện tượng mẫu bị biến tính bởi polyphenol và dịch nhầy polysaccharide của nấm. Kết quả đo quang phổ kế cho tỷ lệ OD260/OD280 đạt chuẩn độ tinh sạch. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% ghi nhận các vạch khuếch đại đơn, sáng rõ, đúng kích thước dự đoán cho cả 3 gen mục tiêu.
• Hiệu chỉnh trình tự và xây dựng cây phát sinh loài: Dữ liệu sắc ký hai chiều được hiệu chỉnh, cắt bỏ tín hiệu nhiễu ở đầu và đồng bộ hóa chiều dài. Sử dụng mô hình tiến hóa tối ưu được kiểm chứng qua chỉ số BIC trong MEGA 6.06, tác giả xây dựng thành công các cây phát sinh loài đơn gen (nrLSU, nrSSU, Rpb1) và cây đa gen (nrLSU + nrSSU + Rpb1) bằng các phương pháp NJ, MP và ML. Phân tích so sánh chứng minh cây đa gen có độ tin cậy vượt trội, các chỉ số bootstrap tại các nút phân nhánh chính đều đạt trên 70% đến 100%, khắc phục hiện tượng đa phân (polytomy) hoặc thiếu vững chắc khi chỉ phân tích đơn gen.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã xác định các thông số kỹ thuật của 3 cặp mồi và kích thước đoạn khuếch đại tương ứng qua khảo sát in silico và thực nghiệm:

Gen mục tiêu	Tên cặp mồi	Chiều dài mồi (bp)	Hàm lượng %GC	Nhiệt độ Tm (°C)	Năng lượng Self-dimer ΔG (kcal/mol)	Kích thước dự kiến in silico (bp)	Kích thước tài liệu tham khảo (bp)
nrLSU	LR0R (F) / LR5 (R)	19 / 17	52,6 / 47,1	53,3 / 48,0	-0,24 / -1,01	913 – 928	954 (Sung và cs., 2007)
nrSSU	NS1 (F) / NS4 (R)	19 / 20	42,1 / 40,0	47,2 / 48,7	0,71 / 1,53	1126 – 1132	1102 (Sung và cs., 2007)
Rpb1	CRpb1 (F) / Rpb1Cr (R)	20 / 23	42,5 / 42,8	51,3 / 54,2	-9,69 / -12,91	803	803 (Castlebury và cs., 2004)

Kết quả định danh hình thái giải phẫu ban đầu ghi nhận: mẫu DL0038A và DL0038B là Cordyceps takaomontana, DL0067 là Isaria sp., DL0069 là Simplicillium sp., và DL0075 là Cordyceps sp. Phân tích phả hệ phân tử đa gen kết hợp dữ liệu hình thái đã xác định chính xác vị trí phân loại của các chủng nghiên cứu trong hệ thống 3 họ của Sung và cộng sự (2007), xác nhận tính tương đồng cao giữa dữ liệu phân tử đơn gen và đa gen với hình thái học thực tế.

Về mặt đóng góp, tác giả đã kế thừa và hoàn thiện quy trình tách chiết DNA chất lượng cao từ hệ sợi nấm ký sinh hoang dại (vốn chứa nhiều tạp chất gây ức chế phản ứng enzyme) bằng hệ đệm bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB. Đồng thời, đề tài cung cấp dẫn liệu thực nghiệm chứng minh tính ưu việt của việc kết hợp dữ liệu đa gen giữ nhà (nrLSU, nrSSU, Rpb1) so với đơn gen trong phân loại nấm ký sinh côn trùng tại Việt Nam, nâng cao giá trị bootstrap và độ tin cậy phân nhóm loài.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tồn tại một số hạn chế do phạm vi nghiên cứu:

• Số lượng mẫu khảo sát còn hạn chế (5 mẫu thực địa thu thập tại một vùng địa lý duy nhất là núi Langbiang, Lâm Đồng).
• Cặp mồi khuếch đại gen mã hóa protein Rpb1 chứa nhiều base thoái hóa và có xu hướng hình thành cấu trúc self-dimer với mức năng lượng tự do âm tương đối cao (-12,91 kcal/mol), đòi hỏi kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ bắt cặp.
• Thời gian thực hiện ngắn (khoảng hơn 2 tháng) nên nghiên cứu chưa thể mở rộng sang các vùng gen chức năng khác.

Các hướng mở rộng nghiên cứu tiếp theo bao gồm:

• Mở rộng phân tích thêm các vùng gen khác trong hệ thống phân loại đa gen của Sung và cộng sự (2007) như tef1, rpb2, tub và atp6 để gia tăng số lượng nucleotide đồng bộ, hoàn thiện độ phân giải của cây phát sinh loài.
• Thu thập thêm các mẫu nấm ký sinh côn trùng tại các vườn quốc gia và khu bảo tồn khác trên toàn quốc nhằm xây dựng bộ cơ sở dữ liệu DNA mã vạch hoàn chỉnh cho các loài nấm bản địa.
• Triển khai nghiên cứu hoạt tính dược lý và thành phần hợp chất thứ cấp trên các chủng nấm đã được định danh chính xác phục vụ ứng dụng y sinh.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Sinh học phân tử, Bảo vệ thực vật và Hóa sinh dược liệu.

Nội dung đặc biệt có giá trị tham khảo gồm:

• Quy trình thực nghiệm chi tiết về kỹ thuật tách chiết và làm sạch DNA tổng số từ mô nấm ký sinh côn trùng khó xử lý bằng phương pháp Phenol/Chloroform có bổ sung CTAB và chất chống oxy hóa β-mercaptoethanol.
• Phương pháp luận phân tích tin sinh học hoàn chỉnh: từ khâu thẩm định mồi in silico trên IDT Analyzer, đọc và hiệu chỉnh biểu đồ sắc ký chromatogram trên Chromas Lite 2.1, sắp gióng cột trên SeaView 4.12, đến quy trình lựa chọn mô hình tiến hóa tối ưu và dựng cây phả hệ phân tử đa phương pháp (ML, NJ, MP) với 1000 lần lặp bootstrap trên MEGA 6.06.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao việc định danh nấm ký sinh côn trùng chi Cordyceps bằng hình thái giải phẫu truyền thống thường gặp sai số?
Nấm ký sinh côn trùng có cấu trúc cơ thể đơn giản nhưng thành phần loài đa dạng; hình thái và phương thức sinh sản của chúng biến đổi mạnh theo các yếu tố môi trường (nhiệt độ, độ ẩm). Đáng chú ý, nấm có thể tồn tại ở hai pha sinh sản độc lập: vô tính (anamorph) và hữu tính (teleomorph). Hai pha này mang đặc điểm hình thái hoàn toàn khác nhau, dẫn đến việc các nhà phân loại học trước đây thường xếp nhầm cùng một loài vào các chi hoặc họ khác nhau.

2. Ba cặp mồi được sử dụng trong khóa luận có đặc điểm gì và kích thước khuếch đại dự kiến là bao nhiêu?
Ba cặp mồi gồm: LR0R/LR5 khuếch đại gen nrLSU (kích thước dự kiến 913–928 bp), NS1/NS4 khuếch đại gen nrSSU (kích thước dự kiến 1126–1132 bp), và CRpb1/Rpb1Cr khuếch đại gen Rpb1 (kích thước dự kiến khoảng 803 bp). Các cặp mồi này đều có độ dài 17–23 bp, hàm lượng GC 40–52,6% và đạt độ đặc hiệu cao khi kiểm tra trên ngân hàng dữ liệu NCBI BLAST.

3. Quy trình tách chiết DNA trong nghiên cứu có cải tiến gì để xử lý mẫu hệ sợi nấm ký sinh?
Tác giả sử dụng dung dịch ly giải tế bào có bổ sung đồng thời CTAB 10% và β-mercaptoethanol 99,9%, kết hợp ủ nhiệt 65°C qua đêm với Proteinase K 1 mg/ml. Hỗn hợp này giúp hòa tan màng tế bào nấm, vô hiệu hóa nuclease, loại bỏ dịch nhầy polysaccharide và ngăn chặn hiện tượng oxy hóa polyphenol thường gặp ở nấm hoang dại, đảm bảo DNA thu được có độ tinh sạch cao cho phản ứng PCR.

4. Vì sao tác giả cần kết hợp phân tích đa gen thay vì chỉ dùng một vùng gen đơn lẻ?
Theo kết quả phân tích trong nghiên cứu, cây phát sinh loài dựng từ một gen đơn lẻ (như nrLSU hoặc Rpb1) có thể xuất hiện các nhánh phân tách chưa rõ ràng hoặc giá trị bootstrap thấp. Việc ghép nối dữ liệu đa gen (nrLSU + nrSSU + Rpb1) làm tăng số lượng vị trí nucleotide đối sánh trong khối dữ liệu, từ đó làm tăng đáng kể giá trị bootstrap (đạt từ 70% đến 100% tại các nút chính), củng cố độ tin cậy thống kê và phản ánh chính xác hơn mối quan hệ tiến hóa giữa các taxon.

5. Kết quả định danh sơ bộ về mặt hình thái của 5 mẫu nấm nghiên cứu tại Langbiang là gì?
Dựa vào phân tích vi học và đối chiếu atlas phân loại của Luangsa-ard và cộng sự, 5 mẫu nấm ký sinh côn trùng được định danh sơ bộ gồm: mẫu DL0038A (Cordyceps takaomontana), mẫu DL0038B (Cordyceps takaomontana), mẫu DL0067 (Isaria sp.), mẫu DL0069 (Simplicillium sp.), và mẫu DL0075 (Cordyceps sp.).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Hải Châu đã xây dựng thành công quy trình kết hợp phân tích hình thái học với dữ liệu phát sinh chủng loài phân tử trên ba vùng gen nrLSU, nrSSU và Rpb1 để hỗ trợ định danh 5 mẫu nấm ký sinh côn trùng thu thập tại núi Langbiang, Đà Lạt. Nghiên cứu đã tối ưu hóa hiệu quả các điều kiện tách chiết DNA, phản ứng PCR và chứng minh ưu thế của việc phân tích cây phả hệ đa gen bằng phần mềm MEGA 6.06 trong việc nâng cao độ tin cậy phân loại học so với phân tích đơn gen. Các kết quả và dẫn liệu thực nghiệm thu được đóng góp cơ sở dữ liệu quan trọng cho công tác phân loại, bảo tồn và định hướng khai thác nguồn tài nguyên nấm dược liệu bản địa tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Cordyceps là một chi nấm ký sinh côn trùng, thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocreales, lớp Pyrenomycetes, ngành nấm túi Ascomycota. Chi nấm này có thành phần loài rất đa dạng, ước tính khoảng 400 loài khác nhau như Cordyceps sinensis, Cordyceps takaomontana, Cordyceps neovolkiana,…phân bố ở nhiều quốc gia Châu Á, bao gồm Việt Nam. Tuy nhiên, sự hiểu biết về thành phần loài của chi nấm này còn rất hạn chế bởi nhiều nguyên nhân khác nhau, đặc biệt phải kể đến là những khó khăn gặp phải trong công tác phân loại, định danh. Vào năm 1982, Kobayasi đã tiến hành định danh nấm ký sinh côn trùng dựa vào vật chủ ký sinh của chúng nhờ mối quan hệ mật thiết giữa nấm này với vật chủ mà chúng chọn để ký sinh.

Bên cạnh đó, Lê Tấn Hưng và cộng sự (2010) cũng định danh nấm ký sinh côn trùng chủ yếu dựa trên phân tích đặc điểm hình thái (morphology): màu sắc, quả thể, sinh sản, bào tử. Nấm ký sinh có cấu trúc cơ thể khá đơn giản nhưng lại có thành phần loài rất phong phú và đặc biệt hình dạng của chúng có khả năng bị biến đổi theo điều kiện môi trường. Chúng tồn tại ở hai thể: vô tính (anamorph) và hữu tính (teleomorph). Vì vậy, định danh dựa trên phân tích hình thái còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế.

Theo nghiên cứu của Sung et al. Kết quả nghiên cứu này rất phù hợp với các phân tích bằng hình thái giải phẫu. Qua công trình này, các tác giả đã khẳng định các loài thuộc nhóm nấm này nên được chia thành 3 họ là họ Clavicipitaceae với các chi Metacordyceps, Hypocrella, Regiocrella và Torrubiella; họ Cordycipitaceae với chi SVTH: Nguyễn Hải Châu viii Khóa luận tốt nghiệp Cordyceps; họ Ophiocordycipitaceae với 2 chi Ophiocordyceps và Elaphocordyceps. Bên cạnh đó, Tang et.

Nhóm tác giả đã tiến hành dựng cây đơn gen đối với 4 vùng gen trên và nối gen nrLSU+nrSSU và nrLSU+nrSSU+Rpb2…và nhận thấy một vài điểm như sau: (1) cây phát sinh loài của gen nrSSU thể hiện mức độ tin cậy cao hơn, mối quan hệ giữa các chi được thể hiện rỏ ràng hơn so với cây phát sinh loài của gen nrLSU và Rpb2; (2) cây phát sinh loài dựa vào gen nrSSU là cây đáng tin cậy và có ý nghĩa về mặt thống kê, tuy nhiên khi kết hợp cả gen nrSSU với nrLSU hoặc nrLSU+Rpb2 thì các nhánh trong cây có mức ý nghĩa của cây khá cao (dựa vào Bayesian và giá trị bootstrap), gen Tub kết hợp với gen nrLSU và Rpb2 cũng cho kết quả khá khả quan; (3) khi kết hợp các vùng gen thì làm gia tăng số lượng các nucleotide kết hợp trong dữ liệu cục bộ, một hướng giải quyết cho cây phát sinh loài. Từ những thông tin thu nhận được cho thấy việc phân tích dữ liệu gen nhóm gen giữ nhà kết hợp tin sinh học là cần thiết nhằm hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng. Vì vậy, chuyên đề khóa luận tốt nghiệp được thực hiện với tên đề tài: “Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phát sinh chủng loài các gen nrLSU, nrSSU, Rpb1”. SVTH: Nguyễn Hải Châu ix Khóa luận tốt nghiệp PHẦN 1.

TỔNG QUAN VỀ CHI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG 1. Tổng quan chi nấm Cordyceps 1. Sơ lược về nấm Cordyceps Cordyceps là chi nấm ký sinh côn trùng, thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocreales, lớp Pyrenomycetes, ngành nấm túi (Ascomycota) [28][45]. Tên Cordyceps bắt nguồn từ tiếng Latinh bao gồm hai thành phần là “cord” và “ceps” nghĩa là “chùy, dùi” và “đầu”, chúng kết hợp với nhau nhằm mô tả một tập hợp nấm có chất nền và quả thể phát triển từ xác côn trùng (Hình 1.

Cordyceps có thành phần loài rất đa dạng.