Chương 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Bệnh cháy bìa lá lúa Bệnh cháy bìa lá lúa (bacterial blight of rice) hay còn gọi là bệnh bạc lá do vi khuẩn gây hại trên cây lúa, là một trong những loại bệnh gây hại thiệt hại nặng nề nhất đối với cây lúa. Trong những đợt dịch bệnh nghiêm trọng nhất có thể giảm năng suất vụ mùa lên tới 75%, hàng năm có hàng triệu ha lúa bị nhiễm bệnh [5]. Nguyên nhân gây bệnh được mô tả lần đầu từ năm 1884 – 1885 ở Kyushu, Nhật Bản.
Tác nhân gây bệnh được xác định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pathovar oryzae (gọi là Xoo), được định danh lần đầu tiên vào năm 1911 và đặt tên là Bacillus oryzae [6, 7]. Mầm bệnh phát triển mạnh trong môi trường ấm, ẩm ướt, bệnh cháy bìa lá lúa thường xuất hiện ở các vùng trồng lúa của châu Á , bờ biển tây Phi, Australia, Mỹ Latinh và vùng Caribe [8]. Dấu hiệu của bệnh xuất hiện rõ ràng là những vệt giống như thấm nước lan rộng từ ngọn và mép lá, vết bệnh lớn dần và cuối cùng có màu trắng đục, khô lại thành màu vàng (Hình 1. Vào giai đoạn cuối của bệnh, các vết bệnh màu trắng xám đặc trưng xuất hiện trên lá, lá bị khô và dẫn đến chết cây.
Cây lúa non nhiễm bệnh lá sẽ khô và héo, hội chứng bệnh được gọi là kresek. Cây non bị nhiễm bệnh thường chết trong vòng hai đến ba tuần sau khi bị nhiễm bệnh; cây trưởng thành vẫn có thể sống sót nhưng năng suất và chất lượng lúa sẽ bị giảm mạnh. Riêng tại Việt Nam, bệnh xuất hiện và gây hại trên ruộng lúa trải dài từ miền Bắc tới miền Nam, nhất là các vùng trồng lúa quan trọng ở đồng bằng sông Cửu Long, do việc thâm canh từ lâu cùng với canh tác các giống cao sản và tác động của các yếu tố gây stress làm tăng tỷ lệ nhiễm bệnh. Theo số liệu năm 2013, diện tích lúa bị nhiễm bệnh trên cả nước khoảng 135,4 nghìn ha.
Đến năm 2019, chỉ riêng diện tích lúa bị nhiễm bệnh của đồng bằng sông Cửu Long tới 50 – 60 nghìn ha gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nông dân [9]. Các triệu chứng của bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xoo trên (a) ở cây lúa trưởng thành; (b) ở trên luống ươm lúa; (c) ở cây lúa non [10]. Trong thời kỳ sinh trưởng, ruộng lúa luôn ngập nước, vi khuẩn Xoo có thể dễ dàng lây nhiễm, vi khuẩn di chuyển trong môi trường nước từ cây bị nhiễm bệnh sang rễ và lá của những cây lúa khỏe mạnh ở lân cận. Yếu tố gió có thể giúp việc lây lan nhanh chóng vi khuẩn Xoo sang các cánh đồng lúa khác.
Ngoài cây lúa, Xoo còn có thể lây nhiễm sang các cây khác như cỏ cắt lúa Leersia oryzoides, cỏ Leptochloa chinensis và nhiều loại cỏ dại thông thường khác. Sau vụ mùa thu hoạch, Xoo vẫn có thể tồn tại trong hạt lúa, rơm rạ, các thực vật khác, trong nước hoặc trong đất một thời gian ngắn. Vi khuẩn có thể xuất hiện ở khắp nơi trong môi trường trồng lúa tự nhiên. Vì thế, nhiều phương pháp khác nhau đã được phát triển để kiểm soát mầm bệnh từ trên đồng ruộng 4 nhưng các phương pháp phòng trừ bệnh vẫn còn có nhiều hạn chế.
Sử dụng hóa chất để kiểm soát không mang lại hiệu quả cao trong việc giảm thiểu bệnh cháy bìa lá lúa, mà còn mang lại các mối lo ngại về tính an toàn, có khả năng gây ô nhiễm môi trường, hiệu quả thực tiễn không cao và làm tăng khả năng kháng thuốc của vi khuẩn. Phương pháp phổ biến nhất để chống lại bệnh này là lai tạo ra các giống lúa có chứa gen kháng nhiễm Xoo. Trên 30 gen kháng đã được tìm thấy trong cây lúa, chẳng hạn như gene Xa21 đã được tích hợp vào bộ gen của nhiều dòng lúa thương phẩm. Những giống lúa kháng bệnh này phần lớn đã thành công, giúp giảm đáng kể thiệt hại ở nhiều nước sản xuất lúa gạo.
Ngoài ra, những năm gần đây các phương pháp kiểm soát sinh học như ứng dụng thực khuẩn thể để bảo vệ, chống lại vi khuẩn gây bệnh cho cây lúa có thể làm giảm bệnh cháy bìa lá lúa, và được đánh giá là một phương pháp an toàn, có khả năng ứng kiểm soát rộng rãi [11].2 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae thuộc chi Xanthomonas là các vi khuẩn hình que với hai đầu tròn với chiều dài từ 0,8 – 1 µm và chiều rộng từ 0,4 – 0,7 µm, có một tiên mao ở một đầu và có màng nhầy bao bọc. Khuẩn lạc trên môi trường Growth Factor agar (GF) tròn, nhỏ, màu vàng và sáng bóng và trên mXOS các khuẩn lạc có màu hồng hồng đặc trưng, sáng và nhầy (Hình 1.
Nhiệt độ phát triển tối ưu của Xoo là từ 25 – 30oC và giới hạn nhiệt độ là từ 5 – 40oC [4, 12]. Con đường xâm nhiễm chủ yếu của Xoo vào trong cây lúa là thông qua các thủy khổng ở mép lá, các vết thương, khí khổng hoặc từ hạt giống chứa mầm bệnh và nhân lên ở biểu mô trước khi tăng sinh mạnh trong mạch xylem và lan truyền khắp nơi trong cây và gây ra hiện tượng cháy lá [13]. Năng suất cây lúa nhiễm bệnh cháy bìa lá do Xoo giảm mạnh do hai nguyên nhân sau: lá bị khô héo làm giảm diện tích lá xanh, giảm sự khả năng thu nhận ánh sáng; gây khô tắc mạch xylem làm giảm sự vận chuyển nước nên khả năng quang hợp của cây giảm mạnh [14]. Xoo có thể tồn tại trong đất khoảng hai tháng, trong nước khoảng 15 ngày hoặc trên hạt giống hoặc rơm rạ.
Do đó, đây có thể là các nguồn lưu trữ và lan truyền mầm bệnh từ vụ này qua vụ khác [14, 4]. Vi khuẩn Xoo xâm nhiễm và gây bệnh cho tất cả các giai 5 đoạn sinh trưởng và phát triển của cây lúa từ giai đoạn cây non cho đến giai đoạn lúa chín, tuy nhiên bệnh đạt đỉnh và gây hại nặng nhất trong giai đoạn trổ bông. Khi vi khuẩn xâm nhiễm và gây bệnh trong giai đoạn đẻ nhánh và giai đoạn ra hoa sẽ gây giảm mạnh năng suất [14, 12].2 A: Khuẩn lạc của Xoo trên môi trường GF; B: khuẩn lạc của Xoo trên môi trường thạch mXOS [10]. Nghiên cứu thực khuẩn thể lây nhiễm trên Xanthomonas oryzae pv.
oryzae Một số thực khuẩn thể (phage) lây nhiễm Xoo đã được mô tả từ lâu, trước đây Wakimoto (1960) đã phân loại phage lây nhiễm Xoo thành hai loại OP1 và OP2, dựa 6 trên các đặc điểm về hình thái học. Những năm gần đây các loại phage Xoo khác biệt về mặt hình thái như: Xp10, Xp20 và Xp12 được phân lập ở Đài Loan, đã được giải trình tự và phân tích sâu hơn [11]. Các phage chỉ có thể lây nhiễm cho một loài vi khuẩn và không thể lây nhiễm các loài vi khuẩn khác, do có sự khác biệt trong các thụ thể bề mặt của tế bào vi khuẩn. Điều này là một lợi thế cho việc sử dụng phage như một phương pháp kiểm soát sinh học vi khuẩn gây bệnh mà không ảnh hướng đến các vi khuẩn có lợi khác.
Tuy nhiên việc sử dụng phage còn một số lo ngại về khả năng chuyển gen của phage, cho nên việc phân tích genome của phage để đảm bảo tính an toàn trước khi ứng dụng là rất cần thiết. Thực khuẩn thể xuất hiện đa dạng trong nhiều môi trường khác nhau và một số loài có khả năng kiểm soát các bệnh do vi khuẩn gây ra [15]. Những năm gần đây, nhiều phương pháp khác nhau đã được nghiên cứu và phát triển để kiểm soát mầm bệnh bằng cách sử dụng một thực khuẩn thể đơn lẻ hoặc nhiều thực khuẩn thể [16]. Hiện tại đang có nhiều nghiên cứu trên thế giới để phân lập một phage mới trên Xoo (bảng 1.
Sử đụng thực khuẩn thể có nhiều lợi thế để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn cũng như ứng dụng vào các kỹ thuật công nghệ sinh học khác.1 Các quốc gia có nghiên cứu phân lập các thể thực khuẩn xâm nhiễm Xoo Quốc gia phân lập Phage Họ (Family) Trung Quốc Xop41 Siphoviridae Trung Quốc Xoo-sp1,Xoo-sp2, Xoo-sp3, Siphoviridae Xoo-sp4. Trung Quốc X1, X2, X3, X4, X5 Myoviridae Trung Quốc Xoo-sp14, Xoo-sp13 Myoviridae Đài Loan Xp10, Xp12, Xp20 Siphoviridae Hàn Quốc P8L, P27L, P30L, P59L, P73L Siphoviridae Philippines XPP1, XPP2 … Myoviridae Ấn Độ φXOF1, φXOF2 … Siphoviridae Ấn Độ φXOT1, φXOT2 Siphoviridae 7 Phá hủy cấu trúc màng sinh học rất quan trọng trong kiểm soát khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Thực khuẩn thể X3 làm giảm 53% quá trình tổng hợp sản xuất exopolysaccharide và giảm 43% sự tổng hợp màng sinh học ở vi khuẩn Xoo. Phun phage X3 lên lá và hạt lúa trước khi mầm bệnh xâm nhập làm tăng khả năng không bị bệnh lên 83,1% và 95,4%.
Phage X3 có phổ ký chủ rộng ( 22 trong số 23 chủng Xoo được thử nghiệm) và thời gian tiềm tan dài 40 phút với hệ số nhân là 50 pfu/tế bào [18]. Nghiên cứu về phage lysin như một biện pháp kiểm soát sinh học cho các mầm bệnh gây ra bởi Xanthomonas còn ít được nghiên cứu. Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng phage lysozyme, Lys411, được mã hóa bởi bộ gen thực khuẩn thể ϕXo411 để kiểm soát Xoo, có thể ly giải các chủng Xanthomonas , làm cho protein trở thành ứng cử viên có tiềm năng kiểm soát các bệnh thực vật do Xanthomonas gây ra [19]. Sự lây nhiễm giữa phage - vi khuẩn gây ra những thay đổi phân tử trong đó có sự methyl hóa DNA, sự phosphoryl hóa quá trình phiên mã.
Khi xâm nhiễm vào vi khuẩn Xoo, thực khuẩn thể Xp12 gây ra quá trình sinh tổng hợp bất thường ở base 5- methylcytosine, thay thế tất cả các gốc cytosine trong DNA của Xp12. Các base còn lại: adenine, thymine và guanine không thay đổi [20]. Quá trình methyl hóa DNA tạo ra các đặc tính vật lý và hóa học độc đáo cho DNA của Xp12, làm giảm tỷ trọng, tăng nhiệt độ nóng chảy của DNA. Các tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage Xp12 tạo ra một enzyme deoxycytidylate methyltransferase, xúc tác sự methyl hóa trực tiếp deoxycytidine monophosphate (dCMP) thành 5-methylcytosine, với sự hiện diện của axit tetrahydrofolic [21].
Sự biến đổi phân tử này giống như cơ chế điều hòa đặc hiệu của phage trong quá trình xâm nhiễm. Phage Xp10 lây nhiễm lên Xoo đã gây nên sự bất hoạt hoàn toàn của RNA polymerase vật chủ do sự phân ly của tiểu đơn vị δ khỏi lõi RNA polymerase của vật chủ.