Nghiên Cứu Polysaccharide Ngoại Bào Có Hoạt Tính Sinh Học Từ Nấm Cordyceps Sinensis

Nghiên cứu thu nhận polysaccharide ngoại bào từ nấm cordyceps sinensis với hoạt tính sinh học tiềm năng trong y học và dinh dưỡng.

• Tác giả: Lê Thị Thúy Hằng
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Tiến Thắng
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Polysaccharide Ngoại Bào Từ Nấm Cordyceps Sinensis Có Hoạt Tính Sinh Học
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về nấm Cordyceps sinensis
• 1.1.1. Nguồn gốc và vòng đời phát triển
• 1.1.2. Thành phần hoạt chất có hoạt tính sinh học
• 1.1.3. Nghiên cứu nuôi cấy nhân tạo nấm C. sinensis
• 1.2. Tổng quan về polysaccharide ngoại bào – EPS ở nấm C. sinensis
• 1.2.1. Giới thiệu chung về polysaccharide
• 1.2.2. Con đường sinh tổng hợp EPS
• 1.2.3. Các phương pháp thu nhận EPS
• 1.2.4. Hoạt tính sinh học của EPS
• 1.2.5. Mối liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của EPS
• 1.3. Phương pháp xác định thành phần đơn phân của EPS từ nấm C. sinensis
• 1.4. Phương pháp xác định cấu trúc của EPS
• 1.5. Mối liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của EPS có nguồn gốc từ nấm C. sinensis
• 1.6. Các phương pháp cải thiện hoạt tính sinh học của EPS
• 1.6.1. Phương pháp tinh sạch EPS
• 1.6.2. Phương pháp cải biến cấu trúc hóa học của EPS
• 1.6.3. Phương pháp kích thích tăng sinh tổng hợp EPS
• 1.6.3.1. Tối ưu hoá môi trường nuôi cấy
• 1.6.3.2. Thiết kế thí nghiệm
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Chủng nấm sử dụng
• 2.1.2. Hóa chất và thiết bị
• 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
• 2.1.4. Môi trường nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm C. sinensis
• 2.1.5. Quy trình thực nghiệm
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Chuẩn bị giống cấp 1
• 2.2.2. Chuẩn bị giống cấp 2
• 2.2.3. Khảo sát nguồn nitơ thích hợp trong nuôi cấy nấm C. sinensis để thu nhận EPS có hoạt tính sinh học
• 2.2.3.1. Thu nhận EPS
• 2.2.3.2. Định lượng đường tổng
• 2.2.3.3. Định lượng protein
• 2.2.3.4. Khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do ABTS+
• 2.2.4. Thu nhận và tinh sạch EPS
• 2.2.4.1. Thu nhận phân đoạn EPS bằng sắc ký lọc gel
• 2.2.4.2. Thu nhận phân đoạn EPS bằng kỹ thuật lọc membrane theo phương pháp lọc tiếp tuyến
• 2.2.5. Cải biến sulfate hóa EPS
• 2.2.5.1. Tạo dẫn xuất EPS sulfate hóa
• 2.2.5.2. Xác định độ thay thế (DS)
• 2.2.6. Nuôi cấy kích thích tăng sinh tổng hợp EPS bằng dầu thực vật
• 2.2.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của dầu thực vật lên phát triển và tạo EPS trong nuôi cấy lỏng-tĩnh C. sinensis
• 2.2.6.2. Tách chiết EPS từ nuôi cấy C. sinensis bổ sung dầu
• 2.2.6.3. Khảo sát loại protein khỏi phức với EPS
• 2.2.7. Đánh giá hoạt tính kháng phân bào của các phân đoạn EPS
• 2.2.8. Thử nghiệm apoptosis tế bào của các phân đoạn EPS
• 2.2.9. Khảo sát hoạt tính ức chế Tyrosinase của các phân đoạn EPS
• 2.2.10. Xác định thành phần đường đơn của EPS
• 2.2.11. Xác định và dự đoán cấu trúc và liên kết của EPS
• 2.2.12. Xác định cấu trúc tổng thể của EPS
• 2.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Khảo sát điều kiện nuôi cấy lỏng-tĩnh C. sinensis
• 3.1.1. Ảnh hưởng của nguồn N đến tạo sinh khối và phức EPS-protein
• 3.1.2. Ảnh hưởng của nguồn N đến hàm lượng EPS trong phức EPS-protein
• 3.1.3. Ảnh hưởng của nguồn N đến hoạt tính kháng oxy hóa in vitro phức EPS-protein
• 3.1.4. Khảo sát nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm C. sinensis kích thích tăng sinh tổng hợp và hoạt tính sinh học của EPS bằng dầu thực vật
• 3.1.4.1. Sự thay đổi hàm lượng sinh khối và EPS của nấm C. sinensis trong môi trường nuôi cấy có bổ sung dầu thực vật
• 3.1.4.2. Kết quả khảo sát trên môi trường bổ sung dầu dừa
• 3.1.4.3. Kết quả khảo sát trên môi trường bổ sung dầu hướng dương
• 3.1.4.4. Kết quả khảo sát trên môi trường bổ sung dầu ô liu
• 3.1.5. Khảo sát hàm lượng polysaccharide và protein trong tủa EPS thu từ các môi trường bổ sung dầu
• 3.1.6. Khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do ABTS+ của tủa phức protein-EPS thu được từ 3 môi trường bổ sung dầu
• 3.1.7. Khảo sát thời gian thích hợp thu nhận sinh khối và EPS trong dịch nuôi cấy bổ sung dầu ô liu
• 3.1.8. Tối ưu hoá khả năng tổng hợp EPS trong môi trường bổ sung dầu ô liu
• 3.1.8.1. Kết quả sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng sinh khối và EPS
• 3.1.8.2. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy bằng đáp ứng bề mặt Box-Behnken
• 3.1.8.3. Hàm lượng polysaccharide và protein của EPS của 15 nghiệm thức bổ sung dầu
• 3.1.8.4. Hoạt tính bắt gốc tự do ABTS+ của 15 nghiệm thức bổ sung dầu
• 3.1.9. Xây dựng quy trình tách chiết EPS từ môi trường bổ sung dầu ô liu
• 3.1.9.1. Kết quả xác định dung môi loại dầu
• 3.1.9.2. Khảo sát hàm lượng polysaccharide và lipid trong dịch nuôi cấy nấm sau khi loại dầu
• 3.1.9.3. Khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do ABTS+ của các mẫu loại dầu
• 3.1.10. Khảo sát thu nhận phức EPS-protein
• 3.2. Thu nhận, tinh sạch và cải biến sulfate hóa nâng cao hoạt tính sinh học của các phân đoạn EPS
• 3.2.1. Thu nhận và tinh sạch EPS
• 3.2.1.1. Khảo sát nồng độ TCA dùng để loại protein khỏi phức EPS
• 3.2.1.2. Khảo sát loại protein khỏi phức EPS bằng phương pháp Sevag
• 3.2.1.3. Khảo sát nồng độ enzyme Alcalase để loại protein khỏi phức EPS
• 3.2.2. Thu nhận và khảo sát hoạt tính sinh học của các phân đoạn EPS
• 3.2.2.1. Thu nhận các phân đoạn EPS bằng lọc gel
• 3.2.2.2. Thu nhận các phân đoạn EPS bằng lọc gel sau khi loại protein bằng Alcalase 20 UI/ml
• 3.2.2.3. Hoạt tính bắt gốc tự do ABTS+, hàm lượng polysaccharide và protein của phân đoạn EPS I và EPS II
• 3.2.2.4. Khảo sát hoạt tính kháng phân bào của phân đoạn EPS I và EPS II
• 3.2.3. Khảo sát thu nhận và tinh sạch phân đoạn EPS từ dịch nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm C. sinensis bằng lọc tiếp tuyến
• 3.2.4. Kết quả cải biến sulfate hóa của các phân đoạn EPS sau lọc tiếp tuyến
• 3.2.4.1. Kết quả sulfate hóa phân đoạn < 100 kDa
• 3.2.4.2. Kết quả sulfate hóa phân đoạn 100 - 750 kDa
• 3.2.4.3. Kết quả sulfate hóa phân đoạn > 750 kDa
• 3.2.4.4. Kết quả khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do ABTS+ của 3 phân đoạn EPS sau khi được sulfate hóa
• 3.2.4.5. Khảo sát hoạt tính kháng Tyrosinase của 3 phân đoạn EPS sau khi được sulfate hóa
• 3.3. Xác định thành phần cấu tạo và cấu trúc hóa học của EPS từ dịch nuôi cấy lỏng-tĩnh C. sinensis
• 3.3.1. Khảo sát đơn vị thành phần đường đơn của EPS
• 3.3.2. Xác định các dạng liên kết glycoside trong EPS
• 3.3.3. Khảo sát cấu trúc của EPS bằng NMR
• 3.4. Bàn luận kết quả nghiên cứu của luận án và đề xuất quy trình công nghệ nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm C. sinensis tạo EPS có hoạt tính sinh học
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới Thiệu Tổng Quan Về Nấm Cordyceps Sinensis 55 ký tự

Đầu thế kỷ XIV, học giả Pier Andrea Saccarado đặt tên cho một loài nấm tìm thấy ở Tây Tạng, Trung Quốc là Cordyceps sinensis. Tên Cordyceps có nguồn gốc từ tiếng Latin, mô tả quá trình xâm nhập của nấm. Nấm Cordyceps là loài nấm nội ký sinh trên ấu trùng và côn trùng trưởng thành. Năm 1878, phát hiện nấm ký sinh trên ấu trùng chi Thitarodes. Cuối thu, bào tử nấm xâm nhập sâu non họ ngài đêm, đến đầu hè năm sau, nấm phát triển mạnh, giết chết vật chủ và hình thành quả thể. Do đó, nấm có tên "Đông trùng hạ thảo". Năm 2007, Sung và cộng sự đề nghị đổi tên thành Ophiocordyceps sinensis, tuy nhiên, C. sinensis vẫn được sử dụng phổ biến. Hiện có hơn 750 loài Cordyceps trên thế giới, nhưng mới chỉ nghiên cứu một số ít. Cordyceps sinensis là một dược phẩm quý hiếm trong y học cổ truyền, được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học.

1.1. Nguồn Gốc và Vòng Đời Phát Triển Của Nấm Cordyceps

Tên "Đông trùng hạ thảo" xuất phát từ việc nấm sống trong cơ thể côn trùng vào mùa đông và phát triển như cây cỏ vào mùa hè. Tại Trung Quốc và Nhật Bản, tên gọi này đều mang ý nghĩa tương tự. Nấm Cordyceps ký sinh trên ấu trùng họ ngài đêm Hepialidae, trong đó phổ biến nhất là chi Thitarodes. Quá trình xâm nhập và phát triển của nấm diễn ra qua nhiều giai đoạn, từ xâm nhập bào tử đến hình thành quả thể, tận dụng nguồn dinh dưỡng từ vật chủ.

1.2. Phân Loại và Danh Pháp Khoa Học Của Cordyceps Sinensis

Mặc dù đề xuất đổi tên thành Ophiocordyceps sinensis, tên Cordyceps sinensis vẫn được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu khoa học. Hiện nay, có hàng trăm loài Cordyceps khác nhau, nhưng chỉ một số ít được nghiên cứu kỹ lưỡng về dược tính. Sự đa dạng về loài và sự khác biệt về thành phần hóa học đặt ra thách thức trong việc tiêu chuẩn hóa các sản phẩm từ nấm Cordyceps.

II. Thành Phần và Hoạt Tính Sinh Học Cordyceps Sinensis 59 ký tự

Cordyceps sinensis chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm cordycepin, adenosine, polysaccharide, ergosterol, protein, acid amin và các nguyên tố vi lượng. Nghiên cứu cho thấy Cordyceps sinensis có tác dụng tăng cường miễn dịch, chống suy giảm trí nhớ, làm chậm lão hóa, bảo vệ não và tim mạch. Các dược phẩm và thực phẩm chức năng từ Đông trùng hạ thảo ngày càng phổ biến. Nguồn cung chủ yếu từ quả thể tự nhiên, tuy nhiên, công nghệ nuôi cấy lỏng nhân tạo đang được phát triển để đáp ứng nhu cầu. Dịch nuôi cấy chứa polysaccharide ngoại bào (EPS), một nguồn hoạt chất sinh học tiềm năng thường bị bỏ qua. EPS có nhiều tác dụng sinh học như điều hòa miễn dịch, kháng ung thư, chống oxy hóa.

2.1. Các Hợp Chất Có Hoạt Tính Sinh Học Trong Cordyceps

Các hợp chất chính bao gồm cordycepin và adenosine, được biết đến với vai trò trong việc tăng cường miễn dịch và bảo vệ tế bào. Polysaccharide cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên hoạt tính sinh học của Cordyceps, đặc biệt là các polysaccharide ngoại bào. Ngoài ra, Cordyceps còn chứa ergosterol, protein, acid amin và các nguyên tố vi lượng góp phần vào các tác dụng dược lý của nấm.

2.2. Tiềm Năng Ứng Dụng Của Polysaccharide Ngoại Bào Cordyceps

EPS từ Cordyceps có nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng, bao gồm điều hòa miễn dịch, kháng khối u, chống oxy hóa, và khả năng giảm đường huyết. Hoạt chất này có những tác dụng quan trọng khác như kháng viêm, giảm mệt mỏi, bảo vệ thận và bảo vệ khỏi tia phóng xạ. Nghiên cứu về EPS vẫn còn hạn chế, đặc biệt là về cấu trúc và tác dụng sinh học cụ thể của từng phân đoạn.

III. Phương Pháp Thu Nhận Polysaccharide Từ Nấm Cordyceps 58 ký tự

Nguồn polysaccharide chủ yếu từ quả thể tự nhiên, nhưng nuôi cấy lỏng nhân tạo cung cấp giải pháp bền vững. Dịch nuôi cấy chứa polysaccharide ngoại bào (EPS). Việc thu nhận EPS từ dịch nuôi cấy có ý nghĩa kinh tế và môi trường. Các phương pháp bao gồm tách chiết bằng dung môi, kết tủa bằng ethanol hoặc acetone. Quy trình tinh sạch bao gồm loại bỏ protein bằng TCA (Trichloroacetic acid) hoặc enzyme. Kỹ thuật sắc ký như lọc gel, lọc màng được sử dụng để phân tách và tinh sạch các phân đoạn EPS. Phân tích polysaccharide bao gồm xác định thành phần đường đơn, cấu trúc liên kết bằng các phương pháp hóa học và phổ nghiệm như NMR.

3.1. Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Để Tăng Sinh Khối và EPS

Môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sản lượng sinh khối và EPS. Việc bổ sung nguồn nitơ thích hợp, dầu thực vật và các yếu tố kích thích khác có thể tăng cường sản xuất EPS. Các nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) giúp xác định điều kiện tối ưu cho sản xuất EPS.

3.2. Quy Trình Tách Chiết và Tinh Sạch Polysaccharide Ngoại Bào

Quy trình tách chiết thường bắt đầu bằng việc loại bỏ sinh khối nấm và các tạp chất rắn khỏi dịch nuôi cấy. Sau đó, polysaccharide được kết tủa bằng ethanol hoặc acetone. Quá trình tinh sạch bao gồm loại bỏ protein bằng TCA, enzyme hoặc phương pháp Sevag. Cuối cùng, các kỹ thuật sắc ký như lọc gel và lọc màng được sử dụng để phân tách và tinh sạch polysaccharide.

IV. Cải Biến và Nâng Cao Hoạt Tính Sinh Học Polysaccharide 57 ký tự

Hoạt tính sinh học của EPS phụ thuộc vào thành phần, cấu trúc và kích thước. Các phương pháp cải biến polysaccharide có thể nâng cao hoạt tính. Sulfat hóa là một phương pháp phổ biến để tăng cường hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm và điều hòa miễn dịch. Các phương pháp khác bao gồm acetyl hóa, glycosyl hóa và phosphoryl hóa. Việc xác định cấu trúc và mối liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính là quan trọng để phát triển các ứng dụng dược phẩm và thực phẩm chức năng.

4.1. Phương Pháp Sulfate Hóa Để Tăng Cường Hoạt Tính Sinh Học

Sulfate hóa là quá trình gắn nhóm sulfate vào phân tử polysaccharide. Quá trình này có thể làm thay đổi cấu trúc và tính chất của polysaccharide, dẫn đến tăng cường hoạt tính sinh học. Nghiên cứu cho thấy polysaccharide sulfate hóa có hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm và điều hòa miễn dịch cao hơn.

4.2. Xác Định Cấu Trúc Polysaccharide và Mối Liên Hệ với Hoạt Tính

Việc xác định cấu trúc của polysaccharide là cần thiết để hiểu rõ cơ chế hoạt động sinh học. Các phương pháp như NMR, FT-IR và phân tích thành phần đường đơn được sử dụng để xác định cấu trúc. Mối liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính giúp tối ưu hóa quá trình cải biến polysaccharide để đạt được hoạt tính sinh học mong muốn.

V. Ứng Dụng Nghiên Cứu Polysaccharide Cordyceps 52 ký tự

Nghiên cứu polysaccharide ngoại bào từ Cordyceps mở ra tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm và thực phẩm chức năng. Polysaccharide có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư, đái tháo đường và các bệnh lý khác. Việc nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và hoạt tính sinh học sẽ giúp khai thác tối đa tiềm năng của polysaccharide Cordyceps.

5.1. Polysaccharide Cordyceps Trong Dược Phẩm và Thực Phẩm Chức Năng

Polysaccharide có thể được sử dụng như một thành phần hoạt tính trong các sản phẩm tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư và các bệnh lý khác. Các sản phẩm thực phẩm chức năng chứa polysaccharide Cordyceps có thể giúp cải thiện sức khỏe tổng thể và phòng ngừa bệnh tật. Cần có các nghiên cứu lâm sàng để chứng minh hiệu quả của các sản phẩm này.

5.2. Tiềm Năng Phát Triển Các Sản Phẩm Từ Polysaccharide Cordyceps

Nghiên cứu và phát triển các sản phẩm mới từ polysaccharide Cordyceps là một lĩnh vực đầy tiềm năng. Việc kết hợp polysaccharide với các hoạt chất khác có thể tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học hiệp đồng. Ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất polysaccharide với cấu trúc và hoạt tính được kiểm soát là một hướng đi quan trọng.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Về Polysaccharide 54 ký tự

Nghiên cứu về polysaccharide ngoại bào từ nấm Cordyceps sinensis là một lĩnh vực đầy tiềm năng. Việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy, tách chiết, tinh sạch và cải biến polysaccharide là cần thiết để khai thác tối đa giá trị của hoạt chất này. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào xác định cấu trúc chi tiết, cơ chế hoạt động sinh học và ứng dụng lâm sàng của polysaccharide Cordyceps.

6.1. Tổng Kết Các Kết Quả Nghiên Cứu Về Polysaccharide Cordyceps

Nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng sinh học của polysaccharide trong việc hỗ trợ miễn dịch và ngăn ngừa bệnh tật. Polysaccharide ngoại bào Cordyceps sinensis có vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo và Tiềm Năng Ứng Dụng Rộng Rãi

Cần tập trung vào xác định cấu trúc chi tiết, cơ chế hoạt động sinh học và ứng dụng lâm sàng của polysaccharide Cordyceps. Khám phá những phương pháp mới trong cải tiến hoạt tính sinh học polysaccharide Cordyceps.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Nấm Cordyceps sinensis (tên đồng danh Ophiocordyceps sinensis), thường gọi là Đông trùng hạ thảo, là loài nấm dược liệu ký sinh trên sâu non thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera), phân bố tự nhiên chủ yếu ở các vùng núi cao 3000 – 5000 m so với mực nước biển như Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Vân Nam (Trung Quốc) và dãy Himalaya. Do khai thác quá mức và ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, nguồn nấm tự nhiên ngày càng cạn kiệt, thúc đẩy sự phát triển của công nghệ nuôi cấy nhân tạo để thu nhận sinh khối sợi nấm.

Tuy nhiên, trong quy trình sản xuất sinh khối nấm C. sinensis bằng phương pháp nuôi cấy lỏng, dịch nuôi cấy sau khi tách sợi nấm thường bị thải bỏ. Việc này vừa làm gia tăng chi phí xử lý môi trường, vừa làm thất thoát một lượng lớn polysaccharide ngoại bào (exopolysaccharide - EPS) – nhóm hợp chất biến dưỡng có nhiều hoạt tính sinh học như điều hòa miễn dịch, kháng oxy hóa, kháng khối u và hạ đường huyết. Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu toàn diện về môi trường nuôi cấy lỏng-tĩnh nhằm kích thích sinh tổng hợp EPS từ C. sinensis, cũng như quy trình thu nhận, tinh sạch, phân tích đặc điểm cấu trúc hóa học và nâng cao hoạt tính sinh học của EPS thông qua cải biến cấu trúc vẫn còn rất hạn chế.

Mục tiêu và các nội dung nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của luận án là xây dựng quy trình nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm C. sinensis, thu nhận, tinh sạch, xác định cấu trúc và cải biến nhằm nâng cao hoạt tính sinh học của polysaccharide ngoại bào. Luận án triển khai 4 nội dung nghiên cứu chính (được đánh số theo văn bản):

1. Nội dung 1: Khảo sát nguồn nitơ thích hợp trong nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm C. sinensis để thu nhận EPS có hoạt tính sinh học và nghiên cứu kích thích tăng sinh tổng hợp EPS bằng cách bổ sung dầu thực vật.
2. Nội dung 2: Khảo sát quy trình thu nhận, tinh sạch và cải biến sulfate hóa nhằm nâng cao hoạt tính sinh học của các phân đoạn EPS.
3. Nội dung 3: Khảo sát thành phần cấu tạo và cấu trúc hóa học của EPS thu nhận từ dịch nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm C. sinensis.
4. Nội dung 4: Nghiên cứu đề xuất quy trình công nghệ nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm C. sinensis tạo EPS có hoạt tính sinh học.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm Cordyceps sinensis CS-YK2007 (do TS. Trương Bình Nguyên, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Nông nghiệp Công nghệ cao, Trường Đại học Đà Lạt cung cấp) và sản phẩm polysaccharide ngoại bào (EPS) tiết ra trong dịch nuôi cấy lỏng-tĩnh.
• Phạm vi không gian: Các thí nghiệm nuôi cấy, tách chiết, tinh sạch và phân tích hóa lý, hoạt tính sinh học được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh hóa (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh), Viện Sinh học Nhiệt đới và Học viện Khoa học và Công nghệ (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
• Phạm vi thời gian: Luận án hoàn thành và bảo vệ năm 2023.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Luận án điểm lại hệ thống tài liệu nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến phân loại học, công nghệ nuôi cấy, cấu trúc và hoạt tính sinh học của polysaccharide từ C. sinensis:

• Phân loại học và đặc tính sinh học: Pier Andrea Saccardo đặt tên chi Cordyceps từ đầu thế kỷ XIV; Sung và cộng sự (2007) đề xuất chuyển danh pháp C. sinensis thành Ophiocordyceps sinensis. Nhóm tác giả Mỹ, Thái Lan, Hàn Quốc (2010) sắp xếp lại chi này thuộc 3 họ: Clavicipitaceae, Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae.
• Công nghệ nuôi cấy lỏng nấm C. sinensis: Các nghiên cứu của Kim và Yun (2005), Cha và cộng sự (2007), Leung và cộng sự (2007), Wu, Chen và Hao (2009), Yin và cộng sự (2013) đã xác lập các thông số môi trường lỏng có bổ sung saccharose, glucose, peptone, cao nấm men và muối khoáng để thu nhận sinh khối và EPS. Bổ sung nguồn nitơ vô cơ như $NH_4Cl$ ở nồng độ 10 mmol/L kích thích tổng hợp cordycepin và EPS (Leung và Wu, 2007); bổ sung muối $CaCl_2$, $MgSO_4$, $K_2HPO_4$ kích thích tăng trưởng sinh khối (Chen và cộng sự, 2007; Wang và cộng sự, 2019).
• Kích thích sinh tổng hợp bằng lipid: Stasinopoulos và Seviour (1990), Yang và cộng sự (2000, 2005), Park và cộng sự (2002) chứng minh các loại dầu thực vật (dầu ô liu, hướng dương, đậu nành) và acid béo (acid oleic, acid palmitic) có khả năng kích thích tăng sinh khối và hàm lượng EPS ở các loài Acremonium persicinum, Ganoderma lucidum và Cordyceps militaris.
• Hoạt tính sinh học của EPS: Pasteur (1861) phát hiện EPS đầu tiên ở vi sinh vật. Nghiên cứu của Dong và Yao (2008), Li và cộng sự (2003), Cheung và cộng sự (2009), Lin R và cộng sự (2012), Sharmi Stha Sinha và cộng sự (2015) chứng minh EPS từ chi Cordyceps có khả năng bắt các gốc tự do DPPH, ABTS+, superoxide, hydroxyl, kích thích tiết cytokine (TNF-$\alpha$, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10) và ức chế tế bào khối u. Chen và cộng sự (2010) và Leung và cộng sự (2009) chỉ ra rằng polysaccharide liên kết với protein thành phức hợp polysaccharide-protein (PSP) có hoạt tính kháng oxy hóa tỷ lệ thuận với hàm lượng protein gắn kèm.
• Cấu trúc hóa học và phương pháp phân tích: Miyazaki và cộng sự (1977), Nie và cộng sự (2011), Yan và cộng sự (2010), Kim và cộng sự (2009), Chen và cộng sự (2009), Wang và cộng sự (2009, 2010) xác định đơn vị đường đơn của polysaccharide C. sinensis chủ yếu gồm glucose, mannose, galactose. Cấu trúc mạch chính và mạch nhánh được phân tích thông qua thủy phân bằng acid trifluoroacetic (TFA), tạo dẫn xuất PMP (1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone) chạy HPLC, phản ứng thoái hóa Smith, methyl hóa phân tích GC-MS, phổ hồng ngoại FT-IR (Ren và cộng sự, 2019, 2020) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D NMR (Yuan và cộng sự, 2016).
• Cải biến cấu trúc hóa học: Yan và cộng sự (2010) sulfate hóa EPS bằng phức hợp chlorosulfonic acid-pyridine (CSA-Pyr) tạo dẫn xuất S-EPS-1D có hoạt tính bắt gốc tự do ABTS+ và hydroxyl tăng vượt trội.

Khoảng trống nghiên cứu được giải quyết

Mặc dù đã có các công bố về nuôi cấy lỏng lắc và thu hồi sinh khối C. sinensis, nhưng ảnh hưởng của dầu thực vật đến quá trình nuôi cấy lỏng-tĩnh nhằm kích thích tiết EPS của chủng nấm này chưa từng được công bố. Bên cạnh đó, việc tách phân đoạn EPS bằng kết hợp lọc tiếp tuyến (TFF), loại protein bằng enzyme Alcalase, sulfate hóa các phân đoạn kích thước khác nhau và giải mã cấu trúc phân tử EPS dưới tác động của các nguồn dinh dưỡng khác nhau tại Việt Nam là những khoảng trống khoa học mà luận án trực tiếp giải quyết.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Lý thuyết sinh tổng hợp EPS: Quá trình chuyển hóa nguồn carbon thành các phân tử tiền chất nucleotide-đường (như UDP-glucose, UDP-galactose, UDP-mannose) dưới sự xúc tác của các enzyme nội bào (hexokinase, pyrophosphorylase), sau đó enzyme glycosyltransferase (GTF) lắp ráp chuỗi polymer và tiết ra môi trường ngoài tế bào.
• Lý thuyết phức hợp polysaccharide-protein (PSP): EPS tồn tại ở dạng liên kết với protein tự nhiên; hàm lượng protein và cấu trúc chuỗi carbohydrate quyết định tính chất hóa lý và hoạt tính sinh học.
• Lý thuyết sulfate hóa polysaccharide: Sự thay thế các nhóm hydroxyl (-OH) bằng nhóm ester sulfate ($-SO_3^-$ / $-OSO_3^-$) trên khung phân tử carbohydrate làm biến đổi mật độ điện tích bề mặt, tăng độ hòa tan và gia tăng tương tác liên kết với các gốc tự do hoặc thụ thể tế bào.
• Khung phân tích quy hoạch thực nghiệm: Ứng dụng ma trận sàng lọc Plackett-Burman và phương pháp đáp ứng bề mặt Box-Behnken (RSM) để tối ưu hóa đa biến số môi trường nuôi cấy.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án kết hợp các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm sinh học, hóa học phân tích và hóa sinh học:

1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh:
   • Hoạt hóa và nhân giống cấp 1 trên thạch PGA (khoai tây 200 g/L, glucose 20 g/L, agar 15 g/L), ủ ở $20 \pm 2^\circ\text{C}$ trong 7 ngày.
   • Nhân giống cấp 2 trong môi trường dịch thể PG (khoai tây 200 g/L, glucose 20 g/L, pH 6,0 – 7,0).
   • Nuôi cấy lỏng-tĩnh trong hộp nhựa vô trùng 500 mL chứa 200 mL môi trường dinh dưỡng ở $20 \pm 2^\circ\text{C}$ trong 30 – 40 ngày.
2. Phương pháp tách chiết và định lượng hóa sinh:
   • Tách sinh khối bằng ly tâm (4.000 vòng/phút, 10 phút), cô quay chân không dịch nuôi cấy ở $60^\circ\text{C}$ còn 1/10 thể tích.
   • Tủa EPS thô bằng ethanol lạnh 96% theo tỷ lệ thể tích dịch:ethanol là 1:5 ở $4^\circ\text{C}$ trong 24 giờ.
   • Định lượng đường tổng bằng phương pháp Phenol – Acid Sulfuric ($H_2SO_4$ đậm đặc, phenol 5%), đo mật độ quang OD ở bước sóng 490 nm, dùng đường chuẩn saccharose (0 – 70 $\mu\text{g/mL}$).
   • Định lượng protein bằng phương pháp Bradford (thuốc thử Coomassie Brilliant Blue G250 trong acid phosphoric), đo OD ở bước sóng 595 nm, dùng đường chuẩn albumin (0 – 70 $\mu\text{g/mL}$).
3. Phương pháp tinh sạch và phân đoạn:
   • Khảo sát loại protein khỏi phức EPS bằng 3 phương pháp: acid trichloroacetic (TCA 10%), dung môi Sevag (chloroform : n-butanol tỷ lệ 4:1 v/v), và enzyme protease Alcalase (20 UI/mL).
   • Phân đoạn EPS bằng sắc ký lọc gel trên cột Sephadex G-100 (thu 2 phân đoạn EPS I và EPS II).
   • Phân đoạn EPS theo kích thước phân tử bằng kỹ thuật lọc màng dòng tiếp tuyến (Tangential Flow Filtration - TFF) với các màng cắt kích thước, thu nhận 3 phân đoạn: $< 100\text{ kDa}$, $100 - 750\text{ kDa}$, và $> 750\text{ kDa}$.
4. Phương pháp cải biến hóa học (Sulfate hóa):
   • Sulfate hóa EPS bằng phức chất Sulfur trioxide pyridine ($SO_3\cdot\text{Pyr}$) / chlorosulfonic acid-pyridine.
   • Xác định mức độ thay thế nhóm sulfate (Degree of Substitution - DS) bằng phương pháp chuẩn độ/kết tủa muối $BaCl_2$.
   • Kiểm tra liên kết sulfate gắn vào khung polysaccharide bằng phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR).
5. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro:
   • Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa thông qua năng lực bắt gốc tự do cation $ABTS^{\bullet+}$ tại bước sóng 734 nm.
   • Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme Tyrosinase (sử dụng L-DOPA làm cơ chất, đo sản phẩm dopachrome ở 475 nm), xác định giá trị $IC_{50}$.
   • Khảo sát hoạt tính độc tế bào / kháng phân bào và thử nghiệm kích hoạt apoptosis trên dòng tế bào ung thư biểu mô gan người Hep-G2.
6. Phương pháp phân tích cấu trúc hóa học:
   • Thủy phân polysaccharide thành đường đơn bằng acid trifluoroacetic (TFA 2 M ở $120^\circ\text{C}$ trong 6 giờ).
   • Tạo dẫn xuất đường đơn với 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) trong môi trường kiềm NaOH 0,3 M ở $70^\circ\text{C}$, trung hòa bằng HCl 0,3 M, chiết loại PMP dư bằng chloroform.
   • Định tính và định lượng đơn phân trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC Agilent 1260, đầu dò UV, cột ZORBAX Eclipse XDB-C18 / Lichrosorb RP18).
   • Phân tích kiểu liên kết glycoside qua methyl hóa kết hợp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS).
   • Phân tích cấu trúc phân tử tổng thể bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1\text{H}$-NMR và NMR 2 chiều (COSY, HSQC, HMBC, TOCSY, NOESY).
7. Phương pháp xử lý số liệu và tối ưu hóa:
   • Xử lý thống kê và phân tích phương sai (ANOVA).
   • Thiết kế thực nghiệm sàng lọc Plackett-Burman và tối ưu hóa bề mặt đáp ứng Box-Behnken trên phần mềm chuyên dụng (Design-Expert).

Hạng mục thực nghiệm	Hóa chất / Thiết bị chính	Mục đích kỹ thuật
Nuôi cấy lỏng-tĩnh	Khoai tây, saccharose, peptone, cao nấm men, dầu ô liu, dầu dừa, dầu hướng dương	Tăng sinh khối nấm và kích thích tiết EPS ngoại bào
Tách chiết & Tinh sạch	Ethanol 96%, TCA, Chloroform, Butanol, Enzyme Alcalase, Sephadex G-100, Màng lọc tiếp tuyến (TFF)	Thu hồi, loại bỏ protein liên kết và phân tách phân đoạn EPS theo khối lượng phân tử
Cải biến hóa học	Phức chất $SO_3\cdot\text{Pyr}$, pyridine, dimethylformamide	Gắn nhóm sulfate ($-SO_3^-$) vào khung phân tử EPS
Phân tích cấu trúc	TFA, thuốc thử PMP, máy HPLC Agilent 1260, FT-IR, hệ thống NMR	Xác định tỷ lệ đường đơn, kiểu liên kết glycoside và cấu trúc khung phân tử
Thử nghiệm sinh học	Gốc tự do ABTS, enzyme Tyrosinase, L-DOPA, tế bào ung thư gan Hep-G2	Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa, làm sáng da và ức chế tế bào ung thư

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan tài liệu

Chương I trình bày tổng quan hệ thống gồm 4 nội dung chính:

1. Nguồn gốc, vòng đời phát triển của nấm Cordyceps sinensis ký sinh trên sâu non họ Hepialidae (chi Thitarodes), vị trí phân loại học và các thành phần hoạt chất sinh học chính (cordycepin, adenosine, polysaccharide, ergosterol, mannitol, peptide).
2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy nhân tạo nấm C. sinensis trên môi trường lỏng và bán rắn. Tổng hợp các thông số nuôi cấy lỏng từ các công trình quốc tế (nhiệt độ $20 - 26^\circ\text{C}$, pH 4,0 – 7,0, nguồn carbon saccharose/glucose, nguồn nitơ peptone/cao nấm men, thời gian 4 – 16 ngày).
3. Bản chất hóa học, phân loại (homopolysaccharide và heteropolysaccharide) và dự đoán con đường sinh tổng hợp EPS dựa trên mô hình vi khuẩn Bifidobacterium IPLA-R1 qua 4 giai đoạn (hoạt hóa tiền chất tạo UDP-đường, lắp ráp chuỗi bởi GTF và tiết ra ngoài).
4. Các phương pháp thu nhận, tinh sạch (loại protein bằng Sevag, TCA, enzyme), phương pháp cải biến cấu trúc (sulfate hóa, carboxymethyl hóa, acetyl hóa, phương pháp vật lý/sinh học), và cơ sở khoa học của việc bổ sung dầu thực vật (dầu ô liu, hướng dương, dừa) kích thích tính thấm màng tế bào và enzyme glucan synthetase nhằm gia tăng năng suất sinh tổng hợp EPS.

Chương II: Vật liệu và phương pháp

Chương II mô tả chi tiết nguồn vật liệu, hóa chất, chủng giống nấm C. sinensis CS-YK2007 và bố trí các hệ thống thực nghiệm:

• Xây dựng quy trình chuẩn bị giống cấp 1 (môi trường PGA) và cấp 2 (môi trường dịch thể PG).
• Bố trí thí nghiệm nuôi cấy trên 3 môi trường cơ bản có nguồn nitơ khác nhau (Môi trường cơ bản; Môi trường bổ sung 6 g/L peptone + 4 g/L cao nấm men; Môi trường bổ sung 10 g/L bột nhộng) để đánh giá động thái tạo sinh khối và phức EPS-protein qua các mốc 10, 20, 30, 40 ngày.
• Bố trí thí nghiệm bổ sung 3 loại dầu thực vật (dầu dừa, dầu hướng dương, dầu ô liu) ở các nồng độ khác nhau; xây dựng quy trình loại dầu tồn dư bằng dung môi hữu cơ trước khi tủa EPS.
• Ứng dụng quy hoạch thực nghiệm Plackett-Burman để sàng lọc các biến môi trường có ý nghĩa thống kê và thiết kế Box-Behnken (15 nghiệm thức) để tối ưu hóa hàm lượng EPS và khả năng kháng oxy hóa.
• Bố trí quy trình loại protein khỏi phức EPS (so sánh TCA 10%, Sevag 4:1 và Alcalase 20 UI/mL); quy trình phân đoạn bằng sắc ký cột lọc gel Sephadex G-100 và hệ thống lọc màng tiếp tuyến TFF (ngưỡng cắt 100 kDa và 750 kDa).
• Bố trí phản ứng sulfate hóa 3 phân đoạn EPS thu được sau lọc tiếp tuyến bằng tác nhân $SO_3\cdot\text{Pyr}$, đo độ thế DS và phân tích FT-IR.
• Chi tiết hóa quy trình phân tích thành phần đường đơn qua dẫn xuất PMP bằng HPLC, xác định liên kết glycoside qua GC-MS và phân tích cấu trúc tổng thể bằng phổ $^1\text{H}$-NMR và NMR 2D.

Thành phần môi trường	Môi trường cơ bản	Môi trường Peptone & Cao nấm men	Môi trường Bột nhộng
Khoai tây	200 g/L	200 g/L	200 g/L
Saccharose	50 g/L	50 g/L	50 g/L
$K_2HPO_4$	0,5 g/L	0,5 g/L	0,5 g/L
$KH_2PO_4$	0,5 g/L	0,5 g/L	0,5 g/L
$MgSO_4$	0,2 g/L	0,2 g/L	0,2 g/L
Peptone	—	6,0 g/L	—
Cao nấm men	—	4,0 g/L	—
Bột nhộng tằm	—	—	10,0 g/L

Chương III: Kết quả và bàn luận

Chương III trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được theo 4 nhóm nội dung:

1. Khảo sát điều kiện nuôi cấy lỏng-tĩnh và kích thích sinh tổng hợp bằng dầu thực vật

• Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Môi trường bổ sung peptone và cao nấm men cho khả năng sinh trưởng sinh khối khô và tiết phức hợp EPS-protein cao nhất sau 40 ngày nuôi cấy. Hàm lượng đường và protein trong phức hợp biến đổi theo thời gian nuôi; hoạt tính bắt gốc tự do $ABTS^{\bullet+}$ của phức EPS-protein thu từ môi trường peptone + cao nấm men ở ngày thứ 40 đạt giá trị cao nhất.
• Kích thích bằng dầu thực vật: Cả 3 loại dầu (dầu dừa, dầu hướng dương, dầu ô liu) đều thúc đẩy sự tăng trưởng sinh khối và tăng hàm lượng EPS so với đối chứng không bổ sung dầu. Trong đó, dầu ô liu thể hiện hiệu quả kích thích mạnh nhất lên cả năng suất sinh khối khô, sản lượng EPS và hoạt tính kháng oxy hóa của tủa EPS thu nhận.
• Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy bổ sung dầu ô liu:
  • Ma trận sàng lọc Plackett-Burman xác định các yếu tố ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê lớn nhất đến hàm lượng EPS.
  • Mô hình bề mặt đáp ứng Box-Behnken (15 nghiệm thức) thiết lập phương trình hồi quy tương quan giữa các thành phần môi trường và hàm lượng EPS cũng như giá trị $IC_{50}$ kháng oxy hóa. Thí nghiệm kiểm chứng trên môi trường tối ưu cho kết quả thực nghiệm tương thích cao với giá trị mô hình dự đoán.
• Quy trình loại dầu và thu hồi EPS: Xác định hệ dung môi hữu cơ thích hợp để tách lớp và loại bỏ triệt để lipid khỏi dịch nuôi cấy trước khi tủa ethanol, đảm bảo mẫu EPS thu được không bị lẫn lipid mà không làm suy giảm hoạt tính bắt gốc tự do.

2. Tinh sạch, phân đoạn và cải biến sulfate hóa EPS

• Hiệu quả loại protein: So sánh 3 phương pháp cho thấy xử lý bằng enzyme Alcalase ở nồng độ 20 UI/mL đạt hiệu quả loại bỏ protein cao, bảo tồn tối đa cấu trúc mạch polysaccharide so với phương pháp hóa học dùng TCA 10% (dễ gây thủy phân cắt mạch đường) và phương pháp Sevag (sử dụng dung môi độc hại, hiệu suất thu hồi thấp).
• Phân đoạn EPS:
  • Qua sắc ký lọc gel Sephadex G-100: Tách được 2 phân đoạn chính là EPS I và EPS II. Phân đoạn EPS I có khối lượng phân tử lớn hơn, hàm lượng polysaccharide cao và thể hiện hoạt tính gây độc/kháng phân bào rõ rệt trên dòng tế bào ung thư gan người Hep-G2 với giá trị $IC_{50}$ xác định.
  • Qua hệ thống lọc tiếp tuyến (TFF): Tách thành công 3 phân đoạn kích thước: $< 100\text{ kDa}$, $100 - 750\text{ kDa}$, và $> 750\text{ kDa}$.
• Cải biến sulfate hóa và hoạt tính sinh học:
  • Sulfate hóa thành công cả 3 phân đoạn EPS thu được sau lọc tiếp tuyến bằng phức chất $SO_3\cdot\text{Pyr}$. Phổ FT-IR của các phân đoạn sau sulfate hóa xuất hiện các đỉnh hấp thụ đặc trưng của liên kết $S=O$ (vùng xung quanh $1240 - 1250\text{ cm}^{-1}$) và liên kết $C-O-S$ (vùng $810 - 830\text{ cm}^{-1}$).
  • Cả 3 phân đoạn sau khi gắn nhóm sulfate đều có hoạt tính bắt gốc tự do $ABTS^{\bullet+}$ gia tăng vượt bậc so với các phân đoạn EPS nguyên bản chưa biến tính.
  • Phân đoạn EPS sulfate hóa thể hiện hoạt tính ức chế mạnh enzyme Tyrosinase, mở ra khả năng ứng dụng trong ức chế tổng hợp melanin.

Phân đoạn EPS (Lọc tiếp tuyến TFF)	Trọng lượng phân tử (MW)	Cải biến hóa học	Biến đổi phổ FT-IR đặc trưng	Hoạt tính sinh học sau biến tính
Phân đoạn 1	$< 100\text{ kDa}$	Sulfate hóa ($SO_3\cdot\text{Pyr}$)	Xuất hiện peak $S=O$ và $C-O-S$	Tăng mạnh năng lực bắt gốc $ABTS^{\bullet+}$, ức chế Tyrosinase
Phân đoạn 2	$100 - 750\text{ kDa}$	Sulfate hóa ($SO_3\cdot\text{Pyr}$)	Xuất hiện peak $S=O$ và $C-O-S$	Hoạt tính bắt gốc $ABTS^{\bullet+}$ và ức chế Tyrosinase tối ưu
Phân đoạn 3	$> 750\text{ kDa}$	Sulfate hóa ($SO_3\cdot\text{Pyr}$)	Xuất hiện peak $S=O$ và $C-O-S$	Tăng hoạt tính kháng oxy hóa

3. Cấu trúc hóa học và thành phần đường đơn của EPS

• Thành phần đường đơn: Phân tích dẫn xuất PMP-đường bằng HPLC từ dịch nuôi cấy nấm C. sinensis trên 5 nghiệm thức môi trường chứa các nguồn carbon/nitơ khác nhau (glucose, fructose, sucrose, peptone, hỗn hợp và đối chứng) cho thấy thành phần cấu tạo gồm 3 loại đường đơn chính là Glucose, Mannose và Galactose. Tỷ lệ phần trăm mol giữa các monosaccharide thay đổi phụ thuộc trực tiếp vào loại cơ chất cung cấp trong môi trường nuôi cấy.
• Cấu trúc liên kết và phổ NMR: Phân tích methyl hóa/GC-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR, NMR 2 chiều) xác định các liên kết glycoside chủ yếu dạng $\alpha\text{-(1}\rightarrow\text{6)-D-glucopyranosyl}$, $\alpha\text{-(1}\rightarrow\text{4)-D-glucopyranosyl}$ và các liên kết nhánh gắn gốc mannosyl/galactosyl.
• Đề xuất quy trình công nghệ: Luận án tổng hợp toàn bộ các thông số kỹ thuật tối ưu để xây dựng sơ đồ quy trình công nghệ hoàn chỉnh nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm C. sinensis, thu nhận, tinh sạch bằng enzyme Alcalase, phân đoạn bằng lọc tiếp tuyến và sulfate hóa EPS định hướng ứng dụng thực tiễn.

Chương IV: Kết luận và kiến nghị

Chương IV đúc kết toàn bộ các kết luận khoa học đạt được tương ứng với 4 nội dung nghiên cứu, đồng thời nêu các kiến nghị tiếp theo nhằm mở rộng thử nghiệm quy mô và đánh giá an toàn sinh học in vivo.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

1. Khám phá tác động kích thích của dầu thực vật: Lần đầu tiên chứng minh việc bổ sung dầu thực vật (đặc biệt là dầu ô liu) vào môi trường nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm Cordyceps sinensis làm tăng sinh khối sợi nấm, kích thích mạnh quá trình sinh tổng hợp và tiết polysaccharide ngoại bào (EPS) có hoạt tính kháng oxy hóa cao.
2. Làm sáng tỏ mối liên hệ giữa cơ chất và cấu trúc EPS: Cung cấp dữ liệu khoa học về sự biến đổi tỷ lệ các đơn phân monosaccharide (glucose, mannose, galactose) và các dạng liên kết glycoside trong cấu trúc EPS dưới ảnh hưởng của các nguồn cơ chất dinh dưỡng carbon và nitơ khác nhau trong nuôi cấy lỏng-tĩnh.
3. Cơ chế nâng cao hoạt tính bằng sulfate hóa: Chứng minh thực nghiệm việc gắn nhóm ester sulfate vào các phân đoạn EPS có khối lượng phân tử xác định ($<100\text{ kDa}$, $100 - 750\text{ kDa}$, $>750\text{ kDa}$) làm gia tăng hoạt tính bắt gốc tự do $ABTS^{\bullet+}$ và kích hoạt khả năng ức chế enzyme Tyrosinase.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và công nghệ

1. Thiết lập quy trình công nghệ nuôi cấy tối ưu: Xây dựng thành công công thức môi trường nuôi cấy lỏng-tĩnh tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng Box-Behnken có bổ sung dầu ô liu, giúp nâng cao năng suất thu nhận sinh khối và EPS từ chủng nấm C. sinensis CS-YK2007 tại Việt Nam.
2. Quy trình tinh sạch và phân đoạn thân thiện: Xác lập quy trình loại bỏ triệt để lipid bằng dung môi hữu cơ, loại protein khỏi phức EPS bằng enzyme protease Alcalase 20 UI/mL đạt hiệu suất cao, không làm đứt gãy mạch polymer như acid vô cơ và an toàn hơn phương pháp Sevag.
3. Ứng dụng kỹ thuật màng lọc dòng tiếp tuyến (TFF): Ứng dụng thành công hệ thống lọc màng tiếp tuyến để phân tách liên tục các phân đoạn EPS theo khối lượng phân tử phục vụ cho quá trình cải biến hóa học định hướng đích.
4. Tạo nguồn nguyên liệu hoạt tính cao: Tạo ra các dẫn xuất EPS sulfate hóa có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, ức chế Tyrosinase và phân đoạn EPS có hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan Hep-G2, cung cấp tiềm năng ứng dụng trong ngành dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

• Các thử nghiệm hoạt tính sinh học (kháng oxy hóa, ức chế Tyrosinase, độc tế bào ung thư gan Hep-G2) mới chỉ dừng lại ở quy mô thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào nuôi cấy và phản ứng enzyme hóa sinh, chưa thực hiện khảo sát trên mô hình động vật sống (in vivo).
• Quy trình nuôi cấy lỏng-tĩnh và tách chiết EPS mới được khảo sát, tối ưu hóa ở quy mô phòng thí nghiệm (bình tam giác, hộp nuôi 500 mL, thể tích mẻ 10 L), chưa triển khai thử nghiệm ở quy mô pilot hoặc công nghiệp.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Nghiên cứu đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và kiểm tra hoạt tính điều hòa miễn dịch, kháng u của các phân đoạn EPS sulfate hóa trên mô hình động vật thực nghiệm in vivo.
• Nghiên cứu mở rộng quy mô nuôi cấy lỏng-tĩnh trên hệ thống khay/bể nuôi lớn hơn hoặc hệ thống lên men bề mặt tự động hóa nhằm hoàn thiện dây chuyền sản xuất EPS quy mô thương mại.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên sâu và hữu ích cho các đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Hóa sinh học, Hóa hợp chất thiên nhiên và Khoa học Thực phẩm: Cung cấp cơ sở lý thuyết và phương pháp luận về quy hoạch thực nghiệm (Plackett-Burman, Box-Behnken), kỹ thuật phân tích cấu trúc carbohydrate phức tạp (PMP-HPLC, FT-IR, GC-MS, NMR 1D/2D) và kỹ thuật cải biến hóa học polysaccharide.
• Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất nấm dược liệu: Cung cấp giải pháp công nghệ để tận dụng triệt để nguồn dịch thải sau nuôi cấy nấm Đông trùng hạ thảo, giúp thu hồi hoạt chất EPS có giá trị gia tăng cao, tối ưu hóa hiệu quả kinh tế và giảm thiểu ô nhiễm môi trường.
• Nhà phát triển sản phẩm dược – mỹ phẩm: Tham khảo quy trình chế tạo dẫn xuất EPS sulfate hóa có khả năng ức chế enzyme Tyrosinase và kháng oxy hóa để ứng dụng trong các chế phẩm bảo vệ da, làm sáng da hoặc hỗ trợ điều trị bệnh.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Việc bổ sung dầu thực vật vào môi trường nuôi cấy lỏng-tĩnh nấm Cordyceps sinensis nhằm mục đích gì và loại dầu nào hiệu quả nhất?

Mục đích của việc bổ sung dầu thực vật là cung cấp nguồn lipid và acid béo để kích thích sự phát triển của hệ sợi nấm, làm thay đổi thành phần và tăng tính thấm của màng sinh học, đồng thời kích thích các enzyme sinh tổng hợp polysaccharide (như glucan synthetase), từ đó làm tăng lượng EPS tiết ra dịch nuôi cấy. Trong 3 loại dầu khảo sát (dầu dừa, dầu hướng dương, dầu ô liu), dầu ô liu mang lại hiệu quả cao nhất về cả sản lượng sinh khối khô, hàm lượng EPS và hoạt tính kháng oxy hóa.

2. Luận án sử dụng phương pháp nào để loại protein ra khỏi phức hợp EPS và tại sao?

Luận án đã khảo sát và so sánh 3 phương pháp loại protein: dùng acid trichloroacetic (TCA 10%), phương pháp Sevag (chloroform : n-butanol tỷ lệ 4:1 v/v) và sử dụng enzyme protease Alcalase (20 UI/mL). Luận án lựa chọn enzyme Alcalase vì phương pháp này cho hiệu suất loại bỏ protein cao, điều kiện phản ứng êm dịu không làm thủy phân hay phá hủy cấu trúc mạch polysaccharide chính, an toàn và thân thiện với môi trường hơn so với việc dùng dung môi độc hại (Sevag) hoặc acid mạnh (TCA).

3. Kỹ thuật nào được áp dụng để phân tách các phân đoạn EPS theo khối lượng phân tử?

Luận án sử dụng hai kỹ thuật chính:

• Sắc ký lọc gel Sephadex G-100: Thu nhận được 2 phân đoạn chính là EPS I và EPS II.
• Kỹ thuật lọc màng dòng tiếp tuyến (Tangential Flow Filtration - TFF): Sử dụng các màng lọc có kích thước lỗ xác định để tách liên tục 3 phân đoạn kích thước: $< 100\text{ kDa}$, $100 - 750\text{ kDa}$, và $> 750\text{ kDa}$.

4. Cải biến sulfate hóa mang lại những thay đổi gì cho hoạt tính sinh học của EPS?

Phản ứng sulfate hóa bằng phức chất $SO_3\cdot\text{Pyr}$ đã gắn thành công các nhóm ester sulfate ($-SO_3^-$) lên khung phân tử của 3 phân đoạn EPS (được chứng minh qua phổ FT-IR tại vùng $1240 - 1250\text{ cm}^{-1}$ và $810 - 830\text{ cm}^{-1}$). Dẫn xuất sulfate hóa làm tăng vượt bậc hoạt tính kháng oxy hóa (năng lực bắt gốc tự do $ABTS^{\bullet+}$) và tạo ra khả năng ức chế mạnh mẽ enzyme Tyrosinase so với các mẫu EPS ban đầu chưa biến tính.

5. Thành phần đơn phân đường đơn của EPS từ nấm C. sinensis gồm những loại đường nào?

Qua phương pháp thủy phân bằng TFA, tạo dẫn xuất với PMP và phân tích trên HPLC, thành phần đường đơn của EPS tiết ra từ nấm C. sinensis CS-YK2007 gồm 3 monosaccharide chính là Glucose, Mannose và Galactose. Tỷ lệ phần trăm mol giữa các loại đường này có sự thay đổi rõ rệt tùy thuộc vào thành phần nguồn carbon và nitơ được cung cấp trong môi trường nuôi cấy lỏng-tĩnh.

---

Kết luận

Luận án đã giải quyết hoàn chỉnh chuỗi nghiên cứu từ công nghệ nuôi cấy lỏng-tĩnh chủng nấm Cordyceps sinensis CS-YK2007 có bổ sung dầu ô liu, tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt Box-Behnken, đến quy trình tách chiết, tinh sạch EPS bằng enzyme Alcalase và phân đoạn bằng kỹ thuật lọc tiếp tuyến. Nghiên cứu đã xác định được thành phần đơn phân (glucose, mannose, galactose), đặc điểm liên kết glycoside và cấu trúc khung phân tử của EPS, đồng thời chứng minh việc sulfate hóa các phân đoạn EPS giúp nâng cao hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế enzyme Tyrosinase. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và giải pháp công nghệ giá trị nhằm tận dụng hiệu quả dịch nuôi cấy nấm Đông trùng hạ thảo để sản xuất các hoạt chất sinh học ứng dụng trong công nghệ sinh học, dược phẩm và thực phẩm chức năng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về nấm Cordyceps sinensis 1. Nguồn gốc và vòng đời phát triển Đầu thế kỉ XIV, học giả người Italia, Pier Andrea Saccarado đặt tên cho một loài nấm tìm thấy ở Tây Tạng, Trung Quốc là “Cordyceps sinensis”. Tên Cordyceps có nguồn gốc từ tiếng Latin bao gồm hai từ là “cord” và “ceps” có nghĩa tương ứng là “thân” và “đầu”.

Các từ Latin kết hợp với nhau mô tả chính xác quá trình xâm nhập của nấm Cordyceps. Cordyceps là loài nấm nội ký sinh trên ấu trùng và các cá thể trưởng thành của nhiều loài côn trùng khác nhau [1]. Năm 1878, các nhà khoa học đã phát hiện ra nấm này ký sinh trên ấu trùng của một loài côn trùng thuộc chi Thitarodes. Thường dễ gặp nhất ở sâu non loài T.

Ngoài ra, hơn 50 loài khác thuộc họ Hepialidae (Lepidoptera) cũng bị nấm thuộc chi Cordyceps ký sinh. Vào cuối mùa thu, các chất trên biểu bì của sâu non họ ngài đêm tương tác với các bào tử nấm và hình thành các sợi nấm, các sợi nấm đâm sâu vào ấu trùng. Đến đầu mùa hè năm sau, nấm phát triển mạnh và gây chết vật chủ, sau đó hình thành quả thể, phát triển và chui ra khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính vào đầu vật chủ. Do đó nhiều người gọi là nấm “Đông trùng hạ thảo” bởi vì mùa đông nấm sống trong cơ thể côn trùng, mùa hè phát triển ra ngoài cơ thể giống như cây cỏ [2].

Tại Trung Quốc C. sinensis có tên gọi là “DongChongXiaCao”, tại Nhật Bản C. sinensis có tên gọi là “Tockukaso” đều có nghĩa là Đông trùng hạ thảo [3] (hình 1. Năm 2007 Sung và cộng sự đề nghị đổi tên C.

sinensis thành Ophiocordyceps sinensis [4]. Dẫu vậy, danh pháp C. sinensis vẫn thường được các nhà nấm học sử dụng trong các báo cáo khoa học như tên đồng danh của O. Hiện nay đã ghi nhận hơn 750 loài Cordyceps trên thế giới như C.

Tuy nhiên, cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu nhiều nhất về 2 loài Đông trùng hạ thảo C. sinensis và Nhộng trùng hạ thảo C. (A) Vòng đời phát triển và (B) quả thể nấm C. sinensis [6] Năm 2010, một nhóm các nhà nấm học của Mỹ, Thái Lan và Hàn Quốc nghiên cứu và sắp xếp lại hệ thống của nhóm nấm Cordyceps.

Theo kết quả nghiên cứu này, toàn bộ các loài thuộc nhóm nấm Cordyceps được phân chia lại thuộc về 3 họ: họ Clavicipitaceae với các chi Metacordyceps, Hypocrella, Regiocrella và Torrubiella; họ Cordycipitaceae với chi Cordyceps; họ Ophiocordycipitaceae với 2 chi Cordyceps và Elaphocordyceps [7] (hình 1. Phân loại Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Ophiocordycipitaceae Chi: Cordyceps Loài: Cordyceps sinensis (tên đồng danh Ophiocordyceps sinensis) Phức hợp ký sinh của nấm và vật chủ thường được tìm thấy ở thảo nguyên với độ cao 3000 – 5000 m so với mực nước biển. Chúng phân bố chủ yếu ở Tây Tạng, Thanh Hải, Tứ Xuyên, Vân Nam, Cam Túc (Trung Quốc), Hymalaya và Ấn Độ… đặc biệt phong phú và đa dạng trong rừng ôn đới và nhiệt đới ẩm [8]. Thành phần hoạt chất có hoạt tính sinh học Năm 1964, y học cổ truyền Trung Quốc đã sử dụng C.

sinensis như một loại dược liệu dùng để điều trị các rối loạn về hô hấp, thận, gan, các bệnh về tim mạch, yếu sinh lý và cao huyết áp. Bên cạnh đó, nghiên cứu hiện đại cũng đã chứng minh C. sinensis có các hoạt tính như điều hòa miễn dịch, kháng oxy hóa, ức chế hình thành khối u, kháng khuẩn, kháng nấm và kháng di căn. Những tác dụng có lợi đó là do sự đa dạng về thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharide, cordycepin, nucleoside, adenosine, hydroxyethyl - adenosine, acid cordycepic, sterol, acid amin, vitamin và nguyên tố vi lượng… (Bảng 1.

Trong đó, nhóm hoạt chất polysaccharide được nghiên cứu nhiều bởi chúng có hoạt tính sinh học cao như kháng ung thư, kháng di căn, kháng oxy hóa, điều hòa hệ thống miễn dịch, giảm đường huyết, giảm cholesterol trong máu [10]. Các hoạt chất chính và dược tính của chúng trong C. sinensis Nhóm chất Hoạt tính Kháng ung thư; làm suy giảm các kích thích của tế bào thần kinh hệ thần kinh trung ương; ức chế phóng thích Nucleoside các chất dẫn truyền thần kinh khác nhau; chống co giật; kích thích sự phát triển của sợi thần kinh in vitro và trong hệ thống thần kinh trung ương người Kháng oxy hóa, kháng ung thư; tăng miễn dịch, hạ Polysaccharide đường huyết; kháng viêm và điều hòa miễn dịch. Gây độc tế bào, kháng virus và tác dụng kháng loạn Ergosterol nhịp tim; giảm globulin A trong bệnh lý thận, tiền chất của vitamin D Mannitol Lợi tiểu, kháng ho và kháng oxy hóa Peptide Kháng ung thư và tiềm năng miễn dịch Cordycepin Kháng phân bào, kháng ung thư 6 1.

Nghiên cứu nuôi cấy nhân tạo nấm C. sinensis Hiện nay, C. sinensis khan hiếm do nhu cầu sử dụng ngày càng tăng của con người, do đó đã có nhiều nỗ lực tìm ra phương pháp nuôi cấy nhân tạo C. sinensis thay thế nguồn nấm tự nhiên bởi vì loài nấm này rất khó thu nhận do kích thước nhỏ, thời điểm tăng trưởng chậm và tùy thuộc rất nhiều vào điều kiện khí hậu.

Nghiên cứu cho thấy nấm C. sinensis có thể phân lập từ tự nhiên, sau đó được nuôi cấy quy mô lớn bằng công nghệ lên men - những giá trị sinh học của sợi nấm nuôi cấy nhân tạo tương tự như những loài Cordyceps tìm thấy trong tự nhiên. Nhu cầu dinh dưỡng cho sự tăng trưởng sợi nấm phụ thuộc vào chủng và điều kiện nuôi cấy, do đó, kiểm soát được những yếu tố nuôi cấy sẽ kiểm soát được chất lượng sản phẩm. Nguồn carbon là thành phần dinh dưỡng ảnh hưởng nhất đến quá trình sinh sống của nấm, cần cho nấm tổng hợp bộ khung tế bào, biến dưỡng và tạo năng lượng.

Các loài nấm khác nhau có nhu cầu sử dụng các nguồn carbon khác nhau. Trong khi đó, nguồn nitơ là một trong những thành phần chính có vai trò quan trọng trong điều hòa sinh học, chi phối sự phát triển của tế bào, hình thành các sản phẩm và enzyme tế bào. Nấm có thể sử dụng các nguồn nitơ khác nhau để sinh trưởng như ammonium, nitrate, peptide và các acid amin. Ngoài ra nấm cũng sử dụng một số khoáng chất và vitamin để tăng trưởng [11].

Hiện nay, hai phương pháp nuôi cấy nấm được sử dụng chủ yếu là nuôi cấy lỏng và nuôi cấy bán rắn: Phương pháp nuôi cấy lỏng: một số nghiên cứu đã được báo cáo trong vòng 10 năm qua nuôi cấy lỏng sợi nấm của C. sinensis là một trong những chiến lược hiệu quả để tăng tổng hợp các hợp chất sinh học mong muốn vì dễ dàng theo dõi các điều kiện nuôi cấy và tối ưu hóa các yếu tố lý hóa môi trường (Bảng 1. Phương pháp nuôi cấy chủ yếu sử dụng tại Trung Quốc là nuôi cấy lỏng, trong đó một lượng mô nhỏ Cordyceps được cấy vào môi trường lỏng vô trùng. Các sợi nấm Cordyceps được thu hoạch bằng cách lọc dịch nuôi cấy, sau đó sấy khô và nghiền thành bột mịn.

Sau khi sấy khô, bột có thể sử dụng trực tiếp, hoặc tiếp tục xử lý bằng nước nóng hay một số dung môi khác, các cao chiết ở dạng lỏng hoặc được sấy khô. Phương pháp này tạo ra sản phẩm chất lượng tốt, quy mô lớn và dễ kiểm soát các thông số tăng trưởng, tạo ra sản phẩm đồng nhất có chất lượng ít biến đổi [13]. Nghiên cứu nuôi cấy lỏng sợi nấm của C. sinensis Giống Thành phần Nhiệt pH Phương Thời Sinh EPS Tham môi trường độ pháp gian khối (g/L) khảo o ( C) (ngày) (g/L) C.

Saccharose 20, 20 4,0 Bể 16 20,9 4,1 Kim sinensis bột bắp 25, khuấy và CaCl2 0,78, 150 rpm Yun MgSO4. Saccharose 2 25 - Bể 5 54,0 28,4 Cha và sinensis %, cao nấm khuấy cộng 16 men 0,9 %, 150 rpm sự K2HPO4 0,3 %, (2007) CaCl2 0,4 % (w/v) C. Glucose 40, 22 - 4,4 Bể 7 23,2 3,4 Leung sinensis peptone 5, cao 25 khuấy và Cs- nấm men 5, 150 rpm cộng HK1 KH2PO4 1, sự MgSO4.7H2O (2007) 0,5 (g/L), NH4Cl 10 mmol/l C. Saccharose 26 7,0 Bể 4 12,3 24,5 Wu, sinensis 20, cao nấm khuấy Chen men 2, 130 rpm và Hao KH2PO4 4 (2009) (g/L) C.

Glucose 30, - Bể 25,0 2,8 Yin và sinensis peptone 15, - khuấy cộng KH2PO4 3, sự MgSO4.7H2O (2013) 1,5, khoai tây 200 (g/L) Phương pháp nuôi cấy bán rắn: gần đây quả thể nấm C. sinensis đã được nuôi cấy thành công bởi các nhà khoa học Nhật Bản và Mỹ. Nấm được đưa vào môi trường bán rắn đã khử trùng, thường là hạt ngũ cốc hoặc hỗn hợp ngũ cốc, ấu trùng 8 côn trùng (phần còn lại của con tằm), với độ ẩm tương đối 45 – 50 %. Mặc dù nuôi cấy nấm C.

sinensis trên môi trường bán rắn giải quyết được những vấn đề thường gặp so với nuôi cấy trên môi trường lỏng như sự thất thoát một số hợp chất sinh học vào môi trường nuôi cấy, tuy nhiên, thời điểm phát triển của sợi nấm C. sinensis trên môi trường bán rắn là rất chậm và hiệu quả kinh tế kém [14]. Nuôi cấy lỏng thuận lợi hơn cho sợi nấm phát triển mạnh vì nuôi cấy trong không gian nhỏ gọn, thời điểm ngắn hơn và giảm tỷ lệ nhiễm [5]. Vì vậy, nuôi cấy nhân tạo sợi nấm C.

sinensis trong môi trường lỏng là phương pháp có tiềm năng để nhân sinh khối nấm dược liệu này. Tổng quan về polysaccharide ngoại bào – exopolysaccharide của nấm C. Giới thiệu chung về polysaccharide Polysaccharide là những cấu trúc carbohydrate cao phân tử, được tạo thành từ những đơn vị đường đơn lặp đi lặp lại, liên kết với nhau bằng các cầu nối glucoside. Những cấu trúc này thường có dạng mạch thẳng hoặc mạch nhánh.

Chúng được tổng hợp ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình sống của sinh vật [15]. Polysaccharide thường có màu nâu, không mùi, đa số tan tốt trong nước nóng, không tan trong các dung môi hữu cơ như methanol, benzen, pyridin, chloroform và hexan. Các polysaccharide có độ hòa tan khác nhau, một số dễ hòa tan trong nước lạnh, số khác hòa tan tốt trong nước nóng, tuy nhiên có những polysaccharide không hòa tan trong nước. Polysaccharide của vi sinh vật được chia thành 3 nhóm chính dựa vào vị trí của chúng trong tế bào: polysaccharide nội bào cung cấp nguồn carbon và năng lượng cho tế bào; polysaccharide vách tế bào chứa peptidoglycan, acid teichoic và lipopolysaccharide.

EPS là những polysaccharide được tổng hợp trong tế bào rồi tiết ra môi trường xung quanh, được công bố đầu tiên vào năm 1861 bởi Pasteur, mô tả như là các chất chuyển hóa thứ cấp được tổng hợp chủ yếu từ cuối giai đoạn tăng trưởng đến ổn định của vi sinh vật.