Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn tại Hà Nội

Vi khuẩn E. coli thuộc nhóm Verotoxigenic (VTEC) đã trở thành một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng trên toàn cầu. 132 trang · 2011.

• Trường học: Trường Đại Học
• Chuyên ngành: Vi Sinh Vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Tính Vi Khuẩn E. Coli VTEC Từ Bò Lợn Tại Hà Nội
• Loại tài liệu: Luận Án
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
• 2. Ý NGHĨA LÝ THUYẾT VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 3. HƯỚNG ĐÓN NHẬN CỦA LUẬN ÁN
• 4. ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI
• 4.1. Đặc tính hình thái
• 4.2. Đặc tính nuôi cấy
• 4.3. Đặc tính sinh hóa
• 4.4. Sức đề kháng
• 4.5. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli
• 4.5.1. Kháng nguyên O (Somatic antigen)
• 4.5.2. Kháng nguyên H (Flagella antigen)
• 4.5.3. Kháng nguyên K (Capsular antigen)

Tóm tắt

I. Giới thiệu về vi khuẩn E

Vi khuẩn E. coli thuộc nhóm Verotoxigenic (VTEC) đã trở thành một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng trên toàn cầu. Theo thống kê, hàng năm có khoảng 2 tỷ người bị ngộ độc thực phẩm, trong đó có một phần lớn do vi khuẩn E. coli. Tại Việt Nam, ước tính có khoảng 8 triệu người bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm, với nhiều vụ dịch liên quan đến E. coli VTEC. Vi khuẩn này có khả năng sản sinh độc tố Verotoxin, gây ra các bệnh lý nghiêm trọng như viêm ruột xuất huyết và hội chứng urê huyết. Việc nghiên cứu đặc tính của E. coli VTEC từ bò và lợn tại Hà Nội là cần thiết để hiểu rõ hơn về nguồn gốc và cách thức lây truyền của vi khuẩn này.

1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam

Ngộ độc thực phẩm là một vấn đề nghiêm trọng tại Việt Nam, với hàng triệu ca mắc mỗi năm. Các vụ ngộ độc thường xảy ra tại bếp ăn tập thể, khu công nghiệp và trường học. Vi khuẩn E. coli là một trong những nguyên nhân chính gây ra tình trạng này. Nghiên cứu cho thấy rằng E. coli VTEC có thể lây truyền từ động vật sang người thông qua thực phẩm chưa được chế biến kỹ. Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kiểm soát an toàn thực phẩm và phát triển các phương pháp phát hiện vi khuẩn này trong thực phẩm.

II. Đặc tính của vi khuẩn E

Vi khuẩn E. coli VTEC có nhiều đặc tính sinh học và hình thái đặc trưng. Chúng là vi khuẩn Gram âm, có hình dạng trực khuẩn ngắn, thường xuất hiện đơn lẻ hoặc thành đôi. Vi khuẩn này có khả năng di động nhờ vào lông và có thể phát triển trong nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Đặc biệt, E. coli VTEC có khả năng sản sinh độc tố Verotoxin, gây ra các triệu chứng nghiêm trọng ở người. Việc xác định chính xác các chủng E. coli VTEC là rất quan trọng để phát hiện và ngăn chặn các vụ dịch liên quan đến thực phẩm.

2.1. Đặc tính hình thái và nuôi cấy

Vi khuẩn E. coli có kích thước từ 2-3 x 0,6 µm, bắt màu Gram âm và có khả năng di động. Chúng phát triển tốt trong môi trường nuôi cấy thông thường, với nhiệt độ tối ưu là 37°C. Vi khuẩn này có khả năng lên men nhiều loại đường, đặc biệt là Lactose, điều này giúp phân biệt với các vi khuẩn khác như Salmonella. Việc nghiên cứu các đặc tính này giúp xác định và phân loại các chủng E. coli VTEC trong thực phẩm.

III. Tầm quan trọng của nghiên cứu E

Nghiên cứu về E. coli VTEC không chỉ giúp hiểu rõ hơn về đặc tính của vi khuẩn này mà còn có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Việc phát hiện và kiểm soát E. coli VTEC trong thực phẩm có thể giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm. Các phương pháp như Multiplex PCR và PFGE đã được áp dụng để xác định các yếu tố độc lực và sự đa dạng di truyền của các chủng E. coli VTEC. Điều này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn trong thực tiễn, giúp xây dựng các hệ thống cảnh báo sớm và biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả.

3.1. Ứng dụng trong thực tiễn

Kết quả nghiên cứu về E. coli VTEC có thể được ứng dụng trong việc phát triển các quy trình kiểm soát an toàn thực phẩm tại Việt Nam. Việc xác định chính xác các chủng vi khuẩn này trong thực phẩm sẽ giúp các cơ quan chức năng có biện pháp xử lý kịp thời, giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm cho người tiêu dùng. Hơn nữa, nghiên cứu này cũng góp phần nâng cao nhận thức về an toàn thực phẩm trong cộng đồng, từ đó cải thiện sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tên luận án: Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội

Chuyên ngành: Vi sinh vật học thú y / Vệ sinh an toàn thực phẩm có nguồn gốc động vật

Hướng tiếp cận: Định lượng (thực nghiệm phòng thí nghiệm, sinh học phân tử, vi sinh vật học)

---

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Tác giả mở đầu bằng bối cảnh dịch tễ học quy mô lớn: ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng 2 tỷ người bị ngộ độc thực phẩm (Đậu Ngọc Hào, 2011). Riêng tại Việt Nam, theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 8 triệu người bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm. Năm 2010, cả nước ghi nhận 175 vụ ngộ độc thực phẩm với hơn 5.000 người mắc, 42 trường hợp tử vong, và thiệt hại kinh tế ước tính khoảng 8 triệu USD/năm (Phương Thuận, 2011).

Trong số các nguyên nhân vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, nhóm vi khuẩn E. coli Verotoxigenic (VTEC) — còn gọi là STEC hoặc SLTEC — ngày càng được xác định là tác nhân quan trọng, liên quan đến viêm ruột xuất huyết (HC), hội chứng urê huyết (HUS), ban xuất huyết giảm tiểu cầu (TTP) và viêm màng não. Sự kiện tháng 6/2011 tại Đức — với hơn 1.270 ca nhiễm, 552 ca tiến triển thành HUS và 18 trường hợp tử vong, gây thất thu 200 triệu euro/tuần cho nông dân châu Âu — được tác giả dẫn dụng như minh chứng cụ thể về tính nghiêm trọng của vấn đề.

Tác giả chỉ ra rằng trong khi nhiều công trình nghiên cứu về VTEC đã được công bố ở hầu khắp các quốc gia, tại Việt Nam vấn đề này vẫn chưa được chú ý. Đặc biệt, có rất ít thông tin về VTEC ở động vật mang trùng, thân thịt sau giết mổ, và thực phẩm lưu hành trên thị trường. Ngoài ra, trên thị trường thế giới cũng có rất ít bộ kit phát hiện VTEC ngoài nhóm O157 (kit PCR DNA vòm, VTEC-LAMP), đặt ra nhu cầu phát triển phương pháp phát hiện nhanh phù hợp với điều kiện Việt Nam.

Mục tiêu, ý nghĩa nghiên cứu

Luận án đặt ra hai mục tiêu:

1. Xác định đặc tính của vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn tại điểm giết mổ.
2. Xây dựng được quy trình chẩn đoán, xác định vi khuẩn VTEC trong sản phẩm thịt tươi.

Đối tượng và phạm vi

• Đối tượng: Các chủng vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập từ bò và lợn; các chủng đối chứng dương và âm.
• Phạm vi không gian: Một số chợ, lò mổ trên địa bàn thành phố Hà Nội; các phòng thí nghiệm tại Bộ môn Vi trùng Viện Thú y quốc gia, Bộ môn Vi sinh vật–Truyền nhiễm Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Trạm chẩn đoán xét nghiệm Cơ quan Thú y vùng I và Phòng thí nghiệm Vi khuẩn Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
• Phạm vi thời gian: Từ năm 2009 đến 2011.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu tác giả điểm lại

Tác giả trình bày tổng quan theo ba hướng chính:

Hướng 1 — Dịch tễ học VTEC tại các vụ dịch lớn trên thế giới: Wachsmuth (1994) xác định VTEC là tác nhân gây tiêu chảy rất hay gặp ở nhiều quốc gia. MacDonald và Osterholm (1993) báo cáo vụ dịch E. coli O157:H7 tại Mỹ; Waters và cs. (1994) ghi nhận tại Canada; Thomas và cs. tại Anh. Vụ dịch lớn nhất tại Nhật Bản (tháng 7–8/1996) ghi nhận 9.578 ca và 11 trường hợp tử vong. Allerberger và cs. ghi nhận VTEC đứng thứ hai sau Salmonella về nguyên nhân gây tiêu chảy ở trẻ em tại Đức.

Hướng 2 — VTEC ở động vật và thực phẩm: Hancock và cs. (1994) khảo sát 3.570 mẫu phân bò sữa và 1.412 mẫu phân bò thịt tại Mỹ. Beutin và cs. (1993) nghiên cứu VTEC trên 7 loài vật nuôi tại Đức, ghi nhận tỷ lệ phân lập cao nhất ở cừu (66,6%), dê (56,1%), trâu bò (21,1%), lợn (7,5%). Mechie và cs. (1997) theo dõi đàn bò sữa tại Anh trong 15 tháng. Faith và cs. (1996) xác định tỷ lệ E. coli O157:H7 ở đàn bò sữa là 7%. Levent Akkaya và cs. (2006) phát hiện tỷ lệ dương tính 1,05% trong 190 mẫu thịt gà tại Thổ Nhĩ Kỳ. Samadpour và cs. (1994) sử dụng mồi gen VT để xác định VTEC trong thực phẩm tại Seattle, Washington, phát hiện 23% mẫu thịt bò, 18% thịt lợn, 48% thịt cừu dương tính.

Hướng 3 — Nghiên cứu E. coli tại Việt Nam: Thi Thu Thao Van (2007) phát hiện trên 90% mẫu thịt và hải sản ở TP. Hồ Chí Minh chứa E. coli, nhưng chưa xác định được cụ thể loại E. coli. Kobayashi (2003) khảo sát 258 con lợn ở Cần Thơ cho thấy khoảng 9% phân heo nhiễm E. coli. Do Thuy Trang (2007) theo dõi 636 người tại làng Yên Sở (Hà Nội) trong 2,5 năm, ghi nhận 31% bị tiêu chảy. Bui Thi Thu Hien (2008) sử dụng mô hình bệnh chứng với 249 trẻ dưới 5 tuổi bị tiêu chảy và 124 trẻ không tiêu chảy, xác định tỷ lệ nhiễm E. coli ở nhóm tiêu chảy là 26% so với 10,5% ở nhóm không tiêu chảy. Phạm Thị Tâm và cs. (2009) đề cập đến E. coli O157:H7 như tác nhân gây ngộ độc nguy hiểm nhất. Đỗ Ngọc Thúy (2004) ghi nhận VTEC gây phù đầu ở lợn. Bergamini (2007) nhận xét ô nhiễm VTEC trong thực phẩm đã trở thành đề tài của nhiều tác giả.

Khoảng trống luận án giải quyết

Các nghiên cứu trong nước trước đây chủ yếu xác định sự hiện diện của E. coli nói chung, chưa định danh được nhóm VTEC cụ thể từ bò và lợn tại cơ sở giết mổ. Đặc biệt, chưa có công trình nào tại Việt Nam thiết lập phương pháp Multiplex PCR để phát hiện đồng thời các gen độc lực VT1, VT2 và eae của VTEC trong sản phẩm thịt.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và các khái niệm cốt lõi

Luận án sử dụng các khái niệm và phân loại sinh học sau:

• VTEC (Verotoxigenic Escherichia coli): nhóm E. coli có khả năng sản sinh độc tố Verotoxin (VT) hoặc Shiga-like toxin. Tên gọi đồng nghĩa: STEC (Shiga toxin-producing E. coli), SLTEC. Luận án thống nhất dùng tên VTEC và VT.
• Phân loại huyết thanh học theo Kauffman (1944) dựa trên kháng nguyên O (Somatic), H (Flagellar) và K (Capsular). Đến nay xác định được 173 kháng nguyên O, 89 kháng nguyên K, 56 kháng nguyên H (Gyles, 2004; Orskov và Orskov, 1992).
• Phân nhóm gây bệnh E. coli: ETEC, EIEC, EPEC, EaggEC và VTEC — phân biệt dựa trên cơ chế gây bệnh và yếu tố độc lực.
• Các yếu tố độc lực chính của VTEC: độc tố VT1 và VT2 (cấu trúc tiểu phần A-B; VT2 có liều LD50 thấp hơn gần 400 lần so với VT1 trên chuột thí nghiệm theo số liệu Takeda, 1995); gen eae mã hóa protein intimin (97 kDa) gây bệnh tích bám dính và xâm nhập (A/E); plasmid 60-Megadalton; độc tố gây xuất huyết ruột (EHEC-Hly).

Phương pháp nghiên cứu

Xác định dung lượng mẫu: Theo TCVN 4833-2002, khảo sát sơ bộ 30–50 mẫu để tính tỷ lệ lưu hành ban đầu, sau đó áp dụng phần mềm WinEpiscope 2.0 để tính dung lượng mẫu cần thiết với độ chính xác 95%.

Phương pháp lấy mẫu:

• Mẫu thịt tươi: mua ngẫu nhiên tại chợ và siêu thị trên địa bàn Hà Nội vào buổi sáng (6–7 giờ), bảo quản ở 4–8°C và xử lý trong cùng ngày.
• Mẫu lau thân thịt: dùng gạc tiệt trùng lau tại 3 vị trí trên thân thịt, 100 cm²/vị trí, gạc đặt vào lọ chứa 20 ml môi trường mTSB.

Phương pháp vi sinh vật học: nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc (MacConkey, CT-SMAC, EMB, thạch máu, thạch SS, Simmon citrate, Endo, LB broth, BHI broth, m-TSB broth, BPW broth của Oxoid, Merck, Biorad, Microbiology); định danh bằng phản ứng sinh hóa (Indol, Catalase, MR dương tính; Citrat, Oxidase, VP, Urease, H₂S âm tính).

Phương pháp định typ huyết thanh học: sử dụng kháng huyết thanh chuẩn (đa giá và đơn giá) do hãng Denka (Seiken Co., Ltd, Niigata, Nhật Bản) sản xuất.

Phương pháp sinh học phân tử — PCR đơn mồi và Multiplex PCR: Tách chiết DNA bằng phương pháp sốc nhiệt (đun 100°C/30 phút, đông lạnh –20°C qua đêm). Phản ứng PCR tổng thể tích 25 µl với Taq DNA polymerase (Fermentas), đệm AMP x 5 (750 mM Tris-HCl pH 8, 200 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Tween 20, dNTPs, 2 mM MgCl₂). Chu kỳ nhiệt: tiền biến tính 94°C/5 phút; 30 chu kỳ (biến tính 94°C/1 phút, bắt cặp 50°C/1 phút, tổng hợp 72°C/1 phút); kéo dài 72°C/7 phút. Điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose 2% trong dung dịch 1× TAE, 50V/30 phút, đọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc 2000.

Các cặp mồi sử dụng:

Gen đích	Ký hiệu mồi	Trình tự mồi (5'→3')	Kích cỡ sản phẩm (bp)
VT1	VT1-F	CAGTTAATGTGGTGGCGAAG	894
VT1	VT1-R	CTGCTAATAGTTCTGCGCATG	894
VT2	VT2-F	CTTCGGTATCCTATTCCCGG	481
VT2	VT2-R	GGATGCATCTCTGGTCATTG	481
eae	eae-F	ACGTTGCAGCATGGGTAACTC	816
eae	eae-R	GATCGGCAACAGTTTCACCTG	816

Phương pháp PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis): xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có nguồn gốc phân lập khác nhau. DNA nhiễm sắc thể được xử lý bằng enzym cắt hạn chế, tách trong agarose nhiệt độ nóng chảy thấp (LMT), xử lý proteinase K và N-lauroylsarcosine trước khi chạy điện di PFGE.

Nguồn chủng đối chứng: Viện nghiên cứu Thú y (NVRI, Ba Lan); Phòng thí nghiệm tham chiếu E. coli Tây Ban Nha (LREC); Phòng thí nghiệm tham chiếu vi khuẩn E. coli của OIE, Canada.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1 — Tổng quan tài liệu

Chương trình bày hệ thống các đặc tính sinh học của E. coli và nhóm VTEC. Về hình thái: trực khuẩn ngắn 2–3 × 0,6 µm, Gram âm, không sinh nha bào, có thể có lông và cấu trúc fimbriae. Về nuôi cấy: phát triển tối ưu ở 37°C, pH 7,4 (dải pH 5,5–8,0); mô tả đặc điểm khuẩn lạc trên 8 loại môi trường khác nhau. Về sinh hóa: lên men và sinh hơi Glucose, Fructose, Galactose, Lactose, Manitol; Indol, Catalase, MR dương tính; Citrate, Oxidase, VP, Urease, H₂S âm tính. Về sức đề kháng: bị diệt ở 55°C/1 giờ hoặc 60°C/30 phút; trong phân, chất độn chuồng ẩm thiếu ánh sáng tồn tại trên 2 tháng; trong môi trường ngoài, chủng gây bệnh có thể tồn tại đến 4 tháng.

Về cấu trúc kháng nguyên, chương mô tả chi tiết bốn nhóm: O (polysaccharide, bền nhiệt, có 173 nhóm), H (protein flagellar, kém bền nhiệt, 56 kháng nguyên), K (polysaccharide vỏ, 89 kháng nguyên, 3 nhóm L/A/B) và F (fimbriae, trước đây gọi là K88/K99, nay là F4/F5).

Chương mô tả chi tiết hoạt tính sinh học của các loại VT theo số liệu của Takeda (1995):

Độc tố	CD50 (pg)	LD50 (ng)
Shiga	1,0	27
VT1	1,0	30
VT2	0,75	1
VT2vh	6	2,7
VT2vp1	6	22
VT2vp2	20	55

CD50: liều gây độc 50% tế bào Vero; LD50: liều gây chết 50% chuột thí nghiệm

Chương cũng trình bày tỷ lệ nhiễm VTEC theo loài vật nuôi tại nhiều quốc gia (Beutin và cs., 1993: cừu 66,6%, dê 56,1%, trâu bò 21,1%, lợn 7,5%, mèo 13,8%, chó 4,8%) và tỷ lệ phân lập VTEC từ thực phẩm (Samadpour và cs., 1994: thịt bò 23%, thịt lợn 18%, thịt cừu 48%, thịt gà 12%).

Chương 2 — Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương xác định bốn nội dung nghiên cứu chính: (1) thực trạng công tác kiểm soát giết mổ và vệ sinh thú y tại Hà Nội; (2) thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR xác định VTEC (lựa chọn PCR đơn mồi vs. Multiplex PCR; lựa chọn môi trường tách chiết DNA; xác định độ nhạy và độ đặc hiệu trong môi trường nhân tạo và mẫu thịt sạch; xây dựng quy trình phát hiện VTEC trong mẫu thịt); (3) tỷ lệ nhiễm VTEC trong phân, thân thịt và mẫu lau thân thịt; (4) đặc tính của các chủng phân lập gồm các yếu tố độc lực (VT1, VT2, intimin), serotyp và đa dạng di truyền bằng PFGE.

Chương mô tả chi tiết điều kiện phản ứng Multiplex PCR với ba cặp mồi đồng thời (VT1: 894 bp, VT2: 481 bp, eae: 816 bp) và quy trình điện di kiểm tra sản phẩm. Phương pháp tính số lượng vi khuẩn theo công thức X = 10 × a × b (a: số khuẩn lạc trung bình, b: hệ số pha loãng).

---

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án tự xác định các đóng góp mới như sau:

1. Công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu có hệ thống đặc tính của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập từ bò và lợn tại cơ sở giết mổ, cũng như từ sản phẩm thịt bò, thịt lợn bày bán tại một số chợ trên địa bàn Hà Nội.

2. Thiết lập thành công phương pháp Multiplex PCR để xác định vi khuẩn nhóm VTEC trên thịt trong điều kiện Việt Nam, đồng thời phát hiện ba gen (VT1, VT2, eae) trong một phản ứng duy nhất.

3. Ứng dụng phương pháp PCR và PFGE để xác định các yếu tố độc lực của E. coli và xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có nguồn gốc phân lập khác nhau.

4. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng hệ thống cảnh báo sớm và các biện pháp phòng chống bệnh do VTEC tại Việt Nam.

5. Các kỹ thuật và phương pháp phân tích của đề tài có thể ứng dụng cho nghiên cứu các vi khuẩn khác ở mức độ phân tử, đồng thời làm tài liệu giảng dạy về vi khuẩn nhóm VTEC.

Luận án không nêu cụ thể kiến nghị về chính sách trong phần fulltext được cung cấp.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Văn bản được cung cấp (phần Mở đầu và Chương 1–2) không trình bày riêng một mục về hạn chế hay hướng nghiên cứu tiếp theo. Dựa trên phạm vi nghiên cứu đã xác định, một số giới hạn tự nhiên của đề tài có thể nhận thấy:

• Phạm vi địa lý giới hạn ở Hà Nội (một số chợ và lò mổ) trong giai đoạn 2009–2011, chưa đại diện cho toàn quốc.
• Đối tượng động vật chỉ gồm bò và lợn, chưa mở rộng sang gia cầm hay các vật nuôi khác.
• Văn bản ghi nhận rằng vai trò chính xác của gen eae trong cơ chế gây bệnh của VTEC "vẫn chưa được khẳng định chắc chắn và cần thêm nhiều nghiên cứu nữa về yếu tố này," cho thấy đây là hướng cần tiếp tục làm rõ.
• Câu hỏi liệu tất cả các chủng VTEC phân lập được từ động vật có gây bệnh cho người hay không vẫn chưa được trả lời đầy đủ trong giai đoạn nghiên cứu.

---

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo cho các nhóm đối tượng sau:

• Nghiên cứu sinh và giảng viên trong các lĩnh vực vi sinh vật học thú y, vi sinh vật học thực phẩm và sinh học phân tử, đặc biệt phần trình bày nguyên lý và thực hành Multiplex PCR cùng kỹ thuật PFGE ở Chương 1 và 2.
• Cán bộ kỹ thuật phòng thí nghiệm cần thiết lập quy trình phát hiện VTEC trong mẫu thịt tươi: phần mô tả điều kiện phản ứng PCR (trình tự mồi, chu kỳ nhiệt, thành phần phản ứng) và quy trình lấy mẫu lau thân thịt có tính ứng dụng thực tế.
• Cán bộ kiểm soát giết mổ và vệ sinh thú y tại các địa phương, đặc biệt về thực trạng ô nhiễm VTEC trong chuỗi sản xuất thịt.
• Nhà hoạch định chính sách trong lĩnh vực vệ sinh an toàn thực phẩm và kiểm dịch thú y, phần tổng quan về tỷ lệ nhiễm VTEC ở động vật và thực phẩm tại các quốc gia cung cấp bức tranh so sánh hữu ích.
• Giảng viên thú y và y tế công cộng có thể sử dụng phần tổng quan (Chương 1) về đặc tính, phân loại, yếu tố độc lực và dịch tễ học VTEC làm tài liệu giảng dạy.

---

Câu hỏi thường gặp

1. VTEC là gì và khác gì so với E. coli thông thường? VTEC (Verotoxigenic Escherichia coli) là nhóm E. coli có khả năng sản sinh độc tố Verotoxin (VT), còn gọi là Shiga-like toxin. Không giống E. coli thường trú vô hại trong đường ruột, VTEC mang các yếu tố độc lực đặc trưng — bao gồm gen VT1, VT2 và gen eae mã hóa intimin — cho phép gây viêm ruột xuất huyết (HC), hội chứng urê huyết (HUS) và ban xuất huyết giảm tiểu cầu (TTP) ở người.

2. Tại sao nghiên cứu tập trung vào bò và lợn tại cơ sở giết mổ? Động vật nhai lại, đặc biệt bê và bò, được xác định là nguồn tàng trữ mầm bệnh VTEC chính. Trong quá trình giết mổ, động vật mang trùng có thể truyền vi khuẩn sang thịt qua phân, nhiễm chéo qua tay người giết mổ và dụng cụ lò mổ. Việt Nam chưa có tiêu chuẩn cho phép VTEC có mặt trong 1g các loại thực phẩm như thịt hộp và sản phẩm sữa, tuy nhiên dữ liệu về mức độ ô nhiễm thực tế tại cơ sở giết mổ trong nước còn rất thiếu ở thời điểm nghiên cứu.

3. Phương pháp Multiplex PCR mà luận án thiết lập phát hiện được những gì? Phương pháp Multiplex PCR thiết lập trong luận án sử dụng đồng thời ba cặp mồi để phát hiện ba gen trong một phản ứng duy nhất: gen VT1 (sản phẩm 894 bp), gen VT2 (481 bp) và gen eae mã hóa intimin (816 bp). Phương pháp này cải tiến từ PCR đơn mồi (Chamberlain, 1988) nhằm giảm thời gian và chi phí sàng lọc; theo văn bản, PCR phát hiện gen VT có thể phát hiện dưới 10 VTEC trong tổng số 10⁹ coliform.

4. Độc tố VT1 và VT2 khác nhau như thế nào về độc tính? Theo số liệu Takeda (1995) được trích dẫn trong luận án, VT2 có CD50 là 0,75 pg (so với 1,0 pg của VT1) và LD50 chỉ 1 ng (so với 30 ng của VT1) — thấp hơn gần 400 lần. Ngoài ra, VT2 bền hơn với nhiệt độ và pH. Các nghiên cứu dịch tễ học tại Mỹ và Anh cho thấy nhiễm VTEC sản sinh cả VT1 + VT2 hoặc chỉ VT2 gây ra tình trạng bệnh phức tạp hơn so với nhiễm chủng chỉ sản sinh VT1. Receptor của VT1 và VT2 là Globotriosylceramide (Gb3), trong khi VT2e gắn với Globotetraosylceramide (Gb4).

5. Serotyp O157:H7 có phải là dạng VTEC duy nhất nguy hiểm không? Không. Luận án trình bày bằng chứng rằng hơn 100 serotyp VTEC dựa trên kháng nguyên O có khả năng gây HC, HUS và TTP. Các serotyp không thuộc O157 gây ra các vụ dịch quan trọng: O111 tại Italia (1992), O111:H– tại Adelaide, Úc (Paton và cs., 1996) gây chết 1 người, 23 trẻ nhập viện, 18 ca HUS; O104:H21 tại Montana, Mỹ; O26:H11 đứng thứ hai sau O157:H7 tại Canada. Beutin và cs. (1993) xác định 60% VTEC phân lập từ vật nuôi khỏe mạnh có khả năng gây bệnh cho người.

---

Kết luận

Luận án nghiên cứu có hệ thống về vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập từ bò và lợn tại cơ sở giết mổ trên địa bàn Hà Nội trong giai đoạn 2009–2011, lấp đầy một khoảng trống thông tin đáng kể tại Việt Nam về tác nhân vi sinh vật nguy hiểm này. Về phương pháp, luận án thiết lập và chuẩn hóa kỹ thuật Multiplex PCR phát hiện đồng thời ba gen độc lực (VT1, VT2, eae) cùng kỹ thuật PFGE xác định đa dạng di truyền — hai phương pháp sinh học phân tử chưa được áp dụng cho VTEC từ thực phẩm tại Việt Nam trước thời điểm nghiên cứu. Kết quả cung cấp dữ liệu cơ sở về tỷ lệ nhiễm, đặc tính serotyp và yếu tố độc lực của VTEC ở bò và lợn, phục vụ cho việc xây dựng các biện pháp kiểm soát nguy cơ trong chuỗi sản xuất thịt. Các quy trình kỹ thuật được mô tả đủ chi tiết để làm tài liệu tham khảo cho nghiên cứu sinh, kỹ thuật viên phòng thí nghiệm và giảng viên trong lĩnh vực vi sinh vật học thú y và an toàn thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

đặt vấn đề thực hiện đề tài: "Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội ” 2 Mục tiêu củ đề tài - Xác định đặc tính của vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn tại điểm giết mổ. - Xây dựng được quy trình chẩn đoán, xác định vi khuẩn VTEC trong sản phẩm thịt tươi. 3 Ý n hĩ h học và thực tiễn củ đề tài - Đề tài luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống về vi khuẩn E.

coli nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội. - Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp chúng ta xác định và hiểu được một số đặc tính cơ bản của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn. - Một số kỹ thuật mới và phương pháp phân tích kết quả có hệ thống của đề tài luận án có thể ứng dụng trong nghiên cứu một số vi khuẩn khác ở mức độ phân tử cũng như tài liệu giảng dạy về vi khuẩn nhóm VTEC. - Hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC ở các loài động vật nuôi làm thực 4 phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống cảnh báo sớm và tiến hành các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp.

4 hữn đón óp m i củ luận án - Đề tài luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu đặc tính của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn tại cơ sở giết mổ và một số sản phẩm thịt bò, lợn bày bán trên một số chợ tại địa bàn Hà Nội. - Thiết lập thành công phương pháp Multiplex PCR để xác định vi khuẩn nhóm VTEC trên thịt trong điều kiện Việt Nam. - Sử dụng phương pháp PCR, PFGE để xác định các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli và xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có nguồn gốc khác nhau.

coli Hơn 100 năm trước, năm 1885, bác sỹ nhi khoa người Đức Theodore Escherich đã lần đầu tiên mô tả một loài vi khuẩn phân lập được từ phân của một bệnh nhân nhi. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacterium coli commune, và sau nhiều lần đổi tên, vào năm 1919, vi khuẩn này được gọi với một tên thống nhất là Escherichia coli, viết tắt là E. Từ đó đến nay, E. coli được xác định là loài vi khuẩn thường gặp nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật (Vu Khac Hung, 2004) [91].

coli là loài chủ yếu của giống Escherichia, họ Enterobacteriaceae. Chúng là những vi khuẩn bắt màu Gram âm, hình gậy ngắn. Quan sát dưới kính hiển vi thường thấy vi khuẩn đứng riêng hoặc thành đôi. Phản ứng Catalase dương tính, Oxidase âm tính, hiếu khí tùy tiện, có thể di động nhờ lông (flagella) hoặc không di động.

Hầu hết các chủng vi khuẩn đều lên men đường Lactose, một số lên men chậm và một số không sinh hơi. Thông thường, E. coli có phản ứng Citrate âm tính, Methyl Red (MR) dương tính, Voges - Proskauer (VP) âm tính và Indol dương tính. coli là vi khuẩn thường thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật; từ đó E.

coli được thải vào nước, đất và đồng cỏ, không chỉ nhiễm lan trong đàn mà có thể nhiễm vào một số sản phẩm nông nghiệp như rau, củ,. Từ đầu những năm 1940, một số ý kiến cho rằng vi khuẩn E. coli là tác nhân gây một số bệnh ở trẻ em. Doyle và Padhye (trích dẫn từ Bray và Beavan, 1989) [28] gọi vi khuẩn này là Bacillus coli typ neopolitanum, mà sau này được gọi là nhóm O111, và thuộc lớp EPEC.

Từ đó, những nhóm E.