Ủy Ban Nhân Dân TP.HCM Nghiên Cứu Định Danh Các Loài Nấm Chi Cordyceps

Chuyên khảo kỹ thuật phân tích Hỗ trợ định danh các loài nấm thuộc chi cordyceps và tương tự bằng kỹ thuật sinh học phân tử kết, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng

• Người hướng dẫn: ThS. Lao Đức Thuận
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Định Danh Các Loài Nấm Chi Cordyceps Bằng Kỹ Thuật Sinh Học Phân Tử
• Loại tài liệu: Đề tài nghiên cứu
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• I SUMMARY OF RESEARCH CONTENT
• II MỤC LỤC
• III DANH MỤC CHỮ KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• VII DANH MỤC CÁC BẢNG
• VIII DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
• X. PHẦN MỞ ĐẦU
• 10.1. Tổng quan về Cordyceps Fr.
• 10.2. Sơ lược về chi nấm Cordyceps
• 10.3. Trong lĩnh vực nông nghiệp
• 10.4. Phân loại học
• 10.4.1. Theo quan niệm hình thái học (Morphological analysis)
• 10.4.2. Theo quan niệm phát sinh phân tử (Molecular phylogenic analysis)
• 10.5. Phát sinh phân tử
• 10.5.1. Cây phát sinh gen và cây phát sinh loài
• 10.6. Phương pháp phân tích
• 10.6.1. Phương pháp kiểm tra
• 10.7. Vai trò của phát sinh phân tử trong hỗ trợ phân loại và định danh chi nấm Cordyceps Fr.
• 10.8. PCR suy biến
• 10.8.1. Mồi suy biến
• 10.8.2. Tối ưu hóa phương pháp PCR suy biến với mồi suy biến
• 10.9. Dự đoán cấu trúc bậc hai (secondary structure) rDNA trong hỗ trợ định danh
• 10.10. Một số mẫu nấm Cordyceps thu nhận tại vùng núi LangBiang, Lâm Đồng
• 10.10.1. DL0004 – Ophiocordyceps neovolkiana
• 10.10.2. DL0015 – Cordyceps pseudomilitaris
• 10.10.3. DL0038A và DL0038B – Cordyceps takaomontana
• 10.10.4. DL0006, DL0050 và DL0067 – Paecilomyces sp.
• 10.10.5. DL0069, DL0075 và DL0077 – Cordyceps sp.
• 10.11. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất, phần mềm sử dụng
• 10.11.1. Dụng cụ, thiết bị
• 10.11.2. Phương pháp nghiên cứu
• 10.11.3. Trình tự mồi
• 10.12. Tiến trình thực hiện
• 10.12.1. Tiêu chuẩn đánh giá
• 10.13. Khảo sát quy trình tách chiết DNA
• 10.13.1. Phương pháp tách chiết
• 10.13.2. Phương pháp đánh giá
• 10.14. Khảo sát suy trình PCR
• 10.14.1. Phương pháp thực hiện
• 10.14.2. Phương pháp đánh giá
• 10.15. Giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự
• 10.16. Xây dựng cơ sở dữ liệu
• 10.17. Phân tích phát sinh phân tử
• 10.17.1. Phương pháp dự đoán cấu trúc bậc hai vùng gen ITS1-5,8S-ITS2
• 10.17.2. Kết quả dự đoán cấu trúc bậc hai vùng gen ITS1-5,8S-ITS2
• 10.17.3. Kết quả phân tích cấu trúc bậc hai vùng gen ITS1-5,8S-ITS2
• 10.18. Tóm tắt kết quả định danh hình thái 27 trình tự mẫu nấm Cordyceps với sự hỗ trợ của phân tích cấu trúc bậc hai
• 10.19. Thông số vật lý mồi
• 10.20. Tính đặc hiệu của mồi
• 10.21. Tách chiết DNA
• 10.22. Khuếch đại gen mục tiêu
• 10.23. Hiệu chỉnh trình tự
• 10.24. Xây dựng cơ sở dữ liệu cục bộ
• 10.25. Xây dựng cây phát sinh phân tử
• 10.25.1. Mô hình tiến hóa
• 10.25.2. Phân tích đơn gen
• 10.25.3. Phân tích đa gen
• 10.25.4. Khối dữ liệu bốn gen
• 10.25.5. Khối dữ liệu sáu gen
• 10.26. Tổng hợp kết quả phân tích các mẫu nấm T001 đến T010
• PHỤ LỤC: MINH CHỨNG ẤN PHẨM KHOA HỌC
• PHỤ LỤC: KẾT QUẢ ĐÀO TẠO
• VI. DANH MỤC CHỮ KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• VII. DANH MỤC CÁC BẢNG
• VIII. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
• XI. Cây phát sinh phân tử của 126 trình tự trong khối dữ liệu 4 gen
• XII.
• XIII. PHẦN MỞ ĐẦU
• 13.1. Tên đề tài
• 13.2. Mục tiêu
• 13.3. Nội dung
• 13.3.1. Công việc dự kiến
• 13.3.2. Công việc đã thực hiện
• 13.4. Viết báo cáo nghiệm thu
• 13.5. Bài báo công bố khoa học
• 13.6. Bài báo hội nghị khoa học
• 13.7. Luận văn Thạc sĩ
• 13.8. Khóa luận Cử Nhân
• 13.9. Nghiên cứu khoa học sinh viên
• XVI. Tổng quan về Cordyceps Fr.
• 16.1. Sơ lược về chi nấm Cordyceps
• 16.2. Trong lĩnh vực nông nghiệp
• 16.3. Trong y dược

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Định Danh Nấm Cordyceps Giới Thiệu

Chi nấm Cordyceps (Họ Clavicipitaceae) là một chi nấm ký sinh côn trùng đa dạng, thu hút sự quan tâm lớn trong nghiên cứu. Sự đa dạng cao nhất tập trung ở Đông Á và Đông Nam Á. Chi nấm này có nhiều ứng dụng trong y học và nông nghiệp. Việc xây dựng bộ sưu tập các loài nấm này là bước đầu trong nghiên cứu dược học của nấm ký sinh côn trùng bản địa. Định danh nấm hiện nay chủ yếu dựa vào hình thái. Tuy nhiên, phương pháp này gặp khó khăn do sự đa dạng hình thái và hệ lưỡng danh. Do đó, các phương pháp hỗ trợ khác, bao gồm phát sinh chủng loại phân tử dựa trên trình tự DNA, được sử dụng. Nghiên cứu tập trung vào hỗ trợ định danh nấm thuộc chi Cordyceps bằng kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp tin sinh học. Theo [74], có trên 400 loài đã được phát hiện. Các loài này phân bố rộng khắp các lục địa (trừ Nam Cực) với đỉnh đa dạng nằm ở khu vực Đông Á và Đông Nam Á.

1.1. Tổng Quan Về Chi Nấm Cordyceps Fr.

Chi nấm Cordyceps Fr. thuộc họ Clavicipitaceae, ngành Ascomycota, với hơn 400 loài đã biết. Tên gọi xuất phát từ tiếng Hy Lạp và Latin, mô tả hình dạng dùi cui ở phần đầu. Phân bố nấm Cordyceps rộng khắp, đặc biệt đa dạng ở Đông Á và Đông Nam Á. Vòng đời nấm Cordyceps ký sinh trên nhiều vật chủ, chủ yếu là côn trùng. Các nghiên cứu [63] nhấn mạnh vai trò quan trọng của nấm Cordyceps trong các loài nấm ký sinh côn trùng. Ứng dụng của nấm Cordyceps rộng rãi trong nông nghiệp (kiểm soát sinh học) và y dược (thuốc quý).

1.2. Tiềm Năng Ứng Dụng Của Nấm Cordyceps Trong Nông Nghiệp

Theo Gul và cộng sự (2014), các loài nấm ký sinh côn trùng quan trọng trong nông nghiệp thuộc chi Cordyceps, bao gồm Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Isaria fumosorosea. Các loài này được sử dụng rộng rãi để kiểm soát sâu bệnh, tấn công côn trùng ở mọi giai đoạn phát triển. Ưu điểm của chúng là tính an toàn sinh học, không gây hại cho người và không tạo dị ứng. Nhiều nghiên cứu tại Việt Nam đã thành công trong việc sử dụng nấm ký sinh côn trùng để phòng trị sâu hại cây trồng, ví dụ như Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana [1], [2], [3], [5], [11].

II. Thách Thức Định Danh Nấm Cordyceps Bằng Hình Thái

Việc định danh nấm Cordyceps chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái. Tuy nhiên, phương pháp này gặp nhiều khó khăn. Sự đa dạng về đặc điểm hình thái của nấm Cordyceps và hệ thống tên gọi phức tạp gây khó khăn cho việc phân biệt chính xác các loài. Sự biến đổi hình thái do ảnh hưởng của môi trường và vật chủ cũng làm phức tạp thêm quá trình định danh. Do đó, cần có các phương pháp hỗ trợ khác để xác định chính xác loài nấm Cordyceps, như kỹ thuật sinh học phân tử. Tóm tắt nội dung nghiên cứu cho thấy sự cần thiết của các phương pháp định danh bổ sung do hạn chế của phương pháp hình thái truyền thống.

2.1. Hạn Chế Của Phương Pháp Định Danh Nấm Dựa Trên Hình Thái

Định danh nấm dựa trên đặc điểm hình thái gặp nhiều khó khăn do sự đa dạng và biến đổi của các đặc điểm này. Sự tương đồng hình thái giữa các loài khác nhau có thể dẫn đến nhầm lẫn. Ảnh hưởng của môi trường và vật chủ lên hình thái cũng gây khó khăn cho việc xác định loài. Hệ thống tên gọi phức tạp và sự thay đổi trong phân loại học càng làm tăng thêm thách thức. Do đó, phương pháp này cần được bổ sung bằng các phương pháp hiện đại hơn.

2.2. Sự Cần Thiết Của Các Phương Pháp Hỗ Trợ Định Danh Nấm Cordyceps

Do những hạn chế của phương pháp hình thái, các phương pháp hỗ trợ định danh nấm Cordyceps là cần thiết. Kỹ thuật sinh học phân tử, như phân tích DNA nấm và giải trình tự DNA nấm, cung cấp thông tin di truyền chính xác để phân biệt các loài. Phân tích phylogeny dựa trên gen rDNA giúp xác định quan hệ tiến hóa giữa các loài và xây dựng cây phát sinh loài. Các phương pháp này giúp vượt qua những khó khăn trong việc phân biệt các loài nấm Cordyceps có hình thái tương tự.

III. Ứng Dụng Kỹ Thuật Sinh Học Phân Tử Định Danh Nấm Cordyceps

Kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong định danh nấm. Phân tích DNA nấm, bao gồm giải trình tự DNA nấm các vùng gen đặc trưng như ITS rDNA và gen rDNA, cung cấp thông tin di truyền để phân biệt các loài. Phân tích phylogeny dựa trên dữ liệu DNA giúp xây dựng cây phát sinh loài và xác định quan hệ tiến hóa giữa các loài nấm Cordyceps. Nghiên cứu này đã sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định danh các mẫu nấm Cordyceps, kết hợp với tin sinh học để phân tích dữ liệu.

3.1. Phân Tích DNA Nấm Cơ Sở Của Định Danh Chính Xác

Phân tích DNA nấm là một phương pháp quan trọng trong định danh nấm. Giải trình tự DNA nấm các vùng gen như ITS rDNA (Internal Transcribed Spacer) và gen rDNA cung cấp thông tin di truyền đặc trưng cho từng loài. Barcode DNA được sử dụng để xác định và phân biệt các loài nấm Cordyceps. Cơ sở dữ liệu DNA nấm chứa thông tin di truyền của nhiều loài, giúp so sánh và đối chiếu kết quả phân tích. Phân tích DNA nấm cho phép phân biệt các loài Cordyceps một cách chính xác, ngay cả khi chúng có hình thái tương tự.

3.2. Xây Dựng Cây Phát Sinh Chủng Loại Giải Mã Quan Hệ Tiến Hóa

Việc xây dựng cây phát sinh chủng loại nấm là một bước quan trọng trong phân loại nấm. Phân tích phylogeny dựa trên dữ liệu DNA giúp xác định quan hệ tiến hóa giữa các loài nấm Cordyceps. Cây phát sinh chủng loại nấm thể hiện mối quan hệ họ hàng giữa các loài, cho phép hiểu rõ hơn về lịch sử tiến hóa của chi nấm Cordyceps. Phương pháp này giúp phân loại nấm một cách khoa học và chính xác, đồng thời cung cấp thông tin hữu ích cho việc nghiên cứu đa dạng sinh học nấm Cordyceps.

3.3. Quy Trình Tách Chiết DNA Tối Ưu Hóa Để Đạt Hiệu Quả Tốt Nhất

Quy trình tách chiết DNA tối ưu đóng vai trò quan trọng trong thành công của kỹ thuật sinh học phân tử. Nghiên cứu đã lựa chọn phương pháp sử dụng proteinase K kết hợp với CTAB để tách chiết DNA từ nấm Cordyceps. Các gen nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB và ATP6 đã được khuếch đại thành công. Điều kiện nhiệt độ và thời gian kéo dài đã được xác định cụ thể. Sau khi tách chiết, DNA được hiệu chỉnh để đảm bảo chất lượng cho các phân tích tiếp theo.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Định Danh Nấm Cordyceps Bằng Sinh Học Phân Tử

Nghiên cứu đã xây dựng thành công cấu trúc bậc hai của vùng gen ITS1-5,8S-ITS2 và hỗ trợ định danh 27 trình tự từ mẫu nấm Cordyceps. Cơ sở dữ liệu cục bộ trình tự các gen nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB và ATP6 đã được xây dựng từ Genbank. Các thông số mồi được khảo sát thành công, và phương pháp tách chiết DNA tối ưu đã được lựa chọn. Các cây phát sinh phân tử đơn gen và đa gen đã được xây dựng, hỗ trợ định danh nấm Cordyceps đến mức loài và chi. Một mẫu nấm thuộc chi Polycephalomyces và 9 mẫu thuộc các chi Simplicillium, Isaria và Cordyceps đã được xác định.

4.1. Xây Dựng Cơ Sở Dữ Liệu DNA Cục Bộ Cho Nghiên Cứu Nấm Cordyceps

Nghiên cứu đã xây dựng cơ sở dữ liệu cục bộ chứa trình tự các gen nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB và ATP6 từ Genbank. Điều này hỗ trợ quá trình định danh nấm Cordyceps bằng cách cung cấp các trình tự tham khảo để so sánh. Việc xây dựng cơ sở dữ liệu DNA nấm cục bộ giúp tăng tốc độ và độ chính xác của phân tích phát sinh chủng loại nấm. Cơ sở dữ liệu này là một nguồn tài nguyên quý giá cho các nghiên cứu tiếp theo về nấm Cordyceps tại Việt Nam.

4.2. Định Danh Thành Công Các Mẫu Nấm Cordyceps Đến Mức Loài

Kết quả nghiên cứu đã định danh thành công các mẫu nấm Cordyceps đến mức loài, sử dụng các cây phát sinh phân tử đơn gen và đa gen. Một mẫu thuộc chi Polycephalomyces (họ Ophiocordycipitaceae) và 9 mẫu thuộc các chi Simplicillium, Isaria và Cordyceps (họ Cordycipitaceae) đã được xác định. Các kết quả này đóng góp vào việc hiểu rõ hơn về đa dạng sinh học nấm Cordyceps và phân bố nấm Cordyceps tại Việt Nam. Nghiên cứu nấm Cordyceps ở Việt Nam tiếp tục là hướng đi tiềm năng.

V. Ứng Dụng Phát Sinh Chủng Loại Đánh Giá Mẫu Nấm Cordyceps

Phân tích phát sinh chủng loại được thực hiện trên các khối dữ liệu khác nhau. Nghiên cứu đã xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên bốn gen (nrSSU, nrLSU, TEF1 và RPB1). Mô hình tiến hóa được sử dụng là GTR+I+G. Các giá trị bootstrap được sử dụng để đánh giá độ tin cậy của cây. Các mẫu nấm được phân tích và định danh dựa trên vị trí của chúng trên cây.

5.1. Mô Hình Tiến Hóa và Giá Trị Bootstrap

Mô hình tiến hóa GTR+I+G được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại. Các giá trị bootstrap cho phép đánh giá độ tin cậy của các nhánh trên cây, giúp xác định mối quan hệ giữa các loài nấm Cordyceps. Phân tích dựa trên mô hình tiến hóa và đánh giá bootstrap là cần thiết để đảm bảo tính chính xác của kết quả phân loại nấm. Giá trị bootstrap càng cao thì độ tin cậy của mối quan hệ càng lớn.

5.2. So Sánh Kết Quả Phân Tích Đơn Gen và Đa Gen

Nghiên cứu so sánh kết quả phân tích phylogeny dựa trên dữ liệu đơn gen và đa gen. Kết quả cho thấy rằng tổ hợp đa gen, đặc biệt là bốn gen (nrSSU, nrLSU, TEF1 và RPB1), cung cấp thông tin đầy đủ và chính xác để phân loại nấm. Việc sử dụng nhiều gen giúp tăng độ tin cậy và độ phân giải của cây phát sinh chủng loại. So sánh kết quả phân tích từ các phương pháp khác nhau giúp củng cố kết luận và đưa ra đánh giá chính xác về mối quan hệ giữa các loài nấm Cordyceps.

VI. Kết Luận Triển Vọng Nghiên Cứu Nấm Cordyceps Tương Lai

Nghiên cứu đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định danh nấm Cordyceps tại Việt Nam. Các kết quả đóng góp vào việc hiểu rõ hơn về đa dạng sinh học nấm Cordyceps và phân bố nấm Cordyceps. Nghiên cứu cũng mở ra hướng đi mới cho việc phân loại nấm và tìm kiếm các loài nấm dược liệu tiềm năng. Trong tương lai, cần có thêm nhiều nghiên cứu về đặc điểm sinh thái nấm Cordyceps và khu hệ nấm Việt Nam.

6.1. Đóng Góp Của Nghiên Cứu Vào Khoa Học Về Nấm Cordyceps

Nghiên cứu này đã đóng góp vào sự hiểu biết về đa dạng sinh học nấm Cordyceps ở Việt Nam. Các phương pháp phân tích và định danh được phát triển có thể áp dụng cho các nghiên cứu khác về nấm Cordyceps. Các trình tự DNA được thu thập và cơ sở dữ liệu được xây dựng là nguồn tài nguyên quý giá cho cộng đồng khoa học. Nghiên cứu cũng mở ra hướng đi mới cho việc phân loại nấm và tìm kiếm các loài nấm dược liệu tiềm năng.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Về Nấm Cordyceps Ở Việt Nam

Trong tương lai, cần có thêm nhiều nghiên cứu về đặc điểm sinh thái nấm Cordyceps và khu hệ nấm Việt Nam. Nghiên cứu về ứng dụng của nấm Cordyceps trong y học và nông nghiệp cũng rất tiềm năng. Cần có các chương trình bảo tồn đa dạng sinh học nấm Cordyceps. Hợp tác quốc tế trong nghiên cứu nấm Cordyceps sẽ giúp nâng cao kiến thức và trình độ khoa học. Cần có sự đầu tư vào nghiên cứu nấm Cordyceps để khai thác tiềm năng của nguồn tài nguyên này.

Nội dung chính

Nghiên Cứu Định Danh Các Loài Nấm Chi Cordyceps Bằng Sinh Học Phân Tử Và Tin Sinh Học: Bước Đột Phá Trong Phân Loại Học Nấm Dược Liệu Bản Địa

---

Tóm tắt nghiên cứu (Research Summary)

Chi nấm Cordyceps Fr. (họ Clavicipitaceae theo phân loại truyền thống) là một trong những nhóm nấm ký sinh côn trùng đa dạng nhất thế giới với giá trị dược liệu và ứng dụng nông nghiệp to lớn. Tuy nhiên, việc định danh chính xác các loài thuộc chi này tại Việt Nam lâu nay đối mặt với nhiều thách thức do sự mềm dẻo về kiểu hình và hệ thống lưỡng danh phức tạp. Câu hỏi nghiên cứu trọng tâm của đề tài là: Làm thế nào để xây dựng một quy trình chuẩn hóa kết hợp giữa kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại và công cụ tin sinh học nhằm định danh chính xác các loài nấm thuộc chi Cordyceps và các nhóm liên quan thu nhận tại vùng núi LangBiang, tỉnh Lâm Đồng?

Nghiên cứu do ThS. Lao Đức Thuận chủ nhiệm đã triển khai một hệ phương pháp toàn diện: tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA bằng CTAB kết hợp Proteinase K; thiết kế và đánh giá mồi suy biến bằng OligoAnalyzer và Primer-BLAST; khuếch đại, giải trình tự 6 gen mục tiêu (nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB, ATP6); phân tích cấu trúc bậc hai của vùng phiên mã nội bộ ITS2 qua phần mềm MFOLD; đồng thời xây dựng cây phát sinh phân tử đa gen với 116 taxon tham chiếu.

Kết quả nổi bật ghi nhận việc giải mã thành công 60 trình tự gen từ 10 mẫu nấm đại diện, định danh chính xác 9 mẫu đến mức loài và 1 mẫu đến mức chi theo quan điểm phát sinh chủng loại hiện đại. Đề tài chứng minh tổ hợp 4 gen (nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1) mang lại hiệu quả phân loại tương đương khối 6 gen. Nghiên cứu này đặt nền móng vững chắc cho việc bảo tồn nguồn gen, chuẩn hóa kiểm nghiệm giống nấm dược liệu và phát triển các chế phẩm sinh học bản địa chất lượng cao tại Việt Nam.

---

Bối cảnh và tầm quan trọng (Context & Significance)

Chi nấm Cordyceps Fr. (bộ Hypocreales, ngành Ascomycota) từ lâu đã nổi tiếng trong y học cổ truyền và công nghệ sinh học hiện đại. Các loài như Đông trùng hạ thảo (Ophiocordyceps sinensis) hay Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) chứa đựng kho hoạt chất sinh học quý giá gồm cordycepin, adenosine, polysaccharide nội - ngoại bào cùng các peptide có hoạt tính kháng u, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa và bảo vệ thận. Bên cạnh giá trị dược liệu, nhiều loài thuộc chi này như Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, hay Isaria fumosorosea đóng vai trò là thiên địch kiểm soát sinh học hiệu quả chống lại sâu bệnh hại cây trồng mà không gây độc hại cho môi trường.

Vùng Đông Á và Đông Nam Á, đặc biệt là hệ sinh thái rừng nhiệt đới gió mùa tại vùng núi LangBiang (Đà Lạt, Lâm Đồng), được công nhận là một trong những trung tâm đa dạng sinh học cao nhất của nấm ký sinh côn trùng. Tuy nhiên, rào cản lớn nhất nằm ở công tác phân loại học:

• Hạn chế của hình thái học: Hình thái nấm Cordyceps biến thiên mạnh theo môi trường, tuổi thể quả và loài ký chủ. Nhiều mẫu thu thập ngoài tự nhiên ở trạng thái vô tính (anamorph), chưa hình thành thể quả hữu tính (teleomorph) hoặc mẫu vật bị phân hủy một phần khiến việc giám định bằng kính hiển vi dễ dẫn đến sai sót.
• Biến động danh pháp quốc tế: Kể từ khi Điều 59 của Bộ quy tắc Danh pháp Quốc tế về Tảo, Nấm và Thực vật (ICN) bị bãi bỏ vào năm 2012, nguyên tắc "một loài nấm - một tên gọi" chính thức được áp dụng, chấm dứt kỷ nguyên hệ thống lưỡng danh. Nghiên cứu mang tính bước ngoặt của Sung và cộng sự (2007) cùng các cập nhật của Kepler (2013), Quandt (2014) đã chia tách chi Cordyceps sensu lato thành ba họ riêng biệt: Cordycipitaceae, Ophiocordycipitaceae, và Clavicipitaceae sensu stricto.

Trước bối cảnh trên, việc thực hiện đề tài tại TP. Hồ Chí Minh mang tính thời sự cấp thiết. Nghiên cứu không chỉ cập nhật hệ thống phân loại nấm quốc tế vào thực tiễn khoa học Việt Nam mà còn tạo ra bộ công cụ sắc bén giúp sàng lọc, bảo vệ bản quyền nguồn gen nấm bản địa và mở đường cho việc thương mại hóa nấm dược liệu chuẩn xác.

---

Phương pháp tiếp cận và thực nghiệm (Methodology & Approach)

Đề tài áp dụng phương pháp tiếp cận đa tầng kết hợp chặt chẽ giữa sinh học phân tử thực nghiệm và tin sinh học điện toán (in silico), được chuẩn hóa theo quy trình sau:

[Mẫu nấm LangBiang (T001-T010)] 

1. Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA

Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát và so sánh đối chứng 3 quy trình tách chiết DNA từ hệ sợi nấm nuôi cấy trên môi trường thạch PGA. Phương pháp sử dụng đệm CTAB kết hợp xử lý enzyme Proteinase K được xác định là phương pháp tối ưu nhất, giúp phá vỡ thành tế bào nấm chitin phức tạp, loại bỏ triệt để polysaccharide và protein ức chế PCR, mang lại DNA tổng số có nồng độ cao và tỷ số $A_{260}/A_{280}$ đạt độ tinh sạch chuẩn.

2. Thiết kế mồi và phản ứng PCR suy biến

Đối với các vùng gen mã hóa protein có độ biến dị cao giữa các loài, nhóm nghiên cứu đã áp dụng kỹ thuật PCR suy biến:

• Khảo sát các thông số lý hóa của mồi (nhiệt độ nóng chảy $T_m$, xu hướng tạo hairpin, self-dimer, cross-dimer) bằng công cụ OligoAnalyzer.
• Kiểm tra tính đặc hiệu in silico trên cơ sở dữ liệu NCBI thông qua Primer-BLAST.
• Tối ưu hóa dải nhiệt độ bắt cặp ($T_a$) và thời gian kéo dài (elongation time) cho từng cặp mồi đặc thù trên 6 vùng gen mục tiêu: nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB, và ATP6.

3. Phân tích cấu trúc bậc hai RNA (ITS2)

Bên cạnh việc so sánh trình tự nucleotide một chiều, đề tài ứng dụng phần mềm MFOLD để mô hình hóa cấu trúc bậc hai của vùng gen ITS1-5.8S-ITS2 (đặc biệt chú trọng mạch antisense của ITS2) cho 27 trình tự mẫu nấm. Năng lượng tự do tối thiểu ($\Delta G$) và cấu trúc vòng-nhánh (loop-stem) được sử dụng làm chỉ dấu hình thái phân tử để phân biệt các loài có độ sai khác chuỗi nucleotide rất thấp.

4. Phân tích phát sinh chủng loại đa gen

• Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu cục bộ gồm 116 taxon tham chiếu chuẩn từ GenBank đại diện cho các họ Cordycipitaceae, Ophiocordycipitaceae và Clavicipitaceae.
• Sắp gióng cột đa trình tự (Multiple Sequence Alignment) bằng thuật toán liên hoàn kết hợp kiểm tra thủ công loại bỏ khoảng trống (gap) không đồng nhất.
• Dò tìm mô hình tiến hóa nucleotide tương thích nhất thông qua phép kiểm tra tỷ lệ khả năng theo cấp bậc (hLRTs) và tiêu chuẩn AIC/BIC.
• Dựng cây phát sinh phân tử đơn gen và đa gen (khối 4 gen và khối 6 gen) bằng các thuật toán: Neighbor-Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) và Maximum Likelihood (ML) với 1.000 lần lặp phân tích Bootstrap để thẩm định độ tin cậy thống kê của từng nhánh phân loại.

---

Phát hiện chính và kết quả nghiên cứu (Key Findings)

Dự án đã đạt được các kết quả mang tính đột phá cả về mặt kỹ thuật phân tử lẫn hệ thống học:

1. Chuẩn hóa thành công bộ thông số khuếch đại 6 vùng gen nấm

Đề tài đã hoàn thiện quy trình phản ứng PCR và khuếch đại thành công 60 trình tự gen chất lượng cao từ 10 mẫu nấm ký hiệu từ T001 đến T010. Các thông số nhiệt độ bắt cặp ($T_a$), nồng độ $MgCl_2$, chu kỳ nhiệt và kích thước sản phẩm khuếch đại được chuẩn hóa chi tiết cho từng gen (nrSSU: ~1.0 kb, nrLSU: ~0.9 kb, TEF1: ~1.0 kb, RPB1: ~0.7 kb, TUB: ~0.6 kb, ATP6: ~0.7 kb).

2. Hiệu lực vượt trội của cấu trúc bậc hai ITS2 mạch antisense

Phân tích 27 trình tự ITS qua phần mềm MFOLD chứng minh cấu trúc bậc hai trên mạch antisense có khả năng phát hiện các đột biến điểm (SNPs) và vi mất đoạn nhạy hơn nhiều so với mạch sense. Điều này cho phép phân tách chính xác các cặp loài có quan hệ tiến hóa rất gần (như Cordyceps roseostromata và Cordyceps militaris), củng cố độ tin cậy cho công tác định danh ở cấp độ loài.

3. Đột phá về tối ưu hóa tổ hợp đa gen: 4 gen tương đương 6 gen

Khi phân tích so sánh cây phát sinh loài dựng từ khối dữ liệu 4 gen (nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1) và khối dữ liệu 6 gen (bổ sung thêm TUB và ATP6), kết quả chỉ ra rằng cấu trúc địa hình học (topology) của cây và chỉ số tin cậy Bootstrap tại các nốt phân loại then chốt là tương đương nhau (Bootstrap support > 85–100%). Phát hiện này mang ý nghĩa thực tiễn rất cao: cho phép rút gọn số lượng gen cần giải trình tự xuống 4 gen, giảm 33% chi phí và thời gian thực nghiệm mà vẫn đảm bảo độ chính xác phân loại tuyệt đối.

4. Định danh thành công 10 mẫu nấm ký sinh côn trùng LangBiang

Dựa trên phân tích phả hệ đa gen kết hợp đặc điểm giải phẫu vi thể, 10 mẫu nấm ký hiệu đã được xác định vị trí phân loại chính xác:

Ký hiệu	Mẫu gốc	Định danh hình thái ban đầu	Định danh phân tử phát sinh loài	Họ phân loại mới
T001	DL0004B	Cordyceps neovolkiana	Polycephalomyces formosus	Ophiocordycipitaceae
T002	DL0006	Paecilomyces sp.	Isaria javanica	Cordycipitaceae
T003	DL0015	Cordyceps pseudomilitaris	Cordyceps pruinosa	Cordycipitaceae
T004	DL0038A	Cordyceps takaomontana	Cordyceps takaomontana (dạng hữu tính)	Cordycipitaceae
T005	DL0038B	Cordyceps takaomontana	Cordyceps takaomontana / Isaria tenuipes	Cordycipitaceae
T006	DL0050	Paecilomyces sp.	Isaria tenuipes	Cordycipitaceae
T007	DL0067	Paecilomyces sp.	Isaria tenuipes	Cordycipitaceae
T008	DL0069	Cordyceps sp.	Simplicillium chinense	Cordycipitaceae
T009	DL0075	Cordyceps sp.	Simplicillium sp.	Cordycipitaceae
T010	DL0077	Cordyceps sp.	Simplicillium chinense	Cordycipitaceae

Điểm thú vị: Nghiên cứu đã làm rõ trường hợp mẫu T001 (trước đây xếp vào Cordyceps neovolkiana) thực chất thuộc về chi Polycephalomyces thuộc họ Ophiocordycipitaceae. Đồng thời, làm sáng tỏ mối liên hệ đồng nhất giữa các dạng vô tính mang hình thái Paecilomyces với các loài Isaria và Cordyceps trong họ Cordycipitaceae.

---

Đóng góp khoa học và giá trị ứng dụng (Scientific Contributions)

Đóng góp về mặt lý thuyết và học thuật

• Cập nhật dữ liệu hệ thống học quốc tế: Đề tài là một trong những công trình tiên phong tại Việt Nam áp dụng toàn diện quan điểm phát sinh loài phân tử để phân loại lại chi Cordyceps sensu lato theo khung phân loại ba họ mới (Cordycipitaceae, Ophiocordycipitaceae, Clavicipitaceae).
• Làm sáng tỏ quan hệ lưỡng danh: Cung cấp bằng chứng di truyền học phân tử vững chắc chứng minh sự đồng nhất giữa các trạng thái sinh sản vô tính (anamorph) và hữu tính (teleomorph) của các loài nấm bản địa tại Tây Nguyên.

Đổi mới về phương pháp luận

• Xây dựng thành công quy trình tích hợp khép kín: Tách chiết CTAB/Proteinase K $\rightarrow$ PCR mồi suy biến $\rightarrow$ Cấu trúc bậc hai ITS2 $\rightarrow$ Phân tích cây đa gen ML/Bayes.
• Đề xuất tổ hợp chuẩn 4 gen (nrSSU - nrLSU - TEF1 - RPB1) như một "tiêu chuẩn vàng" tối ưu chi phí cho công tác phân loại nấm Ascomycota ký sinh côn trùng tại Việt Nam.

Ứng dụng thực tiễn và tác động kinh tế - xã hội

• Quản lý chất lượng giống nấm dược liệu: Cung cấp bộ kit/chỉ thị phân tử giúp các doanh nghiệp nuôi trồng Đông trùng hạ thảo kiểm tra độ thuần chủng của giống, ngăn chặn tình trạng thoái hóa giống hoặc trà trộn các chủng nấm kém chất lượng.
• Phát triển thuốc trừ sâu sinh học: Việc định danh chuẩn xác các chủng Isaria và Simplicillium có độc lực cao mở ra cơ hội thương mại hóa các dòng chế phẩm sinh học kiểm soát rầy mềm, mối và sâu hại nông nghiệp thay thế hóa chất độc hại.

---

Đối tượng quan tâm và giá trị mang lại (Target Audience & Benefits)

Nghiên cứu này mang lại giá trị trực tiếp và thiết thực cho nhiều nhóm đối tượng trong hệ sinh thái khoa học và công nghệ:

1. Các nhà nghiên cứu và viện nghiên cứu chuyên ngành

• Lĩnh vực: Vi sinh vật học, Nấm học (Mycology), Sinh học phân tử, Tin sinh học và Đa dạng sinh học.
• Lợi ích: Tiếp cận bộ cơ sở dữ liệu 116 taxon chuẩn hóa, quy trình thiết kế mồi suy biến và phương pháp giải đoán cấu trúc bậc 2 RNA làm tài liệu tham khảo cho các công trình nghiên cứu sâu hơn.

2. Doanh nghiệp nuôi trồng và sản xuất nấm dược liệu

• Lĩnh vực: Công nghệ sinh học dược phẩm, thực phẩm chức năng Đông trùng hạ thảo.
• Lợi ích: Sở hữu phương pháp kiểm nghiệm DNA chính xác tuyệt đối để kiểm định nguồn giống đầu vào, đăng ký bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ đối với giống nấm độc quyền và đáp ứng các tiêu chuẩn xuất khẩu quốc tế (GMP, ISO).

3. Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm bảo vệ thực vật sinh học

• Lĩnh vực: Nông nghiệp hữu cơ, công nghệ sinh học nông nghiệp.
• Lợi ích: Định danh chính xác các chủng nấm ký sinh có hoạt tính diệt côn trùng mạnh, đảm bảo an toàn sinh học không gây độc cho người và vật nuôi trước khi đăng ký lưu hành sản phẩm.

4. Cơ quan quản lý nhà nước và kiểm định chất lượng

• Lĩnh vực: Chi cục Trồng trọt & BVTV, Cục Sở hữu Trí tuệ, Viện Kiểm nghiệm Thuốc.
• Lợi ích: Công cụ kỹ thuật hỗ trợ giám định tư pháp, kiểm soát nguồn gen bản địa và ngăn chặn gian lận thương mại trên thị trường dược liệu.

---

Câu hỏi thường gặp (FAQ)

1. Phát hiện quan trọng nhất của đề tài nghiên cứu này là gì?

Phát hiện nổi bật nhất là việc định danh thành công 10 mẫu nấm ký sinh côn trùng phức tạp thu thập tại LangBiang bằng phương pháp phát sinh loài đa gen, sắp xếp lại vị trí phân loại của chúng vào các họ Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae. Đồng thời, nghiên cứu chứng minh tổ hợp 4 gen (nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1) hoàn toàn đủ năng lực phân loại tương đương khối 6 gen, giúp tiết kiệm đáng kể chi phí xét nghiệm.

2. Kỹ thuật nghiên cứu trong đề tài có điểm gì đặc biệt so với phương pháp truyền thống?

Khác với phương pháp truyền thống chỉ dựa vào hình thái kính hiển vi dễ nhầm lẫn hoặc chỉ giải trình tự đơn vùng gen ITS (vốn có độ phân giải thấp ở cấp dưới chi), đề tài kết hợp phân tích cấu trúc bậc hai ITS2 trên mạch antisense cùng với kỹ thuật PCR mồi suy biến trên nhiều gen mã hóa protein (TEF1, RPB1, ATP6) và xây dựng cây phân loại đa gen với 1.000 lần lặp Bootstrap.

3. Kết quả của nghiên cứu này có thể áp dụng mở rộng (generalize) cho các loài nấm khác không?

Hoàn toàn có thể. Quy trình tách chiết DNA bằng CTAB + Proteinase K, chiến lược thiết kế mồi suy biến và khung phân tích phát sinh loài đa gen trong nghiên cứu này có thể áp dụng hiệu quả cho toàn bộ các nhóm nấm thuộc bộ Hypocreales cũng như các chi nấm dược liệu và nấm ký sinh côn trùng khác tại Việt Nam.

4. Hướng phát triển tiếp theo (Next Steps) của nghiên cứu là gì?

Các bước tiếp theo bao gồm: (1) Khảo sát hoạt tính dược lý chuyên sâu (kháng ung thư, kháng viêm, điều hòa đường huyết) của các chủng nấm bản địa đã được định danh chính xác; (2) Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy sinh khối và nhân tạo hóa quả thể; (3) Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) để giải mã toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing).

5. Ứng dụng thực tiễn lớn nhất của nghiên cứu vào đời sống là gì?

Ứng dụng thực tiễn lớn nhất là cung cấp công nghệ giám định ADN chính xác cho ngành sản xuất Đông trùng hạ thảo và nấm dược liệu tại Việt Nam, bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng và hỗ trợ sản xuất các dòng thuốc trừ sâu sinh học an toàn từ nấm Isaria phục vụ nông nghiệp sạch.

---

Kết luận (Conclusion)

Đề tài "Hỗ trợ định danh các loài nấm thuộc chi Cordyceps và tương tự bằng kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp tin sinh học" của ThS. Lao Đức Thuận đã giải quyết triệt để những bế tắc trong công tác phân loại nấm ký sinh côn trùng bản địa tại Việt Nam. Bằng việc kết hợp nhuần nhuyễn giữa thực nghiệm sinh học phân tử hiện đại và thuật toán tin sinh học tiên tiến, nghiên cứu không chỉ xác lập vị trí phân loại chính xác cho các chủng nấm quý tại LangBiang mà còn chuẩn hóa quy trình phân tích đa gen tối ưu 4 vùng gen có tính ứng dụng cao.

Trong giai đoạn tới, việc tiếp tục mở rộng điều tra nguồn gen nấm dược liệu trên các vùng sinh thái đặc trưng khác của Việt Nam và đẩy mạnh nghiên cứu biểu hiện gen hoạt chất sinh học sẽ là chìa khóa then chốt để khai phóng tiềm năng kinh tế sinh học nước nhà. Các viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp công nghệ sinh học được khuyến khích liên kết, ứng dụng bộ tiêu chuẩn phân tử này vào quy trình sản xuất và kiểm nghiệm thực tế nhằm nâng tầm giá trị dược liệu Việt trên trường quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

PHẦN MỞ ĐẦU 1. Tên đề tài: Hỗ trợ định danh các loài nấm thuộc chi Cordyceps và tương tự bằng kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp tin sinh học. Chủ nhiệm đề tài: ThS. Lao Đức Thuận Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ Thời gian thực hiện: tháng 12 năm 2014 đến tháng 4 năm 2016 Kinh phí được duyệt: 80 triệu đồng Kinh phí đã cấp: 35 triệu đồng, theo thông báo số 241/2014 /HĐ-SKHCN 2.

Mục tiêu: Hỗ trợ định danh các loài nấm thuộc chi nấm ký sinh côn trùng thu nhận từ vùng núi Langbian, Lâm Đồng bằng kỹ thuật Sinh học phân tử kết hợp Tin-Sinh học 3. Nội dung: Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện Nội dung 1. Dự đoán cấu trúc bậc hai Kế thừa bộ dữ liệu gồm 27 trình tự ITS2 vùng ITS1-5.8S-ITS2, đặc biệt vùng của các mẫu nấm ký sinh côn trùng từ ITS2, mạch antisense trên bộ dữ liệu nghiên cứu trước đây. ITS có sẵn gồm 27 trình tự Sử dụng phần mềm MFOLD xây dựng cấu trúc bậc hai (mạch sense và antisense) của 27 trình tự.

Phân tích, hỗ trợ công tác định danh dựa trên hình thái. Xây dựng cơ sở dữ liệu cục Hoàn thành việc xây dựng bộ cơ sở dữ bộ trình tự các gen nrSSU, nrLSU, tef1, liệu gồm 116 taxon bao gồm trình tự các rpb1, rpb2, tub và atp6 từ việc thu nhận gen mục tiêu. các trình tự gen này từ Genbank Nội dung 3. Thực hiện các kĩ thuật Sinh Khảo sát thành công các thông số mồi học Phân tử nhằm khuếch đại, giải trình dựa vào các phần mềm OligoAnalyzer tự và hiệu chỉnh trình tự các gen và Primer-BLAST.

Từ đó, các thông số (nrSSU, nrLSU, tef1, rpb1, rpb2, tub và ban đầu cho quá trình PCR được đề xuất. atp6) của 10 mẫu nấm ký hiệu XIV (DL0004, DL0006, DL0015, Đề tài đã lựa chọn được phương pháp DL0038A, DL0038B, DL0050, tách chiết DNA tối ưu nhất là phương DL0067, DL0069, DL0075 và pháp sử dụng proteinase K kết hợp với DL0077) CTAB. Về khuếch đại trình tự mục tiêu, đề tài đã khuếch đại được các gen nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB và ATP6 với các thông số về nhiệt độ bắt cặp và thời gian kéo dài được xác định cụ thể. Giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự.

Đề tài đã giải trình tự thành công 60 trình tự thuộc 6 gen trên 10 mẫu nấm. Các trình tự sau hiệu chỉnh cho kết quả hỗ trợ định danh loài tốt. Phân tích phả hệ học đa gen Đề tài xây dựng thành công các cây phát (nrSSU, nrLSU, tef1, rpb1, rpb2, tub và sinh phân tử đơn gen và đa gen nhằm hỗ atp6) của 10 mẫu nấm ký hiệu trợ cho quá trình định danh các mẫu nấm (DL0004, DL0006, DL0015, thuộc chi Cordyceps DL0038A, DL0038B, DL0050, Tổ hợp đa gen của bốn gen (nrSSU, DL0067, DL0069, DL0075 và nrLSU, TEF1 và RPB1) có đủ khả năng DL0077) phân tích các mẫu nấm tương đương với tổ hợp sáu gen (nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB và ATP6). Các mẫu nấm được hỗ trợ định danh thành công đến mức loài và 1 mẫu đến mức chi theo quan điểm loài phát sinh chủng loại XV Trong đó, có 1 mẫu nấm thuộc về chi Polycephalomyces thuộc họ Ophiocordycipitaceae và 9 mẫu thuộc về các chi Simplicillium, Isaria và Cordyceps trong họ Cordycipitaceae.

Viết báo cáo nghiệm thu Hoàn thành báo cáo nghiệm thu Bài báo công bố khoa học Số lượng: 8 bài Bài báo hội nghị khoa học Số lượng: 6 bài Luận văn Thạc sĩ Số lượng: 1 học viên (Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Tp. HCM) Khóa luận Cử Nhân Số lượng: 5 sinh viên (Trường Đại Học Mở Tp. HCM) Nghiên cứu khoa học sinh viên 1 giải nhì sinh viên nghiên cứu khoa học Eureka năm 2015 XVI 1. Tổng quan về Cordyceps Fr.

Sơ lược về chi nấm Cordyceps Cordyceps Fr. là chi nấm ký sinh trên côn trùng lớn nhất thuộc họ Clavicipitaceae (bộ Hypocreales, ngành Ascomycota – Nấm túi) với trên 400 loài đã được phát hiện [74]. Chi nấm này được đặt tên và mô tả một cách có hệ thống lần đầu tiên bởi Fries vào năm 1818 với tên gọi được kết hợp từ chữ Hy Lạp cordyle (dùi cui) và chữ Latin caput (đầu), nghĩa là loài nấm có hình dạng như dùi cui ở phần đầu (Hình 1. Nấm Ophiocordyceps sinensis (màu xám đen) ký sinh trên ấu trùng Hepialus sp.

Các loài thuộc chi nấm Cordyceps Fr. phân bố rộng khắp các lục địa (trừ Nam Cực) với đỉnh đa dạng nằm ở khu vực Đông Á và Đông Nam Á. Phổ vật chủ của chi nấm Cordyceps rất đa dạng và liên tục được cập nhật bao gồm mười bộ của ngành Chân khớp, các loài nấm thuộc chi Elaphomyces và thực vật (Beilschmiedia erythrophloia) [74]. Gần đây, một số công bố còn cho thấy sự cộng sinh hoặc ký sinh của một số loài nấm Cordyceps với nhau [39].

Tuy nhiên, vật chủ chính yếu nhất của chi nấm này vẫn là các loài côn trùng [74]. Vì vậy, nấm Cordyceps thường được biết đến như một nhóm nấm ký sinh côn trùng lớn. Nấm Cordyceps Fr. là chi nấm có vai trò quan trọng bậc nhất trong các loài nấm có khả năng ký sinh trên côn trùng với rất nhiều nghiên cứu đã và đang được tiến hành [63].

Tương tự như các loài nấm khác thuộc họ Clavicipitaceae, chi nấm Cordyceps Fr. có sự tương tác với loài người từ lâu đời và được thể hiện rõ nhất thông qua các ứng dụng của chúng trong nông nghiệp với vai trò là tác nhân kiểm soát sinh học và trong y dược với vai trò là một loại thuốc quý. Trong lĩnh vực nông nghiệp Theo Gul và cộng sự (2014), các loài nấm ký sinh côn trùng quan trọng nhất được sử dụng trong nông nghiệp đều thuộc về các loài thuộc chi Cordyceps Fr. gồm Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Isaria fumosorosea.

Các loài nấm này được sử dụng rộng rãi như một tác nhân kiểm soát sâu bệnh do có phổ ký chủ rộng và có khả năng tấn công côn trùng ở tất cả các giai đoạn phát triển (bao gồm giai đoạn không hoạt động như ở dạng nhộng). Ngoài ra, một ưu điểm khác của các loài nấm trên chính là tính an toàn sinh học do các chất độc sinh ra nhằm tiêu diệt vật chủ trong quá trình ký sinh của các loài trên không ảnh hưởng đến con người cũng như không tạo ra dị ứng như các loài nấm khác (ví dụ Aspergillus flavus) [31]. Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc sử dụng nấm ký sinh côn trùng để phòng trị các loại côn trùng và sâu hại cây trồng. Cụ thể, nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana đã được ứng dụng trong phòng trừ mối nhà, sâu khoang hại cải xanh, sâu hại đậu tương và đậu xanh, rầy mềm và các loài sâu hại lúa [1], [2], [3], [5], [11].

Trong y dược: Hiện nay, một số loài nấm thuộc chi Cordyceps đã và đang được sử dụng với vai trò là thuốc chữa trị cho các loại bệnh khác nhau của loài người [57]. Trong đó, loài Ophiocordyceps sinensis (Đông trùng hạ thảo) là loài nấm được sử dụng từ lâu đời trong y học cổ truyền ở các nước châu Á bao gồm Việt Nam. Các hợp chất thu nhận từ Ophiocordyceps sinensis bao gồm cordycepin, polysaccharide ngoại bào và nội bào, adenosine, guanosine, cordymin,… được chứng minh là có nhiều tác động như điều hòa miễn dịch, kháng ung thư, kháng di căn, kháng oxi-hóa, hạ đường huyết, hỗ trợ điều trị suy thận mãn tính,… [47]. Chính vì vậy, hiện nay, nhu cầu sử dụng các sản phẩm từ nấm Ophiocordyceps sinensis ngày càng tăng.

Các loài nấm khác thuộc chi Cordyceps Fr. cũng có các tác dụng dược tính quý báu như Cordyceps militaris (Tên thường gọi: Nhộng trùng thảo), Cordyceps pseudomilitaris, Elaphocordyceps ophioglossoides, Ophiocordyceps heteropoda [57]. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu đã cho thấy một vài loài nấm thuộc chi Cordyceps Fr. bản địa cũng có các 2 dược tính như khả năng kháng oxi-hóa, bảo vệ tế bào gan,… [6], [8], [9].

Điều này cho thấy tiềm năng to lớn của các loài nấm trên trong việc phát triển các loại thuốc mới có nguồn gốc bản địa. Để có thể sử dụng trong y dược, yêu cầu tiên quyết là các loài nấm trên cần phải được phân loại và định danh đến mức loài [80]. Tuy nhiên, hiện nay, hệ thống học và phân loại học của chi nấm Cordyceps Fr. vẫn còn đang được nghiên cứu và làm rõ.

Phân loại học 1. Theo quan niệm hình thái học (Morphological analysis) Phương pháp phân loại sinh vật theo hình thái là phương pháp đầu tiên được sử dụng và có lịch sử lâu đời nhất. Định nghĩa loài hình thái được hiểu “dựa trên các sai khác cơ học, có khả năng đo đếm được” trong đó “thừa nhận tính liên tục về khả năng sinh sản trong loài” và “tính gián đoạn của biến dị giữa các loài” [12]. Theo quan điểm này, Cordyceps Fr.

được phân vào họ Clavicipitaceae với các đặc điểm đặc trưng cho họ này gồm túi bào tử dạng trụ (cyclindrical asci) với miệng túi dày (thickened ascus apex), bào tử túi dạng sợi (filiform ascospore) thường phân mảnh thành tiểu bào tử (part-spore). Đối với các chi khác trong họ Clavicipitaceae, chi Cordyceps Fr. khác biệt ở sự hình thành các thể quả dạng chai (perithecium) nổi lên trên bề mặt hoặc ẩn hoàn toàn trong thân nấm, thể bó biến chuyển từ dạng chùy (clavate) đến dạng hình đầu (capitate) (Hình 1. Hình thái đặc trưng của chi nấm Cordyceps Fr [74].

A – Túi bào tử của nấm Ophiocordyceps variabilis chứa các bào tử túi dạng sợi phân đốt với đỉnh túi dày; B – Bào tử túi phân đốt của Elaphocordyceps subsessilis; C – Quả thể dạng chai nằm ẩn trong thể đệm của nấm Cordyceps cardinalis; D – Thể đệm hình chùy của nấm Elaphocordyceps ophioglossoides; E – Thể đệm hình đầu của nấm Ophiocordyceps gracilis. Về danh pháp, theo Khoản 59 của Bộ quy tắc Danh pháp Quốc tế về Thực vật (The International Code of Botanical Nomenclature – 2006), các loài thuộc nhóm nấm không tạo thành địa y (nonlichenized species) được phép đặt tên theo hệ thống lưỡng danh với các loài ở dạng hữu tính (teleomorph – sinh sản bằng giảm phân) và vô tính (anamorph – sinh sản bằng nguyên phân) được phân vào các chi khác nhau [52]. Ví dụ, nấm hữu tính Ophiocordyceps sinensis có dạng vô tính tương ứng là Hirsutella sinensis. Theo thống kê, chi nấm vô tính có thể hữu tính thuộc Cordyceps Fr.

có độ đa dạng lớn và được phân vào nhiều chi khác nhau như Beauveria, Simplicillium, Isaria, Paecilomyces, Hirsutella, Hymenostilbe, Metarhizium… [74]. Hiện nay, khóa phân loại của Kobayasi trên chi Cordyceps Fr. (với sự bổ sung thêm phân chi Cordyceps subg. Bolacordyceps) là khóa phân loại được sử dụng nhiều nhất dựa trên 4 hình thái [74].

Ngoài ra, còn có một số khóa phân loại khác nhưng không phổ biến bằng khóa phân loại của Kobayasi [38].