Xây Dựng Mô Hình Phân Tích Phả Hệ Phân Tử Để Định Danh Một Số Loài Ong Dú Ở Việt Nam

Nghiên cứu về mô hình phân tích phả hệ phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc định danh loài… 65 trang · Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh · 2023.

• Tác giả: Phạm Văn Nam
• Người hướng dẫn: TS. Trương Kim Phượng
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Sinh Học Phân Tử
• Đề tài: Mô Hình Phân Tích Phả Hệ Phân Tử Hỗ Trợ Định Danh Loài Ong Dú Ở Việt Nam
• Loại tài liệu: báo cáo khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN I: MỞ ĐẦU
• 1.1. Tổng quan tài liệu
• 1.2. Khái niệm côn trùng
• 1.3. Cấu tạo côn trùng
• 1.4. Tổng quan về Bộ cánh màng
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Phương pháp nghiên cứu chính
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Khai thác dữ liệu
• 3.2. Khảo sát trên máy tính để thiết kế bộ mồi phù hợp, đặc hiệu trên vùng trình tự gen COI, EF-1α của một số loài ong
• 3.3. Kết quả khảo sát bộ mồi của vùng trình tự gen COI
• 3.4. Kết quả khảo sát bộ mồi của vùng trình tự gen EF-1α
• 3.5. Khảo sát thực nghiệm
• 3.6. Kết quả tách chiết
• 3.7. Kết quả khuếch đại vùng gen COI của cặp mồi CB2-F và CB2-R
• 3.8. Kết quả khuếch đại vùng gen EF-1α của cặp mồi EB1-F và EB1-R
• 3.9. Kết quả thiết lập chu kỳ nhiệt PCR khuếch đại vùng gene COI và EF-1α của các mẫu ong Dú
• 3.10. Kết quả giải trình tự
• 3.11. Phân tích phát sinh loài phân tử
• 3.12. Phân tích phả hệ phân tử gene COI
• 3.13. Phân tích phả hệ phân tử gen EF-1α
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Mô Hình Phân Tích Phả Hệ Phân Tử Ong Dú

Nghiên cứu về mô hình phân tích phả hệ phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc định danh loài ong dú ở Việt Nam. Các loài ong dú Việt Nam thuộc họ Meliponini, được biết đến với kích thước nhỏ, không đốt và vai trò quan trọng trong thụ phấn. Việc xác định chính xác loài giúp bảo tồn đa dạng sinh học và khai thác tiềm năng kinh tế. Phân tích phả hệ phân tử ong dú sử dụng các marker di truyền như gen COI và EF-1α. Kết quả cho phép xây dựng cây phát sinh loài, từ đó xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ong dú. Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc bảo tồn và phát triển bền vững các loài ong dú quý giá. Theo Ascher và cộng sự (2009), trên thế giới có hơn 19000 loài ong khác nhau, cho thấy sự đa dạng sinh học đáng kinh ngạc của nhóm côn trùng này. Việc nghiên cứu và bảo tồn các loài ong bản địa là vô cùng cần thiết.

1.1. Tầm quan trọng của định danh loài ong dú

Việc định danh loài ong dú chính xác rất quan trọng vì nhiều lý do. Thứ nhất, nó giúp chúng ta hiểu rõ hơn về sự đa dạng sinh học ong dú ở Việt Nam. Thứ hai, nó cung cấp thông tin cần thiết cho các nỗ lực bảo tồn. Thứ ba, nó có thể giúp chúng ta khai thác các lợi ích kinh tế tiềm năng từ các loài ong dú khác nhau, ví dụ như sản xuất mật ong đặc trưng. Nghiên cứu ong dú có vai trò quan trọng trong nông nghiệp và y học.

1.2. Giới thiệu về mô hình phân tích phả hệ phân tử

Mô hình phân tích phả hệ phân tử là một phương pháp sử dụng dữ liệu di truyền để xây dựng cây phát sinh loài. Cây phát sinh loài biểu diễn mối quan hệ tiến hóa giữa các loài. Dữ liệu di truyền thường được sử dụng là trình tự DNA của các gen cụ thể, chẳng hạn như gen COI và EF-1α. Gen COI thường được sử dụng trong phân tích di truyền ong dú do tính bảo tồn và khả năng phân biệt tốt giữa các loài. Gen EF-1α cung cấp thêm thông tin để giải quyết các mối quan hệ phức tạp.

II. Thách Thức Trong Định Danh Loài Ong Dú Truyền Thống Ở Việt Nam

Việc định danh loài ong dú dựa trên hình thái truyền thống gặp nhiều khó khăn. Các loài ong dú có kích thước nhỏ và hình thái tương đồng, dẫn đến sai sót trong quá trình phân loại ong dú. Bên cạnh đó, sự biến đổi hình thái trong cùng một loài do yếu tố môi trường càng làm tăng thêm sự phức tạp. Mô hình phân tích phả hệ phân tử cung cấp một giải pháp khách quan và chính xác hơn. Phương pháp này dựa trên sự khác biệt di truyền, ít bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường và cho phép phân biệt các loài có hình thái tương tự. Kek và cộng sự (2017) đã sử dụng gen COI để phân tích và xác định mật ong của hai loài Apis và Trigon, chứng minh tiềm năng của phương pháp phân tích di truyền trong lĩnh vực này.

2.1. Hạn chế của phương pháp định danh hình thái

Phương pháp định danh hình thái dựa vào các đặc điểm bên ngoài của ong dú. Tuy nhiên, các đặc điểm này có thể thay đổi theo điều kiện môi trường và giai đoạn phát triển. Điều này dẫn đến khó khăn trong việc phân biệt các loài ong dú khác nhau, đặc biệt là những loài có hình thái tương tự. Việc này có thể dẫn đến những sai sót lớn trong quá trình phân loại ong dú.

2.2. Sự cần thiết của phương pháp phân tích DNA ong dú

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, phân tích DNA ong dú trở thành một công cụ mạnh mẽ trong việc định danh loài ong dú. Phương pháp này dựa trên sự khác biệt trong trình tự DNA của các loài, không bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường. Điều này giúp xác định loài ong dú bằng DNA một cách chính xác và khách quan, khắc phục những hạn chế của phương pháp định danh hình thái.

III. Phương Pháp Phân Tích DNA Hỗ Trợ Định Danh Loài Ong Dú Hiệu Quả

Phân tích DNA ong dú bao gồm các bước chính: thu thập mẫu, tách chiết DNA, khuếch đại gen mục tiêu (COI, EF-1α) bằng PCR, giải trình tự DNA và phân tích dữ liệu. Dữ liệu trình tự DNA được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài, từ đó xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ong dú. Marker phân tử ong dú như COI và EF-1α có vai trò quan trọng trong việc phân biệt các loài. Phân tích này cung cấp thông tin chính xác và đáng tin cậy để hỗ trợ định danh loài và bảo tồn đa dạng sinh học ong dú. Theo Batalha-Filho và cộng sự (2010), phân tích trình tự gen COI từ 145 mẫu ong cho thấy cấu trúc di truyền quần thể và lịch sử học của M. quadrifasciata, chứng minh tiềm năng của gen COI trong việc nghiên cứu các loài ong.

3.1. Quy trình phân tích DNA ong dú chi tiết

Quy trình phân tích DNA ong dú bắt đầu bằng việc thu thập mẫu ong dú. Sau đó, DNA được tách chiết từ mẫu. Gen mục tiêu (COI, EF-1α) được khuếch đại bằng PCR. Sản phẩm PCR được giải trình tự để thu được trình tự DNA. Cuối cùng, trình tự DNA được phân tích để xác định loài ong dú.

3.2. Lựa chọn Marker phân tử phù hợp COI EF 1α

Việc lựa chọn marker phân tử ong dú phù hợp rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác của kết quả. Gen COI thường được sử dụng do tính bảo tồn và khả năng phân biệt tốt giữa các loài. Gen EF-1α cung cấp thêm thông tin để giải quyết các mối quan hệ phức tạp. Sự kết hợp của cả hai marker phân tử giúp tăng cường độ tin cậy của phân tích di truyền ong dú.

3.3. Xây dựng cây phả hệ ong dú bằng phần mềm chuyên dụng

Sau khi có trình tự DNA, cây phát sinh loài có thể được xây dựng bằng các phần mềm chuyên dụng như MEGA. Cây phát sinh loài biểu diễn mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ong dú. Phân tích cây phát sinh loài giúp xác định loài dựa trên vị trí của mẫu trên cây.

IV. Xây Dựng Mô Hình Phân Tích Phả Hệ Phân Tử Cho Ong Dú Việt Nam

Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng mô hình phân tích phả hệ phân tử cho các loài ong dú ở Việt Nam. Các mẫu ong dú được thu thập từ các vùng khác nhau trên cả nước. Dữ liệu trình tự DNA của gen COI và EF-1α được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng về phân loại ong dú và nghiên cứu ong dú ở Việt Nam. Nghiên cứu này góp phần vào việc bảo tồn đa dạng sinh học ong dú và khai thác tiềm năng kinh tế của các loài ong dú quý giá. Brady và cộng sự (2004) đã chỉ ra rằng vùng trình tự elongation factor-1α (EF-1α) chỉ được phát hiện ở họ Colletidae, chứng minh tính đặc hiệu của marker này trong nghiên cứu về ong.

4.1. Thu thập và xử lý mẫu ong dú

Mẫu ong dú được thu thập từ nhiều địa điểm khác nhau ở Việt Nam. Các mẫu được bảo quản cẩn thận để đảm bảo chất lượng DNA. Quá trình thu thập mẫu cần tuân thủ các quy trình chuẩn để tránh nhiễm chéo và đảm bảo tính đại diện của mẫu.

4.2. Phân tích di truyền và xây dựng cây phả hệ

Sau khi có trình tự DNA, các trình tự được căn chỉnh và so sánh với các trình tự đã biết trên cơ sở dữ liệu GenBank. Cây phát sinh loài được xây dựng bằng các phần mềm chuyên dụng, sử dụng các thuật toán khác nhau để đảm bảo tính chính xác. Cây phát sinh loài cung cấp thông tin về mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ong dú.

4.3. Đối chiếu kết quả với cơ sở dữ liệu GenBank

Kết quả phân tích DNA ong dú được đối chiếu với cơ sở dữ liệu GenBank để xác định loài. So sánh trình tự với các trình tự đã được xác định trước đó giúp xác định loài một cách nhanh chóng và chính xác. Việc đối chiếu với GenBank cũng giúp phát hiện các loài mới hoặc các biến thể di truyền mới.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Mô Hình Phân Tích Phả Hệ Phân Tử

Mô hình phân tích phả hệ phân tử có nhiều ứng dụng thực tiễn trong việc định danh loài ong dú, bảo tồn đa dạng sinh học ong dú và nghiên cứu sinh học phân tử ong dú. Nó giúp phân loại ong dú chính xác hơn, từ đó có các biện pháp bảo tồn phù hợp. Mô hình này cũng có thể được sử dụng để nghiên cứu sự tiến hóa và phân bố của các loài ong dú. Ngoài ra, nó còn giúp xác định các loài ong dú có tiềm năng kinh tế, chẳng hạn như các loài sản xuất mật ong có giá trị. Danforth và cộng sự (2013) đã chỉ ra tầm quan trọng của việc hiểu rõ hơn về đa dạng sinh học, phát sinh loài, tiến hóa và đa dạng hóa của loài ong.

5.1. Ứng dụng trong bảo tồn đa dạng sinh học ong dú

Mô hình phân tích phả hệ phân tử giúp xác định các loài ong dú đang bị đe dọa và cần được bảo tồn. Thông tin này có thể được sử dụng để xây dựng các kế hoạch bảo tồn hiệu quả. Việc bảo tồn đa dạng sinh học ong dú có vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng sinh thái.

5.2. Ứng dụng trong phát triển kinh tế từ ong dú

Một số loài ong dú sản xuất mật ong có giá trị kinh tế cao. Mô hình phân tích phả hệ phân tử giúp xác định các loài này và nghiên cứu các đặc tính sinh học của chúng. Điều này có thể giúp phát triển các sản phẩm từ ong dú và tạo ra nguồn thu nhập cho người dân địa phương.

VI. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Phân Tích Phả Hệ Phân Tử

Mô hình phân tích phả hệ phân tử là một công cụ mạnh mẽ trong việc định danh loài ong dú và nghiên cứu đa dạng sinh học ong dú. Nghiên cứu này đã xây dựng một mô hình phân tích phả hệ cho các loài ong dú ở Việt Nam, cung cấp thông tin quan trọng cho các nỗ lực bảo tồn và phát triển kinh tế. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện mô hình phân tích di truyền ong dú, đồng thời mở rộng phạm vi nghiên cứu sang các loài ong dú khác và các vùng khác nhau trên cả nước.

6.1. Tổng kết kết quả nghiên cứu và ý nghĩa

Nghiên cứu đã thành công trong việc xây dựng mô hình phân tích phả hệ phân tử cho các loài ong dú ở Việt Nam. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng về phân loại ong dú và mối quan hệ tiến hóa giữa các loài. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn đa dạng sinh học ong dú và khai thác tiềm năng kinh tế của các loài ong dú.

6.2. Hướng phát triển và mở rộng nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện mô hình phân tích di truyền ong dú, sử dụng các marker phân tử khác nhau và các phương pháp phân tích tiên tiến hơn. Nghiên cứu cũng cần mở rộng phạm vi sang các loài ong dú khác và các vùng khác nhau trên cả nước. Ngoài ra, cần nghiên cứu sâu hơn về các đặc tính sinh học và sinh thái của các loài ong dú để có các biện pháp bảo tồn và khai thác hiệu quả.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ong là nhóm côn trùng đơn ngành (monophyletic) thuộc bộ Cánh màng (Hymenoptera), lớp Côn trùng (Insecta), với hơn 19.000 loài đã được ghi nhận trên toàn thế giới. Trong 7 họ ong hiện diện (bao gồm Andrenidae, Apidae, Colletidae, Halictidae, Megachilidae, Melittidae và Stenotritidae), họ Ong mật (Apidae) là nhóm lớn và đa dạng bậc nhất với hơn 5.700 loài, chia làm 3 phân họ (Apinae, Xylocopinae, Nomadinae). Trong phân họ Apinae, tông ong Dú (Meliponini - stingless bees) là nhóm ong không ngòi đốt phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Châu Phi, Châu Úc, Trung và Nam Mỹ, với khoảng 54 chi khác nhau (theo hệ thống phân loại của NCBI tính đến năm 2023).

Ong Dú đóng vai trò sinh thái quan trọng trong việc thụ phấn cây trồng và mang giá trị kinh tế - y học cao từ mật ong và keo ong có hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, các loài ong Dú thường có kích thước rất nhỏ (khoảng 2 mm), đặc điểm hình thái tương đồng giữa các chi, dễ dẫn đến nhầm lẫn khi phân loại chỉ dựa trên khóa hình thái truyền thống. Việc kết hợp chỉ thị sinh học phân tử và phân tích phát sinh loài là hướng tiếp cận cần thiết để định danh chính xác các loài ong Dú tại Việt Nam.

Khóa luận tốt nghiệp "Xây dựng mô hình phân tích phả hệ phân tử nhằm hỗ trợ định danh một số loài ong Dú ở Việt Nam" do sinh viên Phạm Văn Nam thực hiện (chuyên ngành Sinh học Phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS. Trương Kim Phượng) nhằm giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

1. Mục tiêu tổng quát: Áp dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự Sanger và các công cụ tin sinh học để xây dựng mô hình phân tích phả hệ phân tử, hỗ trợ định danh một số mẫu ong Dú có giá trị dược tính tại Việt Nam dựa trên hai gen mục tiêu là COI và EF-1α.
2. Nhiệm vụ nghiên cứu:
   • Khai thác và hệ thống hóa dữ liệu trình tự gen COI và EF-1α của các loài thuộc tông Meliponini từ GenBank (NCBI).
   • Khảo sát in silico để kiểm tra, đánh giá tính đặc hiệu và thông số kỹ thuật của các cặp mồi chuyên biệt cho vùng gen COI và EF-1α.
   • Thực nghiệm tách chiết DNA tổng số, tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR và giải trình tự nucleotide của các sản phẩm khuếch đại.
   • Phân tích độ tương đồng trình tự (BLAST) và tái dựng cây phát sinh loài phân tử bằng phần mềm MEGA X để xác định vị trí phân loại của các mẫu nghiên cứu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: 7 mẫu ong Dú do Phòng Công nghệ Sinh học Vật liệu và Nano - Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh cung cấp (đã được phân loại sơ bộ qua hình thái).
• Phạm vi nghiên cứu: Tập trung vào vùng chỉ thị gen ti thể COI (Cytochrome c oxidase subunit I) và gen nhân EF-1α (elongation factor-1α), kết hợp dữ liệu trình tự đối chứng và nhóm ngoại (outgroup) được công bố trên ngân hàng gen quốc tế GenBank.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và chỉ thị phân tử

Nghiên cứu ứng dụng hai hệ thống chỉ thị phân tử bổ trợ lẫn nhau:

• Gen ti thể COI (Cytochrome c oxidase subunit I): Gen bảo tồn trong hệ gen ti thể, đóng vai trò tạo trung tâm oxy hóa - khử của enzyme cytochrome c oxidase trong chuỗi hô hấp tế bào. Vùng gen này có tốc độ tiến hóa thích hợp, được sử dụng phổ biến làm mã vạch DNA (DNA barcoding) và phân tích phả hệ côn trùng.
• Gen nhân EF-1α (elongation factor-1α): Gen mã hóa yếu tố kéo dài chuỗi polypeptide trong dịch mã, có độ bảo tồn cao ở mức độ nucleotide và amino acid, đặc biệt hữu ích trong việc phân tích các mối quan hệ phát sinh loài ở cấp độ chi và loài trong họ Apidae.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu phối hợp chặt chẽ giữa phân tích tin sinh học (in silico) và thực nghiệm sinh học phân tử (in vitro):

Khai thác dữ liệu GenBank ➔ Thiết kế & Đánh giá mồi in silico (BLAST, IDT, AnnHyb)
       ➔ Tách chiết DNA mẫu ong (Phenol:Chloroform) ➔ Đo OD A260/A280
       ➔ Phản ứng PCR & Điện di gel Agarose ➔ Giải trình tự Sanger 2 chiều
       ➔ Xử lý chuỗi (BioEdit/Chromas) ➔ Tìm mô hình tiến hóa (ModelTest) 
       ➔ Tái dựng cây phả hệ (ML, MP, NJ trong MEGA X với Bootstrap 1.000)

1. Thu thập và xử lý dữ liệu tin sinh học:

   • Thu thập bộ trình tự tham chiếu và nhóm ngoại từ NCBI/GenBank.
   • Đánh giá thông số lý - hóa của các mồi (nhiệt độ nóng chảy $T_m$, %GC, năng lượng tự bắt cặp, cấu trúc kẹp tóc) bằng phần mềm trực tuyến IDT OligoAnalyzer.
   • Khảo sát độ đặc hiệu mồi bằng công cụ NCBI BLAST và kiểm tra vị trí bắt cặp thực tế trên chuỗi đích qua phần mềm AnnHyb.

2. Quy trình thực nghiệm phòng thí nghiệm:

   • Tách chiết DNA genome: Áp dụng phương pháp ly giải tế bào với SDS/Proteinase K kết hợp tinh sạch bằng Phenol : Chloroform (tỷ lệ 1:1) và kết tủa bằng ethanol tuyệt đối.
   • Đánh giá chất lượng DNA: Đo mật độ quang phổ kế UV-Vis tại bước sóng 260 nm và 280 nm ($A_{260}/A_{280}$) để xác định độ tinh sạch và nồng độ DNA.
   • Khuếch đại PCR: Thiết lập phản ứng PCR thể tích 50 µL (gồm 25 µL Master mix 2X, 1 µL mồi F, 1 µL mồi R, 1 µL DNA khuôn và 22 µL $H_2O$) với chu trình nhiệt tối ưu hóa.
   • Điện di và giải trình tự: Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose; gửi mẫu giải trình tự Sanger hai chiều; xử lý và kiểm tra tín hiệu sắc ký đồ nucleotide bằng BioEdit và Chromas Lite.

3. Phương pháp phân tích phát sinh loài phân tử:

   • Dóng hàng đa trình tự nucleotide bằng thuật toán tích hợp trong phần mềm MEGA X.
   • Xác định mô hình tiến hóa thay thế nucleotide tối ưu thông qua công cụ ModelTest trong MEGA X.
   • Xây dựng cây phát sinh loài theo 3 phương pháp độc lập: Cực đại khả dĩ (Maximum Likelihood - ML), Tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony - MP) và Gia nhập láng giềng (Neighbor-Joining - NJ).
   • Kiểm định độ tin cậy của các nút nhánh trên cây phả hệ bằng phân tích tái lấy mẫu Bootstrap với 1.000 lần lặp.

---

Nội dung chính theo từng phần của khóa luận

Phần I: Mở đầu và Tổng quan tài liệu

Tác giả trình bày hệ thống hóa các kiến thức cơ sở về cấu trúc cơ thể côn trùng (chia làm 3 phần: đầu, ngực, bụng; đặc điểm cánh màng và các biến thái hoàn toàn), đặc điểm sinh học và đời sống xã hội của họ Ong mật (Apidae) và tông Ong Dú (Meliponini). Phần này làm rõ đặc điểm làm tổ bằng gôm, nhựa, sáp và cấu trúc không ngòi đốt của ong Dú. Đồng thời, tác giả tổng quan vai trò của hai vùng chỉ thị phân tử COI và EF-1α trong các nghiên cứu phân loại sinh học côn trùng trên thế giới.

Phần II: Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết nguồn gốc 7 mẫu ong Dú thu thập tại Việt Nam, quy trình 7 bước tách chiết DNA bằng phenol:chloroform, công thức hóa chất đệm ly giải (Tris-HCl 1M, EDTA 0,5M, NaCl 5M, SDS 10%, Proteinase K 20 mg/mL). Tác giả mô tả chi tiết quy trình chạy PCR, nguyên lý phản ứng giải trình tự chuỗi bằng phương pháp kết thúc chuỗi dideoxynucleotide (Sanger) và các bước dựng ma trận khoảng cách di truyền phục vụ phân tích phả hệ trên phần mềm MEGA X.

Phần III: Kết quả và Thảo luận

1. Xây dựng bộ dữ liệu tham chiếu

Từ cơ sở dữ liệu NCBI/GenBank, tác giả đã thu thập hai bộ dữ liệu chuẩn:

• Dữ liệu gen COI: Gồm 18 trình tự, trong đó có 16 trình tự thuộc các chi ong Dú (Partamona, Melipona, Plebeia, Liotrigona, Trigona, Hypotrigona, Frieseomelitta, Geniotrigona, Tetragonula) và 2 trình tự nhóm ngoại thuộc họ Kiến Formicidae (Leptomyrmex cnemidatus HQ207338.1, Leptomyrmex erythrocephalus HQ207346.1).
• Dữ liệu gen EF-1α: Gồm 14 trình tự, trong đó có 12 trình tự tông Meliponini (Lepidotrigona, Scaptotrigona, Hypotrigona, Plebeia, Melipona, Geniotrigona, Tetragonula) và 2 trình tự nhóm ngoại thuộc tông Ancylini (Baeopelma foersteri KY983275.1) và chi Apis (Acizzia albizziae KY983277.1).

2. Kết quả khảo sát bộ mồi in silico

Tác giả đánh giá các cặp mồi chuyên biệt qua công cụ tin sinh học:

• Cặp mồi gen COI (CB2-F và CB2-R):
  • Trình tự: CB2-F (5’-GGATCTCCTGATATAGCATTTCCACG-3’) và CB2-R (3’-GCTCCAGCTAATACTGGTAATG-5’).
  • Kích thước khuếch đại dự kiến: 353 bp; $T_m$ đo được: 56,54 °C.
  • Phân tích BLAST và AnnHyb cho thấy mồi bắt cặp đặc hiệu với độ tương đồng > 90% trên các trình tự Meliponini đối chứng (Partamona bilineata đạt 100%, Mourella caerulea đạt 91,36% - 92,69%, Liotrigona mahafalya đạt 85,38% - 91,36%).
• Cặp mồi gen EF-1α (EB1-F và EB1-R):
  • Trình tự: EB1-F (5’-CTACTGAACCACCATACTCCGAGACC-3’) và EB1-R (5’-GACCAACTGGTACTGTTCCAATACC-3’).
  • Kích thước khuếch đại dự kiến: 244 bp; $T_m$: 59,49 °C.
  • BLAST cho độ tương đồng 100% với Melipona compressipes (EU163224); phân tích AnnHyb trên Mourella caerulea, Tetragonisca angustula và Oxytrigona mediorufa cho thấy mồi xuôi đạt độ tương đồng 85,38% - 92%, mồi ngược đạt 100%.

3. Kết quả thực nghiệm tách chiết và phản ứng PCR

• Quy trình tách chiết cho nồng độ và độ tinh sạch DNA tốt. Tỷ số quang phổ $A_{260}/A_{280}$ của các mẫu dao động trong ngưỡng chuẩn từ 1,8 đến 2,0 (ví dụ mẫu 1 đạt tỷ lệ $A_{260}/A_{280} = 1,8$ với nồng độ DNA đạt 12,8 ng/µL).
• Điện di sản phẩm PCR cho thấy:
  • Với gen COI: Hai mẫu số 1 và số 5 khuếch đại vạch sáng rõ, được ký hiệu lần lượt là C8 và C12.
  • Với gen EF-1α: Bốn mẫu cho sản phẩm khuếch đại rõ nét, được ký hiệu lần lượt là E3, E4, E6 và E7.
• Chu trình nhiệt PCR chuẩn hóa thành công: Biến tính ban đầu ở 95 °C trong 5 phút; 40 chu kỳ lặp lại gồm [95 °C trong 30 giây, bắt cặp ở 56 °C trong 30 giây, kéo dài ở 72 °C trong 120 giây]; kéo dài kết thúc ở 72 °C trong 7 phút.

4. Kết quả giải trình tự và phân tích độ tương đồng (BLAST)

Tất cả các phân đoạn PCR chọn lọc đều được giải trình tự Sanger 2 chiều thành công:

• Mẫu gen COI:
  • Mẫu C8: BLAST cho độ tương đồng 83% - 87% (độ bao phủ 95% - 100%) với các loài Tetragonula fuscobalteata, Tetragonula iridipennis, Mourella caerulea.
  • Mẫu C12: BLAST cho độ tương đồng 84% - 87% (độ bao phủ 95% - 99%) với Tetragonula fuscobalteata, Frieseomelitta nigra, Trigona chanchamayoensis.
• Mẫu gen EF-1α:
  • Mẫu E3, E6, E7: BLAST cho độ tương đồng cao từ 94% đến 99% (độ bao phủ 94% - 99%) với các loài Lepidotrigona terminata, Lepidotrigona ventralis, Heterotrigona itama.
  • Mẫu E4: BLAST cho độ tương đồng 98% - 99% (độ bao phủ ~93%) với Tetragonula sirindhornae, Tetragonula hirashimai, Tetragonula sapiens.

5. Phân tích mô hình tiến hóa và xây dựng cây phát sinh loài

• Kiểm tra qua công cụ ModelTest xác định mô hình tiến hóa thay thế nucleotide tối ưu cho cả hai tập dữ liệu COI và EF-1α là GTR + G + I (General Time Reversible với phân phối biến thiên tốc độ Gamma và tỷ lệ vị trí bất biến Invariant).
• Tái dựng cây phả hệ bằng 3 phương pháp (ML, MP, NJ):
  • Địa hình học (topology) của 3 cây phả hệ trên từng gen hoàn toàn tương đồng.
  • Nhóm ngoại phân tách riêng biệt với chỉ số bootstrap cao (đạt 86% - 100% ở cây COI và 100% ở cây EF-1α).
  • Vị trí các mẫu trên cây phả hệ:
    • Mẫu C8 phân nhóm cùng nhánh với loài Tetragonula iridipennis (bootstrap > 60%).
    • Mẫu C12 nằm cùng phân nhóm với các chi Melipona và Partamona (bootstrap đạt 100%).
    • Các mẫu E3, E6, E7 gom cụm cùng chi Lepidotrigona với giá trị bootstrap đạt 85% - 88%.
    • Mẫu E4 gom cụm cùng chi Tetragonula với độ tin cậy bootstrap đạt 100%.

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp kết quả định danh phân tử các mẫu ong Dú nghiên cứu

Ký hiệu mẫu	Gen mục tiêu	Cặp mồi sử dụng	Kết quả phân tích BLAST (NCBI)	Kết quả cây phát sinh loài (MEGA X)	Phân loại phân tử kết luận
C8	COI	CB2-F / CB2-R	Tương đồng 83% - 87% với Tetragonula fuscobalteata, T. iridipennis	Phân nhóm cùng Tetragonula iridipennis (Bootstrap > 60%)	Chi Tetragonula (gần loài T. iridipennis)
C12	COI	CB2-F / CB2-R	Tương đồng 84% - 87% với T. fuscobalteata, Frieseomelitta nigra	Cùng phân nhóm với Melipona và Partamona (Bootstrap = 100%)	Phân nhóm liên quan Melipona / Partamona
E3	EF-1α	EB1-F / EB1-R	Tương đồng 95% - 99% với Lepidotrigona terminata, L. ventralis	Gom cụm cùng chi Lepidotrigona (Bootstrap = 88%)	Chi Lepidotrigona
E4	EF-1α	EB1-F / EB1-R	Tương đồng 98% - 99% với Tetragonula sirindhornae, T. sapiens	Gom cụm cùng chi Tetragonula (Bootstrap = 100%)	Chi Tetragonula
E6	EF-1α	EB1-F / EB1-R	Tương đồng 94% - 99% với Lepidotrigona terminata, L. ventralis	Gom cụm cùng chi Lepidotrigona (Bootstrap = 87%)	Chi Lepidotrigona
E7	EF-1α	EB1-F / EB1-R	Tương đồng 95% - 99% với Lepidotrigona terminata, L. ventralis	Gom cụm cùng chi Lepidotrigona (Bootstrap = 85%)	Chi Lepidotrigona

Đóng góp của đề tài

1. Thiết lập quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh: Xây dựng quy trình chuẩn từ tách chiết DNA mô côn trùng nhỏ, thiết kế - đánh giá mồi in silico, tối ưu hóa thông số luân nhiệt PCR (56 °C cho cả hai cặp mồi) đến giải trình tự Sanger.
2. Xác định mô hình tiến hóa chuẩn: Chứng minh tính hiệu quả của mô hình thay thế nucleotide GTR + G + I trong việc phân tích cây phát sinh loài cho các chi ong Dú họ Meliponini.
3. Cung cấp dữ liệu định danh sinh học phân tử: Hỗ trợ định danh chính xác các mẫu ong Dú thu thập tại Việt Nam thuộc các chi Tetragonula và Lepidotrigona, khắc phục hạn chế của phương pháp hình thái học đối với các loài côn trùng có kích thước nhỏ.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

• Số lượng mẫu thực nghiệm thu nhận được sản phẩm khuếch đại và giải trình tự thành công còn giới hạn (2 mẫu gen COI và 4 mẫu gen EF-1α từ 7 mẫu ban đầu).
• Bộ dữ liệu tham chiếu trên GenBank đối với các loài ong Dú đặc hữu tại khu vực Đông Nam Á và Việt Nam còn chưa thực sự phong phú, dẫn đến một số mẫu (như C12) mới chỉ dừng lại ở mức độ phân nhóm chi lớn.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng phạm vi thu thập mẫu ong Dú tại nhiều vùng sinh thái khác nhau trên cả nước.
• Mở rộng phân tích đa gen (kết hợp đồng thời nhiều chỉ thị: COI, COII, 16S rRNA, ND5 và EF-1α) để tăng độ phân giải phân loại học và xây dựng cây phát sinh loài toàn diện hơn.
• Kết hợp sâu hơn giữa dữ liệu mã vạch phân tử và các phân tích hình thái hiển vi chuyên sâu.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học Phân tử, Côn trùng học: Cung cấp tài liệu thực hành chi tiết về quy trình khai thác dữ liệu NCBI, sử dụng các công cụ IDT OligoAnalyzer, AnnHyb, chạy ModelTest và xây dựng cây phả hệ trên MEGA X.
• Các phòng thí nghiệm và nhà nghiên cứu phân loại sinh học: Cung cấp thông số nhiệt, trình tự mồi chuẩn (CB2-F/R và EB1-F/R) để khuếch đại thành công vùng gen COI (353 bp) và EF-1α (244 bp) trên mẫu ong Dú kích thước nhỏ.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Cặp mồi nào được tác giả lựa chọn để khuếch đại vùng gen COI và EF-1α trong thực nghiệm?

Tác giả đã chọn lọc và kiểm chứng 2 cặp mồi:

• Vùng gen COI: Cặp mồi CB2-F (5’-GGATCTCCTGATATAGCATTTCCACG-3’) và CB2-R (3’-GCTCCAGCTAATACTGGTAATG-5’), cho sản phẩm khuếch đại kích thước 353 bp, nhiệt độ nóng chảy $T_m = 56,54\ ^\circ\text{C}$.
• Vùng gen EF-1α: Cặp mồi EB1-F (5’-CTACTGAACCACCATACTCCGAGACC-3’) và EB1-R (5’-GACCAACTGGTACTGTTCCAATACC-3’), cho sản phẩm khuếch đại kích thước 244 bp, nhiệt độ nóng chảy $T_m = 59,49\ ^\circ\text{C}$.

2. Điều kiện chu trình nhiệt PCR được chuẩn hóa trong khóa luận như thế nào?

Phản ứng PCR 50 µL được tiến hành theo chu trình:

• Giai đoạn biến tính ban đầu: $95\ ^\circ\text{C}$ trong 5 phút (1 chu kỳ).
• Giai đoạn chu kỳ (40 chu kỳ): Biến tính ở $95\ ^\circ\text{C}$ trong 30 giây; bắt cặp mồi ở $56\ ^\circ\text{C}$ trong 30 giây; kéo dài ở $72\ ^\circ\text{C}$ trong 120 giây.
• Giai đoạn kéo dài cuối cùng: $72\ ^\circ\text{C}$ trong 7 phút (1 chu kỳ).

3. Mô hình tiến hóa nucleotide nào được lựa chọn để tái dựng cây phả hệ và trên phần mềm nào?

Thông qua công cụ ModelTest tích hợp trong phần mềm MEGA X, tác giả đã xác định mô hình tiến hóa tối ưu cho cả hai tập dữ liệu gen COI và EF-1α là mô hình GTR + G + I (General Time Reversible với phân phối biến thiên Gamma và tỷ lệ vị trí bất biến).

4. Kết quả phân tích phả hệ đã định danh các mẫu ong nghiên cứu vào những phân nhóm loài nào?

• Mẫu C8 (COI): Nằm cùng phân nhóm với loài Tetragonula iridipennis (bootstrap > 60%).
• Mẫu C12 (COI): Nằm cùng phân nhóm với chi Melipona và Partamona (bootstrap 100%).
• Các mẫu E3, E6, E7 (EF-1α): Nằm cùng phân nhóm với chi Lepidotrigona (bootstrap đạt từ 85% đến 88%).
• Mẫu E4 (EF-1α): Nằm cùng phân nhóm với chi Tetragonula (bootstrap 100%).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Phạm Văn Nam đã xây dựng thành công quy trình phân tích phả hệ phân tử dựa trên hai vùng chỉ thị gen COI và EF-1α nhằm hỗ trợ phân loại các loài ong Dú tại Việt Nam. Bằng việc kết hợp đánh giá mồi in silico, thực nghiệm PCR - giải trình tự Sanger và xây dựng cây phát sinh loài trên MEGA X theo mô hình GTR + G + I, nghiên cứu đã định danh thành công các mẫu ong thuộc các chi Tetragonula và Lepidotrigona. Kết quả của đề tài đóng góp cơ sở dữ liệu phân tử và quy trình kỹ thuật hữu ích phục vụ cho công tác giám định, bảo tồn và khai thác nguồn gen côn trùng có giá trị dược liệu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tổng quan tài liệu 1. Khái niệm côn trùng Côn trùng (insectum) là động vật thuộc về ngành không xương sống thuộc lớp Insecta. Chúng là nhóm lớn nhất trong ngành động vật chân đốt (N.

Cấu tạo côn trùng Côn trùng được xác định gồm các phần: đầu, ngực, bụng (Capinera, 2011). Hình ảnh mô tả cấu tạo chung của côn trùng được minh họa ở hình I. 1 Đặc điểm cấu tạo côn trùng (Capinera, 2011) Chú thích: (1) Đầu; (2) Ngực; (3) Bụng; (4) Miệng; (5) Chân trước; (6) Chân giữa; (7) Chân Sau; (8) Râu; (9) Mắt đơn; (10) Mắt kép; (11) Cánh trước; (12) Cánh sau; (13) Bộ phận sinh dục ngoài; (14) Lông đuôi Phần đầu nằm ở phía trước chứa các cơ quan cảm nhận và thu thập thức ăn quan trọng bao gồm: Râu đầu, mắt kép, mắt đơn và miệng. Phần lõm vào trong đó được gọi là sống nổi trong.

Các sống nổi này để cơ bám và tăng thêm độ cứng của vỏ đầu. Các ngấn phân chia vỏ đầu thành các khu và các mảnh, như khu trán-chân môi, khu cạnh- đỉnh đầu, khu ót, khu ót sau, khu dưới má, và đặc biệt môi trên và lưỡi cũng là một mảnh của vỏ đầu tạo thành. Trên đỉnh đầu ở giai đoạn ấu trùng thấy rất rõ ngấn lột xác hình chữ Y ngược (N. Phần ngực nằm ở ngay sau đầu và là vùng nối các khớp chân và đôi cánh.

Ngực được chia thành ba phân đoạn, được gọi là (từ trước ra sau) prothorax, mesothorax và metathorax. Đôi cánh được gắn vào trung bì và metathorax (hai cặp cánh), hoặc chỉ đến 2 mesothorax. Chân có sáu thành phần cơ bản bao gồm: hông, xương chày, xương đùi, ống chân, thân trước và xương trước (Capinera, 2011). Phần bụng là cơ quan chính thứ ba và lớn nhất chứa hầu hết các cơ quan tiêu hóa và cơ quan sinh sản (Capinera, 2011).

Ống tiêu hoá chia làm 3 phần: ruột trước, ruột giữa và ruột sau. Ranh giới ruột trước và ruột giữa là van Cacdia. Ranh giới ruột giữa và ruột sau là van Pilo. Các van Cacdia và Pilo ngăn không cho thức ăn đi ngược chiều và điều hoà sự vận chuyển thức ăn trong ruột (N.

Tổng quan về Bộ cánh màng Bộ Cánh Màng là một bộ lớn trong lớp côn trùng. Số loài đã biết trên 120000 loài. Tất cả những loài kiến, ong thường gặp hàng ngày đều thuộc bộ này, ngoài ra còn có nhiều loài ong kí sinh bé nhỏ khác. Đặc điểm chủ yếu của bộ cánh màng là: Miệng gậm nhai hoặc gậm hút.

Có 2 đôi cánh bằng chất màng, cánh trước thường lớn hơn cánh sau. Mép trước của cánh sau có một dãy móc câu nhỏ móc lên nếp cuốn của mép sau cánh trước, hệ thống mạch cánh thay đổi phức tạp. Các mạch dọc thường gấp khúc, có tên gọi là mạch quay. Có loài mạch cánh thoái hoá gắn hết, thậm chí có loài không còn cánh.

Chân phát triển bình thường, có 1-2 đốt chuyển. Đốt bụng thứ nhất thường nhập vào đối ngực. Trừ những loài thuộc họ phụ bụng không thất nhỏ, tất cả đều có đốt bụng thứ hai rất nhỏ tựa hình cuống. Nói chung con cái có ống đẻ trứng dạng răng cưa hoặc dạng ngòi châm.

Bộ Cánh màng thuộc nhóm biến thái hoàn toàn. Sâu non phân nhiều có đầu phát triển, ngực chia 3 đốt, bụng chia 10 đốt. Sâu non loài ong ăn lá, đa số có 3 đời chín ngực và nhiều đôi chân bụng rất giống sâu non bộ cánh vẩy, nhưng cuối chân không có móng và từ đốt bụng thứ 2 đã có chân. Nhiều loài sâu non không có chân, mình mềm, màu trắng nhạt, có loài đầu không cũng lắm.

Có nhiều loài trước khi hoá nhộng nhả tơ làm kén. Bộ cánh màng là một trong những loài có sự đa dạng sinh học cao nhất, bao gồm các loài ăn thức ăn là cây cỏ, và một loạt các loài ký sinh trùng (LaSalle et al, 1993). Trong số các loài côn trùng có ích, các loài ong thuộc bộ Cánh Màng có số lượng rất lớn, nhiều loài có vai trò quan trọng trong việc tạo mật và kiềm hãm số lượng côn trùng gây hại cho cây trồng (Dowton et al, 2009). Họ ong Mật 3 Theo Viện từ điển học và bách khoa thư Việt Nam http://bachkhoatoanthu.vn Ong mật thuộc họ ong mật (Apidea), thuộc bộ cánh màng (Hymenoptera) có đời sống xã hội và có khả năng sản xuất mật.

Trong một đàn ong mật sẽ bao gồm: Ong chúa, Ong thợ và ong đực. Ong chúa: thân dài khoảng 20 - 25 mm. Cánh ngắn, kim châm ngắn. Ong chúa có nhiệm vụ sinh sản.

Ong chúa có thể chủ động đẻ trứng thụ tinh để nở thành ong thợ hoặc trứng không thụ tinh để trở thành ong đực. Ong đực: thân dài khoảng 15 - 17 mm. Không có ngòi châm, cánh lớn. Ong đực chỉ có một tác dụng là giao phối với ong chúa.

Ong thợ: là những con ong cái mà bộ phận sinh dục bị thoái hoá, không có khả năng thụ tinh. Ong thợ thực hiện tất cả công việc của đàn ong: bảo vệ tổ, sản sinh sữa để nuôi ấu trùng, hút mật hoa luyện thành mật ong được mô tả ở hình I. 2 Đặc điểm và thành phần của ong mật (Viện từ điển học và bách khoa thư Việt Nam) Chú thích: 1. Tầng ong cắt dọc (a - Trứng, b - Ấu trùng, c - Tổ đã bịt nắp, d - Nhộng, e - Ong non) 1.

Họ ong Dú Ong Dú (Stingless bee) hay còn được gọi là ong không ngòi đốt, một trong ba phân họ của họ Apidae. Ong không đốt sống ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới trên khắp thế giới bao gồm: Châu Phi, Châu Úc, Trung và Nam Mỹ (hình I. Ong không đốt được cho là có nguồn gốc từ châu Phi (Kwapong et al. 3 Khu vực sống của Ong không đốt trên thế giới (Kwapong et al., 2010) Ong Dú dễ dàng phân biệt bởi có kích cỡ nhỏ, không đốt, tính hiền, an toàn với con người (Wille.

Tổ của Ong không đốt thường được tìm thấy trong các hốc của thân hoặc cành cây, những vết nứt trên tường nhà (Kwapong et al. 4 Tổ của một số loài ong không đốt (a.) (Kwapong et al., 2010) Vật liệu xây tổ của loài ong không đốt thường được sử dụng là gôm, nhựa, sáp. Một số loài khác có thể thêm cát, bùn, keo ong để xây tổ (Kwapong et al, 2010). Đời sống xã hội của Ong Dú cũng tương tự với ong mật, bao gồm: Ong chúa, Ong thợ (Wille.

Ong chúa là ong đứng đầu điều khiển tổ chức và hoạt động hàng ngày của tổ. Ong thợ thì làm các công việc như kiếm ăn, bảo vệ tổ và cho ấu trùng ăn (Kwapong et a. Theo khảo sát trên bộ dữ liệu NCBI tính đến ngày 1 tháng 1 năm 2023, Ong Dú thuộc họ Meliponini có 54 chi khác nhau được thể hiện ở hình I. 5 Chi ong thuộc họ Meliponini (Taxonomy NCBI) 1.

Gen COI Gen COI (Cytochrome oxidase I) là gen thường trực trong ti thể, được sử dụng làm mô hình để kiểm tra sự tương đồng bên trong gen với tốc độ tiến hóa và ý nghĩa của nó đối với các phân tích tiến hóa của côn trùng (Lunt et al. Tiểu đơn vị COI chứa một hệ thống các gốc hữu cơ và kim loại, bao gồm các ion sắt, đồng và kẽm, được sắp xếp trong các cụm phức tạp để tạo thành trung tâm oxy hóa- reduction của enzyme cytochrome c oxidase. Trung tâm này chịu trách nhiệm cho việc chuyển đổi các phân tử oxy và proton thành nước và ATP trong quá trình hô hấp tế bào. Cấu trúc của tiểu đơn vị COI cũng có một số vùng đặc biệt, như vùng N-terminus, vùng transmembrane và vùng C-terminus, có vai trò quan trọng trong quá trình hoạt động của enzyme cytochrome c oxidase.

6 Cấu trúc của tiểu đơn vị COI (Tsukihara. Gen EF-1α (elongation factor-1α) Theo nghiên cứu của Kumar và các cộng sự, 2011 sử dụng trình tự EF-1α nhằm phân tích mối quan hệ trong họ Apis thông qua khuếch đại nucleotide, giải trình tự và phân tích cây phát sinh loài, kết quả Cây cho thấy rằng chủng MSS2 được phân cụm cao với Apis florea và Apis cerana với 100% giá trị bootstrap. Ngoài ra, chủng MSS2 có khả năng đồng nhất trình tự tối đa (99%) với Apis niqrocincta và Apis cerana so với Apis dorsata (96%) và Apis florea(95%). Phân tích trình tự gen EF-1α của ong là một công cụ hiệu quả để phân loại các loài ong mật khác nhau.

Hệ thống phát sinh loài của ong đang được phát triển nhanh chóng, Theo nghiên cứu của Brady và các cộng sự, 2004 đã phát hiện vùng trình tự elongation factor-1α (EF- 1α) chỉ được phát hiện ở họ Colletidae phân họ của ong mật với độ dài từ 101bp đến 1044bp. Tác giả cũng đã chứng minh rằng đoạn trình tự EF-1α không xuất hiện ở bất kỳ loài côn trùng khác, kể cả một số nhóm có đặc tính giống với bộ cánh màng. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật Liệu Một số mẫu ong Dú do phòng CNSH Vật liệu và Nano, Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.

HCM cung cấp. Phương pháp nghiên cứu chính Nội dung 1: Ứng dụng một số công cụ tin sinh học để thu thập bộ dữ liệu gene COI và EF-1α của một số loài ong Khai thác dữ liệu, hệ thống tổng quan khoa học trên nguồn cơ sở dữ liệu của PubMed, PubMed Central (National Central for Biotechnology Information – NCBI), Google bằng cách tra cứu dựa vào một số từ khóa tiếng Anh: COI, elongation factor- 1α (EF-1α), Phylogenetic analysis,. - Tìm hiểu thông tin khoa học - Chọn lọc các báo cáo khoa học phù hợp với tiêu chí nghiên cứu - Trích xuất dữ liệu: tác giả, năm xuất bản; thông tin về loài ong: chủng tộc, cấu trúc phương pháp phân tích. - Trích xuất dữ liệu trình tự gene mục tiêu trên ngân hàng gene.

Nội dung 2: Khảo sát trên máy tính để thiết kế bộ mồi phù hợp, đặc hiệu trên vùng trình tự gene COI, EF-1α của một số loài ong Trên ngân hàng dữ liệu NCBI (http://www.gov/), thu thập thông tin thiết kế các trình tự mồi chuyên biệt trên vùng gene mục tiêu: gene COI, EF-1α từ những công trình nghiên cứu đã công bố trước. Khảo sát, thiết kế bộ mồi với trình tự gene mục tiêu: dự kiến là gene COI, EF-1α; trong trường hợp phù hợp với thời gian nghiên cứu sẽ tiếp tục khảo sát trên các gene mục tiêu còn lại: COII, ND5, 16S rRNA bằng các công cụ tin sinh học phù hợp: + Blast (http://Blast.cgi) với các thông số mặc định sẵn trên NCBI nhằm xác định độ đặc hiệu của mồi thiết kế. + Sử dụng phần mềm trực tuyến IDT analyzer (http://www.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/) để xác định các thông số quan trọng của mồi như kích thước, %GC, nhiệt độ lai, khả năng tạo cấu trúc kẹp tóc.