PHẦN MỞ ĐẦU 1. Tên đề tài: Hỗ trợ định danh các loài nấm thuộc chi Cordyceps và tương tự bằng kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp tin sinh học. Chủ nhiệm đề tài: ThS. Lao Đức Thuận Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ Thời gian thực hiện: tháng 12 năm 2014 đến tháng 4 năm 2016 Kinh phí được duyệt: 80 triệu đồng Kinh phí đã cấp: 35 triệu đồng, theo thông báo số 241/2014 /HĐ-SKHCN 2.
Mục tiêu: Hỗ trợ định danh các loài nấm thuộc chi nấm ký sinh côn trùng thu nhận từ vùng núi Langbian, Lâm Đồng bằng kỹ thuật Sinh học phân tử kết hợp Tin-Sinh học 3. Nội dung: Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện Nội dung 1. Dự đoán cấu trúc bậc hai Kế thừa bộ dữ liệu gồm 27 trình tự ITS2 vùng ITS1-5.8S-ITS2, đặc biệt vùng của các mẫu nấm ký sinh côn trùng từ ITS2, mạch antisense trên bộ dữ liệu nghiên cứu trước đây. ITS có sẵn gồm 27 trình tự Sử dụng phần mềm MFOLD xây dựng cấu trúc bậc hai (mạch sense và antisense) của 27 trình tự.
Phân tích, hỗ trợ công tác định danh dựa trên hình thái. Xây dựng cơ sở dữ liệu cục Hoàn thành việc xây dựng bộ cơ sở dữ bộ trình tự các gen nrSSU, nrLSU, tef1, liệu gồm 116 taxon bao gồm trình tự các rpb1, rpb2, tub và atp6 từ việc thu nhận gen mục tiêu. các trình tự gen này từ Genbank Nội dung 3. Thực hiện các kĩ thuật Sinh Khảo sát thành công các thông số mồi học Phân tử nhằm khuếch đại, giải trình dựa vào các phần mềm OligoAnalyzer tự và hiệu chỉnh trình tự các gen và Primer-BLAST.
Từ đó, các thông số (nrSSU, nrLSU, tef1, rpb1, rpb2, tub và ban đầu cho quá trình PCR được đề xuất. atp6) của 10 mẫu nấm ký hiệu XIV (DL0004, DL0006, DL0015, Đề tài đã lựa chọn được phương pháp DL0038A, DL0038B, DL0050, tách chiết DNA tối ưu nhất là phương DL0067, DL0069, DL0075 và pháp sử dụng proteinase K kết hợp với DL0077) CTAB. Về khuếch đại trình tự mục tiêu, đề tài đã khuếch đại được các gen nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB và ATP6 với các thông số về nhiệt độ bắt cặp và thời gian kéo dài được xác định cụ thể. Giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự.
Đề tài đã giải trình tự thành công 60 trình tự thuộc 6 gen trên 10 mẫu nấm. Các trình tự sau hiệu chỉnh cho kết quả hỗ trợ định danh loài tốt. Phân tích phả hệ học đa gen Đề tài xây dựng thành công các cây phát (nrSSU, nrLSU, tef1, rpb1, rpb2, tub và sinh phân tử đơn gen và đa gen nhằm hỗ atp6) của 10 mẫu nấm ký hiệu trợ cho quá trình định danh các mẫu nấm (DL0004, DL0006, DL0015, thuộc chi Cordyceps DL0038A, DL0038B, DL0050, Tổ hợp đa gen của bốn gen (nrSSU, DL0067, DL0069, DL0075 và nrLSU, TEF1 và RPB1) có đủ khả năng DL0077) phân tích các mẫu nấm tương đương với tổ hợp sáu gen (nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB và ATP6). Các mẫu nấm được hỗ trợ định danh thành công đến mức loài và 1 mẫu đến mức chi theo quan điểm loài phát sinh chủng loại XV Trong đó, có 1 mẫu nấm thuộc về chi Polycephalomyces thuộc họ Ophiocordycipitaceae và 9 mẫu thuộc về các chi Simplicillium, Isaria và Cordyceps trong họ Cordycipitaceae.
Viết báo cáo nghiệm thu Hoàn thành báo cáo nghiệm thu Bài báo công bố khoa học Số lượng: 8 bài Bài báo hội nghị khoa học Số lượng: 6 bài Luận văn Thạc sĩ Số lượng: 1 học viên (Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Tp. HCM) Khóa luận Cử Nhân Số lượng: 5 sinh viên (Trường Đại Học Mở Tp. HCM) Nghiên cứu khoa học sinh viên 1 giải nhì sinh viên nghiên cứu khoa học Eureka năm 2015 XVI 1. Tổng quan về Cordyceps Fr.
Sơ lược về chi nấm Cordyceps Cordyceps Fr. là chi nấm ký sinh trên côn trùng lớn nhất thuộc họ Clavicipitaceae (bộ Hypocreales, ngành Ascomycota – Nấm túi) với trên 400 loài đã được phát hiện [74]. Chi nấm này được đặt tên và mô tả một cách có hệ thống lần đầu tiên bởi Fries vào năm 1818 với tên gọi được kết hợp từ chữ Hy Lạp cordyle (dùi cui) và chữ Latin caput (đầu), nghĩa là loài nấm có hình dạng như dùi cui ở phần đầu (Hình 1. Nấm Ophiocordyceps sinensis (màu xám đen) ký sinh trên ấu trùng Hepialus sp.
Các loài thuộc chi nấm Cordyceps Fr. phân bố rộng khắp các lục địa (trừ Nam Cực) với đỉnh đa dạng nằm ở khu vực Đông Á và Đông Nam Á. Phổ vật chủ của chi nấm Cordyceps rất đa dạng và liên tục được cập nhật bao gồm mười bộ của ngành Chân khớp, các loài nấm thuộc chi Elaphomyces và thực vật (Beilschmiedia erythrophloia) [74]. Gần đây, một số công bố còn cho thấy sự cộng sinh hoặc ký sinh của một số loài nấm Cordyceps với nhau [39].
Tuy nhiên, vật chủ chính yếu nhất của chi nấm này vẫn là các loài côn trùng [74]. Vì vậy, nấm Cordyceps thường được biết đến như một nhóm nấm ký sinh côn trùng lớn. Nấm Cordyceps Fr. là chi nấm có vai trò quan trọng bậc nhất trong các loài nấm có khả năng ký sinh trên côn trùng với rất nhiều nghiên cứu đã và đang được tiến hành [63].
Tương tự như các loài nấm khác thuộc họ Clavicipitaceae, chi nấm Cordyceps Fr. có sự tương tác với loài người từ lâu đời và được thể hiện rõ nhất thông qua các ứng dụng của chúng trong nông nghiệp với vai trò là tác nhân kiểm soát sinh học và trong y dược với vai trò là một loại thuốc quý. Trong lĩnh vực nông nghiệp Theo Gul và cộng sự (2014), các loài nấm ký sinh côn trùng quan trọng nhất được sử dụng trong nông nghiệp đều thuộc về các loài thuộc chi Cordyceps Fr. gồm Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Isaria fumosorosea.
Các loài nấm này được sử dụng rộng rãi như một tác nhân kiểm soát sâu bệnh do có phổ ký chủ rộng và có khả năng tấn công côn trùng ở tất cả các giai đoạn phát triển (bao gồm giai đoạn không hoạt động như ở dạng nhộng). Ngoài ra, một ưu điểm khác của các loài nấm trên chính là tính an toàn sinh học do các chất độc sinh ra nhằm tiêu diệt vật chủ trong quá trình ký sinh của các loài trên không ảnh hưởng đến con người cũng như không tạo ra dị ứng như các loài nấm khác (ví dụ Aspergillus flavus) [31]. Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc sử dụng nấm ký sinh côn trùng để phòng trị các loại côn trùng và sâu hại cây trồng. Cụ thể, nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana đã được ứng dụng trong phòng trừ mối nhà, sâu khoang hại cải xanh, sâu hại đậu tương và đậu xanh, rầy mềm và các loài sâu hại lúa [1], [2], [3], [5], [11].
Trong y dược: Hiện nay, một số loài nấm thuộc chi Cordyceps đã và đang được sử dụng với vai trò là thuốc chữa trị cho các loại bệnh khác nhau của loài người [57]. Trong đó, loài Ophiocordyceps sinensis (Đông trùng hạ thảo) là loài nấm được sử dụng từ lâu đời trong y học cổ truyền ở các nước châu Á bao gồm Việt Nam. Các hợp chất thu nhận từ Ophiocordyceps sinensis bao gồm cordycepin, polysaccharide ngoại bào và nội bào, adenosine, guanosine, cordymin,… được chứng minh là có nhiều tác động như điều hòa miễn dịch, kháng ung thư, kháng di căn, kháng oxi-hóa, hạ đường huyết, hỗ trợ điều trị suy thận mãn tính,… [47]. Chính vì vậy, hiện nay, nhu cầu sử dụng các sản phẩm từ nấm Ophiocordyceps sinensis ngày càng tăng.
Các loài nấm khác thuộc chi Cordyceps Fr. cũng có các tác dụng dược tính quý báu như Cordyceps militaris (Tên thường gọi: Nhộng trùng thảo), Cordyceps pseudomilitaris, Elaphocordyceps ophioglossoides, Ophiocordyceps heteropoda [57]. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu đã cho thấy một vài loài nấm thuộc chi Cordyceps Fr. bản địa cũng có các 2 dược tính như khả năng kháng oxi-hóa, bảo vệ tế bào gan,… [6], [8], [9].
Điều này cho thấy tiềm năng to lớn của các loài nấm trên trong việc phát triển các loại thuốc mới có nguồn gốc bản địa. Để có thể sử dụng trong y dược, yêu cầu tiên quyết là các loài nấm trên cần phải được phân loại và định danh đến mức loài [80]. Tuy nhiên, hiện nay, hệ thống học và phân loại học của chi nấm Cordyceps Fr. vẫn còn đang được nghiên cứu và làm rõ.
Phân loại học 1. Theo quan niệm hình thái học (Morphological analysis) Phương pháp phân loại sinh vật theo hình thái là phương pháp đầu tiên được sử dụng và có lịch sử lâu đời nhất. Định nghĩa loài hình thái được hiểu “dựa trên các sai khác cơ học, có khả năng đo đếm được” trong đó “thừa nhận tính liên tục về khả năng sinh sản trong loài” và “tính gián đoạn của biến dị giữa các loài” [12]. Theo quan điểm này, Cordyceps Fr.
được phân vào họ Clavicipitaceae với các đặc điểm đặc trưng cho họ này gồm túi bào tử dạng trụ (cyclindrical asci) với miệng túi dày (thickened ascus apex), bào tử túi dạng sợi (filiform ascospore) thường phân mảnh thành tiểu bào tử (part-spore). Đối với các chi khác trong họ Clavicipitaceae, chi Cordyceps Fr. khác biệt ở sự hình thành các thể quả dạng chai (perithecium) nổi lên trên bề mặt hoặc ẩn hoàn toàn trong thân nấm, thể bó biến chuyển từ dạng chùy (clavate) đến dạng hình đầu (capitate) (Hình 1. Hình thái đặc trưng của chi nấm Cordyceps Fr [74].
A – Túi bào tử của nấm Ophiocordyceps variabilis chứa các bào tử túi dạng sợi phân đốt với đỉnh túi dày; B – Bào tử túi phân đốt của Elaphocordyceps subsessilis; C – Quả thể dạng chai nằm ẩn trong thể đệm của nấm Cordyceps cardinalis; D – Thể đệm hình chùy của nấm Elaphocordyceps ophioglossoides; E – Thể đệm hình đầu của nấm Ophiocordyceps gracilis. Về danh pháp, theo Khoản 59 của Bộ quy tắc Danh pháp Quốc tế về Thực vật (The International Code of Botanical Nomenclature – 2006), các loài thuộc nhóm nấm không tạo thành địa y (nonlichenized species) được phép đặt tên theo hệ thống lưỡng danh với các loài ở dạng hữu tính (teleomorph – sinh sản bằng giảm phân) và vô tính (anamorph – sinh sản bằng nguyên phân) được phân vào các chi khác nhau [52]. Ví dụ, nấm hữu tính Ophiocordyceps sinensis có dạng vô tính tương ứng là Hirsutella sinensis. Theo thống kê, chi nấm vô tính có thể hữu tính thuộc Cordyceps Fr.
có độ đa dạng lớn và được phân vào nhiều chi khác nhau như Beauveria, Simplicillium, Isaria, Paecilomyces, Hirsutella, Hymenostilbe, Metarhizium… [74]. Hiện nay, khóa phân loại của Kobayasi trên chi Cordyceps Fr. (với sự bổ sung thêm phân chi Cordyceps subg. Bolacordyceps) là khóa phân loại được sử dụng nhiều nhất dựa trên 4 hình thái [74].
Ngoài ra, còn có một số khóa phân loại khác nhưng không phổ biến bằng khóa phân loại của Kobayasi [38].