CHƯƠNG 1: Tổng quan. - 5 tt EE 3E E1 E1511111E1E111111511111111 01111211 gràn 3 1.1 Probiotic và một số hoạt tính căn bản.2 Một số hoạt tính của DTOIOIC .3 Vai trò của cân băng vi sinh vật đường ruột đối với cơ thỀ.2 Vi khuẩn Lactobacillus, probiotic quan trọng đối với đường ruột.1 Vi khuân 1acfobqciÏÏis. c5 SeS 1x1 1111115121212 tt gưyn I1 1.2 Vai trò của Lactobacillus đối với sức khỏe đường ruội.3 Hoạt tinh kháng oxi hóa của LacfOb@GIÏÏ14S.1 Giới thiệu về stress oxi hóa và tác hại đối với cơ thê.2 Khả năng kháng oxi hóa của LacfobaqcilÏu$.3 Hop chat kháng oxi hóa trong quá trình lên men /acfobacillus.4 Lactobacillus kích thích hoạt động kháng oxi hóa của cơ thỀ.5 Sự kết hợp giữa Lactobacillus và prebiotic tăng cường hoạt động kháng oxi hóa ¬— eee eee eeeees eee eeesee cess aeeeesaeeeeeeeeeeeeseeeseseeecesseeecseeeeesseeesesseeecesseeecsseeesesseeeseiseesenaeeeeseeeegs 27 Trang v CHƯƠNG 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.1 Thời gian và địa điỂm.2 Vật liệu và thiết bị sử dụng.-- - - t3 SE EEE1211111 15111 17211 1E Errrrrri 30 2.2 Hóa chất và thiết bị sử UN.3 Phương pháp nghiên CỨu.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quất oo.2 Thuyết minh sơ G6 ooocececcccccccccccscscsesesesesececsesescsusesecscevevscevsesvsnsusevevevevecevsveveseeeses 32 2.3 Phương pháp xử lí số LGU ooo ce ceececccccecececscsescsesescecececsceeseevenssevevevevevscevsveveneeees 35 CHƯƠNG 3: Kết quả và biện 1a.1 Kết quả phân lập vi khuân Lactobacillus từ một sô loại thực phẩm lên men.2 Kết quả sàng lọc các hoạt tính probiotic cơ bản .1 Khả năng chịu pH thập và muối mậtt.2 Hoạt tính tự bám dính.- - - G1111 11111110 51111111 111k kh TT TT veg 4] 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn.3 Khảo sát khả năng kháng oxi hóa của vi khuẩn Lactobacillus có hoạt tinh probiotic C1 ‹4.4 Kết quả định danh 16S rRNA chủng Lactobacillus tiềm năng.5 Thông tin chủng giỗng. - - - 1s T2 E111111115111 1171111111101 1 EEE tràn 50 CHUONG 4: Kết luận và kiến ngh1.- 2 2 tt 3 EEEEEEEEEEEE1111111E1111TETE1E1E 1tr 53 acc na.
- - + 22c 111v EE E3 1121111111111 1E E111 HH HH ghi 53 CÁC BAI BAO ĐÃ CONG BỒ. 2 212212212212121211211122121 01a 54 TÀI LIEU THAM KHẢO. L2 1 2220111112211 135111112011 11 81111150111 E g1 11k KHE KH kg KH khu 68 LÍ LICH TRÍCH NGANG.--:- 5: 5222222212212212211211221121121121121121121 re 69 Trang vi DANH MỤC HINH Hình 1.1: Mô tả cach probiotic tác động lên tác nhân gây di ứng.2: Sự liên hệ giữa stress oxi hóa và bệnh tật.- ¿2 1 SE21215151121112111111111 1111111 1111 ng 31 Hình 3.1 Vong khang của chủng Lac 16 va Lac 4 đối với Salmonella.2: Kết quả định danh chủng Lac 33.3: Kết quả định danh chủng Lac 28 .- 6 SE 121 EEE11111E15111111E1E11E1111 te. 50 Trang vii DANH MUC BANG Bang 1.1: Một số probiotic và nguôn thu nhận.--- 5: tt 1E 3E SEEEEEEEEEEEEEESEEEEEEEErrerrrki 4 Bang 1.2: Một số chủng Lactobacillus thường GP .3: Một số gốc tự do phổ biến.
1-1 S SE EE1111111111115727111111111 11111 1EEEEEErrrei 19 Bang 3.1: Hình ảnh một số chủng Lactobacillus trong bộ sưu tập phân lap duoc.2: Kết quả khảo sát khả năng chịu pH thấp và muối mat. cece vzz£ss2 40 Bang 3.3: Kết qua bám dính và kháng khuẩn của 20 chủng ULacfobaecillus.4: Hoạt tinh probiotic và kháng oxi hóa cua 8 chung Lacfobaecillus.5: Hoạt tính khang oxi hóa của chủng phân lập va chủng thương mạiI.6: Tóm tat thông tin chủng giống .---- ST SEE11111121515115727111111E 11x EEer tre 51 Trang viii DANH MỤC CHỮ VIET TAT BSH: bile salt hydrolase MUB: mucus-binding protein GALT: gut-associated lymphoid tissue SIgA: secretory immunoglobulin A ROS: reactive oxygen species EPS: exopolysaccharide AFBO: exo-AFB¡- 8,9-epoxide XOS: Xylooligosaccharide Nrf2: Nuclear factor erythroid 2-related factor MRS: de Man, Rogosa and Sharpe broth LB: Luria-Bertani DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Trang ix ĐẶT VAN DE Probiotic là những vi sinh vật song khi được su dung với SỐ lượng đủ lớn sẽ mang lại lợi ích cho cơ thể chủ. Probiotie được sử dụng từ lâu, ngày nay lại càng được quan tâm vì các nhà khoa học đã đưa ra nhiều bằng chứng cho thấy tác động có lợi lên cơ thể như: hỗ trợ tiêu hóa, giảm dị ứng, tăng cường miễn dịch, tăng cường lợi khuẩn trong đường ruột cũng như giữ cân bằng chuyển hóa trong cơ thé. Trong đó Lactobacillus là một chỉ vi khuẩn quan trọng được sử dụng từ xưa đến nay trong các sản phẩm lên men, là chủng khởi động trong nhiều quá trình lên men công nghiệp và cũng là một trong những vi khuẩn quan trọng thường trú ở đường ruột.
Góc tự do là sản phẩm thông thường trong hoạt động chuyển hóa của cơ thé hiếu khí. Với nông độ thấp, gốc tự do là tín hiệu nội bào quan trọng và được g1ữ ôn định nhờ hoạt động kháng oxi hóa trong co thé. Khi sự mat cân bang oxi hóa và kháng oxi hóa xảy ra, gốc tự do được hình thành nhiều, hiện tượng này được gọi là stress oxi hóa. Stress oxi hóa gây nhiều tác hại cho hoạt động chuyển hóa thông thường của tế bảo, là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nguy hiểm như tiểu đường, béo phì, dẫu hiệu của lão hóa và ung thư.
Bên cạnh nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng oxi hóa, nghiên cứu cho thay nhiều vi khuẩn lactic cũng có hoạt tính kháng oxi hóa, thé hiện ở khả năng thu dọn gốc tự do, bắt giữ ion kim loại, ức chế quá trình tự oxi hóa trong cơ thé. Lactobacillus thé hiện hoạt tính kháng oxi hóa thông qua kha năng tổng hop hợp chat khang oxi hóa, tăng nông độ chất kháng oxi hóa trong quá trình lên men, kích thích hoạt động kháng oxi hóa của cơ thể, ngoài ra Lactobacillus còn giúp tăng cường hệ lợi khuẩn trong đường ruột, qua đó giúp cải thiện sức khỏe một cách toàn diện. Các sản phẩm lên men truyền thông của Việt Nam phong phú và đa dạng, có sự đặc thù trong nguyên liệu, phương pháp lên men, trong đó lên men lactic đóng góp một phan quan trong tạo nên sự da dạng đó. Nhiều nghiên cứu nhằm thu nhận vi khuẩn probiotic từ các sản phẩm lên men truyền thống, tuy nhiên chưa có nhiều công trình ghi nhận khả Trang 1 năng kháng oxi hóa của vi khuẩn Lactobacillus từ sản phẩm lên men truyền thống Việt Nam.
Trong đề tài này, chúng tôi sẽ tiễn hành phân lập, sàng lọc, tạo bộ sưu tập vi khuẩn Lactobacillus từ một số sản phẩm lên men truyền thống với các mục tiêu và nội dung: Mục tiêu: Tuyến chọn chủng probiotic Lactobacillus có hoạt tính kháng oxi hóa cao Nội dung: — Phân lập vi khuẩn Lactobacillus từ một số sản phẩm lên men truyền thông — Sang lọc những chung có probiotic cơ bản — Tuyến chọn những chủng có khả năng kháng oxi hóa cao — Định danh và bảo quản chủng tiềm năng. Trang 2 CHUONG 1: TONG QUAN 1.1 Probiotic và một số hoạt tính căn bản 1.1 Probiotic “Probiotic” bắt nguồn từ tiếng La tinh, có nghĩa là “cho cuộc sống”. Thuật ngữ probiotic được sử dụng lần đầu tiên bởi Liley và Stillwell năm 1965, mô tả đây là những hợp chất ma một loài vi sinh vật tiết ra có thé kích thích sự phát triển một cơ thé khác. Sperti (1971) định nghĩa probiotic là những chất chiết xuất từ các mô, có lợi cho cơ thể.
Năm 1974, Parker định nghĩa probiotic là những vi sinh vật và “chất” có vai trò cân băng hệ vi sinh vật đường ruột. Định nghĩa nay cho thấy probiotic bao gồm cả vi sinh vật sống và các “chat”, các chất này có thể từ vi sinh vật hoặc không từ vi sinh vật. Đến năm 1989, Fuller định nghĩa lai probiotic là “một loại thức ăn bố sung vi sinh vật sống mà có ảnh hưởng đến cơ thể chủ thông qua việc tạo sự cân bang hệ vi sinh vật đường ruột” (Fuller, 1992). Trong định nghĩa nay có dé cập đến vai trò cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột của probiotic, tuy nhiên nhiều nghiên cứu lại chỉ ra nhiều vai trò mới của probiotic không chỉ đối với đường ruột mà với rất nhiều quá trình chuyên hóa của cơ thé.
Vì vậy tổ chức FAO/WHO năm 2001 đã đưa ra định nghĩa cho probiotic: “Những vi sinh vật sống khi đưa vào co thé với số lượng hợp lí sẽ mang lại lợi ích cho cơ thé chủ” (FAO/WHO, 2001). Probiotic là những vi sinh vật có lợi, không sinh và không chứa độc tố cũng như chong chịu được với các điều kiện của môi trường đường ruột như pH thấp, muối mật, bám dính trên thành ruột. Probiotic được sử dụng cho người chủ yếu gồm hai nhóm vi khuẩn lactic là Bifidobacteria (B. adolescentis) và vi khuân lactic GC thap nhu Enterococcus spp, Lactobacillus spp, Lactococcus spp, Leuconostoc spp, Pediococcus spp, Streptococcus spp.1: Một số probiotic và nguồn thu nhận Chỉ vi khuân | Chung giông Nguôn phân lập Tham khảo Lactobacillus | L.
kefir Kefir Carasi et al. plantarum Kim chi Lee et al. fermentum Dua cai Hué-VN Huong,Thuy, 2012 L. tolerans Tibetan kefir-Trung | Miao et al.
Omegison-Han Oh, Jung, 2015 plantarum, L. lactis Phomat Parente and Cogan, subsp. 2004; Quigley et al. bifidum Phan su, sta me Michelini et al.
| Phân khỉ đuôi soc | Subramonian, 2016 reuteri con Pediococcus | P. acidilactici Omegison-Han Oh, Jung, 2015 quéc Enterococcus | E. faecalis Ruột ca nước ngọt | Allameh et al. faecium Phân su trẻ so sinh | Kumar et al., 2015 Pandya et al., 2013 Nam men Kluyveromyces marxianus Kefir Gabriela et al., 2013 Saccharomyces cerevisiae Trang 4 Nhiều chủng khuẩn là những vi sinh thường trú trong đường ruột của người và động vật, được sử dụng làm probiotic cũng như chủng khởi động trong nhiều quá trình lên men.
Những chủng vi sinh vat này được thu nhận từ nhiều nguồn như miệng, sữa động vật, phân, dịch nhầy âm dao, sản phẩm lên men truyền thống. Dé tồn tại được trong môi trường đường ruột, probiotic có những cơ chế khác nhau dé thích nghỉ với điều kiện stress, đó là khả năng chịu được pH thấp, nông độ muối mật cao, khả năng bám dính và kháng khuẩn.2 Một số hoạt tính của probiotic 1.1 Khả năng chịu pH thấp pH của dịch dạ dày từ khoang 1,8-3,5, phù hợp cho hoạt động của các enzyme tiêu hóa như pepsin (Gowri et al. Khi probiotic vao tới dạ dày, tín hiệu pH thấp kích thích hoạt động của hàng loạt enzyme và hệ thống phòng vệ tế bảo chống chịu với điều kiện stress. Trong điều kiện acid cao, hoạt động của kênh vận chuyển H”/ATPase tăng lên nhằm tăng tốc độ chuyên H* ra khỏi tế bào, các acid béo không no được tăng cường tông hợp dé bảo vệ tế bao (Shobharani et al.
Nghiên cứu sự biểu hiện của các protein của vi khuan Lactobacillus reuteri trong điều kiện nuôi cây ở các pH thấp khác nhau cho thay các protein tăng biểu hiện thuộc vào một số nhóm như: protein vận chuyến, dich mã, chuyền hóa nucleotide và tổng hop amino acid, tong hop năng lượng, cân bằng acid và stress (Lee et al. Có sự tăng và giảm biểu hiện cua hàng loạt gene trong tế bao Bifidobacterium longum subsp longum BBMN68 dé đáp ứng với điều kiện stress.