TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------------------ BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: ỨNG DỤNG MARKER PHÂN TỬ TRONG XÁC ĐỊNH DÒNG BẤT DỤC ĐỰC TẾ BÀO CHẤT (CMS) VÀ DÒNG PHỤC HỒI HỮU DỤC Rf Ở ỚT (Capsicum annuum L.) KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CNSH NÔNG NGHIỆP. Lê Thị Kính CN. Nguyễn Duy Khánh SVTH: Nguyễn Ngọc Kim MSSV: 1053010353 Niên khóa: 2010-2014 TP. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2014 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp khóa 2010 GVHD: TS Lê Thị Kính LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn tất cả thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy, trang bị cho em những kiến thức cần thiết trong suốt những năm tháng đại học. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Lê Thị Kính đã hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài này. Cảm ơn tất cả các anh, chị phòng thí nghiệm Marker phân tử đã giúp đỡ em rất nhiều trong suốt thời gian thực tập và làm khóa luận, đặc biệt cảm ơn anh Nguyễn Duy Khánh đã tận tình chỉ dạy, hướng dẫn để em hoàn thành đề tài. Em xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu nhà trường và Ban giám đốc cùng toàn bộ anh, chị trong công ty Cổ phần giống cây trồng Miền Nam đã tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập và hoàn thành khóa luận. Trân trọng cảm ơn bạn bè đã giúp đỡ, ủng hộ, khích lệ tinh thần cũng như chia sẻ, củng cố kiến thức cùng mình trong quá trình thực tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Cuối cùng, con xin tỏ lòng biết ơn đến ba mẹ đã nuôi nấng, dạy dỗ, chăm sóc, khích lệ, tạo mọi điều kiện để con học tập, hoàn thành thực tập và tốt nghiệp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2014. Nguyễn Ngọc Kim SVTT: Nguyễn Ngọc Kim-1053010353 Trang i Báo cáo khóa luận tốt nghiệp khóa 2010 GVHD: TS Lê Thị Kính MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .1 Giới thiệu về cây ớt .5 Đặc điểm thực vật học của cây ớt .6 Độ cay của ớt .2 Phương pháp phát hiện gen CMS và gen Rf.2 Gen phục hồi Rf .3 Marker phân tử .4 Các dòng ớt trong hệ thống sản xuất ớt lai 3 dòng.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu về marker phân tử liên kết với gen CMS và gen phục hồi hữu dục (Rf) ở ớt . Nghiên cứu về marker liên kết gen CMS .2 Nghiên cứu về marker liên kết gen phục hồi hữu dục (Rf) ở ớt . VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP.1 Mẫu thực vật .2 Nhuộm hạt phấn với acetocarmine .24 SVTT: Nguyễn Ngọc Kim-1053010353 Trang ii Báo cáo khóa luận tốt nghiệp khóa 2010 GVHD: TS Lê Thị Kính 3.3 Tách chiết DNA . Phương pháp tách chiết DNA genome của các giống ớt . Quy trình.4 Kiểm tra tính đặc hiệu của các marker bằng phương pháp PCR và điện di .1 Phương pháp PCR .2 Thành phần phản ứng .2 Phương pháp điện di.2 Quy trình điện di gel agarose . KẾT QUẢ & THẢO LUẬN . Kết quả soi phấn hoa.1 Phấn hoa của 8 cặp A/B và 7 dòng R .1 Phấn hoa của 49 mẫu thu thập . Kết quả khảo sát các bộ mồi .1 Kết quả tách chiết DNA .2 Chạy thử nghiệm marker CMS trên dòng CMS và duy trì .3 Kết quả khảo sát gradient nhiệt độ trên các dòng CMS và duy trì 37 4.4 Kết quả phân tích marker Orf456 trên 8 cặp dòng CMS và dòng duy trì .5 Chạy kiểm tra marker Rf trên dòng phục hồi và dòng duy trì .6 Kết quả khảo sát gradient nhiệt độ của bộ mồi CRF-SCAR trên dòng R.40 SVTT: Nguyễn Ngọc Kim-1053010353 Trang iii Báo cáo khóa luận tốt nghiệp khóa 2010 GVHD: TS Lê Thị Kính 4.7 Kết quả phân tích marker CRFSCAR trên 8 dòng B và 7 dòng R .8 Phân tích yếu tố bất dục và phục hồi trên 49 mẫu thu thập . KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ . TÀI LIỆU THAM KHẢO .50 SVTT: Nguyễn Ngọc Kim-1053010353 Trang iv Báo cáo khóa luận tốt nghiệp khóa 2010 GVHD: TS Lê Thị Kính DANH MỤC HÌNH Hình Trang Hình 2.1 Các loại ớt trồng phổ biến ở Việt Nam.3 Các loại ớt kiểng .1 Phá vỡ màng tế bào.2 Mẫu sau khi ủ vàng cho thêm chloroform - IAA (24:1).3 Mẫu sau ly tâm .4 DNA tủa ở đáy eppendorf.5 Các giai đoạn của phản ứng PCR .1 Hạt phấn các dòng A/B nhuộm với acetocarmine .2 Kết quả soi hạt phấn của 49 dòng/giống ớt thu thập .3 Kết quả tách chiết DNA.4 Chạy thử nghiệm marker orf456 trên dòng CMS và dòng duy trì .5 Chạy thử nghiệm marker atp6 trên dòng CMS và duy trì .6 Khảo sát gradient nhiệt độ mồi orf456 và atp6 .7 Kết quả phân tích marker CMS trên 8 cặp dòng A/B.8 Kiểm tra marker CRFSCAR trên dòng phục hồi và dòng duy trì .9 Khảo sát gradien nhiệt của bộ mồi CRFSCAR trên dòng phục hồi và dòng duy trì .10 Phân tích marker CRFSCAR trên 8 dòng B và 7 dòng R .11 Phân tích nhân tố CMS bằng marker Orf456 trên 49 mẫu ớt thu thập .12 Phân tích nhân tố phục hồi bằng marker CRFSCAR trên 49 mẫu ớt thu thập . 43 SVTT: Nguyễn Ngọc Kim-1053010353 Trang v Báo cáo khóa luận tốt nghiệp khóa 2010 GVHD: TS Lê Thị Kính DANH MỤC BẢNG Bảng Trang Bảng 1: Danh sách tên 49 dòng/ giống thu thập . 20 Bảng 2: Thông và trình tự mồi sử dụng trong đề tài. 22 Bảng 3: Kết quả phân tích yếu tố bất dục, hữu dục bằng marker, kiềm tra hạt phấn trên 8 cặp A/B và 7 dòng R . 40 Bảng 4: Kết quả phân tích nhân tố CMS, Rf bằng marker cùng kết quả kiểm tra hạt phấn trên 49 dòng/giống thu thập . 43 SVTT: Nguyễn Ngọc Kim-1053010353 Trang vi Báo cáo khóa luận tốt nghiệp khóa 2010 GVHD: TS Lê Thị Kính 1. ĐẶT VẤN ĐỀ SVTT: Nguyễn Ngọc Kim-1053010353 Trang 1 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp khóa 2010 GVHD: TS Lê Thị Kính Ớt là loại cây được con người trồng trọt và thu hái từ lâu đời. Với nhiều người, đây là gia vị không thể thiếu trong bữa ăn hằng ngày, làm tăng cảm giác ngon miệng. Trong ớt có các hợp chất sinh học có hoạt tính tốt cho sức khỏe như vitamin, capsaicin, flavonoid,…vì thế ớt được coi là một dược liệu quý trong y học. Hơn thế nữa, ớt còn là nguyên liệu quan trọng cung cấp cho các nhà máy, công ty sản xuất các mặt hàng thực phẩm tiêu thụ và xuất khẩu đem lại lợi nhuận cao [36]. Ở nước ta, ớt được trồng khắp 3 miền với diện tích trồng khoảng 26.000 ha, nhu cầu hạt giống ớt hàng năm khoảng 2,6 tấn hạt với giá trị khoảng 2 triệu USD [7]. Các giống ớt cay được trồng chủ yếu ở nước ta là những giống địa phương như ớt sừng, chìa vôi, ớt hiểm,… Ngoài ra còn một số giống nhập nội từ Trung Quốc, Đài Loan và Nhật Bản [8]. Thị trường hạt giống ớt cay ở Việt Nam hầu như do các công ty nước ngoài chiếm lĩnh, nghiên cứu về chọn tạo và sản xuất hạt giống ớt cay trong nước chỉ phát triển trong khoảng một thập kỷ nay. Năm 2004, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn công nhận giống tạm thời và đưa vào sản xuất thử 2 giống ớt lai F1 do Viên nghiên cứu rau quả Việt Nam lai tạo là HB 9 và HB 14, năng suất trung bình đạt 20- 25 tấn/ha. Viện Nghiên cứu Cây ăn quả Miền Nam đã cho ra đời giống ớt lai Long Định 3 dễ trồng, ít sâu bệnh, phù hợp với thổ nhưỡng vùng Đồng bằng sông Cửu Long, năng suất cao 40-50 tấn/ha. Tuy nhiên, các giống ớt cay kể trên vẫn chưa thể kinh doanh trên diện rộng do chưa có khả năng cạnh tranh với các giống ngoại nhập về năng suất và chất lượng thương phẩm [7]. Khó khăn trong sản xuất hạt giống ớt lai F1 là do hoa ớt có kích thước rất nhỏ, nên việc khử túi phấn tốn rất nhiều công lao động, làm tăng giá thành sản xuất giảm sức cạnh tranh của giống ớt cay F1. Biện pháp phổ biến hiện nay được các công ty giống sử dụng là dùng các giống có yếu tố bất dục đực làm dòng mẹ để giảm chi phí khử túi phấn [7]. Về mặt di truyền, bất dục đực có 2 dạng là bất dục đực do nhân và bất dục đực tế bào chất, dạng bất dục đực trong nhân ít được sử dụng do nó phụ thuộc quá nhiều vào điều kiện môi trường, trong bối cảnh biến đổi khí hậu như hiện SVTT: Nguyễn Ngọc Kim-1053010353 Trang 2 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp khóa 2010 GVHD: TS Lê Thị Kính nay sử dụng dạng bất dục đực nhân để phục vụ công tác lai tạo là không thỏa đáng vì con lai có khả năng tạp nhiễm cao do dòng mẹ bất dục không ổn định. Vì vậy, sử dụng yếu tố bất dục tế bào chất trong sản xuất ớt lai 3 dòng là giải pháp ưu việt do dòng mẹ có tính ổn định cao và không phụ thuộc vào điều kiện môi trường [11]. Một hạn chế trong chọn tạo giống ớt cay lai F1 có yếu tố CMS là mất nhiều thời gian để tạo ra các dòng A/B, R cho con lai 3 dòng, thời gian để tạo một giống ớt lai F1 có khả năng kinh doanh là 6-8 năm. Tuy nhiên, các giống ớt cay nhập nội của các công ty nước ngoài hàng năm vào Việt Nam ngày càng nhiều, càng đa dạng thì thời gian 6-8 năm mới ra giống là không có khả năng cạnh tranh [7]. Ngày nay, công nghệ sinh học đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp nói chung và chọn tạo giống cây trồng nói riêng. Một trong những ứng dụng quan trọng là dùng marker phân tử để xác định một tính trạng mục tiêu của cây trồng với độ chính xác cao và thời gian nhanh chóng. Sử dụng marker phân tử để xác định các yếu tố liên quan đến CMS trên ớt đã được nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới [11]. Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu thuộc trường ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM đã tiến hành khảo sát các bộ mồi liên kết với tính trạng CMS và phục hồi hữu dục ở giống ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens), kết quả nhóm xác nhận 3 marker đặc hiệu trong việc phát hiện nhân tố CMS và phục hồi [12], tuy nhiên đây chỉ là đề tài sơ khởi trên 1 giống với 4 bộ mồi, vì vậy cần có nghiên cứu sâu hơn trên bộ mồi lớn hơn và quần thể ớt đa dạng hơn bao gồm cả ớt chỉ thiên và chỉ địa.
