Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng kháng vi sinh vật của nấm trong sinh tổng hợp EPS

Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng sinh tổng hợp laccase của nấm trong các vùng sinh thái khác nhau, góp phần vào ứng dụng kháng vi sinh vật.

• Tác giả: Hoàng Thị Nhung
• Người hướng dẫn: PGS. Đặng Thị Cẩm Hà
• Trường học: Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật
• Chuyên ngành: Vi Sinh Vật
• Đề tài: Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về nấm ăn và nấm dược liệu (MMs- Medicinal Mushrooms)
• 1.2. Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm
• 1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.4. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
• 1.5. Polysaccharide từ nấm- nguồn carbonhydrate có hoạt tính sinh học tự nhiên
• 1.6. Tách chiết và xác định các đặc tính của polysaccharide từ nấm
• 1.7. Đặc điểm cấu trúc của polysaccharide phân lập từ nấm
• 1.8. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide
• 1.9. Tính chất vật lý của polysaccharide
• 1.10. Khối lượng phân tử của polysaccharide
• 1.11. Độ hòa tan của polysaccharide từ nấm
• 1.12. Vai trò của polysaccharide từ nấm đối với sức khỏe
• 1.13. Tính kháng u, điều trị ung thư và miễn dịch của polysaccharide
• 1.14. Hạ lipid máu và hạn chế đường huyết
• 1.15. Tính chống oxy hóa của polysaccharide từ nấm
• 1.16. Prebiotic từ nấm
• 1.17. Tính kháng virus của polysaccharide từ nấm
• 1.18. Hoạt tính kháng khuẩn của polysaccharide từ nấm
• 1.19. Laccase và ảnh hưởng của nó đến sức khỏe con người
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Vi sinh vật
• 2.2. Hóa chất và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp phân lập các chủng nấm
• 2.5. Phương pháp phân loại nấm dựa vào trình tự xác định trình tự ITS
• 2.6. Chuẩn bị giống
• 2.7. Phương pháp xác định sinh khối và hàm lượng exopolysaccharide
• 2.8. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme laccase
• 2.9. Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp polysaccharide và enzyme laccase
• 2.9.1. Đánh giá ảnh hưởng của pH
• 2.9.2. Đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
• 2.9.3. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ
• 2.9.4. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn carbon
• 2.10. Xác định hàm lượng protein, carbonhydrate tổng số của EPS thô
• 2.11. Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định
• 2.12. Xác định thành phần của polysaccharide
• 2.13. Xác định hoạt tính của EPS và sinh khối nấm lên một số chức năng của tế bào
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập và phân loại các chủng nấm nghiên cứu
• 3.2. Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và hoạt tính laccase của các chủng nấm
• 3.3. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi cấy một số chủng nấm
• 3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tạo sinh khối, sinh tổng hợp EPS và laccase của 2 chủng nấm Earliella sp. FPT31 và Ganoderma sp.
• 3.4.1. Ảnh hưởng của pH môi trường
• 3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
• 3.4.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
• 3.4.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon
• 3.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ glucose
• 3.4.6. Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và laccase của FPT31 khi kết hợp các yếu tố môi trường
• 3.5. Hàm lượng carbonhydrate và protein của EPS thô thu được từ FPT31 và FMD12
• 3.6. Thành phần và cấu trúc EPS của FMD12 và FPT31
• 3.7. Hoạt tính in vitro của EPS từ 2 chủng nấm FMD12 và FPT31
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu đặc tính sinh học của nấm trong sinh tổng hợp EPS

Nấm là một nguồn tài nguyên sinh học phong phú, với khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Nghiên cứu về đặc tính sinh học của nấm trong sinh tổng hợp EPS (exopolysaccharide) đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. EPS từ nấm không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn có khả năng kháng vi sinh vật, mở ra nhiều ứng dụng trong y học và công nghiệp thực phẩm.

1.1. Đặc điểm sinh học của nấm và vai trò của EPS

Nấm có khả năng sinh trưởng trong nhiều môi trường khác nhau. EPS được sản xuất từ nấm có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào nấm khỏi các tác nhân gây hại và tạo ra môi trường sống thuận lợi cho sự phát triển của chúng.

1.2. Khả năng kháng vi sinh vật của nấm trong EPS

Nghiên cứu cho thấy rằng nấm có khả năng sản xuất các hợp chất kháng vi sinh vật mạnh mẽ. Các polysaccharide từ nấm có thể ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn và nấm gây bệnh, góp phần vào việc bảo vệ sức khỏe con người.

II. Thách thức trong nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của nấm

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của nấm vẫn gặp phải nhiều thách thức. Các yếu tố như điều kiện nuôi cấy, loại nấm và phương pháp phân tích đều ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. Việc hiểu rõ các yếu tố này là cần thiết để tối ưu hóa quy trình sản xuất EPS.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng vi sinh vật

Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và nguồn dinh dưỡng có thể ảnh hưởng lớn đến khả năng sản xuất EPS và hoạt tính kháng vi sinh vật của nấm. Nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định các điều kiện tối ưu cho từng loại nấm.

2.2. Phương pháp phân tích khả năng kháng vi sinh vật

Các phương pháp phân tích hiện đại như CALUX đang được áp dụng để đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của EPS từ nấm. Tuy nhiên, việc chuẩn hóa các phương pháp này vẫn là một thách thức lớn trong nghiên cứu.

III. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp EPS từ nấm

Để nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp EPS từ nấm, các phương pháp phân lập và nuôi cấy nấm được áp dụng. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp là rất quan trọng để tối ưu hóa sản lượng EPS.

3.1. Phân lập và nuôi cấy nấm

Quá trình phân lập nấm từ các mẫu tự nhiên và nuôi cấy trong điều kiện kiểm soát giúp xác định các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp EPS cao nhất. Các chủng nấm như Ganoderma sp. và Earliella sp. đã được lựa chọn cho nghiên cứu này.

3.2. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp EPS

Các phương pháp đánh giá như xác định hàm lượng EPS và hoạt tính enzyme laccase được sử dụng để đo lường khả năng sinh tổng hợp của nấm. Kết quả cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các chủng nấm trong khả năng sản xuất EPS.

IV. Ứng dụng thực tiễn của EPS từ nấm trong y học

EPS từ nấm không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học. Các polysaccharide này có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm chức năng và thuốc điều trị.

4.1. Tác dụng của EPS trong điều trị bệnh

Nghiên cứu cho thấy EPS từ nấm có khả năng hỗ trợ điều trị nhiều loại bệnh, bao gồm ung thư và các bệnh viêm nhiễm. Các hợp chất này có thể tăng cường hệ miễn dịch và giảm thiểu tác động của các tác nhân gây bệnh.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

EPS từ nấm đang được nghiên cứu để phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật. Việc sử dụng nấm trong chế biến thực phẩm cũng đang ngày càng phổ biến.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về đặc tính sinh học và khả năng kháng vi sinh vật của nấm trong sinh tổng hợp EPS mở ra nhiều triển vọng cho các ứng dụng trong y học và công nghiệp thực phẩm. Việc tiếp tục nghiên cứu sẽ giúp khai thác tối đa tiềm năng của nấm.

5.1. Tương lai của nghiên cứu nấm trong y học

Nghiên cứu về nấm sẽ tiếp tục phát triển, với nhiều ứng dụng mới trong y học và công nghệ sinh học. Các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và hoạt tính của EPS sẽ giúp phát triển các sản phẩm mới.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần có các nghiên cứu tiếp theo để xác định rõ hơn về cơ chế hoạt động của EPS và khả năng kháng vi sinh vật của nấm. Việc hợp tác giữa các nhà khoa học và ngành công nghiệp cũng sẽ thúc đẩy ứng dụng thực tiễn của các nghiên cứu này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Giới nấm có khoảng 1,5 triệu loài tuy nhiên chỉ có 14.000 loài trong đó là nấm đảm Basidomycetes. Một vài trong số những chi này đã được trồng trên quy mô công nghiệp trên toàn thế giới bao gồm Pleurotus (nấm sò), Lentinula (nấm hương), Auricularia (mộc nhĩ), Agaricus (nấm Thiên Chúa), Flammulina (nấm kim châm), Hypsizygus (nấm ngọc châm), Ganoderma (nấm Linh Chi), Inonotus obliquus (nấm đen), Coprinus (nấm đùi gà), Agrocybe (nấm trân châu) và Volvariella (nấm rơm). Nấm được sử dụng cho rất nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học đặc biệt là trong các ngành sản xuất thực phẩm, enzyme, bổ sung cho chế độ ăn kiêng, các hợp chất có dược tính, thực phẩm bổ sung [111] và nhiều ứng dụng khác. Một thành phần quan trọng của nấm chiếm được sự quan tâm lớn của khoa học là polysaccharide.

Các polysaccharide từ nấm được thu nhận từ Ganoderma, Lentinus, Oyster, Flammulina, Cordyceps, Coriolus và Pleurotus đều đã được chứng minh là có nhiều hoạt tính sinh học bao gồm miễn dịch, kháng u, chống ung thư, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, các đặc tính liên quan đến đường huyết và tim mạch. Ngoài ra các enzyme laccase cũng đang được chứng minh vai trò quan trọng của nó trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe con người. Nấm được sử dụng chủ yếu thông qua ăn trực tiếp (nấm ăn) và sắc lấy nước uống hoặc dùng hàng ngày cũng ở dạng sản phẩm uống (thực phẩm chức năng và thuốc) được tách chiết từ các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm. Cho đến nay hầu hết các sản phẩm từ nấm đều được thu nhận trực tiếp từ quả thể của nấm tự nhiên hay nấm trồng thông qua quá trình tách chiết phức tạp và sử dụng nước nóng hay các dung môi hữu cơ khác nhau.

Lên men chìm là một giải pháp được đưa ra để khắc phục những nhược điểm của một số phương pháp tách chiết truyền thống như thời gian thu nhận, hiệu suất tách chiết, khả năng kiểm soát mức độ an toàn thực phẩm trong suốt quá trình sản xuất và sự phức tạp của quá trình thu nhận sản phẩm cuối cùng để tạo hàng hóa thương mại. Vì vậy, Trang 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17 việc lựa chọn môi trường thích hợp cho nấm sinh tổng hợp một lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học mà quan trọng là polysaccharide có ý nghĩa lớn. Các hoạt tính sinh học của polysaccharide bị ảnh hưởng bởi các đặc điểm về cấu trúc của chúng như thành phần hóa học, khối lượng phân tử, các liên kết glycosidic và dàng cấu hình. Vì vậy, việc nghiên cứu các đặc điểm về cấu trúc của polysaccharide có ý nghĩa trong việc xác định các hoạt tính sinh học của chúng từ đó ứng dụng chúng vào các mục đích thích hợp.

Công nghệ phân tích sàng lọc bằng CALUX đã trở thành một công cụ sinh học mới bắt đầu được sử dụng trong việc phát hiện các chất hay các cụm chất có tác dụng ở mức độ tế bào từ các mẫu sinh phẩm và môi trường dựa vào sự biểu hiện của gen đích gắn với promoter chỉ thị là luciferase. Hiện nay, CALUX là phương pháp hữu hiệu để không chỉ xác định nồng độ dioxin hay các chất đích đang được mong muốn tìm mà công cụ này còn được ứng dụng trong các lĩnh vực như an toàn thực phẩm cho người. Các lĩnh vực như nước uống, chất lượng môi trường, dược phẩm/ hóa chất, thức ăn chăn nuôi, sản phẩm tiêu dùng, các phép thử ở bệnh viện, các sản phẩm sinh học tế bào, các nguyên liệu đối chứng tham khảo và các sản phẩm khác v. là đối tượng mà công nghệ CALUX có thể phân tích.

Việc đánh giá các chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từ nấm lên các chức năng của tế bào giúp định hướng một cách rõ ràng hơn về khả năng ứng dụng của chúng để tạo thuốc, thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung cho người, vật nuôi và cây trồng. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau” đã được tiến hành. Nội dung chính của đề tài bao gồm: - Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn nấm có khả năng sinh tổng hợp EPS và enzyme laccase từ các mẫu nấm thu thập từ Vườn Quốc gia Xuân Sơn- tỉnh Phú Thọ; Vườn Quốc gia Ba Vì- thành phố Hà Nội; rừng keo tỉnh Bình Trang 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17 Phước; rừng bị rải chất độc hóa học là A Lưới- tỉnh Thừa Thiên Huế và Mã Đà- tỉnh Đồng Nai; - Phân loại 2 chủng nấm bằng phương pháp xác định trình tự vùng ITS; - Lựa chọn môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và laccase của 2 chủng nấm Ganoderma sp. FMD12 và Earliella sp.

FPT31; - Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi cấy 2 chủng nấm Ganoderma sp. FMD12 và Earliella sp. FPT31; - Xác định sơ bộ thành phần và tỷ lệ các đường tạo thành EPS của 2 chủng nấm trên. - Đánh giá một số hoạt tính sinh học của EPS bằng kỹ thuật CALUX để định hướng ứng dụng.

Trang 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17 PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về nấm ăn và nấm dược liệu (MMs- Medicinal Mushrooms) Nấm sợi và nấm mũ được phân bố rộng rãi và phong phú trên toàn thế giới. Các ước tính gần đây về nấm cho thấy số lượng nấm vào khoảng 500 000 đến hơn 5 tỉ loài, được công bố hơn 20 năm trước [46].

Cho đến nay, có khoảng 3 tỉ loài nấm được chấp nhận sử dụng chung. Trong khi đó, hiện nay có 110 000 loài nấm đã được mô tả. Số lượng các loài nấm trên trái đất hiện nay ước tính khoảng 150 00 – 160 000. Chưa hết, có lẽ chỉ có 10% số loài có tên được khoa học biết đến [133].

Một phân tích về nguồn gốc của các loài nấm mới cho khoa học đã được mô tả và công bố trong cuốn Biên lục về Nấm xuất bản 10 năm trước cho thấy khoảng 60% các loài nấm mới được mô tả là từ các vùng nhiệt đới. Nấm được tiêu thụ trên toàn thế giới không chỉ do đặc tính cảm quan mà còn thu hút được nhiều sự quan tâm do lợi ích của chúng đối với sức khỏe con người. Hiện nay nấm được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng cũng như dược lý của chúng. Nấm có thể được coi là một loại thực phẩm tốt cho sức khỏe vì chúng có hàm lượng protein và hàm lượng chất xơ cao, với một lượng vitamin và khoáng chất đáng kể và lượng chất béo thấp.

Chúng là một nguồn dược phẩm lớn, mới nhưng chưa được khai thác. Hơn nữa, nấm ngày càng thu hút sự quan tâm bởi chúng có thể được ứng dụng để tạo thực phẩm chức năng và là nguyên liệu cho sự phát triển của các loại thuốc và các sản phẩm dinh dưỡng do để bổ sung vào chứa một loạt các phân tử có hoạt tính sinh học như β- glucans, polyphenol, phytosterol, tecpen. Quan trọng nhất đối với y học hiện đại là nấm dược liệu (MMs) là nguồn polysaccharide vô hạn (đặc biệt là β- glucan) và các phức hợp polysaccharide- protein có khả năng chống ung thư và tăng khả năng miễn dịch. Hầu hết các Basidiomycetes bậc cao đều chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học với phân tử lượng thấp hoặc cao (triterpenes, lactones, alkaloids và các hợp chất khác) trong quả thể nấm, sợi nấm và dịch nuôi cấy [133], [128], [8], [27].

Trang 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17 MMs được so sánh với thuốc thảo dược và được xác định có thể là các nấm lớn, hầu hết thuộc nấm đảm và một vài thuộc nhóm nấm sợi. Chúng được sử dụng ở dạng chiết xuất hoặc dạng bột để ngăn ngừa, giảm thiểu hay chữa trị bệnh, và/ hoặc bổ sung cho người một chế độ ăn uống khỏe mạnh và cân bằng. Nấm dược liệu và nấm ăn có khoảng 130 chức năng để có thể sử dụng làm thuốc do có khả năng kháng ung thư, tăng khả năng miễn dịch, chống lão hóa, kháng các bệnh tim mạch, chống tăng cholesterol, kháng vi rút, kháng khuẩn, kháng ký sinh trùng, kháng nấm, khử độc, bảo vệ gan, chống các ảnh hưởng của đái đường. Nấm được sử dụng vào các liệu pháp tăng miễn dịch, và đã được chứng minh là có hiệu quả như chống viêm, chống oxy hóa, kháng u, hoặc là kháng virus và là các nhân tố kháng khuẩn.

Rất nhiều, nếu không nói là tất cả, các nấm mũ bậc cao chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học không chỉ có trong quả thể nấm, trong sợi nấm qua nuôi cấy mà còn có trong môi trường nuôi cấy. Các polysaccharide từ nấm đang được quan tâm đặc biệt bởi các đặc tính hữu ích của chúng. Các dữ liệu khoa học về các polysaccharide từ nấm và các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được tổng hợp lại khoảng 700 loài. Số lượng các polysaccharide có hoạt tính sinh học hoặc các phức hợp polysaccharide- protein từ các nấm thuốc có mặt để tăng cường các phản ứng miễn dịch bẩm sinh và phản ứng miễn dịch thu được và tạo ra hoạt tính kháng ung thư ở người và động vật.

Cho đến nay các cơ chế về hoạt động kháng ung thư của chúng vẫn còn chưa được hiểu một cách rõ ràng. Polysaccharide và các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp có khối lượng phân tử thấp giữ vai trò đặc biệt quan trọng do đặc tính kháng ung thư và tăng khả năng miễn dịch của chúng [134]. Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm 1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Việc sử dụng các loài nấm trong các liệu pháp điều trị đã xuất hiện ít nhất từ thời kì đồ đá mới.

Trải qua hàng nghìn năm, các loài nấm được đánh giá là có giá trị cho con người là nấm ăn và nấm dược liệu. Các nghiên cứu hiện đại xác nhận và ghi nhận nhiều Trang 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17 kiến thức cổ xưa về nấm dược liệu. Một lĩnh vực khoa học liên ngành tập trung vào nghiên cứu nấm dược liệu đã được phát triển và ngày càng chứng tỏ tính ưu việt và độc đáo của các hợp chất chiết xuất từ một loạt các loài nấm trong ba thập kỷ gần đây.