Luận văn thạc sĩ: Xây dựng và đánh giá hệ thống chủng giống cho nghiên cứu phát triển vắc xin ...

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus xây dựng và đánh giá hệ thống chủng giống cho nghiên cứu phát triển vắc xin sốt xuất huyết, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

Chuyên ngành

Vi sinh vật học

Người đăng

Ẩn danh

2014

96
2
0

Phí lưu trữ

35 Point

Mục lục chi tiết

LỜI CẢM ƠN

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Đặc điểm dịch tễ học về bệnh sốt xuất huyết dengue

1.2. Tình hình mắc sốt xuất huyết dengue trên thế giới

1.3. Tình hình mắc sốt xuất huyết dengue tại Việt Nam

1.4. Virút dengue – tác nhân gây bệnh

1.4.1. Đặc điểm phân loại

1.4.2. Cấu trúc phân tử và thành phần chức năng

1.4.3. Quá trình lắp ráp và trưởng thành của virút

1.4.4. Sự sao chép ARN virút

1.5. Nguồn bệnh và đường lây truyền bệnh sốt dengue

1.5.1. Vector truyền bệnh

1.5.2. Sự lây truyền của virút dengue

1.6. Các biện pháp phòng ngừa dịch bệnh

1.7. Cơ chế bệnh sinh

1.7.1. Các yếu tố nguy cơ dẫn đến sốt xuất huyết dengue

1.7.2. Miễn dịch đối với nhiễm virút dengue

1.8. Vắcxin phòng chống dengue

1.8.1. Vắcxin sống giảm độc lực

1.8.2. Vắcxin bất hoạt toàn virút

1.8.3. Vắcxin tiểu đơn vị tái tổ hợp

1.8.4. Vắcxin nuleic và vector sống

1.8.5. Tình hình nghiên cứu và phát triển vắcxin dengue trên thế giới

1.8.6. Nghiên cứu vắcxin dengue tại Việt Nam

1.8.7. Các triển vọng vắcxin dengue trong tương lai

1.9. Đặc điểm chủng dengue do viện sức khỏe Hoa Kỳ nghiên cứu và phát triển

1.9.1. Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN4

1.9.2. Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN1

1.9.3. Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN2

1.9.4. Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN3

1.10. Xây dựng ngân hàng chủng gốc giống cho vắcxin dengue tại Việt Nam

2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Tế bào Vero

2.2. Các chủng virút dengue tái tổ hợp

2.3. Môi trường nuôi cấy và các dung dịch trong nghiên cứu

2.4. Các hóa chất và sinh phẩm

2.5. Dụng cụ và trang thiết bị

2.6. Phương pháp

2.6.1. Phương pháp cấy chuyển tế bào Vero từ điều kiện bảo quản và nhân số lượng tế bào Vero trên chai nuôi một lớp

2.6.2. Phương pháp gây nhiễm và nuôi cấy virút dengue trên tế bào

2.6.3. Phương pháp thu hoạch virút dengue sau gây nhiễm

2.6.4. Phương pháp chuẩn độ virút dengue bằng tạo đám hoại tử

2.6.5. Phương pháp nhuộm miễn dịch đám hoại tử

2.6.6. Phương pháp thử vô khuẩn

2.6.7. Phương pháp xác định trình tự genome virút dengue

3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Xây dựng quy trình gây nhiễm và nuôi cấy các chủng dengue trên chai nuôi cấy một lớp

3.1.1. Liều gây nhiễm virút dengue trên tế bào Vero

3.1.2. Nhiệt độ và môi trường nuôi cấy virút

3.1.3. Quy trình sản xuất các chủng virút dengue gốc giống

3.2. Sản xuất các chủng virút gốc giống

3.2.1. Gây nhiễm chủng virút dengue trên tế bào Vero

3.2.2. Thu hoạch chủng virút dengue trên tế bào Vero

3.2.3. Đánh giá chất lượng các chủng gốc giống

3.2.3.1. Đánh giá hiệu giá virút
3.2.3.2. Đánh giá bộ gen của các chủng gốc giống virút dengue
3.2.3.3. Đánh giá tính ổn định hiệu giá virút qua các đời nuôi cấy

4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu "Nghiên cứu và phát triển vắc xin sốt xuất huyết dengue: Xây dựng hệ thống chủng giống" cung cấp cái nhìn sâu sắc về quá trình nghiên cứu và phát triển vắc xin cho bệnh sốt xuất huyết dengue, một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm tại nhiều quốc gia. Tài liệu nhấn mạnh tầm quan trọng của việc xây dựng hệ thống chủng giống vắc xin, từ đó giúp nâng cao hiệu quả phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh. Độc giả sẽ tìm thấy những thông tin quý giá về các phương pháp nghiên cứu, quy trình phát triển vắc xin, cũng như những thách thức và cơ hội trong lĩnh vực này.

Để mở rộng kiến thức của mình, bạn có thể tham khảo thêm tài liệu Luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm nghiên cứu quy trình phối trộn vắc xin cúm mùa bốn chủng dạng mảnh ở quy mô sản xuất thử nghiệm, nơi cung cấp thông tin về quy trình phối trộn vắc xin trong sản xuất. Ngoài ra, tài liệu Luận văn tốt nghiệp phân tích tổng quan hệ thống nghiên cứu hiệu quả của một số loại vắc xin trong phòng chống dịch bệnh covid 19 sẽ giúp bạn hiểu rõ hơn về hiệu quả của các loại vắc xin trong bối cảnh dịch bệnh hiện nay. Cuối cùng, tài liệu Luận văn thạc sĩ vnua nghiên cứu đặc tính sinh miễn dịch của chủng vi rút o fmd avac3 để sản xuất vắc xin vô hoạt phòng bệnh lở mồm long móng sẽ cung cấp thêm thông tin về nghiên cứu vắc xin trong lĩnh vực thú y. Những tài liệu này sẽ giúp bạn có cái nhìn toàn diện hơn về nghiên cứu và phát triển vắc xin.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hoàng Anh Đức XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ HỆ THỐNG CHỦNG GIỐNG CHO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VẮCXIN SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đỗ Tuấn Đạt Hà Nội - 2014 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Tuấn Đạt, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong công việc cũng như trong suốt quá trình học tập, và thực hiện các nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo Khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh vật học thuộc trường ĐH Khoa học Tự nhiên, đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập tại Trường . Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các anh chị và bạn các đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi, cùng chia sẻ các kinh nghiệm và kiến thức trong suốt thời gian tôi thực hiện nghiên cứu tại phòng Công nghệ Cao, Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1. Cuối cùng, tôi muốn được cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên khích lệ, động viên tôi trong suốt thời gian vừa qua. Học Viên Hoàng Anh Đức LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC MỤC LỤC . 1 DANH MỤC HÌNH VẼ . 5 DANH MỤC BẢNG BIỂU . 6 BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT . 8 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .1 Đặc điểm dịch tễ học về bệnh sốt xuất huyết dengue .1 Tình hình mắc sốt xuất huyết dengue trên thế giới .2 Tình hình mắc sốt xuất huyết dengue tại Việt Nam .2 Virút dengue – tác nhân gây bệnh .1 Đặc điểm phân loại .2 Cấu trúc phân tử và thành phần chức năng .3 Quá trình lắp ráp và trưởng thành của virút .4 Sự sao chép ARN virút .3 Nguồn bệnh và đường lây truyền bệnh sốt dengue .2 Vector truyền bệnh.3 Sự lây truyền của virút dengue .4 Các biện pháp phòng ngừa dịch bệnh . 24 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.4 Cơ chế bệnh sinh .2 Các yếu tố nguy cơ dẫn đến sốt xuất huyết dengue .3 Miễn dịch đối với nhiễm virút dengue.5 Vắcxin phòng chống dengue .1 Vắcxin sống giảm độc lực .2 Vắcxin bất hoạt toàn virút .3 Vắcxin tiểu đơn vị tái tổ hợp .4 Vắcxin nuleic và vector sống .5 Tình hình nghiên cứu và phát triển vắcxin dengue trên thế giới .6 Nghiên cứu vắcxin dengue tại Việt Nam .7 Các triển vọng vắcxin dengue trong tương lai .6 Đặc điểm chủng dengue do viện sức khỏe Hoa Kỳ nghiên cứu và phát triển 37 1.1 Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN4 .2 Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN1 .3 Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN2 .4 Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN3 .7 Xây dựng ngân hàng chủng gốc giống cho vắcxin dengue tại Việt Nam 43 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .1 Tế bào Vero . 45 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.2 Các chủng virút dengue tái tổ hợp .3 Môi trường nuôi cấy và các dung dịch trong nghiên cứu .4 Các hóa chất và sinh phẩm .5 Dụng cụ và trang thiết bị.2 Phương pháp .1 Phương pháp cấy chuyển tế bào Vero từ điều kiện bảo quản và nhân số lượng tế bào Vero trên chai nuôi một lớp.2 Phương pháp gây nhiễm và nuôi cấy virút dengue trên tế bào .3 Phương pháp thu hoạch virút dengue sau gây nhiễm .4 Phương pháp chuẩn độ virút dengue bằng tạo đám hoại tử .5 Phương pháp nhuộm miễn dịch đám hoại tử .6 Phương pháp thử vô khuẩn .7 Phương pháp xác định trình tự genome virút dengue . 55 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .1 Xây dựng quy trình gây nhiễm và nuôi cấy các chủng dengue trên chai nuôi cấy một lớp .1 Liều gây nhiễm virút dengue trên tế bào Vero .2 Nhiệt độ và môi trường nuôi cấy virút .3 Quy trình sản xuất các chủng virút dengue gốc giống .2 Sản xuất các chủng virút gốc giống .1 Gây nhiễm chủng virút dengue trên tế bào Vero .2 Thu hoạch chủng virút dengue trên tế bào Vero.3 Đánh giá chất lượng các chủng gốc giống.1 Đánh giá hiệu giá virút. 68 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.2 Đánh giá bộ gen của các chủng gốc giống virút dengue .3 Đánh giá tính ổn định hiệu giá virút qua các đời nuôi cấy . 73 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO . So sánh trình tự chủng rDEN1∆30 . So sánh trình tự chủng rDEN2/4∆30(ME) . So sánh trình tự chủng rDEN3∆30/31 . So sánh trình tự chủng rDEN3-3’D4∆30 . So sánh trình tự chủng rDEN4∆30 . So sánh trình tự chủng rDEN4∆30-200,201. 93 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1. Các nước/khu vực có nguy cơ lây nhiễm virút dengue năm 2008. Số ca nhiễm sốt dengue và sốt xuất huyết dengue trung bình hằng năm được Tổ chức y tế thế giới báo cáo, và số nước có ca bệnh được báo cáo, 1955-2007. Tình hình dịch sốt dengue tại Việt Nam 2002 – 2011 [3]. Cấu trúc hạt virút dengue và các dạng khác nhau của protein E [36]:. Cấu trúc genome của virút dengue [36]: . Sự lây truyền của virút dengue [43] . Mô hình miễn dịch tăng cường nhiễm trùng bệnh dengue [43]. Sơ đồ gen các chủng dengue tái tổ hợp được lựa chọn để làm vắcxin sống giảm độc lực [12]. Tế bào Vero sau khi nuôi cấy. Hiệu giá virút dengue thu được ở các liều gây nhiễm khác nhau . Hình ảnh đám hoại tử trên tế bào Vero sau khi nhuộm miễn dịch .70 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1. Các mức độ trên lâm sàng bệnh do virút dengue gây ra . Tóm tắt các vắcxin dengue dự tuyển đang được phát triển trên thế giới . Hiệu giá virút dengue nuôi cấy tại các nhiệt độ khác nhau . Hiệu giá virút rDEN3 nuôi trong các môi trường khác nhau . Kết quả thu hoạch các chủng gốc giống . Tóm tắt kết quả giải mã trình tự gen các chủng gốc giống . Kết quả chuẩn độ hiệu giá virút dengue qua các đời nuôi cấy .75 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Kí hiệu viết tắt Diễn giải 1. ADN Axit deoxyribonucleic 2. ARN Axit ribonucleic 3. cDNA axit deoxyribonucleic bổ sung 4. DEN Virút dengue 5. HCSD Hội chứng sốc dengue 6. HVĐT Hiển vi điện tử 7. KN Kháng nguyên 8. KT Kháng thể 9. MOI Multiple of infection: liều gây nhiễm 10. NIAID National Institute of Allergy and Infectious Diseases: Viện Quốc Gia về dị ứng và các bệnh nhiễm trùng 11. NIH National Institute of Health: Viện sức khỏe Hoa Kỳ 12. PCR Polymerase chain reaction: Phản ứng chuỗi trùng hợp 13. PFU Plague forming unit: Đơn vị tạo đám hủy hoại tế bào 14. SD Sốt dengue 15. SXH Sốt xuất huyết 16. SXHD Sốt xuất huyết dengue 17. TCYTTG Tổ chức Y Tế Thế Giới 18. UTR Unstranslated region: vùng không dịch mã 19. VABIOTECH Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỞ ĐẦU Sốt xuất huyết dengue là một trong những bệnh virút lây truyền qua muỗi phổ biến nhất ở người, gây ảnh hưởng chủ yếu tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới. Phạm vi và sự phân bố địa lý của bệnh này tăng nhanh chóng trong vòng 50 năm qua và tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) ước tính virút dengue là nguyên nhân gây ra khoảng 50-100 triệu ca mỗi năm trên toàn thế giới với khoảng 2 phần 5 dân số trên toàn thế giới có nguy cơ mắc bệnh này. Sốt xuất huyết dengue (SXHD) và hội chứng sốc dengue (HCSD) hiện đang là nguyên nhân chủ yếu khiến trẻ em nhập viện và tử vong tại ít nhất 8 nước Đông Nam Á [10]. Đây là hậu quả của việc phơi nhiễm với muỗi tăng lên do quá trình đô thị hóa, đi du lịch, thay đổi khí hậu và thiếu kiểm soát vector truyền bệnh [10]. Trước những năm 1970, chỉ có 5 nước Đông Nam Á báo cáo về sốt xuất huyết dengue. Tuy nhiên, hiện tại đã có trên 60 nước đưa ra tài liệu về căn bệnh này. Và virút dengue là loài đặc hữu ở hơn 100 nước, bao gồm hầu hết các nước Đông Nam Á, Nam Trung Mỹ, Caribe và vùng Nam Thái Bình Dương. Sự lan truyền nhanh chóng của dịch sốt dengue đang đòi hỏi các tổ chức, các quốc gia tăng cường nỗ lực kiểm soát, phòng và điều trị bệnh này [46]. Nằm trong vùng Đông Nam Á, Việt Nam là một trong những nước lưu hành dịch lớn nhất trên thế giới, với hàng triệu người có nguy cơ mắc bệnh. Hằng năm Việt Nam đã phải đầu từ rất nhiều chi phí cho việc nghiên cứu, kiểm soát và phòng chống dịch do virút dengue gây ra. Bên cạnh việc tăng cường ý thức giáo dục cộng đồng, khống chế vector truyền bệnh là muỗi bằng các biện pháp phun hóa chất, diệt ổ bọ gậy hiện được sử dụng phổ biến tuy vẫn còn nhiều hạn chế. Kiểm soát dịch bệnh qua vector gây tốn kém và không triệt để. Hiện nay, tiêm vắcxin phòng bệnh dengue được coi là biện pháp triệt nhất để giúp cho việc phòng chống dịch bệnh trên người một cách chủ động và có thể khống chế sự bùng phát của dịch bệnh ra toàn cộng đồng. 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Cho đến nay hầu hết các vắcxin dengue dự tuyển trên thế giới đều đang ở giai đoạn thử nghiệm lâm sàng, và vắcxin dự tuyển sớm nhất có thể được cấp phép vào năm 2016. Một vắcxin phòng bệnh dengue được coi là lý tưởng khi vắcxin có khả năng gây đáp ứng miễn dịch bền vững và đầy đủ với tất cả bốn týp huyết thanh virút hoang dại, cần ít mũi tiêm nhắc lại và không gây ra các phản ứng trầm trọng trong cơ thể [43]. Hơn nữa, giá thành vắcxin phải thấp để đáp ứng đòi hỏi của phần lớn các nước nghèo nằm trong vùng dịch. Những yêu cầu này hiện đều có thể đạt được với các công nghệ sản xuất vắcxin hiện nay. Cho đến nay, tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào công bố liên quan đến việc nghiên cứu vắcxin dengue. Là một trong những công ty hàng đầu trong lĩnh vực sản xuất vắcxin, Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1, Bộ Y Tế hiện đã tiến hành các nghiên cứu sản xuất vắcxin dengue với công nghệ tiên tiến.

Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ