MỞ ĐẦU Lý do chon đề tài Cúm là một bệnh hô hấp cấp tính do vi rút RNA gây ra thuộc họ Orthomyxoviridae và lây truyền chủ yếu qua các giọt bắn do ho và hắt hơi bởi những người bị nhiễm bệnh. Bệnh cúm rất phổ biến trong cộng đồng và phân bố rộng khắp toàn cầu, gây bệnh cho cộng đồng và có khả năng bùng phát thành đại dịch mang tính toàn cầu như đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918, do vi rút cúm A/H1N1 gây tử vong khoảng 40-50 triệu người; đại dịch cúm năm 1968, do vi rút cúm A/H3N2 phát hiện ban đầu ở Hồng Kông sau đó lan rộng sang Hoa Kỳ và nhiều châu lục khác, ước tính gây tử vong khoảng một triệu người trên toàn thế giới [1]. Đặc trưng của vi rút cúm là tỷ lệ đột biến cao, dẫn đến sự xuất hiện của các biến thể kháng nguyên mới với khả năng lẩn tránh khỏi hệ thống miễn dịch được tạo ra bởi các loại vắc xin hoặc quá trình nhiễm bệnh trước đó. Vì vậy, tạo điều kiện cho vi rút cúm dễ dàng lây truyền từ người sang người [2].
Bệnh cúm có thể phòng ngừa bằng vắc xin và tiêm vắc xin trở thành chiến lược hiệu quả nhất để phòng ngừa và kiểm soát nhiễm vi rút cúm mùa, đồng thời giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong liên quan đến cúm [3]. Tuy nhiên, thành phần kháng nguyên được lựa chọn của vắc xin không phải lúc nào cũng phù hợp với các chủng vi rút đang lưu hành. Hiện nay, hai phân nhóm cúm A (A/H1N1 và A/H3N2) và hai dòng cúm B (B/Victoria và B/Yamagata) đã lưu hành trên toàn thế giới, trong khi vắc xin cúm thương mại ba chủng chứa hai phân nhóm A nhưng chỉ có một dòng cúm B (B/Victoria hoặc B/Yamagata). Do vậy, các vắc xin này có hạn chế về khả năng tạo đáp ứng miễn dịch.
Trong mùa cúm từ năm 2001 - 2002 và 2010 - 2011, dòng cúm B lưu hành chủ yếu là khác với dòng được chọn cho vắc xin. Do đó, hiệu quả của các chiến dịch tiêm phòng cúm mùa bị hạn chế trong việc chống lại dịch cúm B mà một tỷ lệ đáng kể bệnh do các chủng cúm B khác dòng gây ra. Năm 2012, WHO và FDA khuyến cáo cần phải có vắc xin cúm bốn chủng, chứa chủng cúm A/H1N1, A/H3N2 và chủng cúm B dòng B/Victoria và B/Yamagata, nhằm cải thiện khả năng bảo vệ chống lại vi rút cúm B và giảm tỷ lệ mắc bệnh cúm B. Chính vì vậy, với nền tảng công nghệ sản xuất vắc xin cúm mùa ba chủng trên trứng gà có phôi hiện có, IVAC đã triển khai nghiên 9 cứu phát triển sản phẩm vắc xin cúm mùa bốn chủng.
Trong đó, đề tài “Nghiên cứu quy trình phối trộn vắc xin cúm mùa bốn chủng dạng mảnh ở quy mô sản xuất thử nghiệm” là một phần trong dự án nghiên cứu này. Mục đích nghiên cứu Xây dựng được quy trình phối trộn vắc xin cúm mùa bốn chủng dạng mảnh tại IVAC với các chủng cúm A/H1N1, A/H3N2 và hai chủng cúm B/Victoria và B/Yamagata. Ứng dụng quy trình đã xây dựng vào sản xuất ở quy mô thử nghiệm và đánh giá chất lượng lô sản phẩm theo tiêu chuẩn của WHO/ DĐVN. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu ứng dụng, phát triển công nghệ đối với các vắc xin khác hiện đang được nghiên cứu tại IVAC.
Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu khẳng định sự thành công của quy trình sản xuất vắc xin cúm mùa bốn chủng, tạo tiền đề quan trọng cho IVAC tiếp tục nâng quy mô phát triển sản xuất và thương mại hóa sản phẩm. Nội dung nghiên cứu - Thiết lập tiêu chuẩn cho nguyên liệu nước cốt cúm mùa đơn chủng A/H1N1, chủng A/H3N2, chủng cúm B/Victoria và B/Yamagata. - Đánh giá tính tương thích giữa các thành phần cúm A/H1N1, A/H3N2, cúm B/Victoria, B/Yamagata và khả năng tương tác chéo giữa các chủng cúm. - Xây dựng quy trình phối trộn.
- Sản xuất thử 3 lô vắc xin cúm mùa bốn chủng dạng mảnh ở quy mô 10.000 liều/lô với quy trình đã xây dựng và đánh giá chất lượng sản phẩm theo tiêu chuẩn của WHO/DĐVN. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. TỔNG QUAN VỀ VI RÚT CÚM 1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại chung, có 3 phân nhóm huyết thanh A, B và C trong đó vi rút cúm A được chia thành nhiều phân tuýp (type) dựa trên kháng nguyên bề mặt ngưng kết hồng cầu Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA), vi rút cúm A có khả năng đột biến cao.1: Hình thái cấu trúc vi rút cúm Nguồn: doi.1038/s41572-018-0002-y [4] Vi rút cúm (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 - 120 nm.
Cấu tạo hạt vi rút gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm. Trên bề mặt có các HA và NA mang bản chất kháng nguyên và khác nhau giữa các type vi rút và các chủng (subtype). Kháng thể của kháng nguyên HA là yếu tố quyết định chủ yếu sự miễn dịch đối với vi rút cúm, trong khi những kháng thể của kháng nguyên NA giới hạn sự lây truyền và góp phần làm giảm nhiễm vi rút. Bộ gen vi rút cúm A và B gồm 8 phân đoạn RNA riêng biệt được sắp xếp theo thứ tự (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS) có 890 - 2341 nucleotid, mã hoá các protein cấu trúc và phi 11 cấu trúc (Hình 1.
Vi rút cúm A là loại có khả năng biến đổi kháng nguyên bề mặt mạnh nhất bằng cách biến đổi cấu trúc kháng nguyên HA và NA, có 16 loại HA (từ H1 đến H16) và 9 loại NA (từ N1 đến N9) tức là có tất cả 144 tập hợp các loại vi rút cúm A. Nhờ bộ gen nhiều phân đoạn giúp vi rút có khả năng biến đổi cấu trúc kháng nguyên để tạo thành chủng vi rút cúm mới. Lệch/trượt kháng nguyên (antigenic shift) và trộn/trôi kháng nguyên (antigenic driff) là hai kiểu thay đổi kháng nguyên của vi rút cúm. Lệch/trượt kháng nguyên là sự thay đổi di truyền quan trọng do sự tái tổ hợp gen giữa các chủng khác nhau tạo ra.
Trộn/trôi kháng nguyên là do đột biến ngẫu nhiên xảy ra ở gen mã hóa cho HA dẫn đến sự thay đổi một số acid amin trong protein HA [5], [6]. Vi rút cúm A có nhiều chủng gây bệnh cho người và động vật trong đó có những chủng có khả năng lây nhiễm cao, gây bệnh nặng hoặc dẫn tới tử vong như A/H1N1, A/H5N1, A/H3N2… Khác với cúm A, vi rút cúm B ít biến đổi cấu trúc kháng nguyên hoặc tương tác chéo kháng nguyên giữa hai dòng thấp nên thường gây ra các bệnh cúm thông thường, diễn biến nhẹ và tản phát, có thể gây ra các vụ dịch do bản thân nó hoặc kết hợp với các vi rút gây viêm đường hô hấp khác. Các bệnh do vi rút cúm C hiếm xảy ra [5], [6], [7]. Vi rút cúm lây truyền theo đường hô hấp, người mắc bệnh hít phải các giọt nhỏ chứa vi rút được phát tán từ đường hô hấp của người đang mắc bệnh hoặc từ gia cầm nhiễm bệnh sang người… Hiện nay, chưa có đủ cơ sở để khẳng định có sự lây truyền từ người sang người của một số chủng vi rút cúm như cúm A/H5N1 và A/H7N9, tuy nhiên điều này hoàn toàn có thể xảy ra và khi đó nguy cơ lan rộng dẫn đến đại dịch gây nguy hiểm cho cộng đồng.
Bệnh cúm có khả năng lây nhiễm cao với tất cả mọi người, đặc biệt ở người lớn và trẻ em tỷ lệ có thể lên tới 90% với các chủng vi rút cúm mới. Sau khi bị bệnh, cơ thể sẽ tạo ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với chủng vi rút gây nhiễm. Thời gian miễn dịch phụ thuộc vào mức độ biến đổi kháng nguyên và số lần bị nhiễm trong quá khứ. Miễn dịch thu được sau khi khỏi bệnh không bảo vệ được khỏi mắc các biến chủng khác của vi rút cúm.
Trẻ em, người già, người đang mắc các bệnh mãn tính, suy giảm miễn dịch thường dễ cảm nhiễm hơn những người khác [6], [8]. Tính chất kháng nguyên Hemagglutinin và Neuraminidase là hai kháng nguyên đóng vai trò quan trọng, thể hiện độc tính của vi rút cúm. Hemagglutinin (HA): HA là một glycoprotein gồm 1.778 nucleotide mã hóa cho 562 - 566 axit amin, hình nấm, nhô ra từ màng lipid của vi rút, phía ngoài có tán hình cầu. HA có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của các động vật máu nóng.
HA mang tính chất kháng nguyên có khả năng gắn vào thụ thể đặc hiệu của tế bào chủ. Protein HA có hình trụ, cấu tạo gồm 2 đơn phân (monomer) là HA1 (36 kDa) là phần tự do chứa vị trí gắn vào thụ thể thích hợp trên bề mặt màng của tế bào đích và HA2 (27 kDa) gắn vào mặt ngoài capsid. HA1 và HA2 liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Trong một số nghiên cứu gần đây cho thấy, tốc độ tiến hóa ở vùng đầu của HA nhanh hơn vùng thân và vùng gốc khi nghiên cứu về sự tiến hóa của các phân đoạn HA trên cúm H1N1, H3N2 và cúm B.
Kháng thể kháng vùng thân HA có khả năng tương tác chéo giữa các vi rút cúm A, kể cả tương tác chéo với vi rút cúm B [11], [12], [13]. Enzyme neuraminidase (NA): NA là một glycoprotein, có dạng nút lồi hình cây trên bề mặt vỏ của vi rút cúm. NA có hai phần: phần phía ngoài gồm 4 monomer hình cầu trên cùng mặt phẳng, vùng còn lại là vùng kỵ nước gắn vào màng vi rút. NA có chức năng phân cắt axít sialic bằng cắt các liên kết glycoside nối nhóm keto với D-glactose hoặc D-glactosesamine của axít neuraminic.
Phản ứng này cho phép vi rút vượt qua lớp niêm dịch để tới được các tế bào biểu mô của đường hô hấp trong quá trình nhiễm trùng. Đồng thời việc loại bỏ axít neuraminic của phân tử NA giúp các vi rút mới được tổng hợp phóng thích ra ngoài tế bào và gia tăng khả năng gây nhiễm trùng. Vi rút cúm có 9 phân tuýp NA, được kí hiệu từ N1 đến N9. Cho đến nay, các vụ dịch xảy ra ở người được xác định chỉ có N1, N2 [9], [10].
TỔNG QUAN VỀ VẮC XIN CÚM 1. Sự phát triển của vắc xin cúm Cách đây gần 90 năm vào năm 1933, vi rút cúm lần đầu tiên được phân lập đã làm tiền đề cho sự phát triển của các loại vắc xin sau này. Đầu tiên là 13 vắc xin sống giảm độc lực, sau đó là vắc xin cúm bất hoạt một chủng (chủng cúm A).