Luận án tiến sĩ nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trypanosomiasis ở đàn trâu tại tỉnh tuyên quang

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trypanosomiasis ở đàn, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

• Tác giả: Phạm Thị Trang
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Thị Kim Lan
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Ký sinh trùng và vi sinh vật học thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Xác Định Tỷ Lệ Nhiễm Và Phát Triển Kit Chẩn Đoán Bệnh Trypanosomiasis Ở Đàn Trâu Tại Tuyên Quang
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cơ sở khoa học của đề tài
• 1.2. Bệnh tiên mao trùng ở động vật
• 1.3. Kỹ thuật sinh học phân tử trong sản xuất kháng nguyên của tiên mao trùng
• 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
• 1.5. Điều kiện tự nhiên, điều kiện kinh tế - xã hội của tỉnh Tuyên Quang
• 1.5.1. Điều kiện tự nhiên
• 1.5.2. Điều kiện kinh tế - xã hội
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.3.1. Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị
• 2.3.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị
• 2.4.2. Phương pháp nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán bệnh
• 2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tình hình nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả
• 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang
• 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo lứa tuổi trâu tại tỉnh Tuyên Quang
• 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt
• 3.1.4. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa vụ
• 3.2. Kết quả xác định loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 3.3. Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 3.4. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 3.5. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1
• 3.5.1. Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T.
• 3.5.2. Kết quả nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

Tóm tắt

I. Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh tiên mao trùng là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, ảnh hưởng đến sức khỏe và năng suất của đàn gia súc, đặc biệt là trâu tại Việt Nam. Theo Elshafie E. (2015), bệnh do ký sinh trùng Trypanosoma evansi gây ra, có thể dẫn đến thiệt hại lớn cho người chăn nuôi nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời. Việc phát hiện sớm và điều trị hiệu quả bệnh tiên mao trùng là cần thiết nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong ở gia súc. Tại tỉnh Tuyên Quang, nơi có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho sự phát triển của ruồi và mòng, vật truyền bệnh, việc nghiên cứu tỷ lệ nhiễm và phát triển kit chẩn đoán là cực kỳ quan trọng. Nghiên cứu này không chỉ giúp xác định tỷ lệ nhiễm bệnh mà còn phát triển phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, chính xác, từ đó góp phần bảo vệ sức khỏe đàn trâu và nâng cao đời sống cho người chăn nuôi.

II. Mục tiêu của đề tài

Đề tài này được thực hiện với hai mục tiêu chính. Đầu tiên, nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm bệnh tiên mao trùng trên đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang, từ đó định danh loài ký sinh trùng gây bệnh và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả. Mục tiêu thứ hai là chế tạo kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Việc đạt được những mục tiêu này sẽ không chỉ cung cấp thông tin quan trọng về tình hình bệnh tật ở trâu mà còn tạo ra công cụ chẩn đoán hữu ích cho các bác sĩ thú y và người chăn nuôi, giúp họ có thể phát hiện bệnh sớm và điều trị kịp thời.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đề tài mang lại nhiều ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Về mặt khoa học, nghiên cứu cung cấp dữ liệu về tỷ lệ nhiễm bệnh tiên mao trùng, đồng thời phát triển công nghệ chế tạo kit chẩn đoán từ kháng nguyên tái tổ hợp, khẳng định khả năng làm chủ công nghệ trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh. Về mặt thực tiễn, kit chẩn đoán giúp phát hiện nhanh chóng, chính xác bệnh tiên mao trùng, từ đó nâng cao chất lượng đàn trâu và cải thiện đời sống cho người chăn nuôi. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh bệnh tiên mao trùng có thể gây thiệt hại lớn về kinh tế nếu không được kiểm soát hiệu quả.

IV. Những đóng góp mới của đề tài

Đề tài đã có những đóng góp mới đáng kể trong lĩnh vực nghiên cứu bệnh tiên mao trùng. Việc chế tạo thành công kit chẩn đoán từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 với độ nhạy và độ đặc hiệu cao là một trong những thành tựu nổi bật. Kit này có thể được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tại các địa phương, giúp nâng cao khả năng phát hiện sớm và điều trị kịp thời. Những đóng góp này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn trong thực tiễn sản xuất, góp phần bảo vệ sức khỏe đàn gia súc và phát triển ngành chăn nuôi tại Việt Nam.

V. Tổng quan tài liệu

Tổng quan tài liệu cung cấp cái nhìn sâu sắc về bệnh tiên mao trùng và các nghiên cứu liên quan. Bệnh này do ký sinh trùng Trypanosoma evansi gây ra, có sự phân bố rộng rãi ở nhiều quốc gia, bao gồm cả Việt Nam. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng bệnh tiên mao trùng ảnh hưởng đến nhiều loài gia súc và có thể gây thiệt hại lớn nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Các phương pháp chẩn đoán hiện tại có nhiều hạn chế, do đó, việc phát triển phương pháp chẩn đoán mới, hiệu quả hơn là cần thiết. Những thông tin này sẽ là cơ sở cho việc thực hiện nghiên cứu và phát triển các giải pháp phòng chống bệnh tiên mao trùng trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) do ký sinh trùng đơn bào Trypanosoma evansi (T. evansi) thuộc giới Protozoa, lớp trùng roi Flagellata gây ra trên nhiều loài gia súc như trâu, bò, ngựa, dê, lạc đà. Theo các nghiên cứu dịch tễ học thú y, bệnh phân bố rộng tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc châu Phi, châu Á và Nam Mỹ. Tại Việt Nam, bệnh xuất hiện ở hầu hết các vùng sinh thái, đặc biệt là khu vực trung du và miền núi phía Bắc. Tỉnh Tuyên Quang là địa bàn có địa hình đồi núi phức tạp, thời tiết nóng ẩm, tạo môi trường thuận lợi cho các loài côn trùng hút máu như ruồi trâu (Stomoxydinae) và mòng (Tabanidae) phát triển, đóng vai trò là vật môi giới truyền lây cơ học mầm bệnh. Tại địa phương này, bệnh thường diễn biến ở thể mạn tính với triệu chứng lâm sàng không điển hình, khiến trâu bò suy nhược, giảm sức đề kháng và có tỷ lệ ngã gục, chết cao trong vụ Đông - Xuân khi thời tiết giá lạnh và nguồn thức ăn khan hiếm.

Khoảng trống nghiên cứu được chỉ ra là các phương pháp chẩn đoán truyền thống đang bộc lộ nhiều hạn chế: soi tươi kính hiển vi và nhuộm tiêu bản máu khô có độ nhạy thấp do mật độ ký sinh trùng trong máu ngoại vi dao động; phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm (chuột nhắt trắng) cho độ chính xác cao nhưng đòi hỏi thời gian theo dõi dài; kỹ thuật sinh học phân tử (PCR) yêu cầu trang thiết bị chuyên sâu, khó áp dụng tại thực địa. Bên cạnh đó, kháng nguyên bề mặt của T. evansi liên tục biến đổi (Variant Surface Glycoprotein - VSG), gây khó khăn cho các phản ứng huyết thanh học thông thường. Do đó, việc xác định chính xác tỷ lệ nhiễm, làm chủ quy trình công nghệ sinh học phân tử để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp ổn định RoTAT 1.2 nhằm chế tạo bộ Kit CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis) chẩn đoán nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, kết hợp xác lập phác đồ điều trị hiệu quả là yêu cầu cấp thiết.

Luận án xác định 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Xác định được tỷ lệ nhiễm, định danh loài tiên mao trùng gây bệnh và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang.
2. Chế tạo được Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Bệnh tiên mao trùng do đơn bào T. evansi gây ra trên đàn trâu; kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 tái tổ hợp; Kit CATT ngưng kết hạt latex chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
• Phạm vi không gian: Khảo sát dịch tễ, thu thập mẫu máu và thử nghiệm điều trị tại nông hộ thuộc 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang gồm Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên và Chiêm Hóa. Các phân tích sinh học phân tử, tách dòng gen, biểu hiện protein và đánh giá phòng thí nghiệm được thực hiện tại Khoa Chăn nuôi Thú y (Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên), Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương và Khoa Công nghệ Sinh học (Viện Đại học Mở Hà Nội).
• Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai thực hiện trong giai đoạn từ năm 2013 đến năm 2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến đặc điểm sinh học, phương thức truyền lây, bệnh lý, chẩn đoán và điều trị bệnh tiên mao trùng:

Các nghiên cứu trong nước:

• Về dịch tễ học và tỷ lệ nhiễm: Nguyễn Quốc Doanh và cs. (1996) ghi nhận tỷ lệ nhiễm T. evansi ở trâu tại Tả Thanh Oai (Hà Nội) là 17,80% bằng phương pháp tiêm truyền chuột và 30,12% tại Phấn Mễ bằng Card-test; Hà Viết Lượng (1998) xác định tỷ lệ nhiễm ở bò miền Trung là 8,99%; Nguyễn Quốc Doanh và Phạm Sỹ Lăng (2001) phát hiện tỷ lệ nhiễm trên máu rắn và ba ba trung bình là 7,89%; Nguyen V. L. và cs. (2013) xét nghiệm 585 mẫu huyết thanh trâu tại Thái Nguyên và Cao Bằng ghi nhận 22,4% dương tính; Nguyen T. và cs. (2014) khảo sát 484 mẫu huyết thanh trâu ở 5 tỉnh miền Bắc xác định tỷ lệ dương tính là 27,1% qua phản ứng CATT và ELISA; Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2014) ghi nhận tỷ lệ nhiễm T. evansi cao nhất ở trâu (15,58%), tiếp đến bò (12,94%), ngựa (10,26%), dê (9,52%) và lợn (0,99%); Van Vinh Chau N. và cs. (2016) báo cáo trường hợp bệnh nhân nữ 38 tuổi tại miền Nam Việt Nam nhiễm T. evansi qua vết thương tiếp xúc thịt bò.
• Về vật môi giới truyền bệnh: Bùi Quý Huy (2006) khảo sát độc lực của ký sinh trùng trong vòi hút côn trùng; Phan Văn Chinh (2006) xác định mùa hoạt động cao điểm của mòng và ruồi Stomoxys calcitrans từ tháng 5 đến tháng 8; Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2014) định danh 1.801 cá thể côn trùng thu thập được tại 4 tỉnh miền Bắc gồm Stomoxys calcitrans (45,25%), Tabanus kiangsuensis (22,15%) và Tabanus rubidus (32,59%).
• Về phương pháp chẩn đoán và điều trị: Phạm Sỹ Lăng (1982) ứng dụng phản ứng ngưng kết trên phiến kính (SAT) đạt độ chính xác 70 - 80%; Lê Ngọc Mỹ (1994, 2002) nghiên cứu chế tạo kháng nguyên và ứng dụng ELISA ghi nhận tỷ lệ nhiễm ở trâu là 53,33%; Vương Thị Lan Phương (2004) xác định gen quy định kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 có tính ổn định cao; Trần Đức Hạnh và cs. (2009) chẩn đoán ELISA tại Phổ Yên (Thái Nguyên) ghi nhận 15,06% trâu và 17,48% bò dương tính; Phạm Thị Tâm và cs. (2013) thiết lập phản ứng ELISA với độ nhạy 97,96% và độ đặc hiệu 98,68%; Nguyễn Mạnh Hùng và cs. (2015) chế tạo Kit Latex; Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2013, 2015) thử nghiệm Kit TUAF-CATT trên 1.570 mẫu huyết thanh đạt độ đồng dương tính 98,24% so với tiêm truyền chuột bạch và xác định phác đồ phối hợp Trypamidium samorin, Cafein, dịch truyền, Vitamin C, Vitamin B1 đạt hiệu quả điều trị 100%; Nguyen T. T. và cs. (2015) ứng dụng kháng nguyên TeGM6-4r trong phản ứng sắc ký miễn dịch ICT.

Các nghiên cứu ở nước ngoài:

• Về phân bố và dịch tễ: Goossens B. và cs. (2006) tại Tanzania ghi nhận 0,8% bò nhiễm bệnh; Sinshaw A. và cs. (2006) tại Ethiopia phát hiện tỷ lệ nhiễm ở bò là 6,1% (mùa mưa 9,6%, mùa khô 3,6%); Marcotty T. và cs. (2007) tại Zambia ghi nhận 14,4% mẫu có kháng thể; Sumba A. L. và cs. (2009) khảo sát hình thái ký sinh trùng trong vòi ruồi mòng; Milocco C. và cs. (2012) tại Lào, Campuchia, Thái Lan ghi nhận 1,26% loài gặm nhấm nhiễm bệnh; Adrian P. và cs. (2012) tại Philippines ghi nhận 140/179 mẫu trâu nhiễm bệnh; Roldan M. và cs. (2014) tại Argentina phát hiện 16,7% chuột Capybara nhiễm T. evansi; Ibrahim A. và cs. (2017) tại Nam Ai Cập ghi nhận tỷ lệ dương tính trên gia súc.
• Về bệnh học: Herrera H. M. và cs. (2010), Aregawi W. G. và cs. (2011), Radostits O. M. và cs. (2012), Ngeranwa J. và cs. (2012), Tehseen S. và cs. (2015), Saleh M. và cs. (2016), Ogundele F. và cs. (2016), Krishnamoorthy P. và cs. (2016) phân tích các biến đổi huyết học (giảm hồng cầu, giảm huyết sắc tố, giảm cholinesterase, tăng enzyme SOD, CAT, AST), rối loạn thần kinh, viêm hoại tử gan, thận, lách và suy giảm chức năng sinh sản.
• Về kỹ thuật chẩn đoán và kháng nguyên: Urakawa T. và cs. (2001) phân lập gen RoTAT 1.2 kích thước 205 bp và biểu hiện trên tế bào côn trùng Sf9 cho độ nhạy tương đương kháng nguyên tự nhiên và độ đặc hiệu đạt 99%; Uzcanga G. và cs. (2002) khẳng định tính đặc hiệu của epitope RoTAT 1.2 trên các chủng T. evansi; Ngaira J. và cs. (2003), Singh N. và cs. (2003, 2004), Holland W. và cs. (2004), Shahzad W. và cs. (2005), Fernandez D. và cs. (2009), Garba U. và cs. (2012), Sazmand A. và cs. (2012), Kaur P. và cs. (2012), Sengupta P. và cs. (2014), Rogé S. và cs. (2014, 2015), Sobhy N. và cs. (2015), Sivajothi S. và cs. (2016), Kulyar M. và cs. (2017) đánh giá so sánh độ nhạy và độ đặc hiệu giữa các phương pháp CATT, LATEX, ELISA, PCR, Duplex-PCR.
• Về thuốc và phác đồ điều trị: Tuntasuvan D. và cs. (2003), Gutierrez C. và cs. (2008), Jacquiet P. và cs. (2010), Desquesnes M. và cs. (2011), Gillingwater K. và cs. (2014), Tchamdja E. và cs. (2016), Bossche P. và cs. (2016), Mossaad E. và cs. (2017), Baldissera M. và cs. (2017) nghiên cứu hiệu lực của Diminazene aceturate, Cymelarsan, Melasomin hydroclorua, Quinapyramine, Curcumin nano, Nerolidol nano cũng như cảnh báo hiện tượng kháng thuốc Diminazene và Isometamidium.

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết: Phần lớn các nghiên cứu huyết thanh học trước đây phụ thuộc vào nguồn kháng nguyên tự nhiên phân lập từ động vật thí nghiệm, quy trình nuôi cấy và tinh sạch phức tạp, tiềm ẩn nguy cơ sai số do kháng nguyên bề mặt biến đổi. Luận án lựa chọn giải quyết việc ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp để tạo nguồn kháng nguyên RoTAT 1.2 tinh khiết, đồng nhất, biểu hiện trên hệ thống vi khuẩn E. coli, tối ưu hóa các thông số kỹ thuật để chế tạo bộ Kit CATT hoàn chỉnh có thể ứng dụng tại hiện trường chăn nuôi trâu tỉnh Tuyên Quang, song song với việc định danh phân tử và thiết lập phác đồ trị liệu đặc hiệu cho địa phương.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Đặc tính sinh học và miễn dịch học của Trypanosoma evansi: Đơn bào ký sinh trong huyết tương, phân chia bằng hình thức trực phân, di chuyển nhờ màng rung động và roi tự do. Cơ chế né tránh miễn dịch của ký sinh trùng dựa trên hiện tượng biến đổi liên tục glycoprotein bề mặt (VSG). Kháng nguyên RoTAT 1.2 (Rode Trypanozoon Antigen Type 1.2) là một VSG đặc biệt có mặt ở hầu hết các dòng T. evansi phân lập tại châu Á, có tính ổn định cao, xuất hiện sớm và không gây phản ứng chéo với các loài đơn bào đường máu khác.
• Nguyên lý kỹ thuật ADN tái tổ hợp và biểu hiện gen: Sử dụng vector dòng hóa (cloning vector) pJET1.2/blunt để giữ và nhân đoạn gen đích; sử dụng vector biểu hiện pET22b mang promoter T7 mạnh, tín hiệu điều khiển phiên mã và vùng mã hóa His-tag/pelB leader để biểu hiện protein ngoại lai trong tế bào chủ Escherichia coli BL21 dưới sự cảm ứng của IPTG.
• Nguyên lý phản ứng ngưng kết hạt Latex trên bản nhựa (CATT): Phức hợp hạt latex polystyrene được gắn đồng hóa trị hoặc hấp phụ vật lý với kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 tinh sạch và nhuộm màu chỉ thị. Khi tiếp xúc với huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu kháng T. evansi, các phân tử kháng thể đóng vai trò cầu nối gắn kết các hạt mang kháng nguyên tạo thành mạng lưới ngưng kết dạng hạt lấm tấm màu xanh quan sát được bằng mắt thường.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

• Khảo sát dịch tễ học và thu thập mẫu máu:
  • Địa bàn: 4 huyện Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên, Chiêm Hóa (tỉnh Tuyên Quang).
  • Thu thập mẫu máu trâu theo các yếu tố: địa phương, nhóm tuổi, tính biệt, các mùa trong năm (Xuân, Hạ, Thu, Đông).
  • Phương pháp xét nghiệm đối chứng: Soi tươi giọt máu, nhuộm giemsa tiêu bản máu khô, tiêm truyền chuột nhắt trắng (theo dõi ký sinh trùng định kỳ trong máu chuột), xét nghiệm huyết thanh học ELISA.
• Kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ gen:
  • Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu nhiễm T. evansi.
  • Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 18S rRNA sử dụng cặp mồi đặc hiệu để định danh loài ký sinh trùng, giải trình tự nucleotide và xây dựng cây phả hệ phát sinh chủng loại qua phần mềm so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI/GenBank.
  • Phản ứng PCR khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2, xử lý cắt đầu bằng Klenow, lai tạo vào vector pJET1.2, biến nạp vào tế bào E. coli DH5α-T, chọn lọc khuẩn lạc trên môi trường LB bổ sung Ampicillin, X-gal, IPTG.
  • Tách chiết plasmid tái tổ hợp pJET1.2-RoTAT 1.2, cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI và SalI, tinh sạch đoạn gen đích và ghép nối vào vector biểu hiện pET22.
  • Biến nạp vector biểu hiện pET22-RoTAT 1.2 vào tế bào E. coli BL21. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy biểu hiện: thời gian cảm ứng (giờ), nhiệt độ nuôi cấy (°C), mật độ tế bào (giá trị OD), pH môi trường, nồng độ kháng sinh Ampicillin và nồng độ chất cảm ứng IPTG.
  • Kiểm tra protein tái tổ hợp bằng điện di gel Tricine-SDS PAGE và phản ứng Western blot với huyết thanh kháng đặc hiệu.
• Quy trình chế tạo và đánh giá Kit CATT:
  • Khảo sát tỷ lệ phối trộn mật độ hạt latex và nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2.
  • Khảo sát nhiệt độ và thời gian tối ưu gắn kháng nguyên lên hạt latex.
  • Đánh giá ảnh hưởng của chất nhuộm màu, chất ức chế protease (PMSF), chất ổn định protein (BSA, Glycerol, DMSO) và chất diệt khuẩn (Sodium azide, Merthiolate).
  • Xác định độ pha loãng huyết thanh, thời gian đọc kết quả và thang điểm ngưng kết từ âm tính (-), nghi ngờ (+/-) đến dương tính (1+ đến 4+).
  • Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định và thời hạn bảo quản của bộ Kit CATT ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau so với kỹ thuật ELISA và phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng.
• Thử nghiệm phác đồ điều trị:
  • Thử nghiệm diện hẹp và diện rộng trên trâu mắc bệnh tự nhiên tại Tuyên Quang.
  • Sử dụng các loại hóa dược: Trypamidium samorin, Berenil (Azidin), Diminavet kết hợp thuốc trợ tim Cafein, truyền dịch NaCl 0,9%, bổ sung Vitamin C và Vitamin B1.

Nguồn tư liệu và dữ liệu

• Dữ liệu thực địa: Mẫu máu trâu thu thập tại các hộ chăn nuôi thuộc 4 huyện Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên, Chiêm Hóa, tỉnh Tuyên Quang.
• Dữ liệu ngân hàng gen: Các chuỗi nucleotide chuẩn của gen 18S rRNA và RoTAT 1.2 của giống Trypanosoma trên NCBI.
• Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng (khối lượng 18 - 20 g/con) và thỏ (khối lượng 2 - 2,5 kg/con) khỏe mạnh.
• Báo cáo thống kê chăn nuôi và thú y của Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Tuyên Quang.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1 tập trung phân tích 3 nội dung trọng tâm:

1. Cơ sở khoa học của bệnh tiên mao trùng ở động vật: Hệ thống hóa phân loại học đơn bào Trypanosoma, đặc điểm hình thái kích thước (18 - 34 µm), cơ chế truyền lây cơ học qua vòi hút của ruồi trâu (Stomoxys calcitrans) và mòng (Tabanus kiangsuensis, Tabanus rubidus). Trình bày cơ chế bệnh sinh: ký sinh trùng sử dụng protein huyết tương làm giảm áp lực keo huyết thanh, tăng tính thấm thành mạch dẫn đến phù thũng tổ chức, tiết độc tố tác động lên trung khu điều hòa nhiệt gây sốt gián đoạn và tổn thương thoái hóa nội tạng (tim nhão, gan sưng, lách mềm, phổi sung huyết). Phân tích chi tiết các kháng nguyên bề mặt biến đổi (VSG) và kháng nguyên ổn định (ISG 65, ISG 75, ISG 100, RoTAT 1.2).
2. Kỹ thuật sinh học phân tử trong sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp: Trình bày nguyên lý công nghệ dòng hóa gen, các loại vector tách dòng (plasmid pCR2.1, pJET1.2; phage; cosmid; phagemid), vector biểu hiện mang promoter mạnh và các hệ thống tế bào chủ biểu hiện protein (E. coli, nấm men, tế bào côn trùng Baculovirus), trong đó nhấn mạnh ưu thế sinh trưởng nhanh và năng suất cao của chủng E. coli BL21.
3. Tổng quan điều kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội tỉnh Tuyên Quang: Phân tích đặc điểm địa hình miền núi (53% diện tích là đồi núi), khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm (lượng mưa trung bình 1.800 mm/năm, độ ẩm 85%, nhiệt độ 22 - 24°C) thuận lợi cho côn trùng trung gian phát triển. Đánh giá tập quán chăn nuôi trâu nhỏ lẻ, thả rông trên đồi rừng, chuồng trại thô sơ nền đất và sự khan hiếm thức ăn trong vụ Đông - Xuân làm gia súc suy giảm đề kháng, giải thích nguyên nhân dịch bệnh phát sinh và tỷ lệ trâu chết rét kết hợp bệnh ký sinh trùng cao trong năm 2016 (toàn tỉnh chết 223 gia súc, trong đó có 140 trâu).

Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả toàn bộ quy trình thực nghiệm, nguyên vật liệu và phương pháp bố trí nghiên cứu:

1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị: Mẫu máu trâu tại 4 huyện của Tuyên Quang; chủng T. evansi phân lập tại địa phương; chuột nhắt trắng (18 - 20 g), thỏ (2 - 2,5 kg); các hóa chất sinh học phân tử (Tricine, SDS, PMSF, PVDF, DMSO, EDTA, PBS, TMB, IPTG, X-gal, Ampicillin, enzym Klenow, enzym giới hạn EcoRI, SalI, ADN polymerase, hạt latex polystyrene).
2. Nội dung và thiết kế thí nghiệm:
   • Nghiên cứu dịch tễ: Xác định tỷ lệ nhiễm theo địa phương (4 huyện), lứa tuổi, tính biệt và mùa vụ; so sánh phương pháp xét nghiệm; thử nghiệm phác đồ điều trị.
   • Nghiên cứu công nghệ gen và chế tạo kit: Khuếch đại PCR gen 18S rRNA và RoTAT 1.2; tách dòng vào vector pJET1.2; biểu hiện trên vector pET22 trong E. coli BL21; tinh sạch protein và kiểm tra Western blot; khảo sát điều kiện gắn kháng nguyên lên hạt latex tạo Kit CATT; thử nghiệm đánh giá chất lượng kit.
3. Phương pháp xử lý số liệu: Thống kê sinh học, tính toán tỷ lệ phần trăm (%), kiểm định thống kê so sánh các chỉ tiêu dịch tễ và độ nhạy/đặc hiệu của các phương pháp chẩn đoán.

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được kèm phân tích, thảo luận chuyên sâu:

1. Tình hình nhiễm tiên mao trùng và điều trị tại Tuyên Quang:
   • Xác định tỷ lệ nhiễm T. evansi trên đàn trâu tại 4 huyện khảo sát (Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên, Chiêm Hóa).
   • Biến động tỷ lệ nhiễm theo lứa tuổi (tỷ lệ nhiễm tăng dần theo độ tuổi, trâu già và trâu trưởng thành cày kéo có tỷ lệ nhiễm cao hơn trâu non).
   • Biến động theo mùa: Tỷ lệ nhiễm tăng cao vào các tháng mùa hè - thu (từ tháng 5 đến tháng 9), trùng khớp với mùa phát triển cao điểm của ruồi trâu và mòng hút máu.
   • Kết quả phân tích phân tử đoạn gen 18S rRNA từ các mẫu phân lập tại 4 huyện (Tev-CH-VN, Tev-HY-VN, Tev-SD-VN, Tev-YS-VN): Sản phẩm PCR trên gel agarose 1% hiển thị băng đặc hiệu, kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI và giải trình tự nucleotide khẳng định độ tương đồng 99 - 100% với các chủng Trypanosoma evansi công bố trên GenBank, xác nhận loài gây bệnh duy nhất là T. evansi.
   • Kết quả điều trị: Phác đồ sử dụng Trypamidium samorin kết hợp trợ tim Cafein và truyền dịch giải độc, nâng cao thể trạng (NaCl 0,9%, Vitamin C, Vitamin B1) đạt tỷ lệ khỏi bệnh 100% trên cả diện hẹp và diện rộng, an toàn cho gia súc.
2. Kết quả chế tạo và thử nghiệm Kit CATT từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2:
   • Tách dòng và biểu hiện gen: Khuếch đại thành công đoạn gen RoTAT 1.2, gắn vào vector pJET1.2 và chuyển tiếp sang vector pET22b; biến nạp thành công vào E. coli BL21.
   • Khảo sát tối ưu hóa biểu hiện protein: Xác định chính xác các thông số tối ưu gồm nồng độ IPTG cảm ứng, thời gian cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy, giá trị pH môi trường, nồng độ Ampicillin và mật độ tế bào OD. Điện di Tricine-SDS PAGE và Western blot xác nhận protein RoTAT 1.2 tái tổ hợp có kích thước phân tử chuẩn, phản ứng đặc hiệu mạnh với kháng thể kháng T. evansi.
   • Hoàn thiện quy trình sản xuất Kit CATT: Xác lập mật độ hạt latex và nồng độ kháng nguyên tối ưu để tạo phức hợp; lựa chọn chất nhuộm màu giúp quan sát rõ ngưng kết; bổ sung chất ức chế phân giải protein (PMSF), chất ổn định (Glycerol/BSA) và chất bảo quản diệt khuẩn giúp kit duy trì hoạt tính ổn định khi bảo quản.
   • Đánh giá chất lượng kit: Thử nghiệm so sánh Kit CATT chế tạo với kỹ thuật ELISA và phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng trên các mẫu huyết thanh thực địa cho thấy Kit CATT đạt độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian cho kết quả nhanh (vài phút), thao tác đơn giản tại hiện trường.

Bảng tổng hợp các thông số kỹ thuật và nội dung thực nghiệm chính của luận án:

Nội dung nghiên cứu	Phương pháp / Kỹ thuật áp dụng	Vật liệu / Đối tượng thực hiện	Kết quả / Thông số kỹ thuật chính
Dịch tễ học thực địa	Thu mẫu máu, xét nghiệm huyết thanh, tiêm truyền chuột	Trâu nuôi tại 4 huyện: Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên, Chiêm Hóa (Tuyên Quang)	Xác định tỷ lệ nhiễm theo vùng, lứa tuổi, tính biệt và mùa vụ (cao điểm mùa mưa/nóng)
Định danh loài phân tử	PCR gen 18S rRNA, cắt EcoRI, giải trình tự, phân tích phả hệ	Mẫu Tev-CH-VN, Tev-HY-VN, Tev-SD-VN, Tev-YS-VN	Tương đồng 99 - 100% với T. evansi trên ngân hàng gen NCBI
Dòng hóa gen kháng nguyên	Nhân gen RoTAT 1.2, xử lý Klenow, ghép plasmid pJET1.2	Vector pJET1.2, tế bào E. coli DH5α-T, enzym EcoRI & SalI	Tạo dòng plasmid tái tổ hợp mang gen RoTAT 1.2 chuẩn xác
Biểu hiện gen đích	Chuyển gen vào pET22, cảm ứng IPTG, nuôi cấy E. coli BL21	Vector pET22, tế bào E. coli BL21, môi trường LB + Ampicillin	Xác định điều kiện tối ưu (nhiệt độ, pH, OD, thời gian, nồng độ IPTG)
Kiểm tra protein tái tổ hợp	Điện di Tricine-SDS PAGE, thẩm tách Western blot	Protein RoTAT 1.2 tái tổ hợp, huyết thanh chuẩn	Protein biểu hiện đặc hiệu, liên kết mạnh với kháng thể kháng T. evansi
Sản xuất Kit CATT	Gắn kháng nguyên lên hạt latex polystyrene, nhuộm màu	Kháng nguyên RoTAT 1.2, hạt latex, PMSF, chất ổn định, chất diệt khuẩn	Tạo hạt ngưng kết xanh, phản ứng nhanh, rõ ràng trên bản nhựa
Đánh giá hiệu quả Kit	So sánh chẩn đoán song song với ELISA và tiêm truyền chuột	Mẫu huyết thanh trâu thực địa tại các nông hộ	Độ nhạy và độ đặc hiệu cao, kết quả đồng nhất với các phương pháp chuẩn
Phác đồ điều trị	Thử nghiệm lâm sàng diện hẹp và diện rộng	Trâu mắc bệnh tiên mao trùng tự nhiên	Trypamidium samorin + Cafein + NaCl 0,9% + Vit C + Vit B1 đạt hiệu lực 100%

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

• Cung cấp hệ thống dữ liệu khoa học toàn diện, cập nhật về tình hình dịch tễ học, sự phân bố, đặc điểm mùa vụ và các yếu tố liên quan đến bệnh tiên mao trùng trên đàn trâu tại 4 huyện trọng điểm thuộc tỉnh Tuyên Quang.
• Định danh chính xác loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu tại địa phương là Trypanosoma evansi dựa trên giải trình tự gen 18S rRNA và phân tích phả hệ di truyền phân tử.
• Làm chủ công nghệ tách dòng và quy trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của T. evansi trên hệ thống vi khuẩn Escherichia coli, tạo nguồn kháng nguyên tái tổ hợp có tính ổn định cao và đặc hiệu miễn dịch.

Những đóng góp mới về mặt thực tiễn

• Chế tạo thành công bộ Kit CATT từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 gắn hạt latex, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, quy trình thao tác đơn giản, thời gian đọc kết quả nhanh, áp dụng hiệu quả trong chẩn đoán nhanh bệnh tiên mao trùng trực tiếp tại các nông hộ và cơ sở chăn nuôi.
• Xác lập và kiểm chứng thành công phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện hẹp và diện rộng bằng hóa dược Trypamidium samorin kết hợp trợ tim, bù dịch và trợ sức (Cafein, dung dịch NaCl 0,9%, Vitamin C, Vitamin B1), mang lại hiệu quả điều trị đạt 100%, an toàn cho đàn trâu, góp phần ngăn chặn tình trạng trâu ngã gục và chết trong vụ Đông - Xuân tại địa phương.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Ứng dụng rộng rãi bộ Kit CATT đã chế tạo vào công tác kiểm tra, giám sát dịch tễ định kỳ tại các địa phương có nguy cơ cao, đặc biệt là vào thời điểm trước mùa phát triển của ruồi trâu, mòng (tháng 4 hàng năm) và trước mùa rét (tháng 10 hàng năm).
• Triển khai phác đồ điều trị can thiệp sớm ngay khi phát hiện gia súc có kết quả dương tính bằng Kit CATT, kết hợp các biện pháp vệ sinh chuồng trại, diệt côn trùng hút máu truyền bệnh để bảo vệ an toàn đàn trâu.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu: Luận án giới hạn phạm vi điều tra dịch tễ và thu thập mẫu phân lập tại 4 huyện (Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên, Chiêm Hóa) của một tỉnh miền núi (Tuyên Quang); việc thử nghiệm thực địa bộ Kit CATT và phác đồ điều trị chủ yếu tập trung trên đối tượng vật nuôi là trâu.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Mở rộng phạm vi thử nghiệm và đánh giá chất lượng bộ Kit CATT trên các đối tượng gia súc khác như bò, ngựa, dê tại nhiều vùng sinh thái khác nhau trên cả nước.
  • Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất Kit CATT ở quy mô công nghiệp để thương mại hóa sản phẩm, phục vụ rộng rãi cho mạng lưới thú y cơ sở.

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và nhà khoa học: Luận án là tài liệu tham khảo giá trị về phương pháp tiếp cận đa ngành, kết hợp dịch tễ học thú y truyền thống với công nghệ sinh học phân tử hiện đại (tách dòng, biểu hiện gen ngoại lai trong E. coli, tinh sạch protein tái tổ hợp, công nghệ gắn hạt latex chế tạo kit chẩn đoán nhanh).
• Đối với giảng viên và cơ sở đào tạo: Cung cấp nguồn học liệu chi tiết phục vụ giảng dạy các chuyên ngành Ký sinh trùng học thú y, Vi sinh vật học thú y, Dịch tễ học thú y và Công nghệ sinh học ứng dụng trong thú y.
• Đối với cán bộ thú y thực địa và nhà quản lý chăn nuôi: Cung cấp công cụ chẩn đoán nhanh tại chỗ (Kit CATT) và quy trình điều trị cụ thể, có khả năng áp dụng trực tiếp tại các trạm thú y cấp huyện, xã để kiểm soát dịch bệnh, giảm thiểu tổn thất kinh tế cho người chăn nuôi gia súc.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao kháng nguyên RoTAT 1.2 được lựa chọn để nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán thay vì các kháng nguyên bề mặt VSG khác của T. evansi? Kháng nguyên bề mặt VSG thông thường của T. evansi liên tục biến đổi cấu trúc để né tránh hệ miễn dịch của vật chủ, gây khó khăn cho việc chẩn đoán huyết thanh học. Trong khi đó, RoTAT 1.2 là kháng nguyên bề mặt ổn định, xuất hiện sớm ngay sau khi nhiễm bệnh, có mặt ở hầu hết các biến chủng T. evansi tại châu Á và không gây phản ứng chéo với kháng thể của các loài ký sinh trùng khác.

2. Hệ thống vector và chủng vi khuẩn nào được sử dụng để tách dòng và biểu hiện gen RoTAT 1.2 trong luận án? Luận án sử dụng vector pJET1.2/blunt để dòng hóa đoạn gen đích trong tế bào chủ E. coli DH5α-T, sau đó chuyển gen đích sang vector biểu hiện pET22 và biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21 dưới sự cảm ứng của IPTG.

3. Trình tự gen nào được sử dụng để định danh chính xác loài tiên mao trùng gây bệnh tại Tuyên Quang? Đoạn gen 18S rRNA của các mẫu tiên mao trùng phân lập tại 4 huyện thuộc Tuyên Quang (Tev-CH-VN, Tev-HY-VN, Tev-SD-VN, Tev-YS-VN) đã được khuếch đại bằng phản ứng PCR, giải trình tự và đối chiếu với cơ sở dữ liệu NCBI/GenBank, cho thấy độ tương đồng 99 - 100% với loài Trypanosoma evansi.

4. Kit CATT chế tạo từ kháng nguyên RoTAT 1.2 có ưu thế gì so với phương pháp tiêm truyền chuột và kỹ thuật ELISA? Phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng đòi hỏi thời gian nuôi dưỡng và theo dõi kéo dài nhiều ngày; kỹ thuật ELISA đòi hỏi máy đọc quang phổ kế và trang thiết bị phòng thí nghiệm cố định. Kit CATT chế tạo có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương, cho kết quả ngưng kết bằng mắt thường chỉ trong vài phút, chi phí thấp và thao tác trực tiếp tại hiện trường chuồng nuôi.

5. Phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu đạt hiệu lực cao nhất trong luận án gồm những thành phần gì? Phác đồ đạt tỷ lệ khỏi 100% gồm thuốc đặc trị Trypamidium samorin, kết hợp tiêm trợ tim bằng Cafein trước 30 - 45 phút, sau đó truyền dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9% và bổ sung các vitamin nâng cao thể trạng gồm Vitamin C và Vitamin B1.

Kết luận

Luận án của NCS. Phạm Thị Trang đã giải quyết toàn diện vấn đề dịch tễ học và chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang. Bằng việc kết hợp khảo sát thực địa với công nghệ sinh học phân tử, tác giả đã định danh chính xác tác nhân gây bệnh là Trypanosoma evansi, làm chủ quy trình công nghệ sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 trên tế bào E. coli BL21 và chế tạo thành công bộ Kit CATT ngưng kết hạt latex có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Đồng thời, luận án đã xác lập phác đồ điều trị phối hợp thuốc đặc hiệu Trypamidium samorin với các biện pháp trợ sức, trợ tim, đạt hiệu quả điều trị 100%, cung cấp cơ sở khoa học và giải pháp thực tiễn quan trọng cho công tác thú y tại các vùng trung du miền núi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cơ sở khoa học của đề tài 1. Bệnh tiên mao trùng ở động vật 1. Căn bệnh Bệnh tiên mao trùng - Trypanosomiasis - là bệnh do ký sinh trùng đơn bào Protozoa, lớp trùng roi Flagellata gây ra.

Có nhiều loài thuộc giống Trypanosoma như: Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma evansi, Trypanosoma congolense, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma simiae… có khả năng gây bệnh cho người và động vật (Kumar A. Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng do loài đơn bào Trypanosoma evansi (T. evansi) gây ra. Tiên mao trùng T.

evansi có hình thoi, dài 18 - 34 m. Giữa thân tiên mao trùng có một nhân, phía cuối cơ thể có một roi, roi này chạy dọc theo thân và tạo thành nhiều màng rung động, cuối cùng roi lơ lửng ở phần đầu và thành roi tự do (Nguyễn Thị Kim Lan, 2011 [12]). Cấu trúc của tiên mao trùng T. evansi (Nguồn: Desquesnes M.

Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi và thú hoang, thấy phổ biến hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo, sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi, thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch., không ký sinh ở người (Phạm Sỹ Lăng và cs. Sự lây truyền bệnh tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khỏe là nhờ các loài ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu (thuộc họ Tabanidae). Sự lây truyền này chỉ mang tính chất cơ học. Như vậy, ruồi và mòng hút máu là những vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng quan trọng.

Đây là một trong những cơ sở khoa học để xây dựng biện pháp phòng và tránh lây lan bệnh tiên mao trùng hiệu quả (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012 [13]; Baldacchino F. Phương thức truyền lây tiên mao trùng T. evansi (Nguồn: Desquesnes M. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán cầu.

evansi hiện diện tại tất cả các quốc gia có lạc đà, từ Senegal (15° Bắc) 6 đến Kenya (xích đạo), trên vành đai Glossina. evansi được tìm thấy không chỉ ở Mauritania, Morocco, Algeria, Tunisia, Libya, Ai Cập, Sudan, Eritrea và Ethiopia, mà còn ở khu vực phía bắc của Mali, Burkina Faso, Niger, Nigeria, Chad, Somalia, Kenya. Ngày nay, phân bố địa lý của bệnh liên tục từ khu vực phía bắc của châu Phi, qua Trung Đông đến khu vực Đông Nam Á. Bệnh phổ biến ở trâu, bò và ngựa các nước nhiệt đới ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ (Haridy F.

Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng đã được phát hiện thấy phổ biến ở hầu hết các vùng sinh thái khác nhau như miền núi, trung du, đồng bằng và ven biển (Phạm Sỹ Lăng và cs. Mùa phát bệnh có liên quan chặt chẽ với mùa côn trùng hoạt động, thường vào khoảng từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm (Phan Địch Lân và cs. Đặc điểm gây bệnh của T. evansi Khi ruồi, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào gia súc, tiên mao trùng xâm nhập vào da, tạo nên các vết viêm trên mặt da.

Độc tố của tiên mao trùng tác động tới bộ máy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu hoá, làm con vật ỉa chảy. Hội chứng tiêu chảy thường xảy ra khi xuất hiện tiên mao trùng trong máu con vật bệnh. Khi sống trong huyết tương vật chủ, tiên mao trùng sử dụng protein huyết tương, làm giảm áp lực keo trong máu, nước sẽ từ máu thẩm thấu qua thành mạch quản vào gian bào của tổ chức gây hiện tượng thủy thũng. Ngoài ra, khi tiên mao trùng sinh sản nhiều trong máu có thể làm tắc các mạch máu nhỏ và các mao mạch, làm tăng tính thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷ thũng chất keo vàng dưới da.

Sau khi xâm nhập vào máu ký chủ, tiên mao trùng sinh sản theo cấp số nhân. Số lượng tiên mao trùng nhiều thì lượng độc tố cũng tăng lên, tác động vào trung khu điều hòa nhiệt làm cho con vật sốt. Khi động vật sốt cao là lúc trong máu có nhiều tiên mao trùng phát triển. Theo Phạm Sỹ Lăng và cs.

(2008) [22], trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng thể hiện các triệu chứng lâm sàng chủ yếu như: sốt cao và gián đoạn, có biểu hiện rối loạn thần kinh, thủy thũng dưới da, gầy yếu, suy nhược, thiếu máu, viêm kết mạc và giác mạc mắt. Một số trâu, bò bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng màu vàng, sau 7 chuyển màu xám, có lẫn bọt và chất nhầy. Các đợt ỉa chảy tiếp theo những cơn sốt cách quãng. Trâu, bò bị bệnh mạn tính thường kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chân sau, nằm tư thế quỳ và không đi lại được.

Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn và nhai lại cho đến khi sắp chết. Triệu chứng viêm giác mạc và kết mạc mắt thấy ở hầu hết trâu, bò mắc bệnh: mắt có dử trắng hay vàng, chảy liên tục, nếu nặng thì mắt sưng, đỏ ngầu. Khi khỏi bệnh, mắt có màng trắng như cùi nhãn kéo che kín giác mạc. Con vật mắc bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy có những biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão, xoang bao tim tích nước vàng; phổi sung huyết và tụ máu từng đám; gan sưng to, nhạt màu; lách sưng, mềm nhũn và nhạt màu; hạch lâm ba sưng và tụ máu trong hạch; cơ nhão, màu nhợt nhạt, nhát cắt rỉ nước; xoang ngực và xoang bụng tích dịch màu vàng nhạt.

Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tương đối khó khăn vì căn bệnh có khi có ở mạch máu ngoại vi, có khi không. Do đó, cần phải chẩn đoán bằng nhiều phương pháp khác nhau: * Phương pháp chẩn đoán lâm sàng Biểu hiện lâm sàng của bệnh tiên mao trùng không phải lúc nào cũng phát hiện được. Chính vì vậy, việc chẩn đoán qua triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò có độ chính xác không cao. Vì vậy, ngoài chẩn đoán qua các triệu chứng lâm sàng, cần phải tiến hành các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm để có kết quả chẩn đoán chính xác.

* Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm Việc phát hiện tiên mao trùng được thực hiện trên các mẫu máu, có thể xét nghiệm các mẫu máu này bằng hình thức soi tươi, cố định, nhuộm giemsa và một số phương pháp huyết thanh học khác (Desquesnes M. Cụ thể như sau: - Phương pháp phát hiện tiên mao trùng Để phát hiện tiên mao trùng, có thể áp dụng phương pháp soi tươi máu (Direct smear); phương pháp nhuộm giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky); phương pháp tập trung tiên mao trùng. 8 - Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm Đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. Ở phương pháp này, người ta tiêm truyền máu của động vật cần chẩn đoán cho động vật thí nghiệm (thường dùng chuột nhắt trắng).

Sau đó, hàng ngày kiểm tra máu của động vật đã được tiêm truyền để phát hiện tiên mao trùng. Nếu trong máu động vật này có tiên mao trùng thì kết luận động vật cần chẩn đoán bị nhiễm bệnh và ngược lại. Theo Lê Ngọc Mỹ (1994) [26], phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là phương pháp chẩn đoán chính xác, nhưng nhược điểm của phương pháp này là khi cần chẩn đoán nhanh, với số lượng mẫu nhiều trong khoảng thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng được. - Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học Khi tiên mao trùng ký sinh, cơ thể vật chủ sản sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại tiên mao trùng.

Những phương pháp sau cho phép phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng trong máu vật chủ: Phản ứng ngưng kết trên bản nhựa (CATT/T. evansi: Card Agglutination Test for Trypanosomiasis) Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể trong máu động vật nhiễm bệnh. Phương pháp CATT có ưu điểm cho kết quả nhanh chóng, dễ thực hiện, đặc biệt có thể áp dụng trong điều kiện thực địa thiếu các dụng cụ chẩn đoán chuyên biệt. Nguyên lý của phương pháp: kháng nguyên tiên mao trùng đã được nhuộm màu sẽ kết hợp với kháng thể có trong huyết thanh của động vật nhiễm bệnh, tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh, đó là phản ứng dương tính.

Nếu động vật không nhiễm bệnh, trong máu không có kháng thể đặc hiệu, phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể không xảy ra và không có các đám kết tủa, đó là phản ứng âm tính. 9 Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slide Agglutination Test) Phương pháp ngưng kết trên phiến kính là phản ứng giữa kháng nguyên tiên mao trùng sống có sẵn, với kháng thể có trong huyết thanh của động vật nghi nhiễm. Phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành và có thể áp dụng trên diện rộng. Tuy nhiên phải thường xuyên lưu giữ giống tiên mao trùng để có tiên mao trùng sống thực hiện phản ứng này.

Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test) Phương pháp LATEX được dùng để phát hiện kháng thể có trong huyết thanh của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng. Nguyên lý: Đây là phản ứng dùng kháng nguyên gắn hạt latex, khi gặp kháng thể đặc hiệu, kháng nguyên và kháng thể sẽ kết hợp với nhau thành đám lớn mà mắt thường có thể quan sát được. Khi cho kháng nguyên trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, phản ứng ngưng kết sẽ xảy ra. Kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu.

Do mỗi cầu nối với kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn như những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng. Nhờ có hạt latex gắn vào kháng nguyên, hiện tượng ngưng kết này trở nên dễ dàng quan sát hơn. Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect Fluorescent Antibody Test) Trong nhiều trường hợp, để phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể, cần phải sử dụng một số kỹ thuật miễn dịch mới nhìn thấy được. Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT dùng kháng kháng thể đã được nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên cần chẩn đoán.

Trong phương pháp này có ba thành phần tham gia là kháng nguyên cần chẩn đoán, kháng thể đặc hiệu và kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Do đó, phương pháp này còn được gọi là phương pháp hai lớp. Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Phương pháp ELISA là một trong những phương pháp hiện đại được ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.