MỞ ĐẦU Bacillus cereus thuô ̣c nhóm 1 chi Bacillus là vi khuẩn hình que , Gram dương và sinh bảo tử. cereus thường xuấ t hiê ̣n trong đấ t , trong sữa nguyên liê ̣u, trong các sản phẩ m từ sữa và trong các loa ̣i ngũ cố c. cereus có khả năng liên quan đế n các bê ̣nh về đường ruô ̣t như gây nôn và tiêu chảy nhờ khả năng sản sinh 4 loại enterotoxin trong đó có 2 tổ hơ ̣p hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein là enterotoxin T (BCET) và cytotoxin K (Beecher, Wong, 1994). cereus còn có khả năng sản sinh một loại độc tố chịu nhiệt n on-riposome peptide synthetase (NRPS-cereulide) (Agata et al.
Ở nước ta hiện nay theo báo cáo từ bộ y tế, chỉ có khoảng 38 trung tâm y tế có khả năng kiểm nghiệm được loài vi khuẩn này, khoảng 60% các tình thành có năng lực kiểm nghiệm. Tuy nhiên hiện nay phương pháp xét nghiệm vẫn dựa trên phương pháp đếm tổng số khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng kết hợp với các xét nghiệm hóa sinh khác. Phương pháp này có nhược điểm là thời gian lâu, có thể mất nhiều ngày hoặc vài tuần và độ chính xác không cao.Trong những năm gần đây, các phương pháp xét nghiệm vi sinh vật dựa trên nguyên tắc di truyền phân tử và miễn dịch học đã được thiết lập như: lai phân tử, PCR (Polymerase Chain Reaction), Elisa cho kết quả rất khả quan với độ chính xác cao, thời gian rút ngắn có thể xuồng vài giờ, không đòi hỏi nhiều máy móc thiết bị do đó khả năng cơ động là rất cao. Những phương pháp trên đã mở ra cho ngành vi hóa sinh học nói riêng và cả ngành công nghệ thực phẩm hiện đại.
xuất phát từ tính cấp thiết chúng tôi tiến hành đề tài: “Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam”. Với mục đích tạo nguồn gen cho sản xuất nguyên liệu chế tạo kit phát hiện các độc tố của vi khuẩn B. cereus sau này. 1 download by : skknchat@gmail.com */ Mục tiêu của nhiệm vụ: - Tách dòng và đọc trình tự gen mã hóa độc tố gây nôn và tiêu chảy nhờ khả năng sản sinh 4 loại enterotoxin trong đó có 2 tổ hơ ̣p hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein là enterotoxin T (BCET) và cytotoxin K từ vi khuẩn B.
*/ Nhiệm vu của đề tài: - Phân lập vi khuẩn B.cereus tư các mẫu phẩm thu thập tại một số quán an vỉa hè tại hà nội, - Sàng lọc hệ gen mã hóa độc tố gây nôn và tiêu chảy , trong đó có 2 tổ hơ ̣p hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein là enterotoxin T (BCET) và cytotoxin K - Tách dòng và đọc trình tự các gen HBL, NHE, BCET và cytotoxin K từ một số chủng vi khuẩn B. 2 download by : skknchat@gmail.com TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm (Food poisoning) Ngộ độc thực phẩm là thuật ngữ dùng để chỉ một hội chứng cấp tính, xảy ra đột ngột, do ăn phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng những triệu trứng nôn mửa, tiêu chảy và những triệu chứng khác tuỳ theo đặc điểm của từng loại ngộ độc (tê liệt thần kinh, co giật, rối loạn hô hấp, tuần hoàn, vận động…) [3].
Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Hiện nay tại Việt Nam cũng như trên thế giới, ngộ độc thực phẩm xảy ra thường xuyên với nhiều nguyên nhân khác nhau. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm thường được chia thành tác nhân lây nhiễm và tác nhân độc tố. Tác nhân lây nhiễm bao gồm các loại vi khuẩn, virut, ký sinh trùng… Còn tác nhân độc tố bao gồm các độc tố có sẵn trong thực phẩm, các loại hoá chất tồn dư trong thực phẩm như kim loại nặng, thuốc trừ sâu, các chất phụ gia hoá học…[60]. Trong các vụ ngộ độc thực phẩm hiện nay, nguyên nhân do vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn chiếm tỉ lệ cao.
Có rất nhiều loại vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc thực phẩm tuy nhiên khoảng 90% ca ngộ độc thực phẩm hiện nay là do Staphylococus aureus, Salmonella, Clostridium perfingens, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli và Bacillus cereus… [59]. Do đó việc tìm hiểu các đặc tính của chúng là vô cùng cần thiết để có thể đưa ra biện pháp kiểm soát hiệu quả. Dưới đây là đặc tính của một số chủng vi khuẩn có nguy cơ ngộ độc cao: Staphylococus aureus S. aureus thường gặp ở các món ăn như salat cà chua, bánh sandwich và các sản phẩm đóng hộp.
aureus nhiễm vào thực phẩm, chúng sẽ sản sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với triệu chứng nôn, choáng váng và đau quặn bụng [59,60]. 3 download by : skknchat@gmail.com Salmonellae sp. Salmonellae thường tồn tại trong các thực phẩm có hàm lượng protein cao như thịt, cá, trứng…Salmonellae có thể sinh trưởng trong thực phẩm, nhưng không sinh độc tố, khi chúng vào trong ruột hoặc vào máu chúng mới sinh độc tố. Bệnh ngộ độc do Salmonellae có triệu chứng điển hình như buồn nôn, nôn, tiêu chảy và đau đầu [59,60].
perfrigens thường xuất hiện trong đất, nước do đó chúng rất dễ nhiễm vào thức ăn. Khi xâm nhập vào cơ thể người và động vật, chúng thường cư trú trong ruột non. Nếu thực phẩm chứa một lượng lớn vi khuẩn này được tiêu hoá thì khi C. perfrigens vào tới ruột non, chúng sẽ sản sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với triệu chứng đau bụng dữ dội, tiêu chảy ra nước [59,60].
cholerae thường có mặt trong những thực phẩm chưa được nấu chín kỹ đặc biệt là các loại thuỷ, hải sản sống. Ngộ độc do V. cholerae có các triệu chứng điển hình như nôn, tiêu chảy dữ dội và liên tục nhưng không đau bụng. Bệnh nhân nếu không điều trị kịp thời sẽ bị mất nước nghiêm trọng, trụy tim dẫn đến tử vong [59,60].
coli là vi khuẩn sống chủ yếu trong ruột của người và động vật. Nhiễm trực khuẩn đường ruột này với số lượng lớn sẽ bị ngộ độc. Triệu chứng bệnh chủ yếu là đau bụng dữ dội, tiêu chảy, có thể nôn mửa [59,60]. Ngoài ra còn rất nhiều loại vi khuẩn khác có khả năng gây ngộ độc đã được nghiên cứu.
Trên đây chỉ là một vài ví dụ điển hình nhưng nhìn chung vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc thực phẩm ở 2 dạng: Ngộ độc do ăn phải thức ăn có độc tố của vi khuẩn mà không cần có mặt tế bào của chúng (Staphylococus aureus) và ngộ độc do ăn phải thức ăn nhiễm một số lượng 4 download by : skknchat@gmail.com lớn tế bào hoặc bào tử vi khuẩn để khi vào tới ruột non chúng phát triển sinh độc tố gây ngộ độc ( Salmonella). Nhưng trong số đó, vi khuẩn Bacillus cereus lại có khả năng gây ngộ độc thực phẩm ở cả hai dạng trên với hai thể bệnh điển hình là nôn và tiêu chảy. Tổng quan về Bacillus cereus B. cereus thuộc nhóm 1 chi Bacillus.
Các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus có mặt ở khắp mọi nơi trong môi trường sống, chúng mang đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương, tế bào có dạng hình que, hô hấp hiếu khí hay hiếu khí không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [43]. Hiện nay, có khoảng trên 100 loài thuộc chi này đã được miêu tả, một số loài có ứng dụng trong công nghiệp (sản xuất emzym) hoặc trong nông nghiệp (sản xuất thuốc trừ sâu sinh học), một số loài lại gây bệnh cho người và động vật. Các loài gây bệnh quan trọng thường nằm trong nhóm Bacillus cereus (nhóm 1 chi Bacillus) gồm Bacillus cereus, Bacillus myco¿des, Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis, Bacillus megaterium và mới đây có thêm hai loài là Bacillus weihenstephanensis và Bacillus pseudomyco¿des được phát hiện [38]. Các loài trong nhóm này có độ tương đồng về trình tự 16S, 23S rất cao và chúng có % (G + C) tương đồng khoảng 31%-41%.
Đây chính là những đặc điểm quan trọng để phân loại chúng thuộc nhóm Bacillus cereus [43]. Trong các loài thuộc nhóm B. cereus có liên quan tới an toàn thực phẩm và sức khoẻ con người thì B. thuringiensis được biết đến như là một loài vi khuẩn có khả năng hình thành protein tinh thể độc có khả năng sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học, B.
anthracis là tác nhân gây bệnh than. weihenstephanensis thường được tìm thấy trong các sản phẩm lương thực, thực phẩm bị hỏng [14]. cereus là nguyên nhân chủ yếu và quan trọng nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm. Lịch sử nghiên cứu Bacillus cereus B.
cereus được Frankland phân lập đầu tiên vào năm 1887 từ không khí tại một chuồng bò [64]. Năm 1906 ở Châu Âu, 300 người bệnh được đưa vào 5 download by : skknchat@gmail.com bệnh viện với những triệu chứng của bệnh đường ruột do ăn phải món thịt băm bị nhiễm số lượng lớn một loại vi khuẩn hiếu khí, sinh bào tử, hình que được gọi tên là Bacillus peptonificans. Sau này nó được đổi tên là Bacillus cereus [61,64]. Từ năm 1926 đến năm 1929: Theo thông báo có hai vụ ngộ độc liên quan tới một loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus hiếu khí có trong nước sốt vani và món thịt đông.Từ năm 1936 đến năm 1943: Trong 367 vụ ngộ độc ở thành phố Stockholm thì có 117 vụ nguyên nhân là do Bacillus spp.
Tuy nhiên do chưa có những hiểu biết rõ ràng về B. cereus nên chưa thể khẳng định rõ vai trò của chúng trong các vụ ngộ độc trên [61]. Năm 1950, Steinar Hauge nhà khoa học người Na Uy với những thí nghiệm đặc biệt đã khẳng định B. cereus là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và là tác nhân gây bệnh cho con người.
Để cung cấp bằng chứng khẳng định B. cereus là nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm, Hauge đã chứng minh bằng cách uống môi trường nuôi cấy B. Ông đã nuôi chúng tới mật độ 4.106 tế bào /g và uống 200ml. Sau 13 giờ, ông cảm thấy đau bụng dữ dội và bị tiêu chảy ra nước.
Đó là những thí nghiệm đầu tiên về loại B. cereus gây tiêu chảy. Năm 1954, một số cuộc thí nghiệm với những người tình nguyện ở Mỹ đã thất bại trong việc xác nhận lại những thí nghiệm của Hauge. Đến năm 1969, những vụ ngộ độc thực phẩm do B.
cereus đầu tiên đã được công bố ở Mỹ [64]. cereus được công nhận là tác nhân gây ra thể bệnh tiêu chảy, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một loại ngộ độc khác gây ra bởi B. cereus được gọi là typ gây nôn.