Đặt vấn đề Hiện nay ung thƣ cổ tử cung là loại ung thƣ xếp thứ hai trong các bệnh ung thƣ phổ biến của phụ nữ trên thế giới nhƣng lại chiếm vị trí đầu trong các bệnh ung thƣ của phụ nữ ở các nƣớc đang phát triển. HPV (Human Papilloma Vius) đã và đang là mối nguy hiểm đe dọa sức khỏe của những ngƣời phụ nữ mắc ung thƣ cổ tử cung hoặc những phụ nữ mang virus này. HPV đƣợc định type (genotype) dựa trên sự khác biệt về trình tự DNA của virus. Đến nay các nhà khoa học đã xác định đƣợc trên 100 type HPV khác nhau trong đó hơn 80 type đã đƣợc giải trình tự toàn bộ hệ gen và các type còn lại cũng đã đƣợc giải mã một phần.
Dựa trên khả năng gây ra các tổn thƣơng mô học, đặc biệt là khả năng gây ung thƣ cổ tử cung, HPV đƣợc chia làm hai nhóm: nhóm HPV nguy cơ cao (High-risk HPV) gồm các type HPV16, 18, 31, 45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68 ,70. trong đó HPV16, 18 chiếm tỷ lệ cao nhất. Các type HPV nguy cơ cao là nguyên nhân chính gây ra các tổn thƣơng nghiêm trọng và phát triển thành ung thƣ cổ tử cung. Nhóm HPV nguy cơ thấp (Low-risk HPV) gồm các type HPV1, 2, 6, 8, 9, 11, 42, 43, 44, 48, 49, 50, 64.
phổ biến nhất là HPV6, 11. Các type nguy cơ thấp là tác nhân gây nên đa số các dạng sùi mào gà sinh dục (HPV6, 11), mụn cóc ở chân (HPV1), mụn cơm ở tay (HPV2) và các dạng viêm nhiễm khác. Mối liên quan giữa nhiễm HPV và ung thƣ cổ tử cung đã đƣợc xác định từ những năm 70 của thể kỷ trƣớc, theo đó HPV gây ra rối loạn sinh sản của tế bào biểu mô cổ tử cung, với diễn tiến tự nhiên từ viêm nhiễm mạn tính, đến dị sản nhẹ, dị sản vừa, dị sản nặng, rồi ung thƣ cổ tử cung. Tuy hầu hết (khoảng 98%) tình trạng nhiễm HPV sẽ tự khỏi, nhƣng các types HPV thuộc nhóm nguy cơ cao có thể làm tổn thƣơng cổ tử cung nặng hơn hoặc thành ung thƣ, thƣờng sau khoảng 10 năm.
Khi đã bị nhiễm và có tổn thƣơng do HPV, không có thuốc điều trị đặc hiệu cho HPV, để tránh nguy cơ tổn thƣơng diễn tiến nặng hơn, chỉ có một cách điều trị là lấy đi tổn thƣơng này. 2 Hạn chế quan hệ tình dục sớm, không quan hệ tình dục với nhiều ngƣời và tình dục an toàn là những cách có thể giúp giảm nguy cơ nhiễm HPV. Tuy nhiên, cách phòng ngừa nhiễm HPV hiệu quả nhất là tiêm ngừa vacxin, hiện nay ở Việt Nam đang lƣu hành 3 loại vacxin phòng 4 types HPV phổ biến (type 6, 11, 16 và 18) đó là vacxin Vacxin Gardasil (MERCK &CO.,) và vacxin Cervarix (GlaxoSmithKline). Với những tiến bộ của y khoa hiện đại, ung thƣ cổ tử cung có thể đƣợc chữa khỏi nếu bệnh đƣợc phát hiện sớm.
Do đó bên cạnh việc tầm soát ung thƣ cổ tử cung bằng xét nghiệm tế bào học cổ tử cung (xét nghiệm PAP) thì việc phát hiện tình trạng nhiễm HPV và định type virus này cũng có vai trò rất quan trọng. Trên cơ sở các kết quả thu đƣợc từ những đề tài nghiên cứu về HPV trƣớc đây, chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot”. Mục tiêu nghiên cứu 1. Phát hiện đƣợc HPV ở phụ nữ bằng kỹ thuật Realtime-PCR.
Xác định đƣợc genotype HPV bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu và phát hiện tình trạng nhiễm HPV ở nhóm phụ nữ đƣợc lựa chọn bằng kỹ thuật Realtime-PCR. - Xác định các genotype HPV ở những trƣờng hợp nhiễm virus này bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
HPV – Human Papilloma Virus 1. Đặc điểm HPV Human Papilloma Virus (HPV) là nhóm virus có kích thƣớc nhỏ, mang vật liệu di truyền là DNA, gây bệnh ở ngƣời thuộc họ Papovaviridae. HPV có cấu trúc capsid không vỏ và đối xứng xoắn ốc, đƣờng kính hạt virus khoảng 52- 55nm chứa DNA dạng vòng, mạch đôi, liên kết với protein giống histone. Vỏ capsid đƣợc tạo thành từ 72 đơn vị capsomere, mỗi đơn vị là một pentamer của protein cấu trúc L1 và một protein cấu trúc L2 (protein này là thành phần kháng nguyên đƣợc sử dụng trong miễn dịch đặc hiệu).
Cả hai protein cấu trúc đều do virus tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) chiếm khoảng 80% tổng số protein của virus. Protein capsid phụ (L2) chiếm khoảng 20%. Riboxom có hệ số lắng là 21S. Tiểu phần lớn có một vòng xoắn cuộn có thể chuyển đổi thành tiểu phần nhỏ trong quá trình sao chép.
Ngoài ra, một tiểu phần thứ 3 có hệ số lắng là 14S sẽ xuất hiện chịu trách nhiệm sao chép lại DNA tế bào chủ khi bao trong Virion. Khi đó, capsid chứa DNA tế bào chủ đƣợc gọi là Virion giả hay Pseudovirion. Sự hình thành capsid của genome HPV 4 Hình 1. Hình dạng HPV HPV không phát triển trong điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, do đó muốn thực hiện đề tài này chỉ có thể dựa trên nghiên cứu invivo trên ngƣời bị nhiễm và những mẫu bị nhiễm sẽ đƣợc lƣu giữ ở nhiệt độ -700C trong một thời gian dài mà không làm ảnh hƣởng tới khả năng hoạt động của virus [22].
Bộ gen HPV Genome của HPV là một phân tử ADN kép không hoàn chỉnh, siêu xoắn vòng tức là capsome sắp xếp xung quanh theo chiều xoắn của acid nucleic (ở đây là DNA) tạo thành ống giống nhƣ cầu thang xoắn, chiều dài của capsid phụ thuộc chiều dài sợi acid nucleic, bộ gen virus chiếm 12% trọng lƣợng hạt virus, có kích thƣớc nằm trong khoảng 7,2 kb đến 8,1 kb (trong đó các base Guanine và Cytosine chiếm 42%), 10 khung đọc mở ORF. Khung đọc mở mã hoá cho toàn bộ protein của HPV nằm trên một mạch của phân tử ADN kép, tức là sự sao chép, phiên mã xảy ra trên một mạch và chỉ theo một chiều duy nhất [22]. Cấu trúc bộ gene HPV Dựa theo chức năng, genome của HPV đƣợc chia thành ba vùng chính: Vùng gene mã hoá cho protein muộn bao gồm các gene mã hoá cho các protein cấu trúc L1 và L2 hình thành vỏ capsid của virus. Gene L1 và L2, vùng L1 mã hóa protein L1 là thành phần chủ yếu cấu tạo vỏ capsid của virus, đây là vùng bảo tồn nhất của virus và cũng là vùng để phát hiện cũng nhƣ phân loại virus.
L1 có trọng lƣợng phân tử 56-60 kDa, đƣợc phosporyl hóa yếu và không gắn với DNA. Vùng L2 mã hóa protein vỏ capsid phụ, có trọng lƣợng phân tử 49-60 kDa, lại đƣợc phosphoryl hóa cao và có khả năng gắn DNA [22]. Bộ gene HPV dạng mạch thẳng Khi chỉ gen L1 bộc lộ, có thể hình thành các hạt giả virus hoặc phân tử giống virus (Virus like particles - VLPs), các thành phần này khó phân biệt với virus thực sự và đóng vai trò quyết định trong sản xuất virus, sản xuất vaccine. Cấu tạo hạt giả virus Nếu L2 bộc lộ cùng với L1, nó cũng góp phần tạo ra VLPs, nhƣng L2 không cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid.
L1 và L2 bộc lộ đặc hiệu trong hầu hết lớp ngoài cùng của tế bào sừng (nơi giải phóng các virus mới đƣợc hình thành). Mặc dù L2 không đặc biệt cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid nhƣng có vai trò quan trọng trong chu kỳ sống và trong quá trình xâm nhập của virus do L2 có khả năng tạo sự gắn kết giữa receptor bề mặt tế bào với actin và với PML, cần thiết cho giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm [22]. 7 Vùng gene mã hoá cho các protein sớm gồm 6 gene: E1, E2, E4, E5, E6 và E7 và khung đọc mở ORF. Các gene này mã hóa cho các protein có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của virus và sự tiến triển của ung thƣ cổ tử cung.
- Gene E1 là một trong 2 vùng bảo tồn nhất ở HPV (cùng với vùng L1). Chức năng chính của E1 là mã hóa cho protein gắn đặc hiệu vào DNA, Gene E1 gắn vào vị trí khởi đầu của quá trình nhân lên (ori), thực hiện quá trình chia tách DNA (helicase) và giúp các chuỗi gene của virus duỗi ra trong quá trình sao chép. E1 có hoạt động tháo xoắn không phụ thuộc ATP, rất cần thiết cho sự sao chép của virus [22]. - Gene E2, ngoài chức năng trong sao chép DNA của virus, E2 là gene mã hóa chủ yếu cho các nhân tố phiên mã của tế bào, duy trì chuỗi gene virus ngoài nhiếm sắc thể.
Chức năng điều hòa giải mã của gene E2 đƣợc thực hiện do sự gắn kết với E2BSs trong chuỗi gene của virus có ái lực với gene E2 và những vị trí liên quan này xác định hiệu quả của gene E2 trong quá trình giải mã. Bên cạnh đó, E2 còn tƣơng tác với E1, giúp E1 dễ dàng gắn với điểm khởi đầu sao chép và có thể bắt đầu sao chép tăng cƣờng hơn [22]. Gene E1 và E2 đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh quá trình nhân lên của virus. Gene E2 còn có khả năng gắn với chuỗi DNA đặc hiệu (vị trí gắn E2 - E2BSs) và protein E1.
Tuy nhiên, cả hai chức năng của E2 đều do gene E1 điều chỉnh. Trong quá trình sao chép virus, có nhiều thành phần tế bào phụ thuộc gene E1 nhƣ DNA polymerase, chaperone protein, histone H1 và yếu tố sao chép A vì gene E1 có khả năng trực tiếp thúc đẩy các thành phần này [22]. - Gene E4 mã hóa cho protein E4, có vai trò trợ giúp trong sự trƣởng thành và phóng thích HPV ra khỏi tế bào mà không làm tan tế bào chủ. - Gene E5 tổng hợp protein E5 một protein chuỗi đôi kỵ nƣớc, kích thƣớc nhỏ nằm ở phần màng Golgi và lƣới nguyên sinh chất của tế bào, giúp HPV xâm nhập và tồn tại trong tế bào chủ.
Protein E5 tác động ngay trong giai đoạn đầu của sự xâm nhiễm, chúng tạo ra các phức hợp với các thụ thể của nhân tố tăng trƣởng và biệt hóa, từ đó kích thích sự phát triển của tế bào và giúp virus lẩn trốn khả năng 8 miễn dịch của tế bào chủ. Protein E5 còn có vai trò trong việc ngăn chặn sự chết theo chƣơng trình của tế bào khi có sự sai hỏng DNA do chính virus gây ra [22]. - Gene E6 mã hóa protein E6, cực kỳ quan trọng trong vai trò gây ung thƣ, nhất là ở những types đƣợc xếp vào nhóm nguy cơ cao gây ung thƣ.
