Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1. Khái niệm Kỹ thuâ ̣t nuôi cấ y mô tế bào thực vâ ̣t mô tả các phương pháp nuôi cấ y các bô ̣ phâ ̣n thực vâ ̣t (tế bào đơn, mô, cơ quan…) trong điề u kiê ̣n vô trùng.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc - Dựa vào tính toàn năng của tế bào. - Dựa vào khả năng phân hóa và phản phân hóa. Ý nghĩa - Nhân nhanh giống cây trồ ng. - Bảo quản nguồ n gen.
- Ta ̣o cây sa ̣ch bê ̣nh. - Sản xuấ t các hoa ̣t chấ t sinh ho ̣c. - Mang tıń h công nghiê ̣p. Sơ lươ ̣c lich ̣ sử phát triể n Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua hơn 100 năm phát triển.
Ngày càng có nhiều ứng dụng và làm sáng tỏ lý thuyết về tính toàn năng của tế bào. Có thể thấy sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật luôn song song với lịch sử các ngành khoa học sự sống khác. Các giai đoạn chính của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật [1, 3, 7, 8]: - 1665: Robert Hooke quan sát đươ ̣c tế bào số ng dưới kı́nh hiể n vi và đưa ra khái niêm ̣ tế bào. - 1838: Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng ho ̣c thuyế t tế bào.
- 1898: Haberlandt là người đầu tiên đề xuất ra lý thuyết về tính toàn năng của tế bào, ông cũng là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm. Ông đã đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông: “Mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó”. Vì vậy, khi gặp 4 điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.
Haberlandt đã nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng chưa thành công. - 1904: Hannig nuôi cấ y phôi đầ u tiên ở các loài ho ̣ cải. - Đến năm 1922, Robbins và Kotte đã thành công trong nuôi cấy đầu rễ cây hòa thảo kéo dài 12 ngày trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng, glucose. - 1934: White (Mỹ) đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cây cà chua với môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men.
Sau đó ít lâu White đã chứng minh là có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Piridoxin (B6), axit nicotinic. Cùng năm, Gautheret thành công trong việc nuôi cấy mô tách từ mô tượng tầng của cây Salic apraea và cây Populus nigra. Mô nuôi cấy đã phân chia liên tục trong môi trường Knop bổ sung glucose và cysteinhyochloride. - 1937: Went và Thimann đã phát hiện ra chất sinh trưởng thực vật đầu tiên là axit β-indolaxetic (IAA) tác động lên quá trình phân chia tế bào và hình thành rễ.
- 1938: Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng với thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt trên môi trường thạch bằng cách cấy chuyển đều đặn 6 tuần/lần. - 1941: Overbeck (Mỹ) chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà. Trong thời gian này, nhiều chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm Auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công như: α-napthyl axetic axit (NAA), và 2,4-Dichlorophenoxy axetic axit (2,4-D). Nhiều tác giả đã nhận thấy cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy.
- 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan. - 1952: Morel và Martin thực hiêṇ vi ghép in vitro thành công. 5 - 1954: Skoog đã phát hiện ra Kinetin (6 furfuryl-amino-purin) là chất điều khiển quá trình phân bào và phân hóa chồi. Sau này người ta cũng tìm thấy Zeatin tách từ mầm ngô có hoạt tính tương tự Kinetin.
Cả 2 chất này đều thuộc nhóm Cytokinin. - 1960: Bergman đã phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn lên một bước mới là tạo được khối mô sẹo từ một tế bào đơn bằng kĩ thuật gieo trải tế bào thực vật trên đĩa thạch như trải tế bào vi sinh vật. Cũng năm 1960, Cooking đã dùng men cellulase để phân hủy cellulose của tế bào thực vật và thu được các tế bào trần (protoplast). - 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấ y tế bào thực vâ ̣t.
- 1964: Guha và Maheswari công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. - Bourgin và Nitsch (1967), Nakata (1968) tạo thành công cấy đơn bội từ bao phấn thuốc lá, mở ra nhiều triển vọng ứng dụng tạo cây đơn bội vào công tác giống và nghiên cứu di truyền. - 1969: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của Hapopappus gracilis. - 1971: Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast thuốc lá giống Xanthi.
- 1973: Phát hiện Cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas. - 1977: Melchers lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây. - 1978: Marton và cộng sự xây dựng quy trıǹ h chuyể n gen vào tế bào trầ n. - 1983: Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp.
- 1985: Cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố. - 1988: Klein và cộng sự tái sinh cây chuyể n gen bằ ng phương pháp bắ n gen. - 1994: Là năm đánh dấu cây cà chua đầu tiên (cà chua Flav’rSav’r) có mặt trên thị trường thực phẩm Hoa Kì. Cùng năm 1994, giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp được đưa vào sản xuất đại trà tại Na Uy.
6 Đến nay, đã có hàng trăm loài cây được nuôi cấy mô thành công với nhiều mục đích khác nhau như nhân nhanh, bảo tồn in vitro, nuôi cấy bao phấn… Đặc biệt, nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô và chuyển gen thông qua giai đoạn mô sẹo và tái sinh tạo chồi mà nhiều giống cây trồng chuyển gen đã được tạo ra (cà chua, lúa, đậu tương, khoai tây, bông, đu đủ…) [7]. Các bước chính trong nhân giống in vitro [7], [5] Theo George (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước sau: Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và đang ở giai đoạn sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng bệnh hợp lý sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng khi tra đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro.
Bước 2: Nuôi cấy khởi động Giai đoạn khử trùng mẫu, giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu như tỉ lệ mẫu nhiễm thấp, tăng tỉ lệ mẫu tái sinh, mô tồn tại, sinh trưởng và phát triển tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển tốt của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách, đỉnh chồi hoa và sau đó là đoạn thân, mảnh lá. Bước 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo phôi vô tính, tạo chồi bất định… Vấn đề là cần xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất.
Theo nguyên tắc chung, môi trường có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi (Auxin/Cytokinin < 1: thì kích thích tạo chồi), môi trường có nhiều Auxin sẽ kích thích tạo mô sẹo (Auxin/Cytokinin > 1: kích thích tạo mô sẹo). Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16h chiếu sáng/ngày, 7 cường độ ánh sáng 2000-3000lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy khác nhau đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau. Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi người ta cấy chuyển sang môi trường tạo rễ.
Môi trường tạo rễ thường được bổ sung thêm một lượng nhỏ Auxin. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay cả khi ta không bổ sung Auxin. Bước 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm Để đưa được cây ra bên ngoài vườn ươm phát triển tốt ta cần phải đảm bảo một số yêu cầu sau: - Cây đảm bảo về chiều cao, số rễ, số lá. - Giá thể phải tơi xốp, sạch sẽ, thoát nước tốt.
- Phải điều chỉnh độ ẩm, chế độ chiếu sáng vườn ươm, cũng như chế độ dinh dưỡng thích hợp. Môi trường nuôi cấy [2] Thành phầ n môi trường nuôi cấy gồ m các thành phầ n cơ bản sau: - Muối khoáng đa lượng - Muối khoáng vi lượng - Vitamin - Nguồn cacbon - Chất điều hòa sinh trưởng - Ngoài ra có thể bổ sung các thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men,. Môi trường nuôi cấ y có thể chia thành ba loa ̣i: - Môi trường nghèo dinh dưỡng: White, Knop. - Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg.
- Môi trường giàu dinh dưỡng: MS. Các chất điều hòa sinh trưởng [2] 1. Auxin Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật. IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn NAA, IBA, 8 2,4-D là các auxin nhân tạo, thường các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn.
Chúng có mặt ở các bộ phận của cây như mô phân sinh đỉnh, các bộ phận non khác của cây. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: - Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu. - Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy. - Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy.
- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh. - Đặc tính của auxin. Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin: - Kích thích phân chia và kéo dài tế bào. - Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên.
- Kích thích sự phân hoá của các mô dẫn. - Ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường.