Luận văn thạc sĩ hus xây dựng và đánh giá hệ thống chủng giống cho nghiên cứu phát triển vắc xin sốt xuất huyết dengue

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus xây dựng và đánh giá hệ thống chủng giống cho nghiên cứu phát triển vắc xin sốt xuất huyết, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Hoàng Anh Đức
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Tuấn Đạt
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Xây dựng và đánh giá hệ thống chủng giống cho nghiên cứu phát triển vắcxin sốt xuất huyết dengue
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đặc điểm dịch tễ học về bệnh sốt xuất huyết dengue
• 1.2. Tình hình mắc sốt xuất huyết dengue trên thế giới
• 1.3. Tình hình mắc sốt xuất huyết dengue tại Việt Nam
• 1.4. Virút dengue – tác nhân gây bệnh
• 1.4.1. Đặc điểm phân loại
• 1.4.2. Cấu trúc phân tử và thành phần chức năng
• 1.4.3. Quá trình lắp ráp và trưởng thành của virút
• 1.4.4. Sự sao chép ARN virút
• 1.5. Nguồn bệnh và đường lây truyền bệnh sốt dengue
• 1.5.1. Vector truyền bệnh
• 1.5.2. Sự lây truyền của virút dengue
• 1.6. Các biện pháp phòng ngừa dịch bệnh
• 1.7. Cơ chế bệnh sinh
• 1.7.1. Các yếu tố nguy cơ dẫn đến sốt xuất huyết dengue
• 1.7.2. Miễn dịch đối với nhiễm virút dengue
• 1.8. Vắcxin phòng chống dengue
• 1.8.1. Vắcxin sống giảm độc lực
• 1.8.2. Vắcxin bất hoạt toàn virút
• 1.8.3. Vắcxin tiểu đơn vị tái tổ hợp
• 1.8.4. Vắcxin nuleic và vector sống
• 1.8.5. Tình hình nghiên cứu và phát triển vắcxin dengue trên thế giới
• 1.8.6. Nghiên cứu vắcxin dengue tại Việt Nam
• 1.8.7. Các triển vọng vắcxin dengue trong tương lai
• 1.9. Đặc điểm chủng dengue do viện sức khỏe Hoa Kỳ nghiên cứu và phát triển
• 1.9.1. Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN4
• 1.9.2. Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN1
• 1.9.3. Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN2
• 1.9.4. Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN3
• 1.10. Xây dựng ngân hàng chủng gốc giống cho vắcxin dengue tại Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Tế bào Vero
• 2.2. Các chủng virút dengue tái tổ hợp
• 2.3. Môi trường nuôi cấy và các dung dịch trong nghiên cứu
• 2.4. Các hóa chất và sinh phẩm
• 2.5. Dụng cụ và trang thiết bị
• 2.6. Phương pháp
• 2.6.1. Phương pháp cấy chuyển tế bào Vero từ điều kiện bảo quản và nhân số lượng tế bào Vero trên chai nuôi một lớp
• 2.6.2. Phương pháp gây nhiễm và nuôi cấy virút dengue trên tế bào
• 2.6.3. Phương pháp thu hoạch virút dengue sau gây nhiễm
• 2.6.4. Phương pháp chuẩn độ virút dengue bằng tạo đám hoại tử
• 2.6.5. Phương pháp nhuộm miễn dịch đám hoại tử
• 2.6.6. Phương pháp thử vô khuẩn
• 2.6.7. Phương pháp xác định trình tự genome virút dengue
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Xây dựng quy trình gây nhiễm và nuôi cấy các chủng dengue trên chai nuôi cấy một lớp
• 3.1.1. Liều gây nhiễm virút dengue trên tế bào Vero
• 3.1.2. Nhiệt độ và môi trường nuôi cấy virút
• 3.1.3. Quy trình sản xuất các chủng virút dengue gốc giống
• 3.2. Sản xuất các chủng virút gốc giống
• 3.2.1. Gây nhiễm chủng virút dengue trên tế bào Vero
• 3.2.2. Thu hoạch chủng virút dengue trên tế bào Vero
• 3.2.3. Đánh giá chất lượng các chủng gốc giống
• 3.2.3.1. Đánh giá hiệu giá virút
• 3.2.3.2. Đánh giá bộ gen của các chủng gốc giống virút dengue
• 3.2.3.3. Đánh giá tính ổn định hiệu giá virút qua các đời nuôi cấy
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu vắc xin sốt xuất huyết dengue

Nghiên cứu và phát triển vắc xin sốt xuất huyết dengue (SXHD) đang trở thành một trong những ưu tiên hàng đầu trong lĩnh vực y tế công cộng. Bệnh SXHD do virus dengue gây ra, lây truyền qua muỗi Aedes aegypti, đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng tại nhiều quốc gia, đặc biệt là ở khu vực Đông Nam Á. Việc xây dựng hệ thống chủng giống cho vắc xin là bước đầu tiên và quan trọng trong quá trình phát triển vắc xin hiệu quả. Hệ thống này không chỉ giúp kiểm soát virus mà còn đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của vắc xin trong cộng đồng.

1.1. Đặc điểm dịch tễ học của bệnh sốt xuất huyết dengue

Bệnh sốt xuất huyết dengue đã xuất hiện từ lâu và ngày càng gia tăng về số lượng ca mắc. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm có khoảng 50-100 triệu ca mắc bệnh trên toàn cầu. Tại Việt Nam, bệnh này đã trở thành một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nhập viện ở trẻ em. Sự gia tăng này chủ yếu do sự phát triển đô thị hóa, thay đổi khí hậu và sự gia tăng mật độ dân số.

1.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin dengue trên thế giới

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để phát triển vắc xin phòng chống bệnh sốt xuất huyết dengue. Các loại vắc xin đang được thử nghiệm bao gồm vắc xin sống giảm độc lực và vắc xin bất hoạt. Tuy nhiên, việc phát triển một loại vắc xin hiệu quả và an toàn vẫn còn nhiều thách thức.

II. Vấn đề và thách thức trong phát triển vắc xin sốt xuất huyết dengue

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu vắc xin, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua. Một trong những vấn đề lớn nhất là sự tồn tại của bốn týp huyết thanh virus dengue, mỗi týp có đặc điểm kháng nguyên khác nhau. Điều này làm cho việc phát triển một loại vắc xin có khả năng bảo vệ toàn diện trở nên khó khăn. Ngoài ra, các phản ứng phụ có thể xảy ra sau khi tiêm vắc xin cũng là một mối quan tâm lớn.

2.1. Sự đa dạng của các týp huyết thanh virus dengue

Virus dengue có bốn týp huyết thanh khác nhau (DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4), mỗi týp có khả năng gây bệnh khác nhau. Việc phát triển vắc xin cần phải đảm bảo rằng nó có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch đối với tất cả các týp này.

2.2. Các phản ứng phụ và an toàn của vắc xin

Một trong những thách thức lớn trong phát triển vắc xin là đảm bảo tính an toàn. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng một số vắc xin có thể gây ra phản ứng phụ nghiêm trọng, làm giảm lòng tin của cộng đồng vào vắc xin.

III. Phương pháp xây dựng hệ thống chủng giống cho vắc xin dengue

Xây dựng hệ thống chủng giống là một bước quan trọng trong quá trình phát triển vắc xin. Hệ thống này bao gồm việc tạo ra các chủng virus giảm độc lực từ các chủng hoang dại. Các chủng này sẽ được sử dụng để phát triển vắc xin an toàn và hiệu quả. Quy trình này bao gồm nhiều bước, từ việc nuôi cấy tế bào đến việc thu hoạch và đánh giá chất lượng các chủng virus.

3.1. Quy trình nuôi cấy và sản xuất chủng virus

Quy trình nuôi cấy tế bào Vero là bước đầu tiên trong việc sản xuất các chủng virus dengue. Tế bào Vero được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu virus do khả năng sinh sản tốt và dễ dàng nuôi cấy. Sau khi nuôi cấy, virus sẽ được gây nhiễm vào tế bào để sản xuất số lượng lớn.

3.2. Đánh giá chất lượng và tính ổn định của chủng giống

Sau khi thu hoạch, các chủng virus sẽ được đánh giá về chất lượng và tính ổn định. Việc này bao gồm kiểm tra hiệu giá virus và phân tích trình tự gen để đảm bảo rằng các chủng virus không bị biến đổi trong quá trình nuôi cấy.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu vắc xin dengue

Kết quả nghiên cứu về vắc xin dengue đã cho thấy nhiều triển vọng. Các chủng virus được phát triển đã cho thấy khả năng giảm độc lực và tạo ra đáp ứng miễn dịch tốt. Việc ứng dụng các công nghệ hiện đại trong sản xuất vắc xin sẽ giúp tăng cường hiệu quả và an toàn cho người sử dụng. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng vắc xin có thể giúp giảm thiểu số ca mắc bệnh và tử vong do sốt xuất huyết dengue.

4.1. Kết quả thử nghiệm lâm sàng vắc xin dengue

Các thử nghiệm lâm sàng đã cho thấy vắc xin dengue có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch bền vững. Tuy nhiên, cần tiếp tục theo dõi để đánh giá hiệu quả lâu dài của vắc xin trong cộng đồng.

4.2. Triển vọng ứng dụng vắc xin trong cộng đồng

Việc triển khai vắc xin dengue trong cộng đồng sẽ giúp giảm thiểu sự lây lan của bệnh. Các chiến dịch tiêm chủng cần được thực hiện đồng bộ và hiệu quả để đạt được kết quả tốt nhất.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu vắc xin dengue

Nghiên cứu và phát triển vắc xin sốt xuất huyết dengue đang ở giai đoạn quan trọng. Mặc dù còn nhiều thách thức, nhưng với sự nỗ lực của các nhà khoa học và tổ chức y tế, hy vọng rằng một loại vắc xin hiệu quả sẽ sớm được đưa vào sử dụng. Điều này không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe cộng đồng mà còn góp phần vào việc kiểm soát dịch bệnh trên toàn cầu.

5.1. Tương lai của nghiên cứu vắc xin dengue

Tương lai của nghiên cứu vắc xin dengue phụ thuộc vào việc giải quyết các thách thức hiện tại. Các công nghệ mới và phương pháp nghiên cứu sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển vắc xin an toàn và hiệu quả.

5.2. Vai trò của cộng đồng trong việc phòng chống bệnh

Cộng đồng cần được nâng cao nhận thức về bệnh sốt xuất huyết dengue và tầm quan trọng của việc tiêm vắc xin. Sự tham gia của cộng đồng sẽ giúp tăng cường hiệu quả của các chương trình phòng chống bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Sốt xuất huyết dengue là bệnh truyền nhiễm cấp tính do virút dengue gây ra qua trung gian truyền bệnh là muỗi Aedes aegypti, phân bố rộng khắp các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, mỗi năm toàn cầu ghi nhận khoảng 50 đến 100 triệu ca nhiễm, đe dọa trực tiếp cuộc sống của 2,5 tỷ người (tương đương 40% dân số thế giới). Khoảng 500.000 trường hợp sốt xuất huyết nặng cần nhập viện mỗi năm với tỷ lệ tử vong trung bình khoảng 2,5%, chủ yếu tập trung ở trẻ em. Tại Việt Nam, dịch bệnh diễn biến vô cùng phức tạp qua nhiều thập kỷ; điển hình là vụ dịch lịch sử năm 1998 ghi nhận 324.866 ca mắc và 384 ca tử vong trên 57 tỉnh thành, và năm 2010 bùng phát với 128.710 ca bệnh.

Các biện pháp phòng chống thụ động như phun hóa chất diệt muỗi và xử lý lăng quăng chỉ mang lại hiệu quả ngắn hạn, tốn kém kinh phí và không thể khống chế triệt để nguồn lây. Tiêm phòng vắc xin tứ liên có khả năng kích thích miễn dịch đồng thời chống lại cả 4 týp huyết thanh virút (DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4) được xác định là giải pháp căn cơ và bền vững nhất. Đề tài luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành Vi sinh vật học được thực hiện tại Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) phối hợp với Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội nhằm giải quyết bài toán cấp thiết này.

Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu là xây dựng quy trình nuôi cấy, thiết lập ngân hàng 06 chủng giống virút dengue dự tuyển (chuyển giao từ Viện Sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ - NIH/NIAID) trên tế bào Vero đạt tiêu chuẩn sản xuất, đồng thời đánh giá tính ổn định về hiệu giá sinh học và cấu trúc di truyền. Thành công của nghiên cứu tạo nền tảng công nghệ quyết định để Việt Nam tự chủ sản xuất vắc xin dengue giá thành hợp lý, phục vụ cộng đồng và giảm thiểu gánh nặng y tế quốc gia.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Cơ sở khoa học của đề tài được xây dựng trên nền tảng sinh học phân tử virút học và miễn dịch học sốt xuất huyết:

• Đặc điểm cấu trúc phân tử virút dengue: Virút dengue thuộc chi Flavivirus, họ Flaviviridae, sở hữu bộ gen ARN sợi đơn dương kích thước khoảng 10.600 nucleotide. Bộ gen mã hóa cho một polyprotein duy nhất gồm 3 protein cấu trúc (Capsid - C, tiền màng - prM/M, vỏ - E) và 7 protein không cấu trúc (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). Protein E đóng vai trò thụ thể gắn kết tế bào và là đích kháng nguyên chính kích thích cơ thể sinh kháng thể trung hòa.
• Hiện tượng miễn dịch tăng cường bệnh (ADE - Antibody-Dependent Enhancement): Sau khi nhiễm một týp huyết thanh tiên phát, cơ thể tạo kháng thể trung hòa suốt đời với týp đó nhưng chỉ có kháng thể bảo vệ chéo tạm thời (khoảng 2-3 tháng) với các týp còn lại. Khi nhiễm thứ phát một týp virút khác, phức hợp kháng thể - virút không được trung hòa hoàn toàn mà bám vào thụ thể Fcγ trên bạch cầu đơn nhân, làm tăng khả năng xâm nhập và nhân lên của virút, kích hoạt cơn bão cytokine dẫn đến thoát huyết tương, xuất huyết nặng và sốc.
• Chiến lược giảm độc lực bằng công nghệ DNA tái tổ hợp: Nghiên cứu áp dụng các chủng virút tái tổ hợp được làm giảm độc lực có chủ đích bằng kỹ thuật di truyền ngược: đột biến mất đoạn 30 nucleotide (Δ30) tại vùng 3’-UTR (vị trí 172-143) hoặc cấu trúc dạng khảm (chimeric). Đột biến mất đoạn tạo tính ổn định di truyền vượt trội, ngăn ngừa nguy cơ đột biến hồi biến thành chủng độc lực hoang dại so với phương pháp làm yếu bằng cấy chuyển đời truyền thống.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng hệ thống vật liệu sinh học chuẩn hóa quốc tế và các quy trình phân tích vi sinh nghiêm ngặt:

• Đối tượng và vật liệu: 06 chủng virút dengue sống giảm độc lực tái tổ hợp gồm rDEN1Δ30, rDEN2/4Δ30(ME), rDEN3Δ30/31, rDEN3-3’D4Δ30, rDEN4Δ30, và rDEN4Δ30-200,201 từ Viện Dị ứng và Bệnh nhiễm trùng Quốc gia Hoa Kỳ (NIAID/NIH). Vật chủ nuôi cấy là dòng tế bào thường trực Vero đời thứ 137, bắt nguồn từ ngân hàng tế bào chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO).
• Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu: Thu hoạch và đóng gói 200 ống giống gốc cho mỗi chủng virút (tổng số 1.200 ống chủng). Mẫu phân tích được chọn ngẫu nhiên có hệ thống ở tỷ lệ 5% từ các lô sản xuất để kiểm định các chỉ tiêu vi sinh và sinh học phân tử.
• Quy trình và phương pháp phân tích:
  • Xác định hiệu giá virút: Phương pháp chuẩn độ tạo đám hoại tử (Plaque Forming Unit - PFU/ml) kết hợp kỹ thuật nhuộm miễn dịch (Immunostaining) sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu týp và cơ chất True Blue. Đây là phương pháp tiêu chuẩn vàng giúp đếm chính xác số lượng hạt virút sống có khả năng gây nhiễm.
  • Kiểm tra tính vô trùng: Thử nghiệm trên môi trường Thioglycollate lỏng (ủ ở 35°C phát hiện vi khuẩn) và Soybean-casein digest (ủ ở 22-25°C phát hiện nấm) theo Dược điển.
  • Kiểm định độ ổn định di truyền: Tách chiết ARN virút bằng bộ kit High Pure Viral RNA, thực hiện RT-PCR khuếch đại toàn bộ bộ gen và giải trình tự nucleotide trực tiếp bằng máy giải trình tự tự động ABI. Phương pháp này đảm bảo phát hiện chính xác từng đột biến điểm và xác nhận sự bảo toàn của các đoạn mất gen giảm độc lực.
• Thời gian và địa điểm: Nghiên cứu tiến hành liên tục trong giai đoạn 2012-2014 tại Phòng Công nghệ cao, Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình khảo sát điều kiện công nghệ và đánh giá chất lượng hệ thống chủng giống đã mang lại các kết quả nổi bật:

• Tối ưu hóa thành công thông số nuôi cấy virút: Đã xác định được liều gây nhiễm (MOI - Multiplicity of Infection) tối ưu từ 0,01 đến 0,1 PFU/tế bào. Nuôi cấy ở nhiệt độ 35°C mang lại hiệu suất nhân lên của virút cao hơn 15-25% so với nuôi cấy ở 37°C hoặc 32°C. Môi trường không huyết thanh chuyên dụng OptiPRO SFM hỗ trợ tế bào duy trì trạng thái ổn định và cho hiệu giá virút tương đương môi trường truyền thống bổ sung 10% FBS, giúp loại bỏ nguy cơ tạp nhiễm protein ngoại lai từ huyết thanh động vật.
• Thiết lập thành công ngân hàng chủng gốc giống quy chuẩn: Đã sản xuất và thu hoạch hoàn chỉnh lô chủng gốc giống gồm 200 ống cho mỗi chủng trong 06 chủng virút tái tổ hợp. Hiệu giá virút thu được sau tinh chế đạt mức cao vượt trội, dao động từ $10^{5,8}$ đến $10^{6,5}$ PFU/ml, đáp ứng hoàn toàn tiêu chuẩn nguyên liệu đầu vào cho sản xuất vắc xin quy mô lớn.
• Đảm bảo độ sạch và độ an toàn sinh học tuyệt đối: 100% mẫu kiểm tra từ ngân hàng chủng giống đều đạt độ vô trùng tuyệt đối, không có sự hiện diện của vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí hay vi nấm sau 14 ngày nuôi cấy theo dõi.
• Tính ổn định di truyền và sinh học bền vững: Khi cấy chuyển liên tục qua 3 đến 5 đời (P1 đến P5) trên tế bào Vero, hiệu giá của cả 06 chủng virút biến thiên không quá 0,3 log10 PFU/ml. Kết quả giải mã trình tự toàn bộ bộ gen ARN (khoảng 10.600 bp) cho thấy các đột biến then chốt như đoạn mất 30 nucleotide tại vùng 3’-UTR hoàn toàn ổn định, tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide so với chủng chuẩn ban đầu của NIH đạt từ 99,9% đến 100%, không ghi nhận bất kỳ đột biến dịch khung hay đột biến hồi biến nào có thể làm tăng độc lực.

Thảo luận kết quả

Các kết quả thực nghiệm chứng minh rằng việc áp dụng công nghệ nuôi cấy tế bào một lớp kết hợp kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ và môi trường đã giải quyết được thách thức lớn trong nhân nuôi virút dengue sống giảm độc lực. Khác với các dòng virút hoang dại dễ gây độc tế bào ồ ạt, các chủng tái tổ hợp mang đột biến mất đoạn vùng 3'-UTR có tốc độ sao chép chậm hơn, đòi hỏi quy trình thu hoạch đúng thời điểm khi lớp tế bào đạt độ phân giải tối ưu (ngày thứ 5 đến ngày thứ 7 sau gây nhiễm).

Số liệu nghiên cứu có thể được trực quan hóa qua biểu đồ động học nhân lên của virút theo thời gian (thể hiện nồng độ virút đạt đỉnh sau 120-144 giờ) và bảng so sánh trình tự nucleotide giữa các đời cấy chuyển. Sự tương thích cao của các chủng virút rDEN1Δ30, rDEN2/4Δ30(ME), rDEN3Δ30/31, rDEN3-3’D4Δ30, rDEN4Δ30, và rDEN4Δ30-200,201 trên dòng tế bào Vero đời 137 cho thấy công nghệ này hoàn toàn có thể mở rộng quy mô từ chai nuôi cấy một lớp sang các hệ thống nuôi cấy mật độ cao (như bình xoay Roller Bottle hoặc hệ thống giá mang vi hạt Microcarrier trong Bioreactor). Điều này có ý nghĩa quyết định trong việc giảm chi phí sản xuất và hạ giá thành liều vắc xin khi phân phối tại các nước đang phát triển.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả thiết lập ngân hàng chủng giống, các đề xuất thực thi cụ thể được đưa ra nhằm phục vụ giai đoạn phát triển sản phẩm tiếp theo:

• Nâng cấp quy mô sản xuất lên hệ thống Bioreactor 10 - 50 lít: Chuyển đổi công nghệ nuôi cấy từ chai một lớp sang hệ thống lên men sinh học mật độ cao sử dụng giá mang vi thể (microcarrier) trong giai đoạn 2015-2018. Chủ thể thực hiện là Phòng Công nghệ cao - VABIOTECH, nhằm mục tiêu tăng sản lượng virút gấp 5-10 lần trên một đơn vị diện tích nuôi cấy.
• Chuẩn hóa quy trình kiểm định chất lượng theo chuẩn WHO: Xây dựng bộ tiêu chuẩn cơ sở và thẩm định quy trình kiểm tra theo Dược điển Việt Nam và Hướng dẫn WHO TRS 978 đối với vắc xin dengue sống giảm độc lực trong vòng 12 tháng, bảo đảm 100% các lô bán thành phẩm đạt chỉ tiêu vô trùng, hàm lượng protein tồn dư và tính đồng nhất kháng nguyên.
• Hoàn thiện công thức phối trộn vắc xin tứ liên: Nghiên cứu tỷ lệ phối trộn tối ưu giữa 4 týp virút (tỷ lệ liều từ $10^3$ đến $10^5$ PFU cho từng týp) trước năm 2017 nhằm hạn chế hiện tượng ức chế miễn dịch chéo giữa các týp, đảm bảo tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh đồng đều trên 80% đối với cả 4 týp huyết thanh sau 1-2 liều tiêm.
• Triển khai đánh giá tiền lâm sàng trên mô hình động vật: Tiến hành thử nghiệm tính sinh miễn dịch và tính an toàn trên mô hình chuột SCID-HuH-7 và khỉ Rhesus trong giai đoạn 2016-2018 do nhóm nghiên cứu VABIOTECH phối hợp với các viện nghiên cứu chuyên ngành thực hiện, hướng tới cấp phép thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 trên người.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình luận văn này cung cấp hàm lượng tri thức thực tiễn và học thuật phong phú, đặc biệt hữu ích cho 4 nhóm đối tượng:

• Học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học: Tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp phân lập, nuôi cấy, chuẩn độ virút tạo đám hoại tử (PFU), kỹ thuật nhuộm miễn dịch và phân tích di truyền hệ gen virút ARN.
• Kỹ sư R&D và chuyên gia sản xuất tại các nhà máy vắc xin sinh phẩm: Cung cấp thông số công nghệ chi tiết, tiêu chí kiểm soát quy trình nhân giống trên tế bào Vero, quy trình vô trùng và tiêu chuẩn lưu trữ ngân hàng chủng gốc âm sâu từ -70°C đến -80°C.
• Chuyên gia dịch tễ học và cán bộ y tế dự phòng: Cung cấp bức tranh toàn diện về sinh bệnh học, động học kháng thể trung hòa, cơ chế ADE và diễn biến dịch tễ sốt xuất huyết tại Việt Nam và trên thế giới.
• Giảng viên các trường Đại học Y Dược và Khoa học Tự nhiên: Giáo trình thực tiễn phục vụ giảng dạy chuyên đề vi sinh học phân tử, vắc xin tái tổ hợp và công nghệ nuôi cấy tế bào động vật.

Câu hỏi thường gặp

• Tại sao vắc xin sốt xuất huyết bắt buộc phải phòng được cả 4 týp huyết thanh virút?
  Bởi vì nhiễm một týp virút chỉ tạo miễn dịch lâu dài với týp đó. Khi nhiễm lần hai với týp khác, hiện tượng tăng cường miễn dịch phụ thuộc kháng thể (ADE) sẽ tạo điều kiện cho virút nhân lên ồ ạt, dễ dẫn đến thể bệnh nặng như sốt xuất huyết có sốc hoặc tử vong. Vắc xin tứ liên cân bằng giúp ngăn chặn hoàn toàn nguy cơ này.
• Đột biến mất đoạn $\Delta 30$ tại vùng 3'-UTR có vai trò gì trong chủng vắc xin?
  Đoạn mất 30 nucleotide (vị trí 172-143) tại vùng không dịch mã 3'-UTR làm giảm khả năng sao chép của ARN virút trong tế bào vật chủ, từ đó làm giảm mạnh độc lực nhưng vẫn giữ nguyên cấu trúc protein kháng nguyên E, kích thích hệ thống miễn dịch tạo kháng thể trung hòa đầy đủ và không bị đột biến hồi biến.
• Tại sao dòng tế bào Vero được lựa chọn làm vật chủ nuôi cấy chủng virút?
  Tế bào Vero từ thận khỉ xanh châu Phi ở đời cấy chuyển 137 là dòng tế bào liên tục đã được Tổ chức Y tế Thế giới chuẩn hóa, chứng minh an toàn tuyệt đối không gây ung thư, không chứa tạp nhiễm retrovirus và hỗ trợ nhân nuôi flavivirus với hiệu giá cao từ $10^{5,8}$ đến $10^{6,5}$ PFU/ml.
• Phương pháp chuẩn độ đám hoại tử nhuộm miễn dịch có ưu điểm gì so với phương pháp TCID50?
  Phương pháp tạo đám hoại tử nhuộm miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho phép đếm trực tiếp từng đơn vị virút lây nhiễm (PFU) trên đĩa nuôi cấy 24 giếng, phát hiện được các đám hoại tử nhỏ của chủng virút giảm độc lực mà mắt thường không thể quan sát rõ, mang lại độ nhạy và độ chính xác cao hơn 30%.
• Lợi ích kinh tế - xã hội lớn nhất khi Việt Nam tự chủ sản xuất vắc xin dengue là gì?
  Chủ động nguồn cung vắc xin với chi phí ước tính chỉ bằng 30-50% so với vắc xin nhập khẩu, giúp hàng triệu người dân, đặc biệt là trẻ em thuộc các vùng lưu hành dịch, được tiếp cận vắc xin phòng ngừa sớm, giảm hàng trăm tỷ đồng chi phí điều trị và kiểm soát vector hàng năm.

Kết luận

• Xây dựng thành công quy trình nuôi cấy chuẩn cho 06 chủng virút dengue sống giảm độc lực tái tổ hợp (rDEN1Δ30, rDEN2/4Δ30(ME), rDEN3Δ30/31, rDEN3-3’D4Δ30, rDEN4Δ30, rDEN4Δ30-200,201) trên tế bào Vero đời 137.
• Thiết lập hoàn chỉnh ngân hàng chủng gốc giống đạt chuẩn với 200 ống/chủng, hiệu giá sinh học cao từ $10^{5,8}$ đến $10^{6,5}$ PFU/ml và vô trùng 100%.
• Chứng minh độ ổn định di truyền vượt trội qua 3-5 đời cấy chuyển, bảo toàn nguyên vẹn cấu trúc đột biến giảm độc lực $\Delta 30$ với độ tương đồng gen đạt 99,9% - 100%.
• Đặt nền tảng công nghệ sinh học phân tử vững chắc cho công cuộc nghiên cứu, pha chế vắc xin tứ liên và thử nghiệm tiền lâm sàng tại Việt Nam trong giai đoạn tiếp theo.
• Khai mở hướng đi tự chủ vắc xin phòng chống sốt xuất huyết tại các nước đang phát triển, tạo tiền đề để các đơn vị sản xuất sinh phẩm y tế tiến hành các bước thử nghiệm lâm sàng và ứng dụng thực tiễn trên diện rộng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm dịch tễ học về bệnh sốt xuất huyết dengue 1.1 Tình hình mắc sốt xuất huyết dengue trên thế giới Những báo cáo đầu tiên về một căn bệnh với các triệu chứng được mô tả tương tự bệnh sốt dengue/sốt xuất huyết dengue (SD/SXHD) đã được thông báo vào năm 1779 tại Batavia (Jakacta- Indonesia) và Cairo (Ai cập). Từ đó, các vụ dịch tương tự đã xuất hiện trở lại tại các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tác nhân gây bệnh sốt xuất huyết (SXH) chưa được biết cho đến tháng 5 năm 1945 khi Alber Sabin phân lập được virút dengue (DEN) lần đầu tiên từ những người lính [7]. Sau đó nhiều chủng virút dengue được phân lập từ các vùng khác nhau trên thế giới và tính kháng nguyên đều được định dạng vào một trong 4 týp huyết thanh DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4 [4,17,37].

Nước có nguy cơ mắc bệnh Hình 1. Các nước/khu vực có nguy cơ lây nhiễm virút dengue năm 2008. [46] Dengue là bệnh do muỗi lan truyền nhanh nhất thế giới. Trong vòng 50 năm trở lại đây, các ca nhiễm bệnh đã tăng 30 lần cùng với sự mở rộng địa lý đến các 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] nước mới và từ vùng nông thôn đến thành thị [46].

Đến nay, dịch đã xuất hiện tại trên 100 quốc gia ở Đông Nam Á, Tây Thái Bình Dương, khu vực Trung Đông, Châu Phi, và Châu Mỹ (Hình 1). Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) ước tính có 2.5 tỉ người trên thế giới hiện đang sống trong vùng lưu hành dịch. Mỗi năm có khoảng 50 đến 100 triệu người mắc bệnh, 500.000 trường hợp SXHD cần nhập viện (Hình 2) , phần lớn trong số đó là trẻ em với tỉ lệ tử vong chung vào khoảng 2,5% [46]. Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương là những khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề nhất.

Dịch lan sang các vùng mới và tăng lên ở các vùng đã bị ảnh hưởng trước đó.333 trường hợp nhiễm dengue đã được báo cáo tại Campuchia, Malaysia, Philippines và Việt Nam - 4 nước trong khu vực Tây Thái Bình Dương với tỉ lệ nhiễm và tử vong cao nhất (theo báo cáo chính thức số tử vong ở cả 4 nước là 4. Về mặt lịch sử, SD hay xảy ra giữa vùng đô thị và vùng ven đô nơi có mật độ dân cư cao dễ lây truyền bệnh. Tuy nhiên, các bằng chứng từ các dịch bùng phát gần đây như Campuchia năm 2007 cho thấy bệnh đang dần xuất hiện cả các khu vực nông thôn [44, 46]. Năm 2003, 8 nước – Bangladesh, Ấn độ, Indonesia, Maldives, Myanmar, Srilanka, Thailand và Timor-Leste đã báo cáo về dịch SD/SXHD [46].

Mức độ nghiêm trọng của SD/SXHD có thể thấy tại một số quốc gia qua các báo cáo năm 2007: - Indonesia có 150 000 trường hợp mắc bệnh, tỉ lệ tử vong khoảng 1%. - Myanmar từ tháng 1 đến tháng 9 năm 2007 có 9578 trường hợp, tỉ lệ tử vong hơn 1%. - Tại Thái Lan, SD xuất hiện ở cả 4 vùng miền trên cả nước, từ tháng 1 đến tháng 11 có 58 836 trường hợp mắc bệnh, tỉ lệ tử vong dưới 0. Dịch SD/SXHD cũng đã lây truyền khắp các quốc đảo Thái Bình Dương.

Từ năm 2001 đến 2008, các quốc đảo Thái Bình Dương bị ảnh hưởng mạnh nhất là French Polynesia (35 869 trường hợp), New Caledonia (6 836 trường hợp), Cook Islands (3 735 trường hợp), American Samoa (1.816 trường hợp) và Liên bang 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tổng số người chết được báo cáo chính thức ở 6 đảo này là 34 [46]. bệnhVABIOTECH Số nước mắc Số ca mắc Hình 2.