Luận văn thạc sĩ về quy trình nuôi trồng Cordyceps militaris với hàm lượng cordycepin cao

• Tác giả: Phạm Thị Loan
• Người hướng dẫn: Nguyễn Thị Minh Hằng
• Trường học: Trường Đại học Lâm nghiệp
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Quy Trình Nuôi Trồng Cordyceps Militaris Đạt Hàm Lượng Cordycepin Cao
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Tổng quan về Đông trùng hạ thảo
• 1.2. Nguồn gốc và phân loại
• 1.3. Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên
• 1.4. Cấu tạo hình thái của một số loài nấm thuộc chi Cordyceps
• 1.5. Cơ chế xâm nhiễm vào ký chủ của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris
• 1.6. Giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris
• 1.7. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển nấm Cordyceps militaris
• 1.8. Tình hình nghiên cứu Đông trùng hạ thảo
• 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu nghiên cứu
• 2.4. Địa điểm nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả ảnh hưởng giá thể gạo nuôi trồng Đông trùng hạ thảo
• 3.2. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng Cacbon đến khả năng sinh trưởng và phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris
• 3.3. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng Nito đến khả năng sinh trưởng và phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris
• 3.4. Kết quả ảnh hưởng của nguồn muối khoáng đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hàm lượng Cordycepin của nấm Cordyceps militaris
• 3.5. Kết quả ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi trồng đến sinh trưởng, phát triển và hàm lượng Cordycepin của nấm Cordyceps militaris
• 3.6. Kết quả nghiên cứu các phương pháp sấy quả thể Cordyceps militaris
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về Cordyceps militaris

Cordyceps militaris, một loại nấm thuộc chi Cordyceps, nổi bật với khả năng sinh sản và phát triển trên cơ thể côn trùng, đặc biệt là ấu trùng. Nấm này không chỉ được biết đến trong y học cổ truyền mà còn trong nghiên cứu hiện đại nhờ vào hàm lượng cao của các hợp chất sinh học, trong đó có cordycepin. Cordycepin (3-deoxyadenosine) là một nucleoside có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và ức chế tế bào ung thư. Việc nuôi trồng Cordyceps militaris trên giá thể nhân tạo đã mở ra cơ hội mới cho việc sản xuất dược liệu này một cách bền vững, giảm áp lực khai thác từ tự nhiên. Sự phát triển của Cordyceps militaris trong môi trường nhân tạo không chỉ giúp tăng sản lượng mà còn nâng cao hàm lượng cordycepin, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường.

II. Quy trình nuôi trồng nấm Cordyceps militaris

Quy trình nuôi trồng Cordyceps militaris bắt đầu từ việc chọn giống và chuẩn bị giá thể. Các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng đều ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm. Nghiên cứu cho thấy rằng việc điều chỉnh hàm lượng dinh dưỡng trong giá thể có thể tăng cường khả năng sinh trưởng và hàm lượng cordycepin trong nấm. Các loại giá thể như gạo, ngô, và các loại tinh bột khác được sử dụng phổ biến trong quy trình này. Ngoài ra, các yếu tố môi trường như cường độ ánh sáng và nhiệt độ cũng cần được kiểm soát chặt chẽ để đạt được hiệu suất tối ưu. "Điều kiện nuôi trồng lý tưởng sẽ giúp nấm phát triển mạnh mẽ và gia tăng hàm lượng dược chất", một nghiên cứu đã chỉ ra.

2.1. Yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng

Yếu tố dinh dưỡng là một trong những yếu tố quyết định đến sự phát triển của Cordyceps militaris. Việc bổ sung các nguồn dinh dưỡng như carbon và nitơ có thể tác động tích cực đến sự hình thành quả thể và hàm lượng cordycepin. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, khi tăng cường hàm lượng nitơ, nấm có thể phát triển nhanh hơn và sản xuất nhiều chất dinh dưỡng hơn. "Cải thiện điều kiện dinh dưỡng sẽ tạo ra môi trường thuận lợi cho nấm phát triển", một chuyên gia trong lĩnh vực sinh học đã nhận định.

2.2. Điều kiện môi trường

Điều kiện môi trường nuôi trồng cũng đóng vai trò quan trọng trong quy trình sản xuất Cordyceps militaris. Nghiên cứu cho thấy rằng độ ẩm và nhiệt độ cần được duy trì ở mức ổn định để đảm bảo nấm phát triển tốt. "Nấm cần một môi trường ẩm ướt và mát mẻ để sinh trưởng", một nhà nghiên cứu đã nhấn mạnh. Việc kiểm soát cường độ ánh sáng cũng rất cần thiết, vì nó ảnh hưởng đến quá trình quang hợp và tổng hợp các hợp chất sinh học trong nấm.

III. Tác dụng và ứng dụng của cordycepin

Hợp chất cordycepin có nhiều tác dụng sinh học quý giá, bao gồm khả năng kháng viêm, kháng khuẩn và chống ung thư. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng cordycepin có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, đồng thời điều hòa miễn dịch hiệu quả. "Cordycepin có khả năng tác động lên nhiều cơ chế sinh học khác nhau, từ đó giúp cải thiện sức khỏe tổng thể", một bài báo khoa học đã nêu rõ. Sự phát triển và ứng dụng của cordycepin trong y học hiện đại đang thu hút sự quan tâm lớn từ các nhà khoa học và chuyên gia y tế.

3.1. Tác dụng dược lý

Nghiên cứu cho thấy cordycepin có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thông qua cơ chế kích hoạt apoptosis. Các nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh rằng việc sử dụng cordycepin có thể giúp cải thiện tình trạng sức khỏe của bệnh nhân ung thư. "Cordycepin là một trong những hợp chất có tiềm năng lớn trong việc phát triển các loại thuốc điều trị ung thư", một chuyên gia đã nhận định.

3.2. Ứng dụng trong y học

Với những tác dụng nổi bật, cordycepin đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong y học hiện đại. Các sản phẩm bổ sung chứa cordycepin đang ngày càng được ưa chuộng và có mặt trên thị trường. "Sự phát triển của các sản phẩm từ cordycepin không chỉ mang lại lợi ích cho sức khỏe mà còn mở ra hướng đi mới cho ngành dược phẩm", một nhà nghiên cứu đã chia sẻ.

Tổng quan nghiên cứu

Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) là một loại nấm quý thuộc lớp Ascomycetes, có giá trị dược liệu cao nhờ chứa nhiều hoạt chất sinh học như Cordycepin, Adenosine, Polysaccharides và các vitamin thiết yếu. Theo ước tính, nhu cầu sử dụng Đông trùng hạ thảo ngày càng tăng trong y học hiện đại và y học cổ truyền, trong khi nguồn cung tự nhiên chỉ đáp ứng được một phần nhỏ, dẫn đến nguy cơ suy giảm nguồn gen do khai thác quá mức. Nghiên cứu này tập trung vào việc phát triển quy trình nuôi trồng Cordyceps militaris trên giá thể nhân tạo thể rắn nhằm đạt hàm lượng Cordycepin cao, đáp ứng nhu cầu thị trường và bảo vệ nguồn gen tự nhiên.

Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu là xác định các điều kiện nuôi trồng tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cordyceps militaris, đồng thời tối ưu hóa phương pháp sấy quả thể để giữ được hàm lượng Cordycepin cao và chất lượng sản phẩm tốt. Nghiên cứu được thực hiện tại Công ty TNHH Thảo dược Vũ Gia, Hà Nội, trong khoảng thời gian từ tháng 10/2021 đến 10/2022. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả sản xuất Đông trùng hạ thảo nhân tạo, góp phần phát triển ngành công nghệ sinh học và thực phẩm chức năng tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết về sinh trưởng và phát triển của nấm Cordyceps militaris, tập trung vào các yếu tố dinh dưỡng và môi trường ảnh hưởng đến năng suất và hàm lượng hoạt chất Cordycepin. Hai mô hình chính được áp dụng gồm:

1. Mô hình dinh dưỡng nấm: Nghiên cứu vai trò của các nguồn dinh dưỡng như cacbon, nito và muối khoáng trong quá trình sinh trưởng và tổng hợp hoạt chất của nấm. Cacbon cung cấp năng lượng và vật chất cho quá trình trao đổi chất, chiếm khoảng 50% trọng lượng khô quả thể. Nito là thành phần thiết yếu cho tổng hợp acid nucleic và protein, ảnh hưởng đến sự phát triển và hàm lượng Cordycepin. Muối khoáng như KH₂PO₄ và MgSO₄·7H₂O đóng vai trò xúc tác enzyme và cân bằng ion trong tế bào.

2. Mô hình điều kiện môi trường nuôi trồng: Nhiệt độ, độ ẩm, cường độ ánh sáng và độ thoáng khí được xem là các yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển quả thể nấm. Nhiệt độ tối ưu cho giai đoạn hình thành quả thể là khoảng 21°C, độ ẩm từ 75-90%, cường độ ánh sáng 500 lux và độ thoáng khí tốt giúp quả thể phát triển đồng đều.

Các khái niệm chính bao gồm: sinh trưởng hệ sợi nấm, hình thành quả thể, hàm lượng Cordycepin, năng suất sinh học (biological efficiency), và phương pháp sấy thăng hoa.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính được thu thập từ hai chủng Cordyceps militaris (ký hiệu VGI và VG2) được cung cấp bởi Công ty TNHH Thảo dược Vũ Gia. Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm với các bước:

• Nhân giống cấp 1 và cấp 2: Sử dụng môi trường thạch và dịch thể bổ sung các nguồn dinh dưỡng như Pepton, Cao nấm men, Glucose, muối Kali và Magie. Cấy giống và nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, nhiệt độ 22°C, chiếu sáng 12 giờ/ngày.

• Nuôi trồng trên giá thể nhân tạo thể rắn: Giá thể gồm 40g gạo lứt Khang dân và 65 ml dung dịch dinh dưỡng với các biến thể về nguồn cacbon, nito và muối khoáng. Cấy giống cấp 2 lên giá thể, nuôi ở 22°C không chiếu sáng 3-7 ngày để phát triển hệ sợi, sau đó chuyển sang điều kiện chiếu sáng liên tục 500 lux, 21°C, độ ẩm 85% để tạo quả thể.

• Phân tích hàm lượng Cordycepin: Quả thể thu hoạch được sấy khô bằng các phương pháp sấy nhiệt, sấy lạnh và sấy thăng hoa. Hàm lượng Cordycepin được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

• Phân tích dữ liệu: Sử dụng phần mềm Excel 2016 để xử lý thống kê, đánh giá các chỉ số sinh trưởng, năng suất sinh học và hàm lượng Cordycepin.

Cỡ mẫu gồm nhiều hộp nhựa kích thước 9x9x9 cm, mỗi hộp chứa giá thể với các công thức dinh dưỡng khác nhau, được thực hiện theo thiết kế thí nghiệm đối chứng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Ảnh hưởng của loại gạo làm giá thể: Gạo lứt Khang dân và gạo lứt Huyết rồng cho kết quả sinh trưởng hệ sợi và hình thành quả thể tốt nhất, với thời gian bật mầm quả thể trung bình khoảng 5-7 ngày cho chủng VGI và 12-20 ngày cho chủng VG2. Gạo nếp cẩm cho kết quả kém nhất với hệ sợi phát triển không đồng đều và thời gian bật mầm quả thể lâu nhất.

2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon: Bổ sung 20 g/lít glucose làm tăng đáng kể số lượng quả thể, chiều dài quả thể và năng suất sinh học. Chủng VGI có số lượng quả thể trung bình 16,7 quả/hộp, chủng VG2 có chiều dài quả thể trung bình 7,4 cm, năng suất sinh học đạt khoảng 14,3%. Hàm lượng Cordycepin cao nhất đạt 3,9 mg/g khô khi sử dụng glucose, vượt trội so với các loại đường khác như sacarose, maltose.

3. Ảnh hưởng của nguồn nito: Bổ sung 20 g/lít bột nhộng tằm khô làm tăng năng suất sinh học và hàm lượng Cordycepin cao nhất, với giá trị lần lượt là 16,8% và 4,8 mg/g khô ở chủng VG2. Thời gian bật mầm quả thể ở chủng VG2 giảm 2 ngày so với nhóm chứng, cho thấy nhu cầu dinh dưỡng nito cao hơn chủng VGI.

4. Ảnh hưởng của muối khoáng: Sử dụng đồng thời KH₂PO₄ và MgSO₄·7H₂O với tỷ lệ 1:1 (1 g/lít mỗi loại) làm tăng chiều dài quả thể lên 6,1 cm và năng suất sinh học đạt 14,3% ở chủng VG2. Hàm lượng Cordycepin cũng tăng lên 3,95 mg/g khô, cao hơn so với việc bổ sung riêng lẻ từng loại muối khoáng.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc lựa chọn loại gạo làm giá thể ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ sinh trưởng và chất lượng quả thể nấm, phù hợp với đặc tính dinh dưỡng và độ xốp của từng loại gạo. Việc bổ sung glucose làm nguồn cacbon chính giúp cung cấp năng lượng hiệu quả cho quá trình sinh trưởng và tổng hợp Cordycepin, tương đồng với các nghiên cứu quốc tế.

Nguồn nito từ bột nhộng tằm khô, một nguyên liệu tự nhiên giàu protein, được hấp thu và chuyển hóa tốt hơn so với các nguồn nito tổng hợp, góp phần nâng cao năng suất và hàm lượng hoạt chất. Sự kết hợp muối khoáng KH₂PO₄ và MgSO₄·7H₂O tạo điều kiện tối ưu cho hoạt động enzyme và cân bằng ion trong tế bào, thúc đẩy sự phát triển quả thể và tổng hợp Cordycepin.

Phương pháp sấy thăng hoa được đánh giá cao trong việc bảo quản màu sắc, cấu trúc và hàm lượng Cordycepin của quả thể nấm, vượt trội so với sấy nhiệt và sấy lạnh. Các dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh năng suất sinh học và hàm lượng Cordycepin giữa các công thức dinh dưỡng và phương pháp sấy, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả của từng yếu tố.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng giá thể gạo lứt Khang dân trong nuôi trồng Cordyceps militaris để tối ưu hóa tốc độ sinh trưởng và chất lượng quả thể, với thời gian thực hiện từ 3-7 ngày cho giai đoạn phát triển hệ sợi.

2. Bổ sung 20 g/lít glucose làm nguồn cacbon chính trong dung dịch dinh dưỡng để tăng năng suất sinh học và hàm lượng Cordycepin, áp dụng trong toàn bộ quy trình nuôi trồng.

3. Sử dụng bột nhộng tằm khô với hàm lượng 20 g/lít làm nguồn nito bổ sung, giúp nâng cao hiệu quả sinh trưởng và tổng hợp hoạt chất, đặc biệt phù hợp với chủng VG2 có nhu cầu dinh dưỡng cao.

4. Kết hợp muối khoáng KH₂PO₄ và MgSO₄·7H₂O theo tỷ lệ 1:1 (1 g/lít mỗi loại) để cải thiện sự phát triển quả thể và hàm lượng Cordycepin, nên được áp dụng trong giai đoạn nuôi trồng quả thể.

5. Ưu tiên sử dụng phương pháp sấy thăng hoa để bảo quản sản phẩm Đông trùng hạ thảo, đảm bảo giữ nguyên màu sắc, cấu trúc và hàm lượng Cordycepin cao, với quy trình cấp đông sản phẩm đến -50°C và áp suất dưới 100 Pa.

Các giải pháp trên nên được thực hiện đồng bộ trong vòng 12 tháng để đạt hiệu quả tối ưu, do các đơn vị sản xuất và nghiên cứu công nghệ sinh học phối hợp triển khai.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp cơ sở khoa học và phương pháp thực nghiệm chi tiết về nuôi trồng nấm Cordyceps militaris, giúp phát triển các đề tài nghiên cứu liên quan đến dược liệu và công nghệ sinh học.

2. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng và dược liệu: Thông tin về quy trình nuôi trồng, tối ưu hóa hàm lượng Cordycepin và phương pháp bảo quản sản phẩm giúp nâng cao chất lượng và giá trị sản phẩm trên thị trường.

3. Các cơ sở nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo: Hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng trên giá thể nhân tạo thể rắn, lựa chọn nguyên liệu và điều kiện môi trường phù hợp để tăng năng suất và ổn định chất lượng sản phẩm.

4. Cơ quan quản lý và phát triển nông nghiệp công nghệ cao: Cung cấp dữ liệu khoa học để xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển ngành nuôi trồng nấm dược liệu, góp phần bảo tồn nguồn gen và phát triển bền vững.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn Cordyceps militaris thay vì Cordyceps sinensis?
   Cordyceps militaris dễ nuôi trồng trên môi trường nhân tạo, có thời gian sinh trưởng ngắn hơn và chứa hàm lượng Cordycepin tương đương hoặc cao hơn, giúp giảm chi phí sản xuất và mở rộng quy mô công nghiệp.

2. Nguồn dinh dưỡng nào quan trọng nhất trong nuôi trồng Cordyceps militaris?
   Nguồn cacbon (đặc biệt là glucose) và nguồn nito (bột nhộng tằm khô) đóng vai trò thiết yếu trong việc cung cấp năng lượng và nguyên liệu tổng hợp protein, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và hàm lượng Cordycepin.

3. Phương pháp sấy nào giữ được hàm lượng Cordycepin cao nhất?
   Phương pháp sấy thăng hoa được đánh giá là tối ưu nhất vì giữ nguyên cấu trúc, màu sắc và hàm lượng Cordycepin cao hơn so với sấy nhiệt và sấy lạnh, phù hợp cho bảo quản và thương mại.

4. Điều kiện môi trường nào ảnh hưởng nhiều nhất đến sự phát triển của nấm?
   Nhiệt độ khoảng 21°C, độ ẩm 75-90%, cường độ ánh sáng 500 lux và độ thoáng khí tốt là các điều kiện tối ưu giúp quả thể phát triển đồng đều và tổng hợp hoạt chất hiệu quả.

5. Làm thế nào để hạn chế hiện tượng thoái hóa giống nấm?
   Sử dụng giống phân lập từ đơn bào tử, duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng và hạn chế số lần chuyển thế giúp giảm đột biến DNA, duy trì sức sinh trưởng và năng suất ổn định của giống.

Kết luận

• Đã xác định được quy trình nuôi trồng Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt Khang dân với bổ sung 20 g/lít glucose, 20 g/lít bột nhộng tằm khô và muối khoáng KH₂PO₄, MgSO₄·7H₂O theo tỷ lệ 1:1, đạt hàm lượng Cordycepin tối thiểu 4,8 mg/g khô.
• Phương pháp sấy thăng hoa được tối ưu để bảo quản quả thể nấm, giữ nguyên màu sắc và hàm lượng hoạt chất.
• Chủng giống VGI và VG2 có đặc điểm sinh trưởng và nhu cầu dinh dưỡng khác nhau, cần lựa chọn phù hợp với điều kiện sản xuất.
• Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất Đông trùng hạ thảo nhân tạo, đáp ứng nhu cầu thị trường và bảo vệ nguồn gen tự nhiên.
• Đề xuất triển khai ứng dụng quy trình trong vòng 12 tháng, đồng thời tiếp tục nghiên cứu mở rộng quy mô và cải tiến kỹ thuật.

Hành động tiếp theo: Các đơn vị sản xuất và nghiên cứu công nghệ sinh học nên phối hợp triển khai quy trình nuôi trồng và bảo quản đã được tối ưu, đồng thời đào tạo kỹ thuật cho cán bộ và công nhân để nâng cao chất lượng sản phẩm Đông trùng hạ thảo trên thị trường.