ĐẶT VẤN ĐỀ Cordyceps là một chi nấm ký sinh côn trùng, thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocreales, lớp Pyrenomycetes, ngành nấm túi Ascomycota. Chi nấm này có thành phần loài rất đa dạng, ước tính khoảng 400 loài khác nhau như Cordyceps sinensis, Cordyceps takaomontana, Cordyceps neovolkiana,…phân bố ở nhiều quốc gia Châu Á, bao gồm Việt Nam. Tuy nhiên, sự hiểu biết về thành phần loài của chi nấm này còn rất hạn chế bởi nhiều nguyên nhân khác nhau, đặc biệt phải kể đến là những khó khăn gặp phải trong công tác phân loại, định danh. Vào năm 1982, Kobayasi đã tiến hành định danh nấm ký sinh côn trùng dựa vào vật chủ ký sinh của chúng nhờ mối quan hệ mật thiết giữa nấm này với vật chủ mà chúng chọn để ký sinh.
Bên cạnh đó, Lê Tấn Hưng và cộng sự (2010) cũng định danh nấm ký sinh côn trùng chủ yếu dựa trên phân tích đặc điểm hình thái (morphology): màu sắc, quả thể, sinh sản, bào tử. Nấm ký sinh có cấu trúc cơ thể khá đơn giản nhưng lại có thành phần loài rất phong phú và đặc biệt hình dạng của chúng có khả năng bị biến đổi theo điều kiện môi trường. Chúng tồn tại ở hai thể: vô tính (anamorph) và hữu tính (teleomorph). Vì vậy, định danh dựa trên phân tích hình thái còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế.
Theo nghiên cứu của Sung et al. Kết quả nghiên cứu này rất phù hợp với các phân tích bằng hình thái giải phẫu. Qua công trình này, các tác giả đã khẳng định các loài thuộc nhóm nấm này nên được chia thành 3 họ là họ Clavicipitaceae với các chi Metacordyceps, Hypocrella, Regiocrella và Torrubiella; họ Cordycipitaceae với chi SVTH: Nguyễn Hải Châu viii Khóa luận tốt nghiệp Cordyceps; họ Ophiocordycipitaceae với 2 chi Ophiocordyceps và Elaphocordyceps. Bên cạnh đó, Tang et.
Nhóm tác giả đã tiến hành dựng cây đơn gen đối với 4 vùng gen trên và nối gen nrLSU+nrSSU và nrLSU+nrSSU+Rpb2…và nhận thấy một vài điểm như sau: (1) cây phát sinh loài của gen nrSSU thể hiện mức độ tin cậy cao hơn, mối quan hệ giữa các chi được thể hiện rỏ ràng hơn so với cây phát sinh loài của gen nrLSU và Rpb2; (2) cây phát sinh loài dựa vào gen nrSSU là cây đáng tin cậy và có ý nghĩa về mặt thống kê, tuy nhiên khi kết hợp cả gen nrSSU với nrLSU hoặc nrLSU+Rpb2 thì các nhánh trong cây có mức ý nghĩa của cây khá cao (dựa vào Bayesian và giá trị bootstrap), gen Tub kết hợp với gen nrLSU và Rpb2 cũng cho kết quả khá khả quan; (3) khi kết hợp các vùng gen thì làm gia tăng số lượng các nucleotide kết hợp trong dữ liệu cục bộ, một hướng giải quyết cho cây phát sinh loài. Từ những thông tin thu nhận được cho thấy việc phân tích dữ liệu gen nhóm gen giữ nhà kết hợp tin sinh học là cần thiết nhằm hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng. Vì vậy, chuyên đề khóa luận tốt nghiệp được thực hiện với tên đề tài: “Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phát sinh chủng loài các gen nrLSU, nrSSU, Rpb1”. SVTH: Nguyễn Hải Châu ix Khóa luận tốt nghiệp PHẦN 1.
TỔNG QUAN VỀ CHI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG 1. Tổng quan chi nấm Cordyceps 1. Sơ lược về nấm Cordyceps Cordyceps là chi nấm ký sinh côn trùng, thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocreales, lớp Pyrenomycetes, ngành nấm túi (Ascomycota) [28][45]. Tên Cordyceps bắt nguồn từ tiếng Latinh bao gồm hai thành phần là “cord” và “ceps” nghĩa là “chùy, dùi” và “đầu”, chúng kết hợp với nhau nhằm mô tả một tập hợp nấm có chất nền và quả thể phát triển từ xác côn trùng (Hình 1.
Cordyceps có thành phần loài rất đa dạng. Uớc tính khoảng 400 loài khác nhau như Cordyceps sinensis, Cordyceps takaomontana, Cordyceps neovolkiana,…phân bố ở nhiều quốc gia Châu Á, bao gồm Việt Nam [12]. Chúng chủ yếu ký sinh trên côn trùng ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Ngoài ra, chi nấm này còn bao gồm một số loài ký sinh trên nấm Elaphomyces.
Trong đó, loài được biết đến nhiều nhất là Cordyceps sinensis. Cordyceps sinensis ký sinh trên các ấu trùng của các loài bướm đêm thuộc chi Thitadores được gọi là “Đông trùng hạ thảo”. Đây là một loại dược liệu quý hiếm sử dụng trong y học cổ truyền một số quốc gia Đông Á, chẳng hạn như Trung Hoa [19]. Cordyceps sinensis có dạng nấm, quả thể mọc trên xác sâu bướm.
Hình dạng quả thể: không có nắp, trông như một lưỡi dao hoặc cành lá, màu nâu sẫm ở chân và màu đen ở đầu. Chúng được tìm thấy ở độ cao từ 4.400m trên các đồng cỏ của dãy núi cao Himalaya và các dãy núi cao khác của Trung Quốc, Tây Tạng và Nepal [19][23].1: Ophiocordyceps sinensis (ở Tây Tạng, Trung Quốc) [19] SVTH: Nguyễn Hải Châu 1 Khóa luận tốt nghiệp Cordyceps có cấu trúc cơ thể khá đơn giản nhưng lại có thành phần loài rất phong phú, đặc biệt hình dạng và hình thức sinh sản của chúng có khả năng bị biến đổi theo điều kiện môi trường. Vào mùa đông, khi điều kiện khí hậu khắc nghiệt (nhiệt độ và độ ẩm thấp) nấm ký sinh dạng hệ sợi, hình thức sinh sản vô tính (anamorph); vào mùa hè, khi nhiệt độ và độ ẩm cao tạo điều kiện thuận lợi để nấm hình thành quả thể, hình thức sinh sản hữu tính (teleomorph) [21]. Tiêu biểu như Cordyceps takaomontana có đặc điểm hình thái sinh sản hữu tính (teleomorph), có thể bình và quả thể nhưng khóa phân loại của Sung et.
Với khả năng ký sinh trên côn trùng, chi nấm Cordyceps đã và đang được sử dụng như tác nhân kiểm soát sinh học với hiệu quả cao. Đặc biệt hơn, các hợp chất của một số loài thuộc chi nấm này đã được chứng minh có tiềm năng ứng dụng trong y dược [19]. Trong nông nghiệp Các loài nấm thuộc chi Cordyceps được ứng dụng phổ biến trong kiểm soát sinh học. Bởi vì Cordyceps mang đặc điểm là nấm ký sinh côn trùng nên chúng trở thành thiên địch của rất nhiều loại côn trùng gây hại [47].
Một số loài điển hình được sử dụng trong nông nghiệp gồm: Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi. Trong đó, Beauveria bassiana (nấm bạch cương), chúng ký sinh chủ yếu trên sâu bướm, côn trùng cánh cứng, có khả năng gây độc nhanh cho ký chủ và an toàn với con người [47]. Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc sử dụng nấm ký sinh côn trùng phòng chống các loại sâu hại hay dịch bệnh. Tiêu biểu như chế phẩm nấm Beauveria bassiana phòng trừ sâu róm hại thông và nấm Metarhizium anisopliae tiêu diệt châu chấu hại ngô, bọ cánh cứng hại dừa,… mang lại hiệu quả kinh tế cao [9].
Trong y dược Các nghiên cứu y học và dược học đã chứng minh các loài nấm ký sinh côn trùng có rất nhiều tác dụng như: kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư máu, ung thư SVTH: Nguyễn Hải Châu 2 Khóa luận tốt nghiệp phổi và ung thư vú [25][38]. Một trong những loài nấm được biết đến nhiều nhất chính là Ophiocordyceps sinensis (Đông trùng hạ thảo). Loài nấm này ký sinh trên các ấu trùng của các loài bướm đêm thuộc chi Thitadores và là một loại dược liệu quý hiếm sử dụng trong y học cổ truyền một số quốc gia Đông Á. Chúng được tìm thấy ở độ cao từ 4.400m trên các đồng cỏ của dãy núi cao Himalaya và các dãy núi cao khác của Trung Quốc, Tây Tạng và Nepal [19][23].
Ngoài ra, các loài nấm khác của chi nấm này cũng đã được chứng minh có tiềm năng ứng dụng trong y dược. Điển hình như khả năng gây độc tế bào để chống tế bào ung thư của Isaria tenuipes [19]. Hơn nữa, các hợp chất chứa trong Cordyceps có tác dụng điều hòa miễn dịch cơ thể và ngăn ngừa bệnh. Polysaccharide là một trong những hợp chất chính có trong Cordyceps.
Một số polysaccharide và các dẫn xuất đường khác chẳng hạn như axit cordycepic [D-mannitol] được xác định là có hoạt tính dược lý. Các polysaccharide có khả năng diều tiết đường máu, chống ưng thư, chống di căn và tăng cường hệ miễn dịch [19]. Ngoài ra, Cordyceps còn có khả năng tăng cường hệ miễn dịch nhờ việc sản xuất các tế bào lympho, tế bào NK (natural killer cell) và cải thiện các kháng thể [36]. Bên cạnh đó, lượng polysaccharide trong Cordyceps (chiếm khoảng 3 – 8% tổng khối lượng) có khả năng điều trị bệnh tim và hỗ trợ giải độc gan[24].
Bên cạnh đó, Cordyceps có vai trò rất quan trọng trong y dược và ẩm thực của người Trung Quốc vì sinh khối của Cordyceps chứa nhiều thành phần dinh dưỡng: các acid amin, các vitamin (B1, B2, B12, E, K…) [19]. Chúng còn chứa 28 acid béo (bão hòa và không bão hòa), các dẫn xuất đường, rất nhiều phức hợp polysaccharide, protein, sterol, nucleoside và các nguyên tố vi lượng (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ni, Sr, Ti, Cr, Ga, V và Zr) [19]. SVTH: Nguyễn Hải Châu 3 Khóa luận tốt nghiệp Hình 1.2: Một số nucleoside tiêu biểu trong Cordyceps sinensis [19] Với độ đa dạng cao về các loài nấm Cordyceps, Việt Nam có tiềm năng lớn trong việc khai thác các loài nấm ký sinh côn trùng bản địa và ứng dụng trong y dược. Tuy nhiên, điều kiện tiên quyết khi sử dụng các sinh vật trong y dược chính là việc xác định chính xác phân loại học của sinh vật đến mức loài [45].
Hiện nay, việc phân loại các loài nấm thuộc chi Cordyceps vẫn đang được nghiên cứu và làm rõ thông qua việc kết hợp thông tin về hình thái cũng như phân tử. Phân loại học 1. Theo quan điểm hình thái Định danh hình thái được xem là tiêu chuẩn vàng để định danh các vi khuẩn, vi nấm,… nói chung và chi nấm ký sinh côn trùng nói riêng. Hiện nay, việc định danh và xây dựng hệ thống học các loài nấm ký sinh côn trùng chủ yếu dựa trên phân tích hình thái giải phẫu: màu sắc, quả thể, sinh sản, bào tử,… [28] Hình thái đặc trưng của Cordyceps gồm: quả thể thuôn dài (chất nền gồm nhiều sợi nấm và sinh sản vô tính), có thể túi dạng trụ, đỉnh túi dày, các bào tử túi dạng sợi, quả thể dạng màu nâu hoặc đen, dài từ 4-11 cm, trọng lượng khoảng 0,06 g [1][45].
Sâu khi còn tươi có dạng con tằm, có màu vàng đến vàng nâu, đầu màu đỏ nhạt, dài khoảng 3-5 cm [1]. Năm 1982, Kobayashi dựa trên cơ sở xử lý các thông tin từ việc phân tích 282 loài trong chi Cordyceps, 59 loài trong chi Torrubiella và 75 loài thuộc các chi lân SVTH: Nguyễn Hải Châu 4 Khóa luận tốt nghiệp cận khác, đã xây đựng nên khóa định danh cho nhóm Cordyceps và Torrubiella [28].