Luận văn thạc sĩ: Ảnh hưởng của vật chủ nuôi cấy đến năng suất cordycepin và adenosine trong đông trùng hạ thảo cordyceps militaris

• Tác giả: Hoàng Phương Ly
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Văn Thắng
• Trường học: Trường Đại học Lâm nghiệp
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của vật chủ đến năng suất cordycepin và adenosine trong đông trùng hạ thảo
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về nấm Đông trùng hạ thảo
• 1.2. Phân loại, hình thái của DTHT C. militaris
• 1.3. Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo
• 1.4. Lược sử nghiên cứu
• 1.5. Vòng đời và cơ chế lây nhiễm của nấm Đông trùng hạ thảo vào cơ thể côn trùng
• 1.6. Thành phần hóa học và ứng dụng trong y học của C. militaris
• 1.7. Tác dụng của hoạt chất trong nấm Đông trùng hạ thảo
• 1.8. Các nghiên cứu về đông trùng hạ thảo
• 1.8.1. Trên tế bào
• 1.8.2. Tại Việt Nam
• 1.9. Năng suất và giá trị thương mại của nấm Đông trùng hạ thảo
• 1.10. Các kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo
• 1.10.1. Nuôi trong môi trường lỏng
• 1.10.2. Nuôi trên môi trường rắn tổng hợp
• 1.10.3. Nuôi trên ký chủ nhộng tằm
• 1.10.4. Nghiên cứu nuôi trồng tăng hoạt chất Cordycepin và Adenosine
• 2. CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mục tiêu chung
• 2.2. Mục tiêu cụ thể
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.4. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và máy móc nghiên cứu
• 2.5. Địa điểm nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Phương pháp tạo dung dịch giống sản xuất (giống cấp 2)
• 2.6.2. Xây dựng quy trình kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (C. militaris) trên ký chủ tằm dâu sống
• 2.6.3. Phương pháp nuôi trồng và đánh giá năng suất nấm Đông trùng hạ thảo (C. militaris) cấy trên các loại ký chủ
• 2.6.4. Phương pháp xác định hàm lượng Cordycepin và Adenosine bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
• 2.6.5. Phương pháp phân tích số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Xác định vị trí gây nhiễm trên cơ thể tằm dâu sống
• 3.2. Xác định thể tích dung dịch giống nấm gây nhiễm vào tằm dâu sống
• 3.3. Ảnh hưởng thời gian nuôi tối đến phát triển quả thể nấm
• 3.4. Kết quả lây nhiễm nấm vào ký chủ nhộng tằm dâu, nhộng tằm sắn, tằm dâu sống và bắp vô trùng
• 3.5. Đánh giá năng suất nấm mủi trên các vật chủ khác nhau
• 3.6. Kết quả xác định hàm lượng cordycepin và adenosine trong DTHT C. militaris trên ký chủ nhộng tằm dâu, nhộng tằm sắn và tằm dâu
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

I. Giới thiệu về Đông trùng hạ thảo

Đông trùng hạ thảo (ĐTHT) là một loại nấm ký sinh có giá trị dược liệu cao, đặc biệt là loài Cordyceps militaris. Loài nấm này được biết đến với khả năng sản xuất các hoạt chất sinh học như cordycepin và adenosine, rất quan trọng trong y học hiện đại. Nghiên cứu về ĐTHT đã chỉ ra rằng nó có thể hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý, bao gồm các bệnh liên quan đến hệ miễn dịch và ung thư. ĐTHT có nguồn gốc từ các vùng núi cao, nơi có điều kiện môi trường khắc nghiệt, nhưng hiện nay có thể được nuôi trồng nhân tạo. Sự phát triển của ĐTHT trên các vật chủ khác nhau có thể ảnh hưởng đến năng suất và hàm lượng các hoạt chất, từ đó mở ra hướng đi mới trong việc sản xuất dược liệu từ nấm này.

1.1. Tầm quan trọng của cordycepin và adenosine

Cordycepin và adenosine là hai hợp chất chính được chiết xuất từ ĐTHT. Cordycepin được biết đến với khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và có tác dụng chống viêm, trong khi adenosine có vai trò quan trọng trong việc điều hòa năng lượng trong cơ thể và có tác dụng bảo vệ tế bào. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tăng cường hàm lượng hai hoạt chất này trong ĐTHT có thể nâng cao giá trị dược lý của nó. Việc tìm kiếm các vật chủ nuôi cấy phù hợp cho ĐTHT là một trong những mục tiêu chính của nghiên cứu này, nhằm tối ưu hóa năng suất và chất lượng sản phẩm.

II. Ảnh hưởng của vật chủ đến năng suất ĐTHT

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc lựa chọn vật chủ nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến năng suất và hàm lượng cordycepin và adenosine trong ĐTHT. Các vật chủ khác nhau như nhộng tằm, nhộng sắn và các loại thực vật khác đã được thử nghiệm để xác định hiệu quả nuôi trồng. Kết quả cho thấy rằng nhộng tằm có khả năng cung cấp môi trường tốt nhất cho sự phát triển của ĐTHT, dẫn đến năng suất cao hơn so với các vật chủ khác. Sự tương tác giữa nấm và vật chủ không chỉ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng mà còn quyết định đến chất lượng của các hoạt chất sinh học được sản xuất.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến năng suất của ĐTHT, bao gồm điều kiện môi trường nuôi trồng, thời gian nuôi cấy, và loại vật chủ. Mỗi loại vật chủ có đặc tính riêng, ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng hấp thụ dinh dưỡng của nấm. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc điều chỉnh các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, và pH trong quá trình nuôi trồng có thể tối ưu hóa năng suất và hàm lượng hoạt chất. Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc nghiên cứu kỹ lưỡng các điều kiện nuôi trồng để đạt được hiệu quả tốt nhất trong sản xuất ĐTHT.

III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng hàm lượng cordycepin và adenosine trong ĐTHT đạt được từ các vật chủ khác nhau có sự chênh lệch rõ rệt. Cụ thể, hàm lượng cordycepin trong ĐTHT nuôi trên nhộng tằm cao hơn so với các loại vật chủ khác, điều này cho thấy nhộng tằm là lựa chọn tối ưu cho việc nuôi cấy ĐTHT. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của nấm và hàm lượng hoạt chất. Những phát hiện này không chỉ giúp nâng cao năng suất sản xuất ĐTHT mà còn mở ra hướng đi mới trong việc nghiên cứu và phát triển các sản phẩm dược liệu từ nấm.

3.1. Đánh giá thực tiễn và ứng dụng

Nghiên cứu này không chỉ mang lại giá trị khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn cao trong ngành dược phẩm. Việc tối ưu hóa quy trình nuôi trồng ĐTHT sẽ góp phần cung cấp nguồn nguyên liệu dồi dào cho ngành y học, đặc biệt là trong việc phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh. Ngoài ra, nghiên cứu cũng mở ra cơ hội cho các nhà sản xuất áp dụng công nghệ nuôi trồng hiện đại, từ đó nâng cao giá trị kinh tế và đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường về các sản phẩm từ ĐTHT.

Tổng quan nghiên cứu

Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) là một loại nấm dược liệu quý, chứa nhiều hoạt chất sinh học có giá trị như cordycepin và adenosine, được ứng dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và hiện đại. Theo ước tính, có hơn 700 loài Đông trùng hạ thảo trên thế giới, trong đó C. militaris được nuôi trồng phổ biến do khả năng sinh trưởng linh hoạt và hàm lượng hoạt chất cao, có thể tương đương hoặc vượt trội so với loài C. sinensis truyền thống. Nghiên cứu này tập trung vào ảnh hưởng của vật chủ nuôi cấy đến năng suất và hàm lượng hoạt chất cordycepin và adenosine trong nấm Đông trùng hạ thảo C. militaris.

Mục tiêu chính của luận văn là xây dựng quy trình kỹ thuật nuôi trồng C. militaris trên các loại ký chủ khác nhau như tằm dâu sống, nhộng tằm sắn và nhộng tằm hấp vô trùng, đồng thời đánh giá năng suất và hàm lượng hoạt chất trong quả thể nấm. Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công ty Cổ phần Dược liệu Hataco Việt Nam và Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp, trong năm 2023. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc tối ưu hóa quy trình nuôi trồng, nâng cao chất lượng sản phẩm và phát triển ngành công nghiệp dược liệu Đông trùng hạ thảo tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về sinh trưởng và phát triển của nấm ký sinh, đặc biệt là Cordyceps militaris, cùng với các khái niệm chính sau:

• Vòng đời và cơ chế lây nhiễm của Đông trùng hạ thảo: Nấm ký sinh trên cơ thể côn trùng, phát triển hệ sợi và hình thành quả thể qua các giai đoạn nuôi tối và nuôi sáng.
• Hoạt chất sinh học Cordycepin và Adenosine: Cordycepin là một nucleoside có hoạt tính kháng virus, chống viêm và hỗ trợ điều trị Covid-19; Adenosine tham gia vào quá trình sinh học quan trọng, có tác dụng bảo vệ tim mạch và làm đẹp da.
• Ảnh hưởng của vật chủ nuôi cấy đến năng suất và hàm lượng hoạt chất: Các loại ký chủ khác nhau ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm và hàm lượng cordycepin, adenosine trong quả thể.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính bao gồm các mẫu nấm C. militaris được nuôi cấy trên các loại ký chủ: tằm dâu sống, nhộng tằm sắn sống, nhộng tằm hấp vô trùng và tằm dâu hấp vô trùng. Cỡ mẫu mỗi thí nghiệm trên 30 cá thể, được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác.

Phương pháp phân tích gồm:

• Nuôi cấy và gây nhiễm nấm: Tiêm dung dịch giống nấm vào các vị trí khác nhau trên cơ thể ký chủ, theo dõi tỷ lệ nhiễm và phát triển hệ sợi nấm trong điều kiện nuôi tối và nuôi sáng.
• Đánh giá năng suất: Đo kích thước, số lượng và trọng lượng quả thể nấm sau các mốc thời gian 35, 40 và 50 ngày nuôi sáng.
• Phân tích hàm lượng hoạt chất: Sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định hàm lượng cordycepin và adenosine trong mẫu quả thể nấm.
• Phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm Excel để xử lý dữ liệu, tính toán tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ bật mầm quả thể, và các chỉ số năng suất.

Timeline nghiên cứu kéo dài trong năm 2023, bao gồm các giai đoạn chuẩn bị giống, gây nhiễm, nuôi trồng, thu thập mẫu và phân tích hóa học.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Vị trí tiêm dung dịch giống nấm ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm thành công: Tiêm vào phần miệng của tằm dâu sống cho tỷ lệ nhiễm thành công cao nhất, đạt 87,9%, trong khi tiêm vào đầu, thân hoặc đuôi chỉ đạt từ 40-61,6%.

2. Thể tích dung dịch giống tối ưu: Thể tích tiêm từ 75 µl đến 100 µl dung dịch giống nấm cho tỷ lệ nhiễm thành công cao nhất, từ 83,5% đến 87,6%. Thể tích nhỏ hơn hoặc lớn hơn làm giảm hiệu quả nhiễm nấm.

3. Ảnh hưởng thời gian nuôi tối đến phát triển quả thể: Nuôi tối từ 6-8 ngày trước khi chuyển sang nuôi sáng cho tỷ lệ bật mầm quả thể 100%, với số lượng quả thể trung bình 9,9-10,7 quả/con và chiều dài quả thể đạt 6,7-7,1 cm. Nuôi tối dài hơn 10 ngày làm giảm số lượng và kích thước quả thể.

4. Tỷ lệ nhiễm và phát triển hệ sợi nấm trên các loại ký chủ khác nhau: Nhộng tim dâu sống có tỷ lệ nhiễm nấm cao nhất 96,1% với thời gian hệ sợi ăn lan kín là 8 ngày; tằm dâu sống có tỷ lệ nhiễm 80,3% với thời gian 6 ngày; các ký chủ hấp vô trùng đều đạt tỷ lệ nhiễm 100% nhưng thời gian phát triển hệ sợi dài hơn (10-12 ngày).

5. Hàm lượng hoạt chất cordycepin và adenosine: Hàm lượng cordycepin trong quả thể nấm nuôi trên nhộng tằm dâu sống đạt khoảng 3,4 mg/g quả thể khô, cao hơn so với nuôi trên nhộng tằm sắn và tằm dâu hấp vô trùng, tương ứng giảm khoảng 15-25%. Hàm lượng adenosine cũng tương tự, dao động từ 1,8 đến 2,5 mg/g quả thể khô tùy loại ký chủ.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy vị trí tiêm dung dịch giống nấm vào phần miệng của tằm dâu sống là tối ưu do không gây tổn thương nhanh đến cơ thể ký chủ, tạo điều kiện cho hệ sợi nấm phát triển mạnh và ức chế vi sinh vật đường ruột. Thể tích dung dịch phù hợp giúp cân bằng giữa lượng nấm đủ để phát triển và tránh gây tổn thương quá mức.

Thời gian nuôi tối ảnh hưởng đến điều kiện nội môi của ký chủ, thời gian 6-8 ngày giúp hệ sợi nấm phát triển tốt trong khi vẫn giữ độ ẩm và dinh dưỡng cần thiết cho quả thể nấm phát triển khi chuyển sang nuôi sáng. Nuôi tối quá dài làm giảm độ ẩm và làm khô ký chủ, ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển quả thể.

So sánh với các nghiên cứu trước, tỷ lệ nhiễm và năng suất quả thể trên các ký chủ sống cao hơn so với ký chủ hấp vô trùng, do môi trường sống tự nhiên cung cấp dinh dưỡng và điều kiện sinh trưởng tốt hơn. Hàm lượng cordycepin và adenosine phụ thuộc vào loại ký chủ, với nhộng tằm dâu sống là vật chủ ưu việt nhất, phù hợp cho sản xuất dược liệu chất lượng cao.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột so sánh tỷ lệ nhiễm nấm và hàm lượng hoạt chất trên các ký chủ, cũng như bảng số liệu chi tiết về kích thước và số lượng quả thể theo thời gian nuôi.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng phương pháp tiêm dung dịch giống nấm vào phần miệng của tằm dâu sống để đạt tỷ lệ nhiễm nấm thành công cao, nâng cao năng suất sản phẩm. Thời gian thực hiện: ngay trong quy trình nuôi trồng hiện tại. Chủ thể thực hiện: các cơ sở nuôi trồng Đông trùng hạ thảo.

2. Điều chỉnh thể tích dung dịch giống tiêm trong khoảng 75-100 µl để tối ưu hóa sự phát triển của hệ sợi nấm và giảm thiểu tổn thương ký chủ. Thời gian thực hiện: trong giai đoạn gây nhiễm. Chủ thể thực hiện: kỹ thuật viên phòng thí nghiệm và nhà sản xuất.

3. Kiểm soát thời gian nuôi tối trong khoảng 6-8 ngày trước khi chuyển sang nuôi sáng nhằm đảm bảo điều kiện phát triển quả thể nấm tốt nhất, tăng số lượng và kích thước quả thể. Thời gian thực hiện: trong quy trình nuôi trồng. Chủ thể thực hiện: quản lý trang trại và kỹ thuật viên.

4. Ưu tiên sử dụng nhộng tằm dâu sống làm vật chủ nuôi cấy để nâng cao hàm lượng cordycepin và adenosine trong sản phẩm cuối cùng, đáp ứng yêu cầu chất lượng dược liệu cao cấp. Thời gian thực hiện: trong kế hoạch sản xuất dài hạn. Chủ thể thực hiện: nhà nghiên cứu và doanh nghiệp dược liệu.

5. Đầu tư trang thiết bị phân tích HPLC để kiểm soát chất lượng hoạt chất trong quá trình sản xuất, đảm bảo sản phẩm đạt tiêu chuẩn. Thời gian thực hiện: trong giai đoạn kiểm tra chất lượng. Chủ thể thực hiện: phòng thí nghiệm và doanh nghiệp.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Dược học: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực nghiệm về ảnh hưởng vật chủ đến năng suất và hoạt chất của Đông trùng hạ thảo, hỗ trợ phát triển đề tài liên quan.

2. Doanh nghiệp sản xuất và kinh doanh dược liệu Đông trùng hạ thảo: Áp dụng quy trình nuôi trồng tối ưu để nâng cao chất lượng sản phẩm, tăng giá trị thương mại và cạnh tranh trên thị trường.

3. Cơ quan quản lý và phát triển nông nghiệp, dược liệu: Tham khảo để xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển ngành nuôi trồng Đông trùng hạ thảo, thúc đẩy sản xuất bền vững và an toàn.

4. Người tiêu dùng và chuyên gia y tế: Hiểu rõ về nguồn gốc, quy trình sản xuất và chất lượng hoạt chất trong Đông trùng hạ thảo, từ đó lựa chọn sản phẩm phù hợp và an toàn cho sức khỏe.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn tiêm dung dịch giống nấm vào phần miệng của tằm dâu sống?
   Tiêm vào phần miệng giúp dung dịch giống nấm vào ruột tằm mà không gây tổn thương nhanh đến cơ thể, tạo điều kiện cho hệ sợi nấm phát triển mạnh và ức chế vi sinh vật đường ruột, nâng cao tỷ lệ nhiễm thành công lên đến 87,9%.

2. Thể tích dung dịch giống nấm tiêm ảnh hưởng thế nào đến kết quả nuôi trồng?
   Thể tích tiêm từ 75-100 µl là tối ưu, giúp cung cấp đủ lượng nấm để phát triển mà không gây tổn thương quá mức cho ký chủ. Thể tích nhỏ hơn hoặc lớn hơn làm giảm tỷ lệ nhiễm và hiệu quả phát triển nấm.

3. Thời gian nuôi tối bao lâu là phù hợp để phát triển quả thể nấm?
   Nuôi tối trong khoảng 6-8 ngày trước khi chuyển sang nuôi sáng là thời gian lý tưởng, giúp hệ sợi nấm phát triển tốt trong cơ thể ký chủ và kích thích quả thể nấm phát triển nhanh, đạt kích thước và số lượng cao.

4. Loại ký chủ nào cho năng suất và hàm lượng hoạt chất cao nhất?
   Nhộng tằm dâu sống là vật chủ ưu việt nhất, cho tỷ lệ nhiễm nấm cao (96,1%) và hàm lượng cordycepin, adenosine trong quả thể nấm cao hơn từ 15-25% so với các ký chủ khác như nhộng tằm sắn và tằm dâu hấp vô trùng.

5. Làm thế nào để xác định hàm lượng cordycepin và adenosine trong nấm?
   Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với cột ODS-C18 và detector PDA tại bước sóng 260 nm để phân tích mẫu chiết xuất từ quả thể nấm, cho kết quả chính xác về hàm lượng hoạt chất.

Kết luận

• Xác định vị trí tiêm dung dịch giống nấm vào phần miệng của tằm dâu sống là tối ưu với tỷ lệ nhiễm thành công cao nhất 87,9%.
• Thể tích dung dịch tiêm phù hợp là 75-100 µl, giúp cân bằng giữa phát triển nấm và bảo vệ ký chủ.
• Thời gian nuôi tối 6-8 ngày trước khi chuyển sang nuôi sáng cho năng suất quả thể và hàm lượng hoạt chất cao nhất.
• Nhộng tằm dâu sống là vật chủ ưu việt nhất cho nuôi trồng C. militaris, nâng cao hàm lượng cordycepin và adenosine.
• Nghiên cứu cung cấp quy trình kỹ thuật và dữ liệu khoa học quan trọng để phát triển sản xuất Đông trùng hạ thảo chất lượng cao tại Việt Nam.

Next steps: Áp dụng quy trình nuôi trồng tối ưu vào sản xuất quy mô công nghiệp, mở rộng nghiên cứu về các loại ký chủ khác và cải tiến kỹ thuật phân tích hoạt chất.

Call to action: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực dược liệu nên phối hợp triển khai ứng dụng kết quả nghiên cứu để nâng cao giá trị sản phẩm Đông trùng hạ thảo, góp phần phát triển ngành công nghiệp sinh học Việt Nam.