Đặt vấn đề Cây Bình vôi có tên khoa học là Stephania spp, họ Tiết dê (Menispermaceae), là một loài dây leo, phần rễ phát triển thành củ to, bám vào núi đá, có củ rất to, nặng tới hơn 40 kg, vỏ thân củ màu đen, xù xì giống như hòn đá, củ còn gọi là “củ một”, “củ mối trôn”, “ngải tượng”, “tử nhiên”,…Cây Bình vôi có giá trị dược liệu cao, đặc biệt củ Bình vôi chứa chủ yếu các alkaloid với hàm lượng rất khác nhau trong từng loài, trong đó hợp chất rotundin chiếm hàm lượng lớn. Roduntin trong củ Bình vôi được dùng chủ yếu để chữa bệnh mất ngủ và an thần với những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sử dụng nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý, sau khi ngủ không bị mệt mỏi và gây nhức đầu. Tuy nhiên theo nhiều nghiên cứu gần đây chỉ ra được rằng hàm lượng rotundin của các loài Bình vôi là rất thấp, tùy thuộc từng loài và điều kiện sinh thái. Ở Việt Nam, chi Bình vôi (Stephania) có khoảng 20 loài, trong đó loài Bình vôi hoa đầu (Stephania cepharantha Hayata), Bình vôi núi cao hay Bình vôi nhị ngắn (Stephania brachyandra Diels), Bình vôi tím (Stephania rotunada Lour), Thiên kim đằng (Stephania japonica Miers).
đang được khai thác quá mức và đã được ghi trong Sách đỏ Việt Nam với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” và ”nguy cấp” (V). Hiện nay, hướng nghiên cứu genome và chức năng của các gen trên đối tượng cây Bình vôi còn rất mới mẻ. Số trình tự gen đăng trên Ngân hàng gen Quốc tế chưa nhiều, chủ yếu là các nghiên cứu trình tự gen mã hóa protein ribosome S2, S3, S4, S7, S8, S11, S12, S14, S15, S16, S18, S19, 23S, 4.5S, 5S, L14, L16, L20, L22, L23, L33, L36, CP43, NADH dehydrogenase subunit 1, NADH dehydrogenase subunit 2, NADH dehydrogenase subunit 5, NADH dehydrogenase subunit 6, NADH dehydrogenase subunit 7, cytochrome b và c , RNA polymerase alpha, RNA polymerase beta, photosystem protein, envelope membrane protein, acetyl-CoA carboxylase beta, ribulose-1,5-bisphosphate 1 carboxylase/oxygenase, ATP synthase, Psa A và B, ATPase, maturase K, ribosomal RNA, tRNA ở cây Stephania. Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật cho phép đưa một hay một số gen nhất định nào đó vào hệ gen của cây chủ được quan tâm để tạo ra cây trồng biến đổi gen nhằm cải thiện một hay một số đặc tính hay tính trạng theo hướng lợi ích cho con người.
Kỹ thuật này đã và đang được quan tâm, được tiến hành thực nghiệm trên nhiều giống cây trồng và được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới đặc biệt là kỹ thuật chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacienes. Như vậy, liệu việc chuyển gen mã hóa enzyme CoOMT sẽ giúp tăng hàm lượng rotundin trong cây Bình vôi hay không đang là câu hỏi nghiên cứu. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen mã hoá enzyme Columbamine O- methyltransferase vào cây Bình vôi (Stephanin brachyandra Diels)”. Mục tiêu nghiên cứu Biến nạp được cấu trúc mang gen mã hoá enzyme Columbamine O- methyltransferase vào cây Bình vôi (Stephanin brachyandra Diels).
Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu biến nạp gen CoOMT vào cây Bình vôi. - Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển CoOMT trong cây Bình vôi bằng phản ứng RT-PCR. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về cây Bình vôi Về nguồn gốc và phân loại Chi Bình vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn gốc ở miền đông và nam châu Á cũng như Australasia.
Tên gọi dân dã trong tiếng Việt là cây Bình vôi [37]. Về mặt phân loại, cây Bình vôi thuộc: Giới (regnum): Plantae Bộ (ordo): Ranunculales Họ (familia): Menispermaaceae Chi (genus): Stephania [37]. Cây Bình vôi [38] 3 Chi Stephania có khoảng trên 45 loài. Một số loài ở Việt Nam đã được công bố như [37]: Stephania glabra (Roxb) Miers Stephania kuinanensis H.
Yang Stephania pierrei Diels Stephania excentrica H. Lo Stephania hainanensis H. Lo et Y Tsoong Stephania kwangsiensis H. Lo Stephania sinica Diels.Yang Stephania rotunda Lour Các loài Bình vôi ở nước ta phân bố khá rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam.
Thường gặp ở các vùng núi đá vôi: Tuyên Quang, Nam Định, Hà Nội, Hà Nam, Hà Giang, Hoà Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hoá, Thái Nguyên, Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu,… Một số loài thường chỉ gặp ở các vùng núi đất và biển như S. pierrei Diels tập trung chủ yếu ở các tỉnh ven biển Bình Định, Phú Yên, Ninh Thuận [37], [42]. Về đặc điểm sinh học Các loài trong chi Bình vôi (Stephania) đều thuộc dạng thân leo, nhẵn, thường xanh, gốc hóa gỗ, sống lâu năm hoặc hằng năm. Ở giai đoạn non thân thường nhẵn, màu xanh nhạt, xanh bóng hoặc xanh đậm.
Trên thân già thường có những rãnh dọc, những mụn cóc sần sùi, màu nâu xám, nâu đen hoặc màu nâu đất. Rễ dạng sợi hoặc phình to tạo thành rễ củ. Củ rất đa dạng về hình thái, kích thước và màu sắc. Củ thường có dạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hoặc hình dạng bất định.
Có loài rễ củ thường chỉ nặng 0,5 – 2kg (hoặc 3 kg), nhưng cũng có loài cho củ có thể nặng tới 50-70 kg. Tuỳ thuộc vào từng loài, tuổi cây và điều kiện môi trường sống mà hình thái, màu sắc vỏ củ cũng có nhiều thay 4 đổi (nhẵn hoặc xù xì, màu nâu sáng, nâu đậm, xám tro, đen…). Thịt củ nạc hoặc có lẫn những vằn xơ, màu trắng ngà, vàng tươi, vàng nhạt hoặc đỏ nâu, đỏ tươi [2], [3], [8]. Lá Bình vôi mọc cách.
Cuống lá thường mảnh, dài 2 đến 5 hoặc 15 đến 20 cm và hai đầu phồng lên [13] có khi gấp khúc ở gốc [7]. Cuống lá đính vào lá thường ở những vị trí cách xa mép dưới của gốc lá ở những khoảng cách nhất định, tùy thuộc vào từng loài (có thể từ 1/5 đến 1/3 chiều dài phiến lá). Phiến lá mỏng hoặc dài, nhẵn mỏng hoặc rải rác có lông, hình khiên, hình tam giác rộng, hình trứng-tam giác, tam giác tròn hoặc gần tròn; mép lá nguyên hoặc chia thùy; gân lá dạng chân vịt, gồm 8-9 hoặc 10-12 gân chính cùng xuất phát từ đỉnh cuống lá. Chóp lá nhọn, thuôn nhọn, tù hoặc gần tròn; gốc lá gần tròn, phẳng hoặc gần hình tim.
Màu sắc của phiến lá tùy thuộc vào từng loài (màu xanh nhạt, xanh vàng nhạt, xanh đậm, xanh nâu nhạt hoặc đốm tía) [16]. Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực, cái thường mọc từ kẽ lá. Cụm hoa có dạng tính tán đơn, tán kép, xim tán kép, hình đầu đến tán ngù [13]., có cuống đơn độc hoặc xếp theo kiểu chum ít nhất ở các nhánh tán cấp 1, các nhánh cuống cùng đôi khi không đều hoặc đôi khi các xim tụ họp thình đầu hình đĩa [19].
Hoa đực thường có cấu tạo đối xứng tỏa tròn, đài 6-8 rời, xếp thành 2 vòng; 3-4 cánh hoa, dạng vỏ sò, màu vàng, đôi khi trắng xanh; nhị 2-6, thường 4, chỉ nhị dính nhau tạo thành ống hình trụ, đầu nhụy xòe thành đĩa tròn. Hoa cái thường chỉ gồm 1 lá đài và 2 cánh hoa (rất ít khi có 3-4 lá đài và 3-4 cánh hoa), bầu hình trứng có 4 đến 6 hoặc 7 núm nhụy hình dùi [16]. Quả hạch, dạng hình gần tròn, hình trứng, trứng bầu, 2 bên dẹt. Ở quả trưởng thành cuống quả lệch về một phía gần với dấu vết còn lại của núm nhụy.
Bầu 2 noãn, nhưng chỉ có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng. Hạt hình móng ngựa, hình trứng đẹp hoặc hơi tròn, 2 mặt bên lõm, ở giữa có lỗ thủng hoặc không, dọc theo gờ lưng bụng thường có 4 hàng vằn hoặc gai (một số loài có 5 hàng [16]. Đặc điểm hình thái của hạt thường đặc trưng cho từng taxon; nên đây được coi là một trong những dấu hiệu đáng tin cậy để giám định tên 5 khoa học đối với các loài chi Bình vôi [13]. Cây mầm có lá mầm ít nhiều bằng rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ [21] Bảng 1.
Đặc điểm đặc trưng về hình thái của một số loài Bình vôi [37] STT Các loài Bình vôi Điểm đặc trưng về hình thái 1 Stephania rotunda Lour - Dây leo có rễ củ vùi dưới đất một nửa giống hình củ bình vôi, ruột màu vàng, thơm. - Lá hình khiên, mọc cách. 2 Stephania pierrei Diels - Ngọn hoa có nhiều chấm màu tím hồng. - Lá có kích thước nhỏ hơn tất cả các loài khác.
- Hoa đực không có cánh hoa. Lo - Cành non et Y. Tsoong - Cuống lá có dịch màu trắng hoặc vàng nhạt. 4 Stephania cambodiana Gagnep - Cuống cụm hoa và cuống tán giả dài hơn so với các loài khác.
Wu - Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá. - Gân lá mặt saucó màu tím hay tím hồng. Lo - Cuống lá rất dài, có khi đến 14 cm. - Giá noãn có lỗ lệch 1 bên.
7 Stephania cepharantha Hay - Giá noãn không có lỗ. 8 Stephania sinica Diels - Giá noãn không có lỗ. - Lá có phiến hình tam giác. Lo et Yang - Cuống lá bằng hoặc dài hơn phiến lá.
6 Về kỹ thuật nhân giống cây Bình vôi Trong tự nhiên, đoạn thân, cành (ở thời kỳ sắp già hoặc bánh tẻ, mỗi đoạn có 2 đến 3 mắt) và các mảnh củ (cắt từ phần gốc, mỗi mảnh có kích thước dài rộng 4 – 5 cm, dày 2 – 2,5 cm) được sử dụng để trồng vào mùa xuân. Nhưng tốc độ sinh trưởng, phát triển rất chậm, tốc độ lớn của củ cũng rất chậm, tỷ lệ sống sót thấp chỉ đạt khoảng 33%. Để gây trồng, theo dõi sự phát triển của các loài Bình vôi, Lã Đình Mỡi và cs đã tiến hành nghiên cứu thu hái củ Bình vôi từ các vùng núi khác nhau (Lào Cai, Ninh Bình, Quảng Ninh, Hòa Bình), đem trồng tại vườn thí nghiệm và nhận thấy tất cả các củ Bình vôi đều sống, nảy chồi, sinh trưởng. Sau 2 năm theo dõi thì thấy tỷ lệ sống sót đạt 99%.
Tuy nhiên, quá trình sinh trưởng phát triển rất khác nhau. Chỉ khoảng 30% số cá thể gây trồng ra hoa kết quả, số còn lại vẫn sinh trưởng xanh tốt nhưng không ra hoa. Cây Bình vôi trong tự nhiên chủ yếu sinh sản bằng hạt. Khi quả chín rụng xuống đất và hạt nảy mầm vào vụ xuân.
Cây Bình vôi mọc từ hạt sinh trưởng, phát triển nhanh. Sau khi nảy mầm, nếu ở điều kiện bình thường cây sinh trưởng khoảng hơn 5 tháng đã hình thành nụ và tháng sau ra hoa kết quả. Khoảng 4 tháng tuổi ở gốc thân, củ cũng dần dần được hình thành.