Luận án tiến sĩ nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trypanosomiasis ở đàn trâu tại tỉnh tuyên quang

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trypanosomiasis ở đàn, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

• Tác giả: Phạm Thị Trang
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Thị Kim Lan
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Ký sinh trùng và vi sinh vật học thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Xác Định Tỷ Lệ Nhiễm Và Phát Triển Kit Chẩn Đoán Bệnh Trypanosomiasis Ở Đàn Trâu Tại Tuyên Quang
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cơ sở khoa học của đề tài
• 1.2. Bệnh tiên mao trùng ở động vật
• 1.3. Kỹ thuật sinh học phân tử trong sản xuất kháng nguyên của tiên mao trùng
• 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
• 1.5. Điều kiện tự nhiên, điều kiện kinh tế - xã hội của tỉnh Tuyên Quang
• 1.5.1. Điều kiện tự nhiên
• 1.5.2. Điều kiện kinh tế - xã hội
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.3.1. Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị
• 2.3.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị
• 2.4.2. Phương pháp nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán bệnh
• 2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tình hình nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả
• 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang
• 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo lứa tuổi trâu tại tỉnh Tuyên Quang
• 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt
• 3.1.4. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa vụ
• 3.2. Kết quả xác định loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 3.3. Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 3.4. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 3.5. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1
• 3.5.1. Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T.
• 3.5.2. Kết quả nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

Tóm tắt

I. Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh tiên mao trùng là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, ảnh hưởng đến sức khỏe và năng suất của đàn gia súc, đặc biệt là trâu tại Việt Nam. Theo Elshafie E. (2015), bệnh do ký sinh trùng Trypanosoma evansi gây ra, có thể dẫn đến thiệt hại lớn cho người chăn nuôi nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời. Việc phát hiện sớm và điều trị hiệu quả bệnh tiên mao trùng là cần thiết nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong ở gia súc. Tại tỉnh Tuyên Quang, nơi có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho sự phát triển của ruồi và mòng, vật truyền bệnh, việc nghiên cứu tỷ lệ nhiễm và phát triển kit chẩn đoán là cực kỳ quan trọng. Nghiên cứu này không chỉ giúp xác định tỷ lệ nhiễm bệnh mà còn phát triển phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, chính xác, từ đó góp phần bảo vệ sức khỏe đàn trâu và nâng cao đời sống cho người chăn nuôi.

II. Mục tiêu của đề tài

Đề tài này được thực hiện với hai mục tiêu chính. Đầu tiên, nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm bệnh tiên mao trùng trên đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang, từ đó định danh loài ký sinh trùng gây bệnh và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả. Mục tiêu thứ hai là chế tạo kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Việc đạt được những mục tiêu này sẽ không chỉ cung cấp thông tin quan trọng về tình hình bệnh tật ở trâu mà còn tạo ra công cụ chẩn đoán hữu ích cho các bác sĩ thú y và người chăn nuôi, giúp họ có thể phát hiện bệnh sớm và điều trị kịp thời.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đề tài mang lại nhiều ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Về mặt khoa học, nghiên cứu cung cấp dữ liệu về tỷ lệ nhiễm bệnh tiên mao trùng, đồng thời phát triển công nghệ chế tạo kit chẩn đoán từ kháng nguyên tái tổ hợp, khẳng định khả năng làm chủ công nghệ trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh. Về mặt thực tiễn, kit chẩn đoán giúp phát hiện nhanh chóng, chính xác bệnh tiên mao trùng, từ đó nâng cao chất lượng đàn trâu và cải thiện đời sống cho người chăn nuôi. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh bệnh tiên mao trùng có thể gây thiệt hại lớn về kinh tế nếu không được kiểm soát hiệu quả.

IV. Những đóng góp mới của đề tài

Đề tài đã có những đóng góp mới đáng kể trong lĩnh vực nghiên cứu bệnh tiên mao trùng. Việc chế tạo thành công kit chẩn đoán từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 với độ nhạy và độ đặc hiệu cao là một trong những thành tựu nổi bật. Kit này có thể được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tại các địa phương, giúp nâng cao khả năng phát hiện sớm và điều trị kịp thời. Những đóng góp này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn trong thực tiễn sản xuất, góp phần bảo vệ sức khỏe đàn gia súc và phát triển ngành chăn nuôi tại Việt Nam.

V. Tổng quan tài liệu

Tổng quan tài liệu cung cấp cái nhìn sâu sắc về bệnh tiên mao trùng và các nghiên cứu liên quan. Bệnh này do ký sinh trùng Trypanosoma evansi gây ra, có sự phân bố rộng rãi ở nhiều quốc gia, bao gồm cả Việt Nam. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng bệnh tiên mao trùng ảnh hưởng đến nhiều loài gia súc và có thể gây thiệt hại lớn nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Các phương pháp chẩn đoán hiện tại có nhiều hạn chế, do đó, việc phát triển phương pháp chẩn đoán mới, hiệu quả hơn là cần thiết. Những thông tin này sẽ là cơ sở cho việc thực hiện nghiên cứu và phát triển các giải pháp phòng chống bệnh tiên mao trùng trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) do đơn bào ký sinh đường máu Trypanosoma evansi (T. evansi) gây ra là một trong những rào cản dịch tễ học và kinh tế nghiêm trọng nhất đối với ngành chăn nuôi đại gia súc tại các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới (Desquesnes et al., 2013). Tại tỉnh Tuyên Quang—địa bàn miền núi phía Bắc Việt Nam với tổng đàn trâu đạt trên 113.000 con (Chi cục Thú y Tuyên Quang, 2016)—đặc điểm địa hình chia cắt, độ ẩm cao (trung bình 85%) và thảm thực vật dày đặc tạo điều kiện tối ưu cho các loài côn trùng môi giới hút máu thuộc họ phụ Stomoxydinae (ruồi Stomoxys calcitrans) và họ Tabanidae (mòng Tabanus kiangsuensis, Tabanus rubidus) sinh trưởng mạnh mẽ (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2014). Bệnh thường diễn biến ở thể mạn tính khó nhận biết, làm suy kiệt sức kéo, gây thiếu máu, suy giảm miễn dịch và dẫn đến tỷ lệ chết cao trong vụ Đông - Xuân khi thời tiết khắc nghiệt và thức ăn khan hiếm.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) then chốt bắt nguồn từ cơ chế biến đổi kháng nguyên bề mặt liên tục (Antigenic Variation) thông qua kho gen mã hóa glycoprotein bề mặt biến đổi (Variant Surface Glycoprotein - VSG) của T. evansi, khiến việc phát hiện trực tiếp bằng kính hiển vi (soi tươi, nhuộm Giemsa) đạt độ nhạy cực thấp khi mật độ ký sinh trùng trong máu ngoại vi xuống dưới ngưỡng $10^2\text{--}10^3\text{ KST/ml}$ (Elshafie, 2015). Trong khi đó, kỹ thuật tiêm truyền chuột nhắt trắng tốn nhiều ngày (Lê Ngọc Mỹ, 1994), kỹ thuật PCR đòi hỏi trang thiết bị phòng thí nghiệm chuyên sâu (Singh et al., 2004), còn phương pháp huyết thanh học dùng kháng nguyên tự nhiên toàn phần (Whole Cell Lysate - WCL) lại có chi phí nuôi cấy lớn và độ đặc hiệu không ổn định (Urakawa et al., 2001).

Nhằm giải quyết triệt để vấn đề này, luận án của NCS. Phạm Thị Trang giải quyết ba câu hỏi nghiên cứu (Research Questions - RQ) và kiểm định ba giả thuyết khoa học (Hypotheses - H):

• RQ1: Thực trạng tỷ lệ nhiễm T. evansi trên đàn trâu tại 4 huyện trọng điểm (Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên, Chiêm Hóa) phân bố theo lứa tuổi, tính biệt, mùa vụ và mối quan hệ di truyền của chủng phân lập là gì?
• H1: Tỷ lệ nhiễm T. evansi có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các mùa (tăng cao vào mùa mưa tương ứng mùa hoạt động của côn trùng môi giới) và các chủng tại Tuyên Quang mang tính bảo tồn cao về trình tự gen 18S rRNA so với cơ sở dữ liệu quốc tế.
• RQ2: Liệu có thể tách dòng, biểu hiện thành công đoạn gen mã hóa epitope bảo tồn RoTAT 1.2 (Rode Trypanozoon Antigen Type 1.2) của T. evansi trong hệ thống tế bào vi khuẩn Escherichia coli để tạo nguồn kháng nguyên tái tổ hợp tinh sạch hay không?
• H2: Đoạn gen mã hóa RoTAT 1.2 (~205 bp) khi được tối ưu hóa biểu hiện trong vector pET-22b(+) và chủng E. coli BL21(DE3) sẽ tổng hợp protein tái tổ hợp giữ nguyên tính đặc hiệu miễn dịch, không phản ứng chéo với các tác nhân khác.
• RQ3: Kit CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis) sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp gắn hạt latex có đáp ứng được độ nhạy, độ đặc hiệu tương đương ELISA và phương pháp tiêm truyền động vật hay không?
• H3: Phức hợp kháng nguyên RoTAT 1.2 - hạt latex sau khi tối ưu hóa nồng độ, chất ổn định và chất nhuộm màu sẽ cho phản ứng ngưng kết nhanh trong vòng 3–5 phút với độ nhạy và độ đặc hiệu đạt trên 98%.

Luận án được xây dựng trên khung lý thuyết về cơ chế né tránh miễn dịch của động vật nguyên sinh (Immune Evasion Theory) và mô hình liên hợp kháng nguyên bề mặt ổn định (Stable Epitope Diagnostic Immunoassay). Nghiên cứu tiến hành thu thập mẫu sinh phẩm trên quy mô lớn tại 4 huyện trọng điểm trong giai đoạn 2013–2017, tích hợp phương pháp phân tử (giải trình tự 18S rRNA), công nghệ DNA tái tổ hợp (pJET1.2, pET-22b(+)) và hóa sinh miễn dịch tạo hạt latex ngưng kết nhằm cung cấp giải pháp chẩn đoán Point-of-Care (POC) giá thành thấp, độ chính xác cao cho ngành thú y.

---

Literature Review và Positioning

Các nghiên cứu dịch tễ học và miễn dịch học về bệnh do Trypanosoma trên thế giới đã hình thành hai trường phái chính:

1. Trường phái dịch tễ học hình thái và trung gian truyền lây: Tập trung vào động học quần thể côn trùng hút máu họ Tabanidae và Muscidae (Baldacchino et al., 2014; Hall et al., 2007). Nghiên cứu của Desquesnes et al. (2009) chỉ ra rằng T. evansi chỉ tồn tại và giữ khả năng truyền lây cơ học trong vòi ruồi mòng tối đa 45 giờ trước khi thoái hóa cấu trúc. Tại Việt Nam, các tác giả Phan Văn Chinh (2006) và Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2014) xác định hai loài mòng Tabanus kiangsuensis (22,15%), Tabanus rubidus (32,59%) và ruồi Stomoxys calcitrans (45,25%) là các vectơ chính, giải thích tính mùa vụ cao điểm từ tháng 5 đến tháng 9.
2. Trường phái sinh học phân tử và kháng nguyên biến đổi: Pays (2011) và Phạm Đức Chương và cs. (2007) làm rõ cơ chế biến đổi kháng nguyên bề mặt nhờ chuyển đổi các vị trí biểu hiện (Expression Sites - ES) của kho gen mã hóa VSG. Tranh luận khoa học lớn nhất tồn tại giữa hai quan điểm về công cụ chẩn đoán: một bên ủng hộ kỹ thuật PCR phát hiện DNA ký sinh trùng với độ nhạy lý thuyết tuyệt đối (Fernandez et al., 2009; Singh et al., 2004), trong khi bên còn lại chứng minh kỹ thuật ngưng kết huyết thanh học CATT và ELISA là phương pháp duy nhất khả thi để sàng lọc quy mô lớn trong điều kiện thực địa (Ngaira et al., 2003; Pathak et al., 2015).

Nghiên cứu của Urakawa et al. (2001) đã mở ra bước ngoặt khi chứng minh kháng nguyên glycoprotein bề mặt RoTAT 1.2 là phân tử ổn định duy nhất có mặt ở hầu hết các biến chủng (Variable Antigen Types - VAT) của T. evansi, có đoạn kích thước đặc trưng ~205 bp và không tạo phản ứng chéo với các loài Trypanosoma khác. Tuy nhiên, nhóm tác giả quốc tế này sản xuất RoTAT 1.2 tái tổ hợp dựa trên hệ thống biểu hiện tế bào côn trùng dòng Sf9 (Spodoptera frugiperda) vốn phức tạp và chi phí rất cao. So sánh với các nghiên cứu quốc tế tại Kenya (Ngaira et al., 2003; CATT đạt độ nhạy 68,6% trên lạc đà) hay tại Ấn Độ (Sengupta et al., 2012; Pathak et al., 2015), luận án của NCS. Phạm Thị Trang định vị sự tiên phong khi là công trình đầu tiên tại Việt Nam thiết lập hoàn chỉnh chuỗi giá trị công nghệ sinh học: từ giải mã đặc tính phân tử 18S rRNA của các chủng T. evansi phân lập tại Tuyên Quang, chuyển nạp thành công gen RoTAT 1.2 vào vector biểu hiện vi khuẩn E. coli pET-22b(+), đến việc chuẩn hóa công nghệ cố định protein lên hạt latex để thương mại hóa bộ Kit CATT chi phí thấp phục vụ trực tiếp cho vùng miền núi khó khăn.

---

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng sâu sắc Thuyết biến đổi kháng nguyên bề mặt (Antigenic Variation Theory) của Pays (2011) và Khung miễn dịch học đơn bào ký sinh của Urakawa et al. (2001) bằng cách xác lập các mệnh đề lý thuyết mới:

• Mệnh đề 1 ($P_1$): Tính bảo tồn tuyệt đối của epitope RoTAT 1.2 không chỉ tồn tại ở các chủng T. evansi phân lập tại châu Phi hay Tây Á mà duy trì tính đồng nhất di truyền 99–100% trên các chủng phân lập tại các tiểu vùng sinh thái Đông Bắc Bộ Việt Nam.
• Mệnh đề 2 ($P_2$): Sự biểu hiện dị bào (Heterologous expression) của đoạn gen mã hóa RoTAT 1.2 trong sinh vật nhân sơ (E. coli) dù không trải qua quá trình glycosyl hóa phức tạp của tế bào nhân thực vẫn duy trì cấu trúc không gian ba chiều cần thiết để liên kết đặc hiệu với globulin miễn dịch kháng T. evansi trong huyết thanh trâu.
• Mệnh đề 3 ($P_3$): Phản ứng ngưng kết hạt latex tạo mạng lưới không gian đa chiều (multidimensional lattice network) khi có mặt kháng thể kháng T. evansi với ngưỡng nhạy tương đương phản ứng miễn dịch gắn enzyme (ELISA), phá vỡ quan niệm truyền thống cho rằng kỹ thuật ngưng kết trực tiếp luôn có độ nhạy thấp hơn miễn dịch đánh dấu.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp chặt chẽ 3 trụ cột khoa học:

1. Trụ cột Dịch tễ học quần thể (Population Epizootiology): Khảo sát mối tương quan đa biến giữa tỷ lệ nhiễm với điều kiện sinh thái, mùa vụ và các chỉ số nhân khẩu học của vật chủ.
2. Trụ cột Di truyền học phân tử (Molecular Phylogenetics): Sử dụng trình tự gen chỉ thị 18S rRNA để phân loại phả hệ và kiểm định tính nguyên vẹn di truyền của các chủng thực địa (Tev-CH-VN, Tev-HY-VN, Tev-SD-VN, Tev-YS-VN).
3. Trụ cột Kỹ nghệ sinh học miễn dịch (Immuno-engineering): Chuẩn hóa bề mặt hạt vi cầu latex, gắn kết phối tử protein RoTAT 1.2 tái tổ hợp và kiểm soát điều kiện hóa lý (pH, nhiệt độ, nồng độ ion, chất diệt khuẩn $NaN_3$, chất ức chế protease PMSF) nhằm đảm bảo hoạt tính bền vững của kit chẩn đoán.

---

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án tuân thủ nghiêm ngặt quan điểm thực chứng hậu kỳ (Post-positivist paradigm), áp dụng thiết kế đa tầng kết hợp giữa điều tra dịch tễ cắt ngang (cross-sectional epizootiological survey), thực nghiệm công nghệ sinh học phân tử (in vitro laboratory experimentation) và thử nghiệm can thiệp lâm sàng (in vivo clinical trial).

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình nghiên cứu được chuẩn hóa qua các bước khép kín:

1. Thu thập mẫu và phân lập chủng: Lấy máu tĩnh mạch cổ của trâu nghi nhiễm tại các nông hộ, đưa vào ống nghiệm chống đông bằng EDTA. Mẫu máu được tiêm truyền vào ổ phúc mạc chuột nhắt trắng khỏe mạnh (trọng lượng 18–20 g/con) để nhân dòng và bảo tồn giống T. evansi thuần khiết.
2. Kỹ thuật sinh học phân tử:
   • Tách chiết DNA tổng số từ máu trâu và máu chuột nhiễm bệnh.
   • Khuếch đại đoạn gen 18S rRNA và gen mã hóa RoTAT 1.2 bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với các cặp mồi đặc hiệu thiết kế chuyên biệt.
   • Tinh sạch sản phẩm PCR qua cột silica gel, xử lý đầu bằng enzyme Klenow, ghép nối (ligation) vào vector tách dòng pJET1.2/blunt, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α.
   • Kiểm tra khuẩn lạc tái tổ hợp bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc (colony PCR) và cắt bằng enzyme giới hạn (EcoRI, SalI).
3. Biểu hiện gen và kiểm chứng Protein:
   • Chuyển đoạn gen đích vào vector biểu hiện pET-22b(+), biến nạp vào chủng E. coli BL21(DE3).
   • Tối ưu hóa các thông số nuôi cấy: nồng độ chất cảm ứng Isopropyl $\beta$-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) từ 0,2 đến 1,0 mM, nhiệt độ nuôi cấy ($25^\circ\text{C}$, $30^\circ\text{C}$, $37^\circ\text{C}$), giá trị mật độ quang $OD_{600}$ khi cảm ứng, độ pH môi trường và nồng độ kháng sinh Ampicillin bổ sung.
   • Điện di kiểm tra protein bằng Tricine-SDS PAGE và xác nhận tính đặc hiệu miễn dịch qua phản ứng lai Western blot sử dụng huyết thanh chuẩn mang kháng thể kháng T. evansi.
4. Chế tạo và tối ưu hóa Kit CATT:
   • Tinh sạch protein RoTAT 1.2 tái tổ hợp.
   • Khảo sát các thông số kỹ thuật tạo phức hợp: kích thước và mật độ hạt vi cầu latex polystyrene, nồng độ protein tối ưu, tỷ lệ chất đệm PBS, chất nhuộm màu xanh Coomassie Brilliant Blue hoặc chất màu huỳnh quang.
   • Bổ sung chất ức chế enzyme phân giải protein Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), chất ổn định protein và chất diệt khuẩn Sodium azide ($NaN_3$) nhằm đảm bảo thời hạn bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau ($4^\circ\text{C}$, $25^\circ\text{C}$, $37^\circ\text{C}$).

Data và phân tích

• Phương pháp kiểm chứng chẩn đoán: Đánh giá độ nhạy (Sensitivity - Se), độ đặc hiệu (Specificity - Sp), giá trị dự báo dương tính (PPV) và giá trị dự báo âm tính (NPV) của Kit CATT thông qua thử nghiệm mù đôi đối chứng trực tiếp với kỹ thuật ELISA huyết thanh học và tiêu chuẩn vàng tiêm truyền chuột bạch.
• Xử lý thống kê và phân tích sinh tin:
  • Dữ liệu dịch tễ học được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS, áp dụng phép kiểm Chi-square ($\chi^2$) và phân tích phương sai ANOVA để xác định mức độ ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$ và $p < 0,01$).
  • Trình tự nucleotide chuỗi gen 18S rRNA và RoTAT 1.2 được phân tích, căn chỉnh dòng (sequence alignment) bằng phần mềm BioEdit và xây dựng cây phả hệ di truyền (Phylogenetic Tree) theo phương pháp Neighbor-Joining trên phần mềm MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), so sánh trực tiếp với các trình tự chuẩn trên Ngân hàng gen quốc tế (NCBI GenBank).

---

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Bức tranh dịch tễ học chính xác tại địa bàn miền núi: Luận án xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu tại Tuyên Quang dao động từ 15,58% đến hơn 27% tùy theo tiểu vùng sinh thái (tương đương với phát hiện của Nguyen et al., 2014 tại 5 tỉnh miền Bắc là 27,1%). Tỷ lệ nhiễm biến động chặt chẽ theo mùa vụ, đạt đỉnh vào giai đoạn hè - thu (tháng 5 đến tháng 9), hoàn toàn tương thích với chu kỳ hoạt động cao điểm của ruồi Stomoxys calcitrans và mòng Tabanus rubidus.

2. Xác định tính đồng nhất di truyền của các chủng phân lập: Kết quả giải trình tự đoạn gen 18S rRNA của 4 mẫu đại diện tại 4 huyện nghiên cứu (Tev-CH-VN, Tev-HY-VN, Tev-SD-VN và Tev-YS-VN) cho thấy độ tương đồng 99–100% so với các chủng T. evansi đăng ký trên NCBI GenBank phân lập từ Thái Lan, Philippines và Ai Cập (Yadava et al., 2013). Điều này bác bỏ giả thuyết về sự tồn tại của các phân loài biến dị sâu tại vùng núi phía Bắc Việt Nam, tạo nền tảng vững chắc cho việc ứng dụng một loại kháng nguyên chẩn đoán thống nhất.

3. Biểu hiện thành công kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 trên E. coli: Luận án đã tinh sạch và tối ưu hóa hệ thống biểu hiện gen dị bào với vector pET-22b(+). Kết quả điện di Tricine-SDS PAGE và lai Western blot xác nhận protein RoTAT 1.2 tái tổ hợp có tính kháng nguyên mạnh, liên kết đặc hiệu với kháng thể trong huyết thanh trâu nhiễm bệnh mà không gây hiện tượng phản ứng chéo giả tạo.

4. Hiệu năng vượt trội của Kit CATT hạt latex: Bộ Kit CATT chế tạo từ kháng nguyên RoTAT 1.2 tái tổ hợp cho kết quả phản ứng ngưng kết rõ ràng trong vòng 3–5 phút. Dữ liệu thực nghiệm chứng minh:

   "Kháng nguyên này được chế tạo bằng công nghệ gen cho khả năng phát hiện đặc hiệu tiên mao trùng đạt trên 98%" (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2015).

   Đồng thời, khi đối chứng thực tế trên hàng trăm mẫu huyết thanh:

   "Kit TUAF - CATT cho kết quả đồng dương tính với biện pháp tiêm truyền chuột bạch là 98,24%" (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2015).

   Hiệu năng này vượt trội hơn so với kết quả của Urakawa et al. (2001) trên kháng nguyên tự nhiên:

   "Kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 có độ nhạy tương tự như với kháng nguyên RoTAT 1.2 tự nhiên, nhưng có độ đặc hiệu cao hơn, tương ứng là 99% và 89,3%" (Urakawa T., 2001).

5. Chuẩn hóa phác đồ điều trị đạt hiệu lực tuyệt đối: Thử nghiệm can thiệp lâm sàng chứng minh:

   "Phác đồ sử dụng thuốc trypamidium samorin kết hợp với truyền dung dịch nước muối sinh lý, vitamin C, vitamin B1 sau khi tiêm cafein trợ tim 30 - 45 phút cho trâu, bò cho hiệu quả điều trị bệnh cao nhất, tỷ lệ khỏi đạt 100% và rất an toàn đối với trâu, bò" (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2013).

Implications đa chiều

• Về lý thuyết sinh học phân tử & Miễn dịch học: Khẳng định tính ổn định của epitope RoTAT 1.2 như một dấu ấn sinh học (biomarker) phổ quát để chẩn đoán T. evansi, mở ra phương thức biểu hiện protein tái tổ hợp không glycosyl hóa trong E. coli ứng dụng cho các ký sinh trùng đơn bào khác.
• Về phương pháp luận chẩn đoán thú y: Chuyển đổi mô hình chẩn đoán từ phụ thuộc vào phòng thí nghiệm trung tâm sang chẩn đoán tại chỗ (Point-of-Care Testing), cho phép cán bộ thú y cơ sở phát hiện bệnh ngay tại chuồng nuôi chỉ trong vài phút.
• Về thực tiễn sản xuất & An sinh xã hội: Giảm thiểu triệt để tỷ lệ trâu ngã nước, trâu chết trong mùa rét đậm rét hại tại Tuyên Quang (năm 2016 toàn tỉnh thiệt hại 140 con trâu do rét kèm suy kiệt bệnh lý), bảo vệ tài sản và sinh kế cho bà con đồng bào dân tộc thiểu số (Tày, Dao, Sán Chay, Mông).
• Về chính sách kiểm soát dịch tễ: Cung cấp công cụ phục vụ chương trình giám sát dịch tễ định kỳ vào tháng 4 và tháng 8 hàng năm theo khuyến cáo của Cục Thú y, ngăn chặn nguy cơ bùng phát dịch bệnh trên diện rộng.

---

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những bước đột phá vượt bậc, luận án ghi nhận một số giới hạn khoa học (boundary conditions):

1. Sự tồn tại của các chủng thiếu hụt gen RoTAT 1.2 (RoTAT 1.2-lacking strains): Một số nghiên cứu trên thế giới (như tại Sudan, Ethiopia) ghi nhận một tỷ lệ nhỏ các chủng T. evansi không mang gen RoTAT 1.2, có thể dẫn đến hiện tượng âm tính giả trên Kit CATT. Dù các chủng tại Tuyên Quang và miền Bắc Việt Nam đều mang gen này, việc mở rộng xét nghiệm trên quy mô toàn quốc cần được tiếp tục đánh giá.
2. Độ bền nhiệt độ của hạt Latex: Hạt latex phủ kháng nguyên tái tổ hợp cần bảo quản ở $4^\circ\text{C}$ để duy trì hoạt tính trên 12 tháng. Khi vận chuyển đến các vùng sâu, vùng xa trong điều kiện nhiệt độ mùa hè ($>35^\circ\text{C}$), nếu thiếu chuỗi cung ứng lạnh (cold chain), độ nhạy của phản ứng ngưng kết có thể bị suy giảm theo thời gian.
3. Phân tích hệ gen chuyên sâu: Nghiên cứu mới dừng lại ở phân tích đoạn gen 18S rRNA và RoTAT 1.2, chưa thực hiện giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) để khảo sát các biến đổi đơn nucleotide (SNP) liên quan đến cơ chế đề kháng thuốc tiềm tàng của T. evansi.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối trong 5–10 năm tới:

• Phát triển que thử nhanh sắc ký miễn dịch dạng dòng chảy bên (Lateral Flow Immunoassay / Dipstick) từ kháng nguyên RoTAT 1.2 kết hợp hạt nano vàng (gold nanoparticles) nhằm nâng cao độ bền nhiệt, không cần tủ lạnh bảo quản.
• Thiết lập hệ thống giám sát phân tử phát hiện các đột biến kháng thuốc Trypamidium Samorin và Diminazene aceturate trên quy mô toàn quốc theo xu hướng nghiên cứu của Tchamdja et al. (2016).
• Ứng dụng kháng nguyên RoTAT 1.2 tái tổ hợp để nghiên cứu phát triển vaccine tái tổ hợp thử nghiệm phòng bệnh tiên mao trùng trên động vật mô hình.

---

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Đặt nền móng vững chắc cho hướng nghiên cứu sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp phục vụ chẩn đoán bệnh ký sinh trùng đường máu tại Việt Nam, trở thành tài liệu tham khảo cốt lõi cho các nghiên cứu sau đại học chuyên ngành Thú y và Công nghệ sinh học.
• Tác động công nghiệp và chuyển giao công nghệ: Việc làm chủ quy trình tạo kit chẩn đoán CATT từ E. coli mở ra cơ hội thương mại hóa sản phẩm chẩn đoán thú y "Make in Vietnam", chủ động nguồn cung vật tư xét nghiệm dịch bệnh với chi phí chỉ bằng một phần nhỏ so với nhập khẩu từ Viện Y học Nhiệt đới Antwerp (Bỉ).
• Tác động chính sách và an sinh xã hội: Đóng góp trực tiếp vào chiến lược bảo tồn và phát triển đàn đại gia súc của tỉnh Tuyên Quang và các tỉnh miền núi phía Bắc, bảo vệ nguồn vốn tư liệu sản xuất chủ lực của các hộ đồng bào dân tộc thiểu số nghèo.
• Ý nghĩa sức khỏe toàn cầu (One Health): Cảnh báo của Van Vinh Chau et al. (2016) về ca bệnh T. evansi nhiễm trên người tại Việt Nam qua tiếp xúc với thịt bò bệnh cho thấy việc kiểm soát triệt để tiên mao trùng trên đàn gia súc có ý nghĩa bảo vệ sức khỏe cộng đồng sâu sắc.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giảng viên chuyên ngành Thú y / Ký sinh trùng học: Tiếp cận quy trình thực nghiệm chuẩn hóa từ tách dòng, biểu hiện gen kháng nguyên ký sinh trùng đến kỹ thuật liên kết bề mặt hạt latex.
• Các nhà phát triển R&D và Doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm thú y: Sở hữu quy trình công nghệ chi tiết để sản xuất thương mại hóa Kit CATT chẩn đoán nhanh tại thực địa với độ nhạy và đặc hiệu cao.
• Chi cục Chăn nuôi và Thú y các tỉnh miền núi: Có trong tay công cụ sàng lọc dịch tễ học tin cậy, thao tác đơn giản, giá thành thấp để điều tra ổ dịch và thanh lọc mầm bệnh trong đàn gia súc.
• Hộ chăn nuôi nông hộ tại vùng cao: Nhận được dịch vụ chẩn đoán nhanh, chính xác và phác đồ điều trị kịp thời (khỏi bệnh 100%), loại bỏ nguy cơ trâu đổ ngã và chết rét do kiệt sức mạn tính, bảo vệ sinh kế gia đình.

---

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Luận án đã chứng minh thành công rằng epitope RoTAT 1.2 của T. evansi phân lập tại Việt Nam hoàn toàn bảo tồn đặc tính kháng nguyên và khả năng liên kết miễn dịch đặc hiệu khi được biểu hiện dưới dạng protein tái tổ hợp không glycosyl hóa trong hệ thống vi khuẩn Escherichia coli, mở rộng thuyết biến đổi kháng nguyên bề mặt (Antigenic Variation Theory) của Pays (2011) và Urakawa et al. (2001) trong điều kiện dịch tễ học nhiệt đới Đông Nam Á.

2. Phương pháp luận của đề tài có bước đột phá nào so với các nghiên cứu trước đây? So với phương pháp của Urakawa et al. (2001) (sử dụng tế bào côn trùng Sf9 đắt đỏ) và Ngaira et al. (2003) (sử dụng kháng nguyên tự nhiên chiết xuất từ máu động vật nhiễm bệnh với độ nhạy chỉ 68,6%), luận án đã thiết lập quy trình công nghệ biểu hiện trên vector vi khuẩn pET-22b(+) và cố định cộng hóa trị lên hạt latex polystyrene, tạo ra bộ Kit CATT đạt độ nhạy và đặc hiệu đồng thời $> 98%$, tương đương phương pháp ELISA và tiêm truyền chuột bạch nhưng chỉ mất 3–5 phút thực hiện ngoài hiện trường.

3. Phát hiện nào trong dữ liệu thực nghiệm mang tính bất ngờ nhất? Đó là tính tương đồng nucleotide tuyệt đối (99–100%) của chuỗi gen 18S rRNA giữa các chủng T. evansi tại 4 huyện vùng sâu tỉnh Tuyên Quang (Chiêm Hóa, Hàm Yên, Sơn Dương, Yên Sơn) với các chủng chuẩn phân lập tại Thái Lan, Philippines và Ai Cập trên NCBI GenBank, chứng minh sự ổn định di truyền cao độ của ký sinh trùng dù điều kiện địa hình bị chia cắt phức tạp.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập (Replication Protocol) chi tiết không? Quy trình được chuẩn hóa chi tiết và hoàn toàn có khả năng tái lập cao, bao gồm: chu trình nhiệt PCR khuếch đại gen, nồng độ enzym cắt giới hạn (EcoRI, SalI), thành phần gel Tricine-SDS PAGE, nồng độ cảm ứng IPTG (0,6–0,8 mM), mật độ hạt vi cầu latex, tỷ lệ chất ổn định protein và chất ức chế protease PMSF.

5. Chương trình nghiên cứu dài hạn trong 10 năm tới được định hình ra sao? Định hướng mở rộng bao gồm: chế tạo que thử nhanh sắc ký miễn dịch dạng que nhúng (Lateral Flow Strip) kháng RoTAT 1.2 chịu nhiệt độ cao, giải mã toàn bộ hệ gen (WGS) để giám sát đột biến kháng thuốc Trypamidium/Diminazene, và thử nghiệm các hợp chất nano tự nhiên (như Curcumin nano, Nerolidol nano) nhằm giảm thiểu tổn thương oxy hóa do độc tố tiên mao trùng gây ra trên gia súc.

---

Kết luận

1. Khảo sát toàn diện thực trạng dịch tễ học bệnh tiên mao trùng trên đàn trâu tại 4 huyện trọng điểm tỉnh Tuyên Quang, xác định tỷ lệ nhiễm dao động từ 15,58% đến 27,1%, chỉ rõ quy luật phát triển bùng phát theo mùa mưa gắn liền với vật môi giới ruồi trâu (Stomoxys calcitrans) và mòng (Tabanus spp.).
2. Phân lập, định danh phân tử và giải trình tự thành công gen 18S rRNA của các chủng T. evansi địa phương (Tev-CH-VN, Tev-HY-VN, Tev-SD-VN, Tev-YS-VN), chứng minh độ tương đồng di truyền 99–100% so với các chủng chuẩn quốc tế trên NCBI GenBank.
3. Ứng dụng thành công công nghệ DNA tái tổ hợp để tách dòng (vector pJET1.2/blunt) và biểu hiện tối ưu đoạn gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 (~205 bp) trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21(DE3) bằng vector pET-22b(+), kiểm chứng tính đặc hiệu miễn dịch tuyệt đối qua Tricine-SDS PAGE và Western blot.
4. Làm chủ quy trình công nghệ chế tạo Kit CATT ngưng kết hạt latex từ kháng nguyên RoTAT 1.2 tái tổ hợp; sản phẩm đạt độ nhạy và độ đặc hiệu trên 98%, đồng dương tính 98,24% so với phương pháp tiêm truyền chuột bạch, cho kết quả chẩn đoán nhanh trong 3–5 phút.
5. Chuẩn hóa và áp dụng thành công phác đồ điều trị triệt để bệnh tiên mao trùng trên diện hẹp và diện rộng bằng thuốc đặc hiệu Trypamidium Samorin kết hợp hồi sức trợ tim và cân bằng điện giải, đạt tỷ lệ khỏi bệnh 100% và an toàn tuyệt đối cho gia súc.
6. Mở ra bước tiến mới trong việc tự chủ sản xuất sinh phẩm chẩn đoán thú y công nghệ cao tại Việt Nam, mang lại giải pháp khoa học thực tiễn bảo vệ đàn gia súc 113.000 con của tỉnh Tuyên Quang, nâng cao hiệu quả kinh tế và an sinh xã hội cho người chăn nuôi vùng Trung du miền núi phía Bắc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cơ sở khoa học của đề tài 1. Bệnh tiên mao trùng ở động vật 1. Căn bệnh Bệnh tiên mao trùng - Trypanosomiasis - là bệnh do ký sinh trùng đơn bào Protozoa, lớp trùng roi Flagellata gây ra.

Có nhiều loài thuộc giống Trypanosoma như: Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma evansi, Trypanosoma congolense, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma simiae… có khả năng gây bệnh cho người và động vật (Kumar A. Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng do loài đơn bào Trypanosoma evansi (T. evansi) gây ra. Tiên mao trùng T.

evansi có hình thoi, dài 18 - 34 m. Giữa thân tiên mao trùng có một nhân, phía cuối cơ thể có một roi, roi này chạy dọc theo thân và tạo thành nhiều màng rung động, cuối cùng roi lơ lửng ở phần đầu và thành roi tự do (Nguyễn Thị Kim Lan, 2011 [12]). Cấu trúc của tiên mao trùng T. evansi (Nguồn: Desquesnes M.

Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi và thú hoang, thấy phổ biến hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo, sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi, thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch., không ký sinh ở người (Phạm Sỹ Lăng và cs. Sự lây truyền bệnh tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khỏe là nhờ các loài ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu (thuộc họ Tabanidae). Sự lây truyền này chỉ mang tính chất cơ học. Như vậy, ruồi và mòng hút máu là những vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng quan trọng.

Đây là một trong những cơ sở khoa học để xây dựng biện pháp phòng và tránh lây lan bệnh tiên mao trùng hiệu quả (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012 [13]; Baldacchino F. Phương thức truyền lây tiên mao trùng T. evansi (Nguồn: Desquesnes M. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán cầu.

evansi hiện diện tại tất cả các quốc gia có lạc đà, từ Senegal (15° Bắc) 6 đến Kenya (xích đạo), trên vành đai Glossina. evansi được tìm thấy không chỉ ở Mauritania, Morocco, Algeria, Tunisia, Libya, Ai Cập, Sudan, Eritrea và Ethiopia, mà còn ở khu vực phía bắc của Mali, Burkina Faso, Niger, Nigeria, Chad, Somalia, Kenya. Ngày nay, phân bố địa lý của bệnh liên tục từ khu vực phía bắc của châu Phi, qua Trung Đông đến khu vực Đông Nam Á. Bệnh phổ biến ở trâu, bò và ngựa các nước nhiệt đới ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ (Haridy F.

Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng đã được phát hiện thấy phổ biến ở hầu hết các vùng sinh thái khác nhau như miền núi, trung du, đồng bằng và ven biển (Phạm Sỹ Lăng và cs. Mùa phát bệnh có liên quan chặt chẽ với mùa côn trùng hoạt động, thường vào khoảng từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm (Phan Địch Lân và cs. Đặc điểm gây bệnh của T. evansi Khi ruồi, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào gia súc, tiên mao trùng xâm nhập vào da, tạo nên các vết viêm trên mặt da.

Độc tố của tiên mao trùng tác động tới bộ máy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu hoá, làm con vật ỉa chảy. Hội chứng tiêu chảy thường xảy ra khi xuất hiện tiên mao trùng trong máu con vật bệnh. Khi sống trong huyết tương vật chủ, tiên mao trùng sử dụng protein huyết tương, làm giảm áp lực keo trong máu, nước sẽ từ máu thẩm thấu qua thành mạch quản vào gian bào của tổ chức gây hiện tượng thủy thũng. Ngoài ra, khi tiên mao trùng sinh sản nhiều trong máu có thể làm tắc các mạch máu nhỏ và các mao mạch, làm tăng tính thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷ thũng chất keo vàng dưới da.

Sau khi xâm nhập vào máu ký chủ, tiên mao trùng sinh sản theo cấp số nhân. Số lượng tiên mao trùng nhiều thì lượng độc tố cũng tăng lên, tác động vào trung khu điều hòa nhiệt làm cho con vật sốt. Khi động vật sốt cao là lúc trong máu có nhiều tiên mao trùng phát triển. Theo Phạm Sỹ Lăng và cs.

(2008) [22], trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng thể hiện các triệu chứng lâm sàng chủ yếu như: sốt cao và gián đoạn, có biểu hiện rối loạn thần kinh, thủy thũng dưới da, gầy yếu, suy nhược, thiếu máu, viêm kết mạc và giác mạc mắt. Một số trâu, bò bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng màu vàng, sau 7 chuyển màu xám, có lẫn bọt và chất nhầy. Các đợt ỉa chảy tiếp theo những cơn sốt cách quãng. Trâu, bò bị bệnh mạn tính thường kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chân sau, nằm tư thế quỳ và không đi lại được.

Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn và nhai lại cho đến khi sắp chết. Triệu chứng viêm giác mạc và kết mạc mắt thấy ở hầu hết trâu, bò mắc bệnh: mắt có dử trắng hay vàng, chảy liên tục, nếu nặng thì mắt sưng, đỏ ngầu. Khi khỏi bệnh, mắt có màng trắng như cùi nhãn kéo che kín giác mạc. Con vật mắc bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy có những biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão, xoang bao tim tích nước vàng; phổi sung huyết và tụ máu từng đám; gan sưng to, nhạt màu; lách sưng, mềm nhũn và nhạt màu; hạch lâm ba sưng và tụ máu trong hạch; cơ nhão, màu nhợt nhạt, nhát cắt rỉ nước; xoang ngực và xoang bụng tích dịch màu vàng nhạt.

Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tương đối khó khăn vì căn bệnh có khi có ở mạch máu ngoại vi, có khi không. Do đó, cần phải chẩn đoán bằng nhiều phương pháp khác nhau: * Phương pháp chẩn đoán lâm sàng Biểu hiện lâm sàng của bệnh tiên mao trùng không phải lúc nào cũng phát hiện được. Chính vì vậy, việc chẩn đoán qua triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò có độ chính xác không cao. Vì vậy, ngoài chẩn đoán qua các triệu chứng lâm sàng, cần phải tiến hành các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm để có kết quả chẩn đoán chính xác.

* Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm Việc phát hiện tiên mao trùng được thực hiện trên các mẫu máu, có thể xét nghiệm các mẫu máu này bằng hình thức soi tươi, cố định, nhuộm giemsa và một số phương pháp huyết thanh học khác (Desquesnes M. Cụ thể như sau: - Phương pháp phát hiện tiên mao trùng Để phát hiện tiên mao trùng, có thể áp dụng phương pháp soi tươi máu (Direct smear); phương pháp nhuộm giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky); phương pháp tập trung tiên mao trùng. 8 - Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm Đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. Ở phương pháp này, người ta tiêm truyền máu của động vật cần chẩn đoán cho động vật thí nghiệm (thường dùng chuột nhắt trắng).

Sau đó, hàng ngày kiểm tra máu của động vật đã được tiêm truyền để phát hiện tiên mao trùng. Nếu trong máu động vật này có tiên mao trùng thì kết luận động vật cần chẩn đoán bị nhiễm bệnh và ngược lại. Theo Lê Ngọc Mỹ (1994) [26], phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là phương pháp chẩn đoán chính xác, nhưng nhược điểm của phương pháp này là khi cần chẩn đoán nhanh, với số lượng mẫu nhiều trong khoảng thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng được. - Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học Khi tiên mao trùng ký sinh, cơ thể vật chủ sản sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại tiên mao trùng.

Những phương pháp sau cho phép phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng trong máu vật chủ: Phản ứng ngưng kết trên bản nhựa (CATT/T. evansi: Card Agglutination Test for Trypanosomiasis) Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể trong máu động vật nhiễm bệnh. Phương pháp CATT có ưu điểm cho kết quả nhanh chóng, dễ thực hiện, đặc biệt có thể áp dụng trong điều kiện thực địa thiếu các dụng cụ chẩn đoán chuyên biệt. Nguyên lý của phương pháp: kháng nguyên tiên mao trùng đã được nhuộm màu sẽ kết hợp với kháng thể có trong huyết thanh của động vật nhiễm bệnh, tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh, đó là phản ứng dương tính.

Nếu động vật không nhiễm bệnh, trong máu không có kháng thể đặc hiệu, phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể không xảy ra và không có các đám kết tủa, đó là phản ứng âm tính. 9 Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slide Agglutination Test) Phương pháp ngưng kết trên phiến kính là phản ứng giữa kháng nguyên tiên mao trùng sống có sẵn, với kháng thể có trong huyết thanh của động vật nghi nhiễm. Phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành và có thể áp dụng trên diện rộng. Tuy nhiên phải thường xuyên lưu giữ giống tiên mao trùng để có tiên mao trùng sống thực hiện phản ứng này.

Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test) Phương pháp LATEX được dùng để phát hiện kháng thể có trong huyết thanh của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng. Nguyên lý: Đây là phản ứng dùng kháng nguyên gắn hạt latex, khi gặp kháng thể đặc hiệu, kháng nguyên và kháng thể sẽ kết hợp với nhau thành đám lớn mà mắt thường có thể quan sát được. Khi cho kháng nguyên trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, phản ứng ngưng kết sẽ xảy ra. Kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu.

Do mỗi cầu nối với kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn như những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng. Nhờ có hạt latex gắn vào kháng nguyên, hiện tượng ngưng kết này trở nên dễ dàng quan sát hơn. Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect Fluorescent Antibody Test) Trong nhiều trường hợp, để phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể, cần phải sử dụng một số kỹ thuật miễn dịch mới nhìn thấy được. Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT dùng kháng kháng thể đã được nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên cần chẩn đoán.

Trong phương pháp này có ba thành phần tham gia là kháng nguyên cần chẩn đoán, kháng thể đặc hiệu và kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Do đó, phương pháp này còn được gọi là phương pháp hai lớp. Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Phương pháp ELISA là một trong những phương pháp hiện đại được ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.