đặt vấn đề thực hiện đề tài: "Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội ” 2 Mục tiêu củ đề tài - Xác định đặc tính của vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn tại điểm giết mổ. - Xây dựng được quy trình chẩn đoán, xác định vi khuẩn VTEC trong sản phẩm thịt tươi. 3 Ý n hĩ h học và thực tiễn củ đề tài - Đề tài luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống về vi khuẩn E.
coli nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội. - Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp chúng ta xác định và hiểu được một số đặc tính cơ bản của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn. - Một số kỹ thuật mới và phương pháp phân tích kết quả có hệ thống của đề tài luận án có thể ứng dụng trong nghiên cứu một số vi khuẩn khác ở mức độ phân tử cũng như tài liệu giảng dạy về vi khuẩn nhóm VTEC. - Hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC ở các loài động vật nuôi làm thực 4 phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống cảnh báo sớm và tiến hành các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp.
4 hữn đón óp m i củ luận án - Đề tài luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu đặc tính của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn tại cơ sở giết mổ và một số sản phẩm thịt bò, lợn bày bán trên một số chợ tại địa bàn Hà Nội. - Thiết lập thành công phương pháp Multiplex PCR để xác định vi khuẩn nhóm VTEC trên thịt trong điều kiện Việt Nam. - Sử dụng phương pháp PCR, PFGE để xác định các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli và xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có nguồn gốc khác nhau.
coli Hơn 100 năm trước, năm 1885, bác sỹ nhi khoa người Đức Theodore Escherich đã lần đầu tiên mô tả một loài vi khuẩn phân lập được từ phân của một bệnh nhân nhi. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacterium coli commune, và sau nhiều lần đổi tên, vào năm 1919, vi khuẩn này được gọi với một tên thống nhất là Escherichia coli, viết tắt là E. Từ đó đến nay, E. coli được xác định là loài vi khuẩn thường gặp nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật (Vu Khac Hung, 2004) [91].
coli là loài chủ yếu của giống Escherichia, họ Enterobacteriaceae. Chúng là những vi khuẩn bắt màu Gram âm, hình gậy ngắn. Quan sát dưới kính hiển vi thường thấy vi khuẩn đứng riêng hoặc thành đôi. Phản ứng Catalase dương tính, Oxidase âm tính, hiếu khí tùy tiện, có thể di động nhờ lông (flagella) hoặc không di động.
Hầu hết các chủng vi khuẩn đều lên men đường Lactose, một số lên men chậm và một số không sinh hơi. Thông thường, E. coli có phản ứng Citrate âm tính, Methyl Red (MR) dương tính, Voges - Proskauer (VP) âm tính và Indol dương tính. coli là vi khuẩn thường thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật; từ đó E.
coli được thải vào nước, đất và đồng cỏ, không chỉ nhiễm lan trong đàn mà có thể nhiễm vào một số sản phẩm nông nghiệp như rau, củ,. Từ đầu những năm 1940, một số ý kiến cho rằng vi khuẩn E. coli là tác nhân gây một số bệnh ở trẻ em. Doyle và Padhye (trích dẫn từ Bray và Beavan, 1989) [28] gọi vi khuẩn này là Bacillus coli typ neopolitanum, mà sau này được gọi là nhóm O111, và thuộc lớp EPEC.
Từ đó, những nhóm E. coli khác được thừa nhận là nguyên nhân gây tiêu chảy. coli gây bệnh có độc lực rất khác nhau và có khả năng gây ra một số bệnh nghiêm trọng. Một số chủng sản sinh độc tố gây phá hủy tế bào Vero và Hela, tương tự như độc tố do Shigella dysenteriae typ 1 sản sinh ra.
Những độc tố này được gọi với những tên khác nhau như Verotoxin, Verocytotoxin hoặc Shiga-like toxin. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tên gọi thống nhất là Verotoxin (VT) và các vi khuẩn có khả năng sản sinh độc tố này được gọi là Verotoxigenic Escherichia coli, viết tắt là VTEC. Trong những năm gần đây, các chủng E. coli gây tiêu chảy được chia thành ít nhất 5 nhóm.
coli gây độc ruột (ETEC - Enterotoxigenic E. coli) - sản sinh độc tố ruột nhưng không xâm nhập, E. coli xâm nhập ruột (EIEC - Entero invasive E. coli) có khả năng xâm nhập tế bào biểu mô ruột, E.
coli gây bệnh tích ruột (EPEC - Enteropathogenic E. coli) có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô và gây bệnh tích bám dính và xâm nhập (Attaching and Effacing - A/E), E. coli gây ngưng kết (EaggEC - Enteroaggregative E. coli) có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô nhờ một cơ quan giống lông nhung và khuếch tán vào trong biểu mô ruột.
Nhóm cuối cùng là VTEC gây bệnh viêm ruột xuất huyết, huyết niệu và ban xuất huyết giảm tiểu cầu ở người. Trước đây, VTEC là một phân nhóm của EPEC vì chúng cũng có khả năng gây bệnh tích A/E ở biểu mô ruột của động vật cảm thụ. Nhưng khi phát hiện một số chủng của VTEC có khả năng sản sinh độc tố VT để trợ giúp cho yếu tố bám dính này, chúng đã được tách ra thành một nhóm riêng là VTEC. coli O157: H7 hiện nay là chủng VTEC được báo cáo nhiều nhất gây ra các vụ dịch lớn ở nhiều nước gồm cả Mỹ (MacDonald và Osterholm, 1993) [55], Canada (Waters và cs.
1994) [96], Anh (Thomas và cs. Vi khuẩn này được xác định là một trong các tác nhân gây ngộ độc nguy hiểm nhất trong các bệnh phát sinh do ngộ độc thực phẩm gây nên hội chứng huyết niệu (Phạm Thị Tâm và cs. 2009, trích dẫn theo Griffin, 1995) [6]. 7 Vụ dịch đầu tiên được báo cáo vào năm 1982, E.
coli O157: H7 được xác định là nguyên nhân gây viêm ruột xuất huyết ở Mỹ. Trong một thập kỷ sau đó, vi khuẩn này đã trở thành một vấn đề lớn liên quan đến sức khỏe cộng đồng, được chính phủ nhiều nước quan tâm. Vụ dịch lớn nhất được báo cáo xảy ra ở Nhật Bản trong tháng 7 - 8/1996, với 9.578 ca bệnh được ghi nhận và 11 người chết, 90 bệnh nhân được xác định là bị HUS. Vụ dịch lớn thứ hai xảy ra ở Mỹ, với 732 ca bệnh trong đó 4 người chết, 55 người bị HUS hoặc TTP.
Mặc dù, serotyp O157: H7 là typ vi khuẩn nổi bật nhất của nhóm VTEC, một số serotyp khác của nhóm này cũng liên quan tới một số bệnh ở người. Hơn nữa, sự tồn tại của các serotyp này là khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau. Có hơn 100 serotyp VTEC được xác định dựa trên kháng nguyên O có khả năng gây một số bệnh nghiêm trọng ở người như HC, HUS, TTP. Ở nhiều nước, VTEC là một tác nhân gây tiêu chảy thông thường (Wachsmuth, 1994) [95].
VTEC gây nên các triệu chứng khác nhau, từ gần như không có triệu chứng gì, có hoặc không có triệu chứng đau bụng nhẹ, đến những triệu chứng nặng hơn như HC, HUS hoặc TTP. Đối tượng thường bị nhiễm VTEC là trẻ em dưới 5 tuổi hoặc người già. Ở những người trưởng thành và trung niên, các triệu chứng có thể nhẹ như bị tiêu chảy nhưng không xuất huyết. Điều này xảy ra khi bị nhiễm ở liều thấp, dưới 100 vi khuẩn.
Ở động vật, VTEC gây viêm ruột xuất huyết và tiêu chảy ở trâu bò, chúng cũng có thể gây bệnh phù đầu ở lợn (Đỗ Ngọc Thúy, 2004) [8]. Hầu hết các vụ dịch VTEC, thường do serotyp O157: H7, có liên quan tới sử dụng thịt bò chưa chín kỹ, và một số thực phẩm tương tự hoặc sữa tươi. Truyền qua thực phẩm là phương thức lây truyền chủ yếu của VTEC. Vật nuôi, đặc biệt là trâu bò, là nguồn tàng trữ VTEC chính (Beutin và cs.
Trong quá trình giết mổ, động vật mang trùng có thể truyền vi khuẩn sang thịt qua phân, nhiễm chéo sang thân thịt của các gia 8 súc khác qua tay người giết mổ và dụng cụ lò mổ. Hiện nay, người ta vẫn chưa khẳng định được liệu tất cả các chủng VTEC phân lập được từ động vật có gây bệnh cho người hay không. Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm của Việt Nam quy định : vi khuẩn này không được phép có mặt trong 1g các loại thực phẩm như thịt hộp, rau quả muối, nước uống, sữa và các sản phẩm từ sữa. Ở Việt Nam, có rất ít thông tin về VTEC ở những động vật mang trùng, thân thịt sau khi giết mổ và thực phẩm.
Hiện nay trên thị trường thế giới có rất ít bộ kít phát hiện VTEC ngoài nhóm O157 (kit PCR DNA vòm, VTEC- LAMP). Do đó, các phương pháp phát hiện nhanh VTEC ở Việt Nam cần phải được phát triển để xác định được vai trò của vi khuẩn này ở động vật mang trùng và các sản phẩm từ động vật. coli có thể được chia thành các nhóm dựa trên bệnh lý mà chúng gây ra, vị trí các kháng nguyên, định typ phage, thông tin về plasmid và khả năng sản sinh yếu tố dung huyết. Tuy nhiên, các phản ứng huyết thanh học thường được sử dụng và hiệu quả khi phân loại E.
Năm 1944, Kauffman là người đầu tiên đưa ra một phương pháp phân loại vi khuẩn E. coli dựa trên đặc điểm huyết thanh học, và cùng với một số cải tiến, phương pháp này vẫn được áp dụng cho tới ngày nay. Theo đó, vi khuẩn E. coli được phân loại dựa theo các kháng nguyên bề mặt, gồm có kháng nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên lông H (Flagellar) và kháng nguyên giáp mô K (Capsular) (Lior, 1996) [53].
coli được phân loại dựa trên 3 loại kháng nguyên này nhưng kháng nguyên O và H thường được sử dụng nhiều hơn. Do đó, thuật ngữ serotyp chỉ được sử dụng khi hai kháng nguyên này đã được xác định. Khi chỉ 9 có kháng nguyên O được xác định, các vi khuẩn E. coli được xếp thành nhóm kháng nguyên O (serogroup O).
Hiện nay, nhóm E. coli dựa trên kháng nguyên O đã được xác định được đánh số từ O1 đến O173 (trừ 7 nhóm đã bị loại : O31, O47, O67, O72, O93, O94, O122).2 Đặc tính của vi khuẩn E.1 Đặc tính hình thái E. coli là trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, có kích thước 2 - 3 x 0,6 µm. Trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram âm, đứng riêng rẽ, đôi khi xếp 2 - 3 vi khuẩn thành một chuỗi dài.
Vi khuẩn không sinh nha bào và không bắt màu với các thuốc nhuộm axit.