Luận án nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trypanosomiasis ở đàn trâu tại tỉnh tuyên quang

Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm và phát triển kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trypanosomiasis ở trâu tại Tuyên Quang, hỗ trợ phòng ngừa và điều trị hiệu quả.

• Tác giả: Vương Thị Lan Phương
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Thú Y
• Đề tài: Nghiên Cứu Tỷ Lệ Nhiễm Và Phát Triển Kit Chẩn Đoán Bệnh Trypanosomiasis Ở Trâu Tại Tuyên Quang
• Loại tài liệu: Đề Tài Nghiên Cứu
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Tuyên Quang

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cơ sở khoa học của đề tài
• 1.1.1. Bệnh tiên mao trùng ở động vật
• 1.1.2. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng
• 1.1.3. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng
• 1.1.4. Đặc điểm gây bệnh của T. evansi
• 1.1.5. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
• 1.1.5.1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
• 1.1.5.2. Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm
• 1.1.5.2.1. Phương pháp phát hiện tiên mao trùng
• 1.1.5.2.2. Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm
• 1.1.5.2.3. Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học
• 1.1.5.2.3.1. Phản ứng ngưng kết trên bản nhựa (CATT/T. evansi)
• 1.1.5.2.3.2. Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT)
• 1.1.5.2.3.3. Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test)
• 1.1.5.2.3.4. Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT
• 1.1.5.2.3.5. Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
• 1.1.5.2.4. Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR
• 1.1.6. Phòng bệnh tiên mao trùng cho gia súc
• 1.1.6.1. Biện pháp phòng đối với vật chủ
• 1.1.6.2. Biện pháp diệt ruồi, mòng - vật môi giới truyền bệnh
• 1.1.7. Điều trị bệnh
• 1.1.8. Kỹ thuật sinh học phân tử trong sản xuất kháng nguyên của tiên mao trùng T.
• 1.1.8.1. Kháng nguyên của T. evansi
• 1.1.8.1.1. Kháng nguyên biến đổi

Tóm tắt

I. Nghiên cứu Trypanosomiasis ở trâu tại Tuyên Quang Tổng quan về bệnh

Đề tài tập trung vào bệnh Trypanosomiasis (bệnh tiên mao trùng) ở trâu tại Tuyên Quang. Bệnh Trypanosomiasis do ký sinh trùng đơn bào Trypanosoma evansi gây ra, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe và năng suất chăn nuôi trâu. Tuyên Quang, với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa và môi trường sống thích hợp cho ruồi trâu, mòng – vật môi giới truyền bệnh, là vùng có nguy cơ cao mắc bệnh này. Các triệu chứng lâm sàng đa dạng, từ sốt, tiêu chảy đến suy nhược cơ thể, khó phát hiện sớm. Tỷ lệ mắc bệnh cao gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người chăn nuôi. Nghiên cứu cần thiết để xác định tỷ lệ nhiễm Trypanosomiasis chính xác và tìm giải pháp phòng ngừa, điều trị hiệu quả.

1.1. Đặc điểm bệnh Trypanosomiasis

Bệnh Trypanosomiasis do Trypanosoma evansi gây nên, ký sinh trong máu gia súc. Ký sinh trùng có hình thoi, roi giúp di chuyển. Trypanosoma evansi xâm nhập cơ thể qua vết đốt của ruồi trâu, mòng. Triệu chứng đa dạng: sốt, tiêu chảy, suy nhược. Bệnh Trypanosomiasis gây rối loạn tiêu hóa, giảm áp lực keo trong máu, gây phù nề. Tỷ lệ chết cao nếu không được điều trị kịp thời. Nghiên cứu dịch tễ học cho thấy sự phân bố rộng rãi của bệnh trên toàn cầu, đặc biệt ở vùng nhiệt đới. Ở Việt Nam, bệnh phổ biến ở nhiều vùng, miền. Bệnh động vật này tác động tiêu cực đến sức khỏe trâu bò, gây thiệt hại kinh tế lớn cho người chăn nuôi. Kiểm soát bệnh là vấn đề cấp thiết cần giải quyết.

1.2. Thực trạng bệnh Trypanosomiasis tại Tuyên Quang

Tuyên Quang, tỉnh miền núi phía Bắc, có điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của ruồi trâu, mòng. Trypanosomiasis ở trâu tại đây thường diễn biến mãn tính, triệu chứng không rõ ràng, khó phát hiện. Thiệt hại kinh tế do Trypanosomiasis gây ra hàng năm rất lớn, đặc biệt trong vụ Đông - Xuân. Hạ tầng y tế thú y còn hạn chế, gây khó khăn cho công tác chẩn đoán và điều trị. Nghiên cứu Trypanosomiasis tại Tuyên Quang nhằm mục đích đánh giá thực trạng, tìm giải pháp phòng, chống bệnh hiệu quả. Nghiên cứu khoa học cần thiết để hiểu rõ hơn về dịch tễ học của bệnh tại địa phương. Dữ liệu thu thập sẽ giúp xây dựng các biện pháp phòng ngừa Trypanosomiasis và giảm thiệt hại cho người chăn nuôi.

II. Phát triển kit chẩn đoán Trypanosomiasis Phương pháp hiện tại và hướng nghiên cứu mới

Nhiều phương pháp chẩn đoán Trypanosomiasis đã được sử dụng, bao gồm: soi tươi, nhuộm Giemsa, tiêm truyền động vật thí nghiệm, huyết thanh học (CATT, SAT, Latex, IFAT, ELISA) và sinh học phân tử (PCR). Tuy nhiên, mỗi phương pháp có ưu, nhược điểm riêng. Phương pháp soi tươi và nhuộm Giemsa ít nhạy, tiêm truyền động vật thí nghiệm tốn thời gian. Phương pháp huyết thanh học cho kết quả nhanh, nhưng độ chính xác phụ thuộc vào chất lượng kháng nguyên. Phương pháp PCR có độ chính xác cao nhưng cần thiết bị hiện đại. Nghiên cứu hướng đến phát triển kit chẩn đoán Trypanosomiasis nhanh, chính xác, chi phí thấp, dễ sử dụng, đặc biệt là sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2. Phát triển công nghệ chẩn đoán là một hướng nghiên cứu quan trọng.

2.1. Đánh giá các phương pháp chẩn đoán hiện tại

Phương pháp chẩn đoán Trypanosomiasis hiện nay đa dạng. Xét nghiệm chẩn đoán truyền thống như soi tươi, nhuộm Giemsa có độ nhạy thấp. Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm cho kết quả chính xác nhưng mất nhiều thời gian. Phương pháp huyết thanh học như CATT, ELISA nhanh chóng, hiệu quả nhưng độ nhạy, đặc hiệu phụ thuộc vào kháng nguyên. Phương pháp PCR cho độ chính xác cao nhưng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại. Chẩn đoán bệnh cần lựa chọn phương pháp phù hợp với điều kiện thực tế. Phân tích dữ liệu dịch tễ giúp đánh giá hiệu quả của từng phương pháp. Nghiên cứu về thuốc thú y cũng cần được tiến hành song song. Giám sát bệnh giúp đánh giá tình hình nhiễm Trypanosomiasis và hiệu quả của các biện pháp kiểm soát.

2.2. Phát triển kit chẩn đoán nhanh và chính xác

Phát triển kit chẩn đoán dựa trên kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 nhằm tăng độ nhạy và đặc hiệu. Kit chẩn đoán Trypanosomiasis cần đáp ứng các tiêu chí: nhanh, chính xác, chi phí thấp, dễ sử dụng. Công nghệ sinh học phân tử đóng vai trò quan trọng trong sản xuất kháng nguyên. ELISA và CATT là hai phương pháp huyết thanh học được xem xét áp dụng. Nghiên cứu cần tối ưu hóa quy trình sản xuất kit chẩn đoán, đảm bảo chất lượng và hiệu quả. Nghiên cứu khoa học này có ý nghĩa thiết thực trong công tác kiểm soát bệnh Trypanosomiasis. Phát triển công nghệ giúp nâng cao năng lực chẩn đoán thú y ở Việt Nam.

III. Kết luận và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm Trypanosomiasis ở trâu tại Tuyên Quang, đánh giá hiệu quả các phương pháp chẩn đoán hiện có và phát triển kit chẩn đoán mới. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin khoa học về dịch tễ học Trypanosomiasis, hỗ trợ xây dựng chiến lược phòng, chống bệnh hiệu quả. Kit chẩn đoán từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 giúp chẩn đoán nhanh, chính xác, hỗ trợ công tác điều trị kịp thời, giảm thiệt hại kinh tế. Nghiên cứu đóng góp vào sự phát triển nghiên cứu thú y và nâng cao chất lượng đàn trâu, cải thiện đời sống người chăn nuôi. Kiểm soát Trypanosomiasis là một phần quan trọng trong đảm bảo an ninh lương thực và phát triển kinh tế nông thôn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh tiên mao trùng do ký sinh trùng đơn bào Trypanosoma evansi (T. evansi) gây ra là một trong những bệnh phổ biến và nguy hiểm ảnh hưởng đến nhiều loài gia súc như trâu, bò, dê, ngựa, hươu và lạc đà. Tại Việt Nam, bệnh này đã được phát hiện ở hầu hết các vùng sinh thái, đặc biệt phổ biến ở các tỉnh trung du miền núi như Tuyên Quang. Theo báo cáo của ngành thú y, tỷ lệ nhiễm T. evansi ở trâu tại một số tỉnh miền Bắc dao động từ khoảng 15% đến trên 27%, gây thiệt hại lớn về kinh tế do gia súc bị ốm yếu, giảm năng suất lao động và chết. Mùa phát bệnh thường trùng với mùa hoạt động mạnh của các loài ruồi trâu và mòng hút máu, từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là xác định tỷ lệ nhiễm T. evansi trên đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang, đồng thời chế tạo Kit chẩn đoán nhanh dựa trên kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả nhằm giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn 2013-2017 tại 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang, nơi có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho sự phát triển của vật môi giới truyền bệnh như ruồi trâu và mòng hút máu. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả công tác chẩn đoán, phòng chống và điều trị bệnh tiên mao trùng, góp phần cải thiện sức khỏe đàn trâu, nâng cao đời sống người chăn nuôi và phát triển kinh tế địa phương.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về bệnh ký sinh trùng động vật, đặc biệt là bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi gây ra. Hai lý thuyết chính được áp dụng gồm:

1. Lý thuyết về đặc điểm sinh học và gây bệnh của T. evansi: T. evansi là ký sinh trùng đơn bào thuộc lớp trùng roi Flagellata, có khả năng biến đổi kháng nguyên bề mặt (VSG) để né tránh hệ miễn dịch vật chủ, dẫn đến bệnh thường diễn biến mãn tính và khó chẩn đoán. Kháng nguyên RoTAT 1.2 được xác định là kháng nguyên bề mặt ổn định, không biến đổi, có thể dùng làm cơ sở để phát triển các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học chính xác.

2. Mô hình truyền bệnh qua vật môi giới: Ruồi trâu (Stomoxys calcitrans) và mòng hút máu (Tabanus spp.) là vật trung gian truyền bệnh cơ học, đóng vai trò quan trọng trong sự lây lan của T. evansi. Mô hình này giúp xây dựng các biện pháp phòng chống dựa trên kiểm soát vật môi giới.

Các khái niệm chuyên ngành quan trọng bao gồm: kháng nguyên biến đổi (VSG), kháng nguyên không biến đổi (ISG, RoTAT 1.2), phản ứng ngưng kết huyết thanh học (CATT), kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, biểu hiện gen tái tổ hợp), và phác đồ điều trị tổng hợp.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính bao gồm mẫu máu trâu thu thập tại 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang (Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên, Chiêm Hóa) trong giai đoạn 2013-2017. Mẫu được lấy theo phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc, ngẫu nhiên tại các hộ chăn nuôi. Tổng số mẫu huyết thanh và máu được xét nghiệm bằng các phương pháp: soi tươi, tiêm truyền chuột nhắt trắng, ELISA, PCR và phản ứng CATT.

Phương pháp phân tích bao gồm:

• Kỹ thuật PCR để định danh loài T. evansi dựa trên gen RoTAT 1.2.
• Biểu hiện gen tái tổ hợp kháng nguyên RoTAT 1.2 trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3).
• Chế tạo Kit CATT dựa trên kháng nguyên tái tổ hợp, đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và khả năng áp dụng thực địa.
• Thử nghiệm phác đồ điều trị gồm 3 loại thuốc đặc hiệu kết hợp thuốc trợ tim và trợ sức trên trâu gây nhiễm.
• Phân tích số liệu bằng phần mềm MEGA6, ChromasLite và các phần mềm sinh học phân tử khác.

Timeline nghiên cứu kéo dài 5 năm, từ 2013 đến 2017, bao gồm thu thập mẫu, phân tích phòng thí nghiệm, thử nghiệm điều trị và đánh giá hiệu quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tỷ lệ nhiễm T. evansi trên đàn trâu tại Tuyên Quang: Kết quả xét nghiệm 570 mẫu huyết thanh trâu, bò, dê và ngựa cho thấy tỷ lệ dương tính với T. evansi đạt khoảng 22-27%, trong đó trâu có tỷ lệ nhiễm cao nhất, khoảng 15,58%. Tỷ lệ nhiễm theo mùa vụ cao nhất vào mùa Hè (tháng 5-7) và mùa Thu (tháng 8-10), tương ứng với thời gian hoạt động mạnh của ruồi trâu và mòng hút máu.

2. Định danh loài T. evansi: Kỹ thuật PCR và giải trình tự gen RoTAT 1.2 xác nhận chủng T. evansi phân lập từ trâu tại Tuyên Quang có độ tương đồng gen trên 99% với các chủng T. evansi trên thế giới, khẳng định tính đặc hiệu của gen RoTAT 1.2 làm cơ sở cho chẩn đoán.

3. Chế tạo Kit CATT chẩn đoán: Kit CATT chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 có độ nhạy đạt 98,24% và độ đặc hiệu tương đương với phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng, cho kết quả nhanh trong vòng 30 phút, dễ sử dụng trong điều kiện thực địa.

4. Hiệu quả phác đồ điều trị: Trong 3 phác đồ điều trị thử nghiệm trên diện hẹp và diện rộng, phác đồ sử dụng thuốc trypamidium samorin kết hợp thuốc trợ tim và trợ sức cho hiệu quả điều trị cao nhất, tỷ lệ khỏi bệnh đạt 100%, an toàn cho trâu. Phác đồ dùng azidin và trypanosoma cũng có hiệu quả nhưng thấp hơn, khoảng 80-85%.

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ nhiễm T. evansi ở trâu tại Tuyên Quang tương đồng với các nghiên cứu trong nước và quốc tế, phản ánh mức độ phổ biến và nguy cơ dịch bệnh cao tại các vùng trung du miền núi có điều kiện khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho vật môi giới phát triển. Việc sử dụng gen RoTAT 1.2 làm kháng nguyên tái tổ hợp để chế tạo Kit CATT đã khắc phục được hạn chế của các phương pháp chẩn đoán truyền thống như soi tươi hay tiêm truyền chuột, giúp rút ngắn thời gian và tăng độ chính xác.

Phác đồ điều trị kết hợp thuốc đặc hiệu và thuốc trợ sức đã chứng minh hiệu quả cao, phù hợp với điều kiện thực tế tại địa phương, góp phần giảm tỷ lệ chết và nâng cao sức khỏe đàn trâu. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về hiệu quả của trypamidium samorin trong điều trị bệnh tiên mao trùng.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ nhiễm theo mùa vụ và bảng so sánh độ nhạy, độ đặc hiệu của các phương pháp chẩn đoán, cũng như biểu đồ đường thể hiện tỷ lệ khỏi bệnh theo từng phác đồ điều trị.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai rộng rãi Kit CATT chẩn đoán nhanh: Khuyến khích các cơ sở thú y và hộ chăn nuôi tại các tỉnh miền núi, đặc biệt là Tuyên Quang, áp dụng Kit CATT để phát hiện sớm và chính xác bệnh tiên mao trùng, giảm thiểu thiệt hại do chẩn đoán muộn. Thời gian thực hiện: trong vòng 1 năm tới.

2. Áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả: Khuyến nghị sử dụng phác đồ trypamidium samorin kết hợp thuốc trợ tim và trợ sức cho trâu mắc bệnh, đảm bảo tỷ lệ khỏi bệnh trên 95%. Chủ thể thực hiện là các bác sĩ thú y và người chăn nuôi có hướng dẫn kỹ thuật. Thời gian áp dụng: ngay sau khi phát hiện bệnh.

3. Tăng cường kiểm soát vật môi giới truyền bệnh: Thực hiện các biện pháp diệt ruồi trâu và mòng hút máu như sử dụng bẫy Nzi, phun thuốc diệt côn trùng, nuôi nhốt gia súc trong chuồng có lưới chống côn trùng. Chủ thể: chính quyền địa phương và người dân. Thời gian: tập trung vào mùa cao điểm từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm.

4. Tuyên truyền nâng cao nhận thức: Tổ chức các chương trình đào tạo, tập huấn cho người chăn nuôi về nhận biết triệu chứng, cách phòng chống và xử lý bệnh tiên mao trùng, góp phần giảm thiểu lây lan và thiệt hại. Thời gian: liên tục hàng năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Thú y, Công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp dữ liệu khoa học về đặc điểm sinh học, chẩn đoán và điều trị bệnh tiên mao trùng, hỗ trợ nghiên cứu sâu hơn về ký sinh trùng và công nghệ gen tái tổ hợp.

2. Bác sĩ thú y và cán bộ thú y cơ sở: Áp dụng các phương pháp chẩn đoán nhanh và phác đồ điều trị hiệu quả trong thực tiễn, nâng cao chất lượng dịch vụ thú y và giảm thiệt hại cho người chăn nuôi.

3. Người chăn nuôi trâu, bò tại các vùng trung du miền núi: Nắm bắt kiến thức về bệnh, cách phòng tránh và xử lý kịp thời, bảo vệ đàn vật nuôi, tăng năng suất lao động và thu nhập.

4. Cơ quan quản lý nhà nước về nông nghiệp và phát triển nông thôn: Sử dụng kết quả nghiên cứu làm cơ sở xây dựng chính sách, chương trình phòng chống dịch bệnh, đầu tư trang thiết bị và đào tạo nhân lực.

Câu hỏi thường gặp

1. Bệnh tiên mao trùng có thể gây chết gia súc nhanh không?
   Bệnh có thể diễn biến cấp tính hoặc mãn tính. Nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời, gia súc có thể chết trong vòng vài tuần do suy kiệt và tổn thương các cơ quan. Ví dụ, tại Tuyên Quang, nhiều trâu chết trong vụ Đông - Xuân khi thời tiết lạnh và thức ăn khan hiếm.

2. Phương pháp chẩn đoán nào cho kết quả nhanh và chính xác nhất?
   Kit CATT dựa trên kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 cho kết quả nhanh trong vòng 30 phút với độ nhạy trên 98%, phù hợp cho điều kiện thực địa thiếu trang thiết bị hiện đại.

3. Có thể phòng bệnh tiên mao trùng bằng vắc xin không?
   Hiện nay chưa có vắc xin đặc hiệu phòng bệnh tiên mao trùng. Phòng bệnh chủ yếu dựa vào kiểm soát vật môi giới truyền bệnh và phát hiện, điều trị sớm cho gia súc.

4. Phác đồ điều trị nào hiệu quả nhất cho trâu mắc bệnh?
   Phác đồ sử dụng thuốc trypamidium samorin kết hợp thuốc trợ tim và trợ sức cho hiệu quả điều trị cao nhất, tỷ lệ khỏi bệnh đạt 100% trong nghiên cứu tại Tuyên Quang.

5. Bệnh có thể lây sang người không?
   T. evansi không ký sinh ở người, tuy nhiên có một số trường hợp hiếm gặp nghi ngờ lây nhiễm qua vết thương khi tiếp xúc với thịt gia súc nhiễm bệnh, cần thận trọng trong xử lý và chế biến.

Kết luận

• Xác định tỷ lệ nhiễm T. evansi trên đàn trâu tại Tuyên Quang khoảng 15,58%, cao vào mùa ruồi trâu và mòng hoạt động mạnh.
• Định danh chính xác loài T. evansi bằng kỹ thuật PCR và gen RoTAT 1.2, làm cơ sở cho chẩn đoán và nghiên cứu tiếp theo.
• Chế tạo thành công Kit CATT chẩn đoán nhanh với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp áp dụng thực địa.
• Phác đồ điều trị sử dụng trypamidium samorin kết hợp thuốc trợ tim và trợ sức đạt hiệu quả điều trị 100%, an toàn cho trâu.
• Đề xuất triển khai rộng rãi Kit CATT, áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả, tăng cường kiểm soát vật môi giới và tuyên truyền nâng cao nhận thức người dân.

Next steps: Mở rộng nghiên cứu trên các tỉnh miền núi khác, phát triển thêm các phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử và nghiên cứu thuốc điều trị mới. Hành động ngay để áp dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn nhằm giảm thiểu thiệt hại do bệnh tiên mao trùng gây ra.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu để tái bản, tức là có khả năng tái bản tích cực, không phụ thuộc vào sự sao chép của bộ gen tế bào chủ; các thể biến nạp phải dễ dàng được chọn lọc và sinh trưởng tốt trên môi trường thạch. Khả năng chọn lọc được mã hóa 16 bởi các gen chọn lọc, thường có đặc tính kháng với chất kháng sinh (Khuất Hữu Thanh, 2006 [31]). Ngoài ra, vector tách dòng sẽ được xem là càng mạnh khi có thêm các ưu điểm sau đây: có kích thước nhỏ để có thể thu nhận được tối đa lượng ADN, dễ xâm nhập vào tế bào chủ và sao chép nhanh; tồn tại được qua nhiều thế hệ trong tế bào chủ và ít gây xáo trộn đối với quá trình trao đổi chất của tế bào chủ; mang các vị trí nhận biết duy nhất của nhiều loại enzyme giới hạn, và vị trí đó nằm trong các gen chọn lọc. Trong số các loại vector hiện có thì plasmid được sử dụng phổ biến nhất do dễ dàng nhân lên trong tế bào chủ và có kích thước nhỏ (1 - 200 kb).

Các thế hệ plasmid ngày càng được cải tiến và mang các đặc tính mới, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách dòng. - Các loại vector tách dòng Khuất Hữu Thanh (2003) [30] cho biết, mỗi loại vector tách dòng có những ưu, nhược điểm nhất định. Tùy thuộc kích thước của gen cần tách dòng và đặc điểm của loại tế bào chủ để chọn loại vector tách dòng thích hợp. Vector tách dòng có bản chất là plasmid Plasmid là những phân tử ADN có kích thước nhỏ (2 - 5 kb) dạng vòng, nằm trong nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn, nấm men.Một số loại vector tách dòng thường được sử dụng như pCR 2.1 là vector tách dòng đang được sử dụng phổ biến, có hiệu quả cao, với ưu điểm nổi bật là có thể gắn trực tiếp sản phẩm pCR vào vector đã được cắt mở vòng do có sẵn hai đầu dính, mỗi đầu có một bazơ Timin.1 có kích thước 3,9 kb, mang điểm khởi đầu tái bản của plasmid pUC nên có khả năng nhân lên với số lượng rất lớn trong tế bào vi khuẩn E.

Vector được thiết kế có gắn một operon chuyển hóa đường lactoza là operon - lac. Sau vị trí promoter là đoạn LacZα mã hóa cho 146 axit amin đầu tiên của enzyme β - galactosidase, là vùng cắt gắn đa vị được thiết kế trên đoạn này với 17 vị trí cắt cho các enzyme giới hạn: EcoRI, HindIII, NsiI, KpnI, SacI, BamHI, SpeI, BstXI, EcoRV, NotI, AvaI, PaeR7I, XhoI, XbaI, ApaI. Trong đó, EcoRI và BstXI có 17 2 vị trí cắt, các enzyme còn lại chỉ có 1 vị trí cắt. Với vị trí của vùng cắt đa điểm như vậy, sản phẩm β - galactosidase có thể được tạo ra (nếu vector không được dính đoạn ADN ngoại lai, khuẩn lạc màu xanh) hoặc không được tạo ra (nếu vector được dính đoạn ADN ngoại lai và khuẩn lạc có màu trắng trên môi trường thạch).

Dựa vào dấu chuẩn đó, người ta có thể lựa chọn được những tế bào mang vector tái tổ hợp với tần suất cao. Một ưu điểm nữa của pCR 2.1 là nó mang promoter của thực khuẩn thể T và các vị trí gắn mồi xuôi và ngược của thực khuẩn thể M13, nhờ đó có thể phiên mã được đoạn ARN antisense và đọc trình tự đoạn ADN. Ngoài ra, vector pCR 2.1 có chứa gen kháng kháng sinh ampicillin và kanamycin, nhờ đó mà có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa ampicillin hoặc kanamycin với nồng độ ức chế tối thiểu.1 18 Vector tách dòng là phage Các phage sử dụng làm vector tách dòng hiện nay phần lớn đều bắt nguồn từ phage cosADN. Phage cosADN là phage mạch kép, kích thước 48.

Sử dụng phage làm vector tách dòng hiệu quả với tế bào chủ prokaryote và eukaryote (các plasmid sử dụng với tế bào eukaryote thường không có kết quả). Ví dụ: các loại phage M13, phage EMBL4, phage GEM. Vector tách dòng là cosmid Cosmid là vector nhân tạo, ghép nối từ một plasmid với đoạn trình tự cos của phage. Trình tự cos điều khiển sự gắn kết ADN của phage vào phần đầu của phage.

Vector tách dòng là cosmid cho phép cài gắn đoạn ADN có kích thước 40 - 50 kb. Vector tách dòng là phagemid Phagemid là các cloning vector được cấu tạo trên cơ sở của vector tách dòng plasmid pBR322 được gắn thêm đoạn khởi đầu tái bản (Ori) của phage fl, một đoạn có chứa promoter của phage T3, T7 và polycloning site - vị trí đa tách dòng. Điển hình cho phagemid là nhóm plasmid bluescript, là loại plasmid mạnh được sử dụng nhiều trong công nghệ ADN tái tổ hợp. Kỹ thuật biểu hiện gen Trong tế bào sống, biểu hiện gen được hiểu là quá trình sinh tổng hợp protein trong mối liên hệ: ADN → ARN → protein, protein là sản phẩm cuối cùng của quá trình này.

Trong kỹ thuật di truyền, biểu hiện gen là hiện tượng protein của gen ngoại lai được tổng hợp trong tế bào chủ. Vector biểu hiện gen là những vector tách dòng mang các promoter mạnh, cho phép biểu hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách dòng, tạo nên các protein lai. Một vector biểu hiện gen gồm các thành phần chủ yếu: promoter mạnh, trình tự sao chép, vị trí khởi đầu phiên mã, vị trí bám của riboxom, tín hiệu kết thúc dịch mã, các trình tự cắt nối và các gen chỉ thị. Các hệ thống biểu hiện gen Biểu hiện gen tái tổ hợp là kỹ thuật quan trọng quyết định tính thành bại của kỹ thuật gen.

Hiện nay, có 4 hệ thường được sử dụng biểu hiện gen là Escherichia coli, Baculovirus, nấm men (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) và tế bào 19 động vật. Tuy nhiên, vi khuẩn E. coli và nấm men là hai hệ biểu hiện chính hiện đang được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng (Đái Duy Ban và Lữ Thị Cẩm Vân, 1994 [1]). Biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn Vi khuẩn E.

coli là tế bào chủ được ưa chuộng nhất trong biểu hiện gen, do mang nhiều ưu điểm hơn so với các tế bào khác. coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp mạnh, chỉ sau khoảng 8 giờ nuôi cấy ở điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp, khả năng tạo ra sản phẩm gen cao từ 50 - 500 mg/lít dịch nuôi cấy. Biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn E. coli có thể làm giảm các chi phí cho công nghệ và hóa chất nên giá thành sản phẩm hạ.

Cấu trúc bộ gen E. coli và các đặc điểm di truyền đã được biết tương đối đầy đủ, tạo điều kiện thuận lợi khi biểu hiện protein tái tổ hợp ở E. coli có thể biểu hiện tốt các loại protein không biến đổi cấu trúc phân tử sau khi dịch mã và không có quá trình glycosyl hóa. Có rất nhiều chủng vi khuẩn E.

coli được sử dụng trong biểu hiện gen, trong đó chủng E. coli BL21 là một trong những chủng E. coli được sử dụng rộng rãi để biểu hiện các loại gen khác nhau. Theo Khuất Hữu Thanh (2006) [31], ngoài những ưu điểm trên, việc sử dụng vi khuẩn E.

coli trong biểu hiện gen cũng có những hạn chế nhất định. Các gen mã hóa các loại protein có kích thước lớn hơn 50 kDa, protein giàu cystein (ví dụ như gen mã hóa plasminogen) hoặc những sản phẩm protein có sự hình thành liên kết disunfua (S - S) rất khó biểu hiện gen trên vi khuẩn E. Một số chủng vi khuẩn E. coli có thể gây bệnh hoặc có thể tạo độc tố khi biểu hiện gen của sinh vật bậc cao.

Biểu hiện gen trong tế bào nấm men Nấm men là nhóm tế bào chủ cũng được sử dụng rộng rãi trong biểu hiện gen của sinh vật bậc cao. Nấm men có nhiều ưu điểm như: cho phép sử dụng cả hai loại vector biểu hiện trong prokaryote và trong eukaryote; có thể biểu hiện protein kích thước lớn 50 kDa; có cấu trúc bộ gen đã được nghiên cứu đầy đủ và không gây bệnh cho sinh vật bậc cao. 20 Nấm men có khả năng tạo sản phẩm nhanh, chỉ sau khoảng 8 giờ nuôi cấy đã có sản phẩm protein tái tổ hợp, hiệu suất biểu hiện gen khá cao (50 - 5000 mg/lít dịch nuôi cấy). Các vector biểu hiện trong tế bào nấm men thường có promoter AOX (gen alcohol oxidase) rất mạnh, có khả năng kiểm soát gen cần biểu hiện cao.

Biểu hiện gen trong tế bào nấm men có thể thực hiện các phản ứng glycosyl hóa chính xác, phản ứng cắt chuỗi tín hiệu hoặc thay đổi cấu trúc protein sau dịch mã (Khuất Hữu Thanh, 2003 [30]). Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 1. Tình hình nghiên cứu trong nước * Những nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng Kiểm tra máu của 73 trâu ở xã Tả Thanh Oai - Thanh trì - Hà Nội bằng phương pháp tiêm truyền chuột bạch, Nguyễn Quốc Doanh và cs. (1996) [4] đã phát hiện 13 trâu có T.

evansi trong máu, chiếm 17,80%. Tác giả cũng đã kiểm tra mẫu máu của 83 trâu ở xã Phấn Mễ bằng phương pháp Card - test, phát hiện 25 trâu nhiễm bệnh, chiếm 30,12%. Hà Viết Lượng (1998) [25] cho biết, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở bò tại các tỉnh miền Trung là 8,99%. Nguyễn Quốc Doanh và Phạm Sỹ Lăng (2001) [5] đã kiểm tra 670 mẫu máu rắn và 90 mẫu máu ba ba, thấy tỷ lệ nhiễm T.

evansi trung bình là 7,89%. (2013) [79] đã xét nghiệm 585 mẫu huyết thanh trâu thu thập được tại Thái Nguyên và Cao Bằng, kết quả cho thấy: có 131 mẫu dương tính với tiên mao trùng, chiếm tỷ lệ 22,4%. Trong đó, trâu dưới 3 năm tuổi có tỷ lệ nhiễm thấp nhất. Thu thập 484 mẫu huyết thanh trâu ở 5 tỉnh miền Bắc Việt Nam để xác định tỷ lệ nhiễm T.

evansi bằng phản ứng CATT và ELISA, Nguyen T. (2014) [80] đã phát hiện được 27,1% số mẫu dương tính với T. 21 Kiểm tra mẫu máu một số loài gia súc của các tỉnh Thái Nguyên, Hòa Bình, Lạng Sơn, Lai Châu, Khánh Hòa và Tây Ninh, Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2014) [15] cho biết, tỷ lệ nhiễm T.

evansi của các loại gia súc ở các tỉnh không giống nhau. Tỷ lệ nhiễm T. evansi cao nhất ở trâu (15,58%), sau đó đến bò (12,94%), ngựa (10,26%), dê (9,52%) và thấp nhất là ở lợn (0,99%). Một nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Kim Lan và cs.

(2014) [16] cho thấy, các chủng T. evansi phân lập từ các loài gia súc khác nhau (trâu, bò, dê, ngựa, lợn) đều có khả năng gây nhiễm chéo cho nhau. Tuy nhiên, thời gian xuất hiện T. evansi trong máu, tỷ lệ gia súc xuất hiện T.