Luận văn xác định genotype HPV ở phụ nữ tại Bệnh viện Trường Đại học Y khoa Thái Nguyên

Xác định genotype HPV ở phụ nữ nhiễm virus tại khoa sản BV Trường ĐH Y khoa Thái Nguyên bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot. Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học.

• Tác giả: Vũ Kỳ Liên
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học - Đại Học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trường Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BẢNG
• MỞ ĐẦU
• Mục tiêu nghiên cứu
• Nội dung nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. HPV – Human Papilloma Virus
• 1.1.1. Đặc điểm HPV
• 1.1.2. Bộ gen HPV
• 1.1.3. Phân type HPV
• 1.1.4. Chu kỳ sống
• 1.2. Ung thư cổ tử cung do HPV ở người
• 1.2.1. Các bệnh do HPV
• 1.2.2. Ung thư cổ tử cung
• 1.2.3. Dịch tễ học HPV
• 1.3. Các phương pháp phát hiện HPV
• 1.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.5. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
• 2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm
• 2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA bằng phenol - chloroform
• 2.2.3. Phương pháp Realtime-PCR phát hiện HPV-DNA
• 2.2.4. Phương pháp lai Reverse Dot Blot (RDB)
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số và phát hiện HPV-DNA
• 3.2. Kết quả xác định type (genotype) virus HPV
• 3.2.1. Kiểu type HPV được phát hiện
• 3.2.2. Sự phân bố của các types HPV được phát hiện
• 3.2.3. Sự đồng nhiễm các type HPV
• KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về HPV và ung thư cổ tử cung

Luận văn thạc sĩ này tập trung vào việc xác định genotype của HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ đến khám tại Khoa Sản, Bệnh viện Trường Đại học Y khoa Thái Nguyên. Ung thư cổ tử cung là một vấn đề sức khỏe nghiêm trọng, đặc biệt ở các nước đang phát triển, và HPV được xác định là nguyên nhân chính gây ra căn bệnh này. HPV là một loại virus DNA nhỏ, có hơn 100 type khác nhau, được chia thành nhóm nguy cơ cao và nguy cơ thấp dựa trên khả năng gây ung thư. Các type nguy cơ cao, đặc biệt là HPV 16 và 18, có liên quan mật thiết với ung thư cổ tử cung. Luận văn nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phát hiện và định type HPV để tầm soát và chẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung, bên cạnh các phương pháp truyền thống như xét nghiệm tế bào học cổ tử cung (PAP). Việc xác định chính xác genotype HPV giúp đánh giá nguy cơ phát triển ung thư và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp. "HPV được định type (genotype) dựa trên sự khác biệt về trình tự DNA của virus. Đến nay các nhà khoa học đã xác định được trên 100 type HPV khác nhau... Dựa trên khả năng gây ra các tổn thương mô học, đặc biệt là khả năng gây ung thư cổ tử cung, HPV được chia làm hai nhóm: nhóm HPV nguy cơ cao... và nhóm HPV nguy cơ thấp..." Đoạn trích này cho thấy sự đa dạng của HPV và mối liên hệ giữa các type HPV khác nhau với nguy cơ ung thư.

II. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật Realtime-PCR để phát hiện sự hiện diện của HPV DNA và kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (RDB) để xác định genotype của virus. Mẫu bệnh phẩm được thu thập từ phụ nữ đến khám tại khoa sản. Sau khi tách chiết DNA tổng số, Realtime-PCR được sử dụng để sàng lọc các mẫu dương tính với HPV. Kỹ thuật RDB cho phép xác định đồng thời nhiều type HPV khác nhau trong cùng một mẫu bệnh phẩm, cung cấp thông tin quan trọng về sự đồng nhiễm. "Kết quả tách chiết DNA tổng số và phát hiện HPV-DNA... Kết quả xác định type (genotype) virus HPV... Sự phân bố của các types HPV được phát hiện... Sự đồng nhiễm các type HPV..." Phần này tóm tắt quy trình nghiên cứu và những kết quả chính thu được, bao gồm tỷ lệ nhiễm HPV, sự phân bố các type HPV, và tỷ lệ đồng nhiễm. Việc sử dụng kỹ thuật RDB là một điểm mạnh của nghiên cứu, cho phép phân tích chi tiết hơn về các type HPV hiện diện trong mẫu.

III. Phân tích và thảo luận

Luận văn phân tích kết quả nghiên cứu và so sánh với các nghiên cứu khác trên thế giới và trong nước. Sự phân bố các genotype HPV được phát hiện trong nghiên cứu có thể phản ánh tình hình nhiễm HPV trong cộng đồng nghiên cứu. Tỷ lệ đồng nhiễm các type HPV cũng là một yếu tố quan trọng cần được xem xét, vì nó có thể ảnh hưởng đến tiến triển của bệnh và hiệu quả điều trị. Luận văn thảo luận về ý nghĩa của việc xác định genotype HPV trong việc đánh giá nguy cơ ung thư cổ tử cung và lựa chọn chiến lược phòng ngừa và điều trị. Việc so sánh với các nghiên cứu khác giúp đánh giá tính đại diện của kết quả và đặt nghiên cứu trong bối cảnh rộng hơn. "Tình hình nghiên cứu trên thế giới... Tình hình nghiên cứu trong nước..." Phần này thể hiện nỗ lực của tác giả trong việc đặt nghiên cứu của mình trong bối cảnh nghiên cứu chung về HPV.

IV. Giá trị và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu này cung cấp dữ liệu về tình hình nhiễm HPV và phân bố genotype HPV ở một nhóm phụ nữ cụ thể tại Thái Nguyên. Thông tin này có giá trị trong việc đánh giá nguy cơ ung thư cổ tử cung và xây dựng các chương trình phòng ngừa và kiểm soát bệnh. Việc xác định genotype HPV bằng kỹ thuật RDB có thể được ứng dụng trong thực tiễn lâm sàng để hỗ trợ chẩn đoán và điều trị ung thư cổ tử cung. Nghiên cứu cũng góp phần nâng cao nhận thức về tầm quan trọng của việc tầm soát và phòng ngừa HPV. "Với những tiến bộ của y khoa hiện đại, ung thư cổ tử cung có thể được chữa khỏi nếu bệnh được phát hiện sớm. Do đó bên cạnh việc tầm soát ung thư cổ tử cung bằng xét nghiệm tế bào học cổ tử cung (xét nghiệm PAP) thì việc phát hiện tình trạng nhiễm HPV và định type virus này cũng có vai trò rất quan trọng." Đoạn trích này khẳng định giá trị thực tiễn của việc nghiên cứu HPV và ứng dụng của nó trong phòng ngừa và điều trị ung thư cổ tử cung. Kỹ thuật RDB được đánh giá là một phương pháp hiệu quả và có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong việc chẩn đoán và theo dõi bệnh nhân nhiễm HPV.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư cổ tử cung hiện là một trong những bệnh lý ác tính hàng đầu đe dọa sức khỏe phụ nữ trên toàn cầu, với hơn 440.000 ca mắc mới mỗi năm và hơn 99% trường hợp có liên quan trực tiếp đến virus sinh u nhú ở người (Human Papilloma Virus - HPV). Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh chuẩn theo tuổi ước tính khoảng 17,3/100.000 dân, tạo nên gánh nặng tài chính và y tế vô cùng lớn với chi phí điều trị có thể lên tới hàng chục tỷ đồng mỗi năm. Việc phát hiện sớm tình trạng nhiễm HPV và định danh chính xác các kiểu gen (genotype) virus đóng vai trò quyết định trong việc sàng lọc sớm các tổn thương tiền ung thư, bởi vì các genotype thuộc nhóm nguy cơ cao có khả năng thúc đẩy quá trình dị sản tế bào biểu mô tiến triển thành ác tính sau khoảng 5 đến 10 năm tiềm ẩn.

Nghiên cứu được triển khai nhằm mục tiêu xác định tỷ lệ nhiễm HPV-DNA bằng kỹ thuật Realtime-PCR và định danh các genotype HPV lưu hành thông qua kỹ thuật lai phân tử chấm đảo ngược (Reverse Dot Blot - RDB). Phạm vi nghiên cứu được thực hiện trên 166 phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ (từ 18 đến 60 tuổi) đến khám phụ khoa và có biểu hiện tổn thương viêm cổ tử cung tại Bệnh viện Trường Đại học Y khoa Thái Nguyên trong khoảng thời gian từ tháng 3/2014 đến tháng 3/2015.

Công trình có ý nghĩa thực tiễn quan trọng khi xác định được tỷ lệ nhiễm HPV ở nhóm bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng là 28,31%, đồng thời phân tích chi tiết cơ cấu phân bố giữa nhóm genotype nguy cơ cao (chiếm 36,17%) và nguy cơ thấp (chiếm 63,83%). Kết quả này cung cấp cơ sở dữ liệu dịch tễ học phân tử vững chắc, hỗ trợ các cơ sở y tế địa phương tối ưu hóa phác đồ theo dõi, can thiệp sớm và xây dựng chiến lược tiêm chủng phòng ngừa hiệu quả.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên nền tảng sinh học phân tử của họ virus Papovaviridae. Virus HPV có cấu trúc capsid không vỏ đối xứng xoắn ốc gồm 72 capsomere, bao bọc bộ gen DNA vòng xoắn kép kích thước từ 7,2 kb đến 8,1 kb chứa 10 khung đọc mở (ORF). Bộ gen được tổ chức thành 3 vùng chức năng chính: vùng gen mã hóa protein cấu trúc muộn (L1, L2), vùng gen mã hóa protein chức năng sớm (E1, E2, E4, E5, E6, E7) và vùng điều khiển dài (LCR/URR) kiểm soát sao chép, phiên mã.

Cơ chế sinh ung thư của HPV chủ yếu được giải thích qua mô hình tích hợp bộ gen virus vào nhiễm sắc thể tế bào chủ. Khi sự tích hợp xảy ra, gen E2 bị đứt gãy làm mất chức năng kìm hãm biểu hiện của hai gen sinh ung thư (oncogene) chủ chốt là E6 và E7:

• Protein E6 liên kết với protein ức chế khối u p53 của tế bào người và thúc đẩy quá trình phân hủy p53 qua phức hợp ubiquitin, làm mất khả năng tự sửa chữa sai hỏng DNA và gây bất tử hóa tế bào.
• Protein E7 liên kết với protein ức chế khối u pRb, giải phóng yếu tố phiên mã E2F tự do, thúc đẩy tế bào phân chia mất kiểm soát.

Về phân loại nguy cơ, HPV được chia thành: nhóm nguy cơ cao (High-risk HPV: gồm các type 16, 18, 31, 33, 45, 52, 58,...) là tác nhân chính gây ung thư cổ tử cung và các tổn thương nội biểu mô vảy mức độ cao (HSIL/CIN 2-3); nhóm nguy cơ thấp (Low-risk HPV: gồm các type 6, 11, 81, 42,...) gây mụn cóc sinh dục, sùi mào gà và các biến đổi tế bào mức độ thấp (LSIL/CIN 1). Chu kỳ sống của virus diễn ra qua 4 giai đoạn: xâm nhập tế bào biểu mô đáy, tiềm ẩn trong nhân, nhân bản mạnh và đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 166 mẫu dịch phết cổ tử cung được thu thập theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện có chủ đích. Tiêu chuẩn lựa chọn bao gồm phụ nữ từ 18 đến 60 tuổi, đã có quan hệ tình dục, chưa tiêm vaccine HPV, không có thai, không hành kinh, không thụt rửa sâu hay đặt thuốc điều trị phụ khoa trong vòng 7 ngày trước khi khám, và có biểu hiện tổn thương viêm cổ tử cung trên lâm sàng (viêm lộ tuyến, trợt loét, nốt sùi).

Quy trình phân tích phân tử được tiến hành chặt chẽ qua 3 bước:

1. Tách chiết DNA tổng số: Áp dụng phương pháp ly trích bằng dung dịch Trizol kết hợp Phenol - Chloroform và tủa lạnh bằng Isopropanol, rửa bằng Ethanol 70% nhằm thu nhận DNA tinh sạch từ tăm bông bệnh phẩm hòa trong dung dịch đệm TE 1X.
2. Sàng lọc HPV-DNA định tính bằng Realtime-PCR: Sử dụng bộ kit iVA HPV rPCR Mix khuếch đại vùng gen bảo tồn L1 thông qua cặp mồi consensus MY09/MY11. Phản ứng được thực hiện qua 40 chu kỳ nhiệt với các kênh tín hiệu huỳnh quang FAM (mẫu thử) và JOE (chứng nội tại), bảo đảm kiểm soát hoàn toàn hiện tượng âm tính giả và dương tính giả.
3. Định danh genotype bằng kỹ thuật Reverse Dot Blot (RDB): Các mẫu PCR dương tính được lai phân tử trên màng lai Biodyn C cố định sẵn các mẫu dò (probe) đặc hiệu cho 24 genotype HPV (gồm 8 type nguy cơ thấp: 6, 11, 42, 43, 61, 70, 71, 81 và 16 type nguy cơ cao: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 82). Tín hiệu lai được hiện màu nhờ liên kết Streptavidin-Alkaline phosphatase với cơ chất NBT/BCIP.

Việc phối hợp Realtime-PCR và Reverse Dot Blot được lựa chọn nhờ độ nhạy phân tích vượt trội, khả năng phát hiện đồng thời nhiều genotype trên một màng lai với độ đặc hiệu cao và chi phí tối ưu hơn so với giải trình tự gen trực tiếp.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình xét nghiệm trên 166 mẫu bệnh phẩm thu được các phát hiện nổi bật sau:

• Tỷ lệ nhiễm HPV-DNA tổng số: Phản ứng Realtime-PCR đã xác định 47 trên tổng số 166 mẫu dương tính thực sự với HPV-DNA, đạt tỷ lệ 28,31%. Toàn bộ 119 mẫu còn lại (71,69%) cho kết quả âm tính và có tín hiệu chứng nội tại đạt chuẩn.
• Phân bố các genotype HPV: Trong 47 mẫu dương tính, kỹ thuật Reverse Dot Blot đã định danh được 5 genotype khác nhau thuộc cả hai nhóm nguy cơ:
  • Nhóm nguy cơ thấp chiếm tỷ lệ áp đảo với 63,83% (30/47 trường hợp), bao gồm 3 type: type 6 chiếm 25,53% (12 mẫu), type 11 chiếm 23,40% (11 mẫu) và type 81 chiếm 14,89% (7 mẫu).
  • Nhóm nguy cơ cao chiếm 36,17% (17/47 trường hợp), gồm 2 type nguy cơ ác tính hàng đầu: type 16 chiếm 19,15% (8 mẫu) và type 18 chiếm 17,02% (9 mẫu).
• Tỷ lệ nhiễm đơn thuần và đồng nhiễm: Đa số bệnh nhân nhiễm đơn thuần một type virus với 36/47 trường hợp (tương ứng 76,60%). Tỷ lệ đồng nhiễm 2 type virus chiếm 23,40% (11/47 trường hợp). Không ghi nhận trường hợp nào đồng nhiễm từ 3 genotype trở lên.
• Cơ cấu các kiểu đồng nhiễm: Trong số 11 ca đồng nhiễm 2 type, kiểu đồng nhiễm giữa các genotype nguy cơ thấp với nhau chiếm tỷ lệ 90,91% (10/11 ca), cụ thể gồm các cặp: type 6-81 chiếm 45,45% (5 ca), type 11-81 chiếm 27,27% (3 ca) và type 6-11 chiếm 18,18% (2 ca). Kiểu đồng nhiễm phối hợp giữa nhóm nguy cơ cao và nguy cơ thấp chỉ ghi nhận 1 trường hợp (cặp type 16-6), chiếm 9,09%. Không xuất hiện ca đồng nhiễm giữa hai type nguy cơ cao.

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ nhiễm HPV 28,31% trong nghiên cứu này cao hơn đáng kể so với tỷ lệ nhiễm trong cộng đồng phụ nữ bình thường tại các đô thị lớn như Hà Nội (khoảng 2% đến 6,13%) hay Thành phố Hồ Chí Minh (khoảng 8,27% đến 11,86%). Sự khác biệt này hoàn toàn phù hợp với thực tiễn lâm sàng vì đối tượng nghiên cứu được tuyển chọn là những phụ nữ đã có sẵn biểu hiện viêm loét hoặc tổn thương cổ tử cung. Môi trường viêm mạn tính và sự tổn thương của lớp tế bào biểu mô lát tầng tạo điều kiện thuận lợi cho virus HPV xâm nhập sâu vào lớp tế bào đáy để nhân bản.

So sánh với các nghiên cứu chuyên biệt trên bệnh nhân ung thư cổ tử cung tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ (ghi nhận tỷ lệ nhiễm HPV lên tới 92,9% với 9 type nguy cơ cao và hoàn toàn không có type nguy cơ thấp), nghiên cứu tại Thái Nguyên phản ánh đặc điểm của quần thể khám phụ khoa thông thường khi nhóm type nguy cơ thấp (type 6, 11, 81) vẫn chiếm đa số (63,83%). Tuy nhiên, sự xuất hiện của hai type nguy cơ cao 16 và 18 ở 36,17% số ca dương tính là một dấu hiệu cảnh báo lâm sàng nghiêm trọng, bởi đây là hai chủng virus liên quan trực tiếp đến hơn 70% các ca ung thư cổ tử cung xâm lấn.

Về mặt hiển thị dữ liệu khoa học, các kết quả này có thể được trực quan hóa hiệu quả thông qua biểu đồ tròn biểu diễn tỷ lệ phân bố giữa nhóm nguy cơ cao và thấp, kết hợp với biểu đồ cột kép so sánh tần suất xuất hiện của 5 genotype đơn lẻ. Ma trận tương quan đồng nhiễm dạng bảng chéo cũng giúp làm rõ sự chiếm ưu thế của phối hợp type 6-81 (45,45%), qua đó khẳng định sự cần thiết của các xét nghiệm phân tử đa mồi nhằm phát hiện toàn diện các ca đa nhiễm trong thực hành phụ khoa.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm nâng cao hiệu quả phòng ngừa và kiểm soát bệnh lý liên quan đến HPV, nghiên cứu đưa ra 4 giải pháp cụ thể:

1. Thiết lập quy trình sàng lọc kết hợp Realtime-PCR và Reverse Dot Blot tại các bệnh viện tuyến tỉnh: Ban Giám đốc và Khoa Xét nghiệm Bệnh viện Trường Đại học Y khoa Thái Nguyên cần phối hợp triển khai thường quy xét nghiệm này cho 100% phụ nữ có triệu chứng viêm lộ tuyến hoặc tổn thương nghi ngờ, hoàn thành chỉ tiêu áp dụng trong lộ trình 12 tháng tới.
2. Xây dựng phác đồ quản lý và theo dõi chuyên sâu cho nhóm mang genotype nguy cơ cao: Các bác sĩ sản phụ khoa cần chỉ định xét nghiệm tế bào học cổ tử cung (Pap smear) hoặc soi cổ tử cung định kỳ 6 tháng/lần đối với 36,17% bệnh nhân phát hiện mang HPV type 16 và 18, nhằm phát hiện sớm các giai đoạn tiền ung thư (CIN 2, CIN 3) để can thiệp kịp thời.
3. Mở rộng chiến dịch tiêm phòng vaccine HPV trong cộng đồng: Trung tâm Y tế dự phòng và ngành Y tế địa phương cần đẩy mạnh truyền thông và triển khai tiêm chủng vaccine tứ giá (phòng 4 type 6, 11, 16, 18) hoặc cửu giá, đặt mục tiêu nâng tỷ lệ bao phủ vaccine đạt trên 70% ở nữ giới từ 9 đến 26 tuổi trong giai đoạn 2 đến 3 năm tới.
4. Mở rộng nghiên cứu dịch tễ học phân tử đa trung tâm: Nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Thái Nguyên cần phối hợp với các bệnh viện khu vực miền núi phía Bắc mở rộng quy mô khảo sát lên trên 1.000 mẫu trong thời gian 2 năm tiếp theo, nhằm đánh giá đầy đủ sự lưu hành của toàn bộ 24 genotype HPV và theo dõi nguy cơ xuất hiện các biến thể mới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và dữ liệu thực chứng của công trình này đem lại giá trị thiết thực cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Bác sĩ sản phụ khoa và chuyên gia ung bướu: Sử dụng dữ liệu về tỷ lệ nhiễm 28,31% và các kiểu đồng nhiễm làm tài liệu tham khảo lâm sàng để cá thể hóa phác đồ điều trị viêm nhiễm, đồng thời chỉ định tầm soát định kỳ chuẩn xác cho bệnh nhân mang genotype 16 và 18.
2. Kỹ thuật viên xét nghiệm và nhà nghiên cứu công nghệ sinh học: Áp dụng chi tiết quy trình tách chiết DNA bằng phenol - chloroform và kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot 24 mẫu dò trên màng Biodyn C để chuẩn hóa, phát triển các bộ sinh phẩm xét nghiệm in-house có độ nhạy cao và giá thành hợp lý.
3. Cán bộ y tế công cộng và nhà hoạch định chính sách: Khai thác số liệu phân bố dịch tễ học của 5 genotype (type 6, 11, 81, 16, 18) để xây dựng chương trình mục tiêu y tế dự phòng, truyền thông nâng cao nhận thức sức khỏe sinh sản và lựa chọn loại vaccine HPV tối ưu cho địa phương.
4. Học viên cao học và sinh viên ngành y dược: Sử dụng luận văn như một tài liệu học thuật mẫu mực về phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử trong y học, từ cách thiết kế thí nghiệm, kiểm soát chứng âm/chứng dương đến phương pháp biện luận kết quả chuyên ngành.

Câu hỏi thường gặp

Tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ có tổn thương cổ tử cung tại Thái Nguyên là bao nhiêu? Nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ nhiễm HPV-DNA là 28,31% (47/166 phụ nữ có biểu hiện viêm cổ tử cung trên lâm sàng). Tỷ lệ này cao hơn mức nhiễm trung bình của phụ nữ không triệu chứng trong cộng đồng nhờ việc tập trung vào nhóm nguy cơ cao.

Những genotype HPV nào được phát hiện trong nghiên cứu này? Kỹ thuật Reverse Dot Blot đã phát hiện 5 genotype gồm 3 type nguy cơ thấp là type 6 (25,53%), type 11 (23,40%), type 81 (14,89%) và 2 type nguy cơ cao là type 16 (19,15%) cùng type 18 (17,02%).

Đồng nhiễm nhiều type HPV có nguy hiểm không? Có. Đồng nhiễm xảy ra ở 23,40% số ca bệnh trong nghiên cứu. Dù chủ yếu là phối hợp nguy cơ thấp (90,91%), nhưng sự hiện diện đồng thời của type nguy cơ cao như cặp 16-6 sẽ làm gia tăng tốc độ chuyển dạng tế bào và rút ngắn thời gian tiến triển thành tổn thương ác tính.

Kỹ thuật Reverse Dot Blot có ưu điểm gì so với các kỹ thuật khác? Phương pháp RDB cho phép định danh đồng thời 24 genotype HPV trên cùng một màng lai với độ đặc hiệu cao, nhận diện chính xác các trường hợp đa nhiễm mà phương pháp giải trình tự gen trực tiếp đôi khi bỏ sót, đồng thời tiết kiệm đáng kể chi phí xét nghiệm.

Người nhiễm HPV type nguy cơ thấp 6 và 11 có bị ung thư cổ tử cung không? Hai type 6 và 11 chịu trách nhiệm chính gây ra sùi mào gà sinh dục và các tổn thương biểu mô lành tính, hiếm khi độc lập gây ung thư. Tuy nhiên, nếu bệnh nhân bị đồng nhiễm thêm các type nguy cơ cao như 16 hoặc 18, nguy cơ ung thư cổ tử cung sẽ tăng lên rõ rệt.

Kết luận

• Nghiên cứu đã xác định tỷ lệ nhiễm HPV đạt 28,31% (47/166 trường hợp) ở phụ nữ có tổn thương viêm cổ tử cung tại Thái Nguyên bằng kỹ thuật Realtime-PCR.
• Kỹ thuật Reverse Dot Blot đã định danh thành công 5 genotype HPV, trong đó nhóm nguy cơ thấp chiếm 63,83% (gồm type 6, 11, 81) và nhóm nguy cơ cao chiếm 36,17% (gồm type 16, 18).
• Tỷ lệ nhiễm đơn genotype chiếm 76,60%, tỷ lệ đồng nhiễm 2 genotype chiếm 23,40% với dạng phối hợp phổ biến nhất là cặp type 6-81 (chiếm 45,45% số ca đồng nhiễm).
• Quy trình phối hợp Realtime-PCR khuếch đại gen L1 và lai phân tử RDB khẳng định độ tin cậy, tính đặc hiệu và khả năng ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán lâm sàng.
• Đóng góp khoa học của luận văn là cung cấp bức tranh dịch tễ học phân tử HPV thực chứng tại Thái Nguyên, tạo tiền đề vững chắc cho việc quản lý bệnh nhân và triển khai các chương trình tiêm chủng vaccine phòng ngừa ung thư cổ tử cung.

Trong lộ trình 12 đến 24 tháng tới, việc mở rộng xét nghiệm định lượng tải lượng virus và khảo sát trên các quần thể dân số rộng lớn hơn là bước đi cần thiết. Phụ nữ trong độ tuổi sinh sản nên chủ động xét nghiệm sàng lọc HPV định kỳ và tiêm vaccine đầy đủ để bảo vệ sức khỏe bản thân một cách toàn diện.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Hiện nay ung thƣ cổ tử cung là loại ung thƣ xếp thứ hai trong các bệnh ung thƣ phổ biến của phụ nữ trên thế giới nhƣng lại chiếm vị trí đầu trong các bệnh ung thƣ của phụ nữ ở các nƣớc đang phát triển. HPV (Human Papilloma Vius) đã và đang là mối nguy hiểm đe dọa sức khỏe của những ngƣời phụ nữ mắc ung thƣ cổ tử cung hoặc những phụ nữ mang virus này. HPV đƣợc định type (genotype) dựa trên sự khác biệt về trình tự DNA của virus. Đến nay các nhà khoa học đã xác định đƣợc trên 100 type HPV khác nhau trong đó hơn 80 type đã đƣợc giải trình tự toàn bộ hệ gen và các type còn lại cũng đã đƣợc giải mã một phần.

Dựa trên khả năng gây ra các tổn thƣơng mô học, đặc biệt là khả năng gây ung thƣ cổ tử cung, HPV đƣợc chia làm hai nhóm: nhóm HPV nguy cơ cao (High-risk HPV) gồm các type HPV16, 18, 31, 45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68 ,70. trong đó HPV16, 18 chiếm tỷ lệ cao nhất. Các type HPV nguy cơ cao là nguyên nhân chính gây ra các tổn thƣơng nghiêm trọng và phát triển thành ung thƣ cổ tử cung. Nhóm HPV nguy cơ thấp (Low-risk HPV) gồm các type HPV1, 2, 6, 8, 9, 11, 42, 43, 44, 48, 49, 50, 64.

phổ biến nhất là HPV6, 11. Các type nguy cơ thấp là tác nhân gây nên đa số các dạng sùi mào gà sinh dục (HPV6, 11), mụn cóc ở chân (HPV1), mụn cơm ở tay (HPV2) và các dạng viêm nhiễm khác. Mối liên quan giữa nhiễm HPV và ung thƣ cổ tử cung đã đƣợc xác định từ những năm 70 của thể kỷ trƣớc, theo đó HPV gây ra rối loạn sinh sản của tế bào biểu mô cổ tử cung, với diễn tiến tự nhiên từ viêm nhiễm mạn tính, đến dị sản nhẹ, dị sản vừa, dị sản nặng, rồi ung thƣ cổ tử cung. Tuy hầu hết (khoảng 98%) tình trạng nhiễm HPV sẽ tự khỏi, nhƣng các types HPV thuộc nhóm nguy cơ cao có thể làm tổn thƣơng cổ tử cung nặng hơn hoặc thành ung thƣ, thƣờng sau khoảng 10 năm.

Khi đã bị nhiễm và có tổn thƣơng do HPV, không có thuốc điều trị đặc hiệu cho HPV, để tránh nguy cơ tổn thƣơng diễn tiến nặng hơn, chỉ có một cách điều trị là lấy đi tổn thƣơng này. 2 Hạn chế quan hệ tình dục sớm, không quan hệ tình dục với nhiều ngƣời và tình dục an toàn là những cách có thể giúp giảm nguy cơ nhiễm HPV. Tuy nhiên, cách phòng ngừa nhiễm HPV hiệu quả nhất là tiêm ngừa vacxin, hiện nay ở Việt Nam đang lƣu hành 3 loại vacxin phòng 4 types HPV phổ biến (type 6, 11, 16 và 18) đó là vacxin Vacxin Gardasil (MERCK &CO.,) và vacxin Cervarix (GlaxoSmithKline). Với những tiến bộ của y khoa hiện đại, ung thƣ cổ tử cung có thể đƣợc chữa khỏi nếu bệnh đƣợc phát hiện sớm.

Do đó bên cạnh việc tầm soát ung thƣ cổ tử cung bằng xét nghiệm tế bào học cổ tử cung (xét nghiệm PAP) thì việc phát hiện tình trạng nhiễm HPV và định type virus này cũng có vai trò rất quan trọng. Trên cơ sở các kết quả thu đƣợc từ những đề tài nghiên cứu về HPV trƣớc đây, chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot”. Mục tiêu nghiên cứu 1. Phát hiện đƣợc HPV ở phụ nữ bằng kỹ thuật Realtime-PCR.

Xác định đƣợc genotype HPV bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu và phát hiện tình trạng nhiễm HPV ở nhóm phụ nữ đƣợc lựa chọn bằng kỹ thuật Realtime-PCR. - Xác định các genotype HPV ở những trƣờng hợp nhiễm virus này bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

HPV – Human Papilloma Virus 1. Đặc điểm HPV Human Papilloma Virus (HPV) là nhóm virus có kích thƣớc nhỏ, mang vật liệu di truyền là DNA, gây bệnh ở ngƣời thuộc họ Papovaviridae. HPV có cấu trúc capsid không vỏ và đối xứng xoắn ốc, đƣờng kính hạt virus khoảng 52- 55nm chứa DNA dạng vòng, mạch đôi, liên kết với protein giống histone. Vỏ capsid đƣợc tạo thành từ 72 đơn vị capsomere, mỗi đơn vị là một pentamer của protein cấu trúc L1 và một protein cấu trúc L2 (protein này là thành phần kháng nguyên đƣợc sử dụng trong miễn dịch đặc hiệu).

Cả hai protein cấu trúc đều do virus tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) chiếm khoảng 80% tổng số protein của virus. Protein capsid phụ (L2) chiếm khoảng 20%. Riboxom có hệ số lắng là 21S. Tiểu phần lớn có một vòng xoắn cuộn có thể chuyển đổi thành tiểu phần nhỏ trong quá trình sao chép.

Ngoài ra, một tiểu phần thứ 3 có hệ số lắng là 14S sẽ xuất hiện chịu trách nhiệm sao chép lại DNA tế bào chủ khi bao trong Virion. Khi đó, capsid chứa DNA tế bào chủ đƣợc gọi là Virion giả hay Pseudovirion. Sự hình thành capsid của genome HPV 4 Hình 1. Hình dạng HPV HPV không phát triển trong điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, do đó muốn thực hiện đề tài này chỉ có thể dựa trên nghiên cứu invivo trên ngƣời bị nhiễm và những mẫu bị nhiễm sẽ đƣợc lƣu giữ ở nhiệt độ -700C trong một thời gian dài mà không làm ảnh hƣởng tới khả năng hoạt động của virus [22].

Bộ gen HPV Genome của HPV là một phân tử ADN kép không hoàn chỉnh, siêu xoắn vòng tức là capsome sắp xếp xung quanh theo chiều xoắn của acid nucleic (ở đây là DNA) tạo thành ống giống nhƣ cầu thang xoắn, chiều dài của capsid phụ thuộc chiều dài sợi acid nucleic, bộ gen virus chiếm 12% trọng lƣợng hạt virus, có kích thƣớc nằm trong khoảng 7,2 kb đến 8,1 kb (trong đó các base Guanine và Cytosine chiếm 42%), 10 khung đọc mở ORF. Khung đọc mở mã hoá cho toàn bộ protein của HPV nằm trên một mạch của phân tử ADN kép, tức là sự sao chép, phiên mã xảy ra trên một mạch và chỉ theo một chiều duy nhất [22]. Cấu trúc bộ gene HPV Dựa theo chức năng, genome của HPV đƣợc chia thành ba vùng chính: Vùng gene mã hoá cho protein muộn bao gồm các gene mã hoá cho các protein cấu trúc L1 và L2 hình thành vỏ capsid của virus. Gene L1 và L2, vùng L1 mã hóa protein L1 là thành phần chủ yếu cấu tạo vỏ capsid của virus, đây là vùng bảo tồn nhất của virus và cũng là vùng để phát hiện cũng nhƣ phân loại virus.

L1 có trọng lƣợng phân tử 56-60 kDa, đƣợc phosporyl hóa yếu và không gắn với DNA. Vùng L2 mã hóa protein vỏ capsid phụ, có trọng lƣợng phân tử 49-60 kDa, lại đƣợc phosphoryl hóa cao và có khả năng gắn DNA [22]. Bộ gene HPV dạng mạch thẳng Khi chỉ gen L1 bộc lộ, có thể hình thành các hạt giả virus hoặc phân tử giống virus (Virus like particles - VLPs), các thành phần này khó phân biệt với virus thực sự và đóng vai trò quyết định trong sản xuất virus, sản xuất vaccine. Cấu tạo hạt giả virus Nếu L2 bộc lộ cùng với L1, nó cũng góp phần tạo ra VLPs, nhƣng L2 không cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid.

L1 và L2 bộc lộ đặc hiệu trong hầu hết lớp ngoài cùng của tế bào sừng (nơi giải phóng các virus mới đƣợc hình thành). Mặc dù L2 không đặc biệt cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid nhƣng có vai trò quan trọng trong chu kỳ sống và trong quá trình xâm nhập của virus do L2 có khả năng tạo sự gắn kết giữa receptor bề mặt tế bào với actin và với PML, cần thiết cho giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm [22]. 7 Vùng gene mã hoá cho các protein sớm gồm 6 gene: E1, E2, E4, E5, E6 và E7 và khung đọc mở ORF. Các gene này mã hóa cho các protein có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của virus và sự tiến triển của ung thƣ cổ tử cung.

- Gene E1 là một trong 2 vùng bảo tồn nhất ở HPV (cùng với vùng L1). Chức năng chính của E1 là mã hóa cho protein gắn đặc hiệu vào DNA, Gene E1 gắn vào vị trí khởi đầu của quá trình nhân lên (ori), thực hiện quá trình chia tách DNA (helicase) và giúp các chuỗi gene của virus duỗi ra trong quá trình sao chép. E1 có hoạt động tháo xoắn không phụ thuộc ATP, rất cần thiết cho sự sao chép của virus [22]. - Gene E2, ngoài chức năng trong sao chép DNA của virus, E2 là gene mã hóa chủ yếu cho các nhân tố phiên mã của tế bào, duy trì chuỗi gene virus ngoài nhiếm sắc thể.

Chức năng điều hòa giải mã của gene E2 đƣợc thực hiện do sự gắn kết với E2BSs trong chuỗi gene của virus có ái lực với gene E2 và những vị trí liên quan này xác định hiệu quả của gene E2 trong quá trình giải mã. Bên cạnh đó, E2 còn tƣơng tác với E1, giúp E1 dễ dàng gắn với điểm khởi đầu sao chép và có thể bắt đầu sao chép tăng cƣờng hơn [22]. Gene E1 và E2 đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh quá trình nhân lên của virus. Gene E2 còn có khả năng gắn với chuỗi DNA đặc hiệu (vị trí gắn E2 - E2BSs) và protein E1.

Tuy nhiên, cả hai chức năng của E2 đều do gene E1 điều chỉnh. Trong quá trình sao chép virus, có nhiều thành phần tế bào phụ thuộc gene E1 nhƣ DNA polymerase, chaperone protein, histone H1 và yếu tố sao chép A vì gene E1 có khả năng trực tiếp thúc đẩy các thành phần này [22]. - Gene E4 mã hóa cho protein E4, có vai trò trợ giúp trong sự trƣởng thành và phóng thích HPV ra khỏi tế bào mà không làm tan tế bào chủ. - Gene E5 tổng hợp protein E5 một protein chuỗi đôi kỵ nƣớc, kích thƣớc nhỏ nằm ở phần màng Golgi và lƣới nguyên sinh chất của tế bào, giúp HPV xâm nhập và tồn tại trong tế bào chủ.

Protein E5 tác động ngay trong giai đoạn đầu của sự xâm nhiễm, chúng tạo ra các phức hợp với các thụ thể của nhân tố tăng trƣởng và biệt hóa, từ đó kích thích sự phát triển của tế bào và giúp virus lẩn trốn khả năng 8 miễn dịch của tế bào chủ. Protein E5 còn có vai trò trong việc ngăn chặn sự chết theo chƣơng trình của tế bào khi có sự sai hỏng DNA do chính virus gây ra [22]. - Gene E6 mã hóa protein E6, cực kỳ quan trọng trong vai trò gây ung thƣ, nhất là ở những types đƣợc xếp vào nhóm nguy cơ cao gây ung thƣ.