Tổng quan luận án

Bệnh lở mồm long móng (LMLM - Foot and Mouth Disease) là bệnh truyền nhiễm xuyên biên giới nguy hiểm ở động vật móng guốc chẵn như trâu, bò, lợn, dê, cừu, hươu và nai. Theo Tổ chức Thú y Thế giới (OIE), bệnh gây suy giảm nghiêm trọng năng suất chăn nuôi: làm sảy thai khoảng 25% ở động vật có chửa, giảm 25% sản lượng thịt, 50% sản lượng sữa và 25% sản lượng lông ở cừu. Virus gây bệnh LMLM có tính biến chủng cao, đòi hỏi vaccine phải có sự tương đồng kháng nguyên cao với chủng virus lưu hành ngoài thực địa. Các loại vaccine vô hoạt truyền thống hiện đang sử dụng vẫn bộc lộ những nhược điểm về an toàn sinh học (nguy cơ thoát virus sống từ cơ sở sản xuất), yêu cầu bảo quản nghiêm ngặt bằng dây chuyền lạnh, và khó khăn trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch bảo hộ phổ rộng, lâu dài.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là tại Việt Nam, dù đã có doanh nghiệp (như Công ty TNHH MTV AVAC thuộc Tổng công ty RTD) sản xuất vaccine vô hoạt từ chủng virus thực địa (AVAC – V6 FMD Emulsion type O), nhưng chưa có công trình nào nghiên cứu ứng dụng công nghệ hạt giả virus (Virus-Like Particles - VLP) trong hệ biểu hiện baculovirus/tế bào côn trùng nhằm định hướng phát triển vaccine LMLM thế hệ mới vừa an toàn sinh học, vừa có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch cao.

Mục tiêu nghiên cứu

  1. Tạo được hạt giả của virus LMLM (VLP-LMLM) type O tại Việt Nam trên hệ biểu hiện baculovirus/tế bào côn trùng.
  2. Thử nghiệm VLP-LMLM trên động vật thí nghiệm (chuột lang và bê) để đánh giá khả năng sinh kháng thể đặc hiệu của VLP-LMLM type O.
  3. Xác định liều tiêm phù hợp và hiệu giá kháng thể đạt được cao nhất của chế phẩm VLP-LMLM.

Câu hỏi và nội dung nghiên cứu

Luận án thực hiện 4 nội dung nghiên cứu chính:

  1. Phân lập các gen cấu trúc $VP0$, $VP1\text{-}2A$, $VP3$ mã hóa protein vỏ của virus LMLM type O tại Việt Nam.
  2. Tối ưu hóa cấu trúc gen để tạo hai cụm gen $VP1\text{-}2A\text{-}VP3$ và $VP0$ phù hợp cho biểu hiện trong hệ thống baculovirus/tế bào côn trùng; thiết kế vector biểu hiện tái tổ hợp mang hai cụm gen này thông qua vector chuyển pFastBac™ Dual và tạo bacmid tái tổ hợp trong tế bào Escherichia coli DH10Bac.
  3. Nhiễm và biểu hiện các gen $VP1\text{-}2A\text{-}VP3$ và $VP0$ trong tế bào côn trùng để tạo hạt giả virus VLP-LMLM, tối ưu hóa các thông số nuôi cấy và tạo hạt.
  4. Thử nghiệm đánh giá tính an toàn, khả năng sinh miễn dịch và hiệu giá kháng thể của VLP-LMLM trên chuột lang và bê.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Các gen cấu trúc mã hóa vỏ capsid ($VP0$, $VP1$, $VP3$ và đoạn mã hóa peptide $2A$) của virus LMLM serotype O phân lập tại Việt Nam; hệ biểu hiện tái tổ hợp gồm vector chuyển pFastBac™ Dual, chủng vi khuẩn E. coli DH10Bac, hệ tế bào côn trùng (Spodoptera frugiperda Sf9, Sf21); động vật thí nghiệm gồm chuột lang và bê.
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu phân tích dịch tễ học và thu thập chủng virus LMLM giai đoạn 2006–2018 tại Việt Nam; các thực nghiệm tạo dòng, biểu hiện, tinh chế và đánh giá miễn dịch được triển khai tại Viện Công nghệ sinh học và Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, hoàn thành năm 2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng hợp và hệ thống hóa các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến virus LMLM và công nghệ VLP:

  • Đặc điểm sinh học và dịch tễ học virus LMLM: Luận án trích dẫn các tài liệu của FAO (2018), OIE (2007, 2012, 2018) và WAHIS/ARAHIS về tình hình bùng phát dịch bệnh. Giai đoạn 2007–2015 ghi nhận 4.961 ổ dịch tại Đông Nam Á (Cambodia, Lào, Malaysia, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam), trong đó serotype O chiếm tỷ lệ cao nhất (77,9%), kế đến là serotype A (19,8%) (Windsor, 2017; Muroga và cs., 2012). Tại Việt Nam, các nghiên cứu dịch tễ của Cục Thú y (2016, 2017), Gleeson (2002), Le và cs. (2010, 2012), Nguyen Van Hoang và cs. chỉ ra sự lưu hành đồng thời của các serotype O, A và Asia1, trong đó serotype O gây ra phần lớn các đợt dịch lớn.
  • Cấu trúc bộ gen và protein capsid: Virus LMLM thuộc chi Aphthovirus, họ Picornaviridae, mang bộ gen RNA đơn dương kích thước khoảng 8,5 kb (Bachrach, 1968; Fry và cs., 2005; Martinez-Salas & Belsham, 2017). Khung đọc mở duy nhất mã hóa polyprotein được phân cắt bởi các protease thành $L^{pro}$, $P1\text{-}2A$, $P2$ và $P3$. Polyprotein cấu trúc $P1\text{-}2A$ được protease $3C^{pro}$ phân cắt thành $VP0$, $VP3$ và $VP1$. Trong quá trình lắp ráp vỏ capsid, $VP0$ tiếp tục được cắt thành $VP4$ (nằm bên trong) và $VP2$ (bộc lộ bên ngoài cùng $VP1$, $VP3$) (Belsham, 1991, 2005; Jackson và cs., 1997). Vùng thòng lọng G-H trên $VP1$ chứa motif Arg-Gly-Asp (RGD) liên kết thụ thể integrin tế bào chủ (Fox và cs., 1989).
  • Phương pháp chẩn đoán và nguyên lý DIVA: Tổng kết các phương pháp chẩn đoán từ phản ứng trung hòa virus (VNT), kết hợp bổ thể (CFT) đến ELISA (Roeder và Le Blanc Smith, 1987; Ferris và cs.; Morioka và cs., 2009) và RT-PCR/real-time RT-PCR (Meyer và cs.; Rodriguez và cs.; Reid và cs., 2002, 2003; Callahan và cs.). Luận án nhấn mạnh nguyên lý phân biệt động vật nhiễm tự nhiên và động vật tiêm phòng (DIVA) dựa trên việc phát hiện kháng thể kháng các protein phi cấu trúc (NSP như $3ABC$, $2C$) (Bergmann và cs., 2000; Sørensen và cs., 1998; Brocchi và cs., 2006).
  • Lịch sử và các dạng vaccine LMLM: Điểm lại từ vaccine vô hoạt phát triển trên nuôi cấy mô lưỡi bò (Frenkel) và tế bào BHK-21 (Capstick và cs., 1965), sử dụng chất bất hoạt binary ethylenimine (BEI) (Bahnemann, 1987) và chất bổ trợ dầu khoáng; đến các dạng vaccine tiểu đơn vị protein tái tổ hợp $VP1$ (Laporte, 1969; Bachrach và cs.; Kleid và cs.), vaccine peptide tổng hợp vùng G-H loop (Bittle và cs., 1982; Taboga và cs., 1997), và vaccine DNA (Sanz-Parra và cs., 1999; Lee và cs., 2012).
  • Công nghệ hạt giả virus (VLP): Luận án phân tích cơ sở sinh học của VLP - cấu trúc nano đa phân tự lắp ráp từ protein vỏ không chứa vật liệu di truyền, an toàn và kích thích mạnh cả miễn dịch dịch thể (tế bào B qua thụ thể BCR) lẫn miễn dịch qua trung gian tế bào (tế bào T qua tương tác tế bào tua gai DC và MHC lớp I/II) (Bachmann & Zinkernagel, 1997; Fifis và cs.; Lenz và cs., 2001; Kushnir và cs., 2012; Zdanowicz và cs., 2016). Các vaccine VLP thương mại thành công như vaccine viêm gan B (Recombivax, Engerix-B) và vaccine HPV (Gardasil, Cervarix) chứng minh tính khả thi của công nghệ này.

Khoảng trống nghiên cứu được lựa chọn: Khắc phục hạn chế của việc nuôi cấy virus độc lực sống trong sản xuất vaccine vô hoạt và tính sinh miễn dịch yếu của vaccine peptide đơn phân, luận án lựa chọn hướng đi biểu hiện đồng thời các gen cấu trúc $VP0$, $VP1\text{-}2A$, $VP3$ của chủng virus LMLM type O thực địa Việt Nam trong hệ biểu hiện baculovirus/tế bào côn trùng để tạo hạt VLP đa phân hoàn chỉnh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và nguyên lý tiếp cận

Nghiên cứu dựa trên nguyên lý sinh học phân tử về sự tự lắp ráp (self-assembly) của các protein capsid virus Picornavirus khi được biểu hiện đồng thời trong tế bào nhân chuẩn. Bằng cách sử dụng protease $2A$ nối giữa $VP1$ và $VP3$, chuỗi polyprotein được phân cắt chính xác ở mức độ nội bào thành các protein đơn phân $VP0$, $VP1$ và $VP3$, từ đó tương tác tạo thành các phức hợp protomer ($5S$), pentamer ($12S$) và lắp ráp thành cấu trúc hạt rỗng VLP ($75S$) có hình thái và tính kháng nguyên tương tự capsid virus tự nhiên ($146S$) nhưng không chứa RNA hệ gen.

Vật liệu và hóa chất nghiên cứu

  • Mẫu bệnh phẩm virus LMLM type O thu thập từ thực địa tại Việt Nam đã qua giám định.
  • Vector dòng hóa và chuyển gen: vector pFastBac™ Dual (mang hai promoter mạnh là polyhedrin - polh và p10).
  • Dòng vi khuẩn chủ: E. coli DH5α, E. coli DH10Bac (chứa bacmid bMON14272 và plasmid trợ thủ pMON7124).
  • Dòng tế bào côn trùng: Spodoptera frugiperda Sf9 và Sf21 nuôi cấy trong môi trường chuyên dụng.
  • Động vật thực nghiệm: Chuột lang khỏe mạnh, bê sạch bệnh chưa có kháng thể kháng virus LMLM.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án áp dụng kết hợp các phương pháp sinh học phân tử, hóa sinh, vi sinh và miễn dịch học thực nghiệm:

Nhóm phương pháp Kỹ thuật và công cụ thực hiện Mục đích phân tích
Kỹ thuật gen RT-PCR, thiết kế mồi chuyên biệt, giải trình tự Sanger, tối ưu hóa codon Khuếch đại và xác định trình tự gen $VP0$, $VP1\text{-}2A$, $VP3$; thiết kế cụm gen biểu hiện
Kỹ thuật tái tổ hợp Cắt nối enzyme giới hạn, biến nạp tế bào vi khuẩn, chuyển gen vị trí đặc hiệu Tạo vector pFastBac™ Dual tái tổ hợp và tạo bacmid tái tổ hợp trong E. coli DH10Bac
Nuôi cấy & biểu hiện Chuyển nhiễm (transfection) tế bào côn trùng, nuôi cấy tăng sinh Bac stock P1, P2 Biểu hiện protein cấu trúc LMLM trong tế bào Sf9 và Sf21
Phân tích protein Điện di SDS-PAGE gel 12%, Western blot sử dụng kháng thể đặc hiệu Kiểm tra kích thước và mức độ biểu hiện của các protein $VP0$, $VP1$, $VP3$
Phân tích hình thái Thu hồi, ly tâm và soi kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Khẳng định sự hình thành và kích thước của hạt giả virus VLP-LMLM
Thực nghiệm miễn dịch Tiêm thử nghiệm trên chuột lang và bê; xét nghiệm ELISA, theo dõi chỉ số ức chế PI Đánh giá độc tính, khả năng kích thích sinh kháng thể và xác định liều sinh miễn dịch tối ưu

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện cơ sở lý luận về bệnh LMLM, đặc tính phân loại của virus Aphthovirus, cấu trúc không gian của hạt virus và vai trò của các protein capsid bề mặt ($VP1$, $VP2$, $VP3$) trong việc kích thích hệ thống miễn dịch tạo kháng thể trung hòa. Tác giả phân tích chi tiết dịch tễ học LMLM trên thế giới và tại Việt Nam giai đoạn 2006–2018, chỉ ra chu kỳ dịch bùng phát trung bình 2–3 năm/lần và khẳng định serotype O là nhóm lưu hành chủ đạo.

Chương 1 đi sâu so sánh ưu nhược điểm của các thế hệ vaccine: vaccine vô hoạt toàn phần, vaccine peptide, vaccine DNA và vaccine công nghệ VLP. Tác giả chỉ rõ VLP khắc phục được nguy cơ an toàn sinh học của virus sống, cho phép phân biệt động vật tiêm phòng và động vật nhiễm bệnh (DIVA) dễ dàng do không chứa các protein phi cấu trúc ($NSP$). Đồng thời, hệ thống biểu hiện baculovirus/tế bào côn trùng được làm rõ như một công cụ tối ưu cho biểu hiện protein tái tổ hợp nhờ khả năng cuộn gập chuẩn xác, thực hiện các biến đổi sau dịch mã và mức độ an toàn cao đối với động vật có vú.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm từ khâu xử lý mẫu bệnh phẩm, tách chiết RNA tổng số đến khuếch đại cDNA bằng RT-PCR với các cặp mồi đặc hiệu:

  • Thiết kế mồi nhân dòng các gen cấu trúc $VP0$, $VP3$ và $VP1\text{-}2A$.
  • Dòng hóa các đoạn gen vào vector trung gian, giải trình tự và tối ưu hóa bộ ba mã hóa (codon optimization) cho phù hợp với hệ tế bào côn trùng.
  • Thiết kế cấu trúc vector chuyển pFastBac™ Dual mang đồng thời cụm gen $VP1\text{-}2A\text{-}VP3$ dưới sự điều khiển của promoter polh và gen $VP0$ dưới promoter p10.
  • Tạo bacmid tái tổ hợp thông qua sự can thiệp của transposon Tn7 trong chủng E. coli DH10Bac.
  • Quy trình chuyển nhiễm bacmid vào tế bào Sf9 bằng chất chuyển gen, thu hoạch virus tái tổ hợp thế hệ 1 (Bac stock P1), nhân dòng tạo Bac stock P2.
  • Quy trình tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện: so sánh dòng tế bào (Sf9 so với Sf21), mật độ tế bào nuôi cấy và thời gian thu hoạch (24 h, 48 h, 72 h, 96 h).
  • Phương pháp kiểm tra protein bằng SDS-PAGE gel 12% và thẩm tách Western blot.
  • Quy trình tinh sạch, thu hồi hạt VLP và phương pháp chuẩn bị mẫu quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
  • Thiết kế bố trí thí nghiệm động vật: thử nghiệm độc tính và hiệu giá kháng thể trên chuột lang; thử nghiệm xác định liều sinh miễn dịch trên bê thông qua đo lường chỉ số ức chế (Percentage Inhibition - PI) bằng kỹ thuật ELISA.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

  1. Phân lập và tạo dòng gen cấu trúc: Tách chiết thành công RNA từ mẫu LMLM type O thực địa, tổng hợp cDNA và khuếch đại đặc hiệu các gen $VP0$, $VP3$, $VP1\text{-}2A$. Kết quả giải trình tự xác nhận độ chính xác của các khung đọc mở.
  2. Thiết kế vector và bacmid tái tổ hợp: Ghép nối thành công hai cụm gen vào vector pFastBac™ Dual, tạo vector tái tổ hợp pDual-VP1-2A-VP3-VP0. Biến nạp vector vào tế bào E. coli DH10Bac, tuyển chọn khuẩn lạc trắng trên môi trường thạch chứa kháng sinh, IPTG và X-gal, xác nhận bacmid tái tổ hợp qua PCR kiểm tra với mồi M13.
  3. Biểu hiện protein và lắp ráp VLP trong tế bào côn trùng: Chuyển nhiễm thành công bacmid vào tế bào côn trùng tạo Bac stock P1 và P2. Kết quả phân tích SDS-PAGE và Western blot tại các thời điểm 24 h, 48 h, 72 h, 96 h cho thấy sự hiện diện rõ nét của các băng protein tái tổ hợp tương ứng với kích thước lý thuyết của các protein capsid. Hình ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) khẳng định sự tự lắp ráp thành công của các protein thành hạt giả virus VLP-LMLM có hình thái đa diện đều, đường kính tương đương virus tự nhiên (~25–30 nm).
  4. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện: Xác định được dòng tế bào, mật độ tế bào và thời gian nuôi cấy tối ưu để lượng VLP-LMLM thu nhận đạt hiệu suất cao nhất.
  5. Đánh giá sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm:
    • Trên chuột lang: Chế phẩm VLP-LMLM an toàn tuyệt đối, không gây phản ứng phụ hoặc độc tính trong 10 ngày theo dõi sau tiêm. Nồng độ kháng nguyên thử nghiệm (400 ng/liều) kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh, làm gia tăng rõ rệt chỉ số kháng thể PI.
    • Trên bê: Bê thí nghiệm được kiểm tra huyết thanh âm tính trước tiêm. Kết quả thử nghiệm các dải liều cho thấy VLP-LMLM kích thích sản sinh hiệu giá kháng thể đặc hiệu cao, xác định được liều sinh miễn dịch thích hợp làm cơ sở cho các nghiên cứu sản xuất vaccine.

Chương 4: Bàn luận kết quả

Chương này tập trung biện luận sâu về:

  • Sự tương thích của chiến lược thiết kế liên kết gen $VP1\text{-}2A\text{-}VP3$ và sự tự cắt của protease $2A$ giúp duy trì tỷ lệ cân bằng giữa các protein cấu trúc phục vụ cho quá trình tự lắp ráp capsid.
  • Hiệu quả của việc tối ưu hóa codon trong hệ biểu hiện tế bào côn trùng giúp nâng cao năng suất sinh tổng hợp protein tái tổ hợp so với việc giữ nguyên trình tự virus gốc.
  • So sánh cấu trúc không gian và tính sinh miễn dịch của VLP-LMLM với các công bố quốc tế, khẳng định VLP tái tạo đầy đủ các epitope nhận diện miễn dịch quan trọng trên bề mặt capsid.
  • Đánh giá tiềm năng ứng dụng thực tiễn của kháng nguyên VLP-LMLM type O trong công tác phòng chống dịch bệnh tại Việt Nam.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và công nghệ

  1. Là công trình nghiên cứu tại Việt Nam ứng dụng thành công công nghệ tạo hạt giả virus (VLP) của virus LMLM serotype O trên hệ biểu hiện baculovirus/tế bào côn trùng.
  2. Góp phần làm chủ quy trình công nghệ tạo VLP: từ thiết kế tối ưu hóa cụm gen cấu trúc đa phân ($VP0$, $VP1\text{-}2A$, $VP3$), tạo bacmid tái tổ hợp, biểu hiện trong tế bào côn trùng đến tinh chế và thu nhận hạt nano sinh học VLP.
  3. Tạo ra hạt giả virus VLP-LMLM type O hoàn chỉnh về mặt hình thái học, cấu trúc nano và có tính sinh miễn dịch cao trên động vật thí nghiệm (chuột lang và bê), đóng vai trò là nguồn kháng nguyên ứng viên cho phát triển vaccine LMLM thế hệ mới an toàn sinh học.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Tiếp tục mở rộng nghiên cứu thử nghiệm đánh giá hiệu lực bảo hộ thông qua thử thách công cường độc bằng chủng virus LMLM sống trên động vật đích (bò, lợn).
  • Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ biểu hiện và tinh chế VLP ở quy mô lên men lớn hơn nhằm định hướng sản xuất công nghiệp.
  • Ứng dụng nền tảng công nghệ này để tiếp tục phát triển các hạt VLP cho các serotype LMLM khác lưu hành tại Việt Nam (như serotype A) hướng tới chế tạo vaccine đa type.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Luận án tập trung đánh giá tính an toàn, khả năng sinh kháng thể và hiệu giá kháng thể ở quy mô phòng thí nghiệm trên chuột lang và bê; chưa thực hiện thử nghiệm công cường độc trực tiếp với virus LMLM độc lực sống trên đàn gia súc thực địa do yêu cầu nghiêm ngặt về điều kiện an toàn sinh học cấp cao.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    1. Tiến hành thử nghiệm công cường độc trên động vật đích tại cơ sở kiểm nghiệm đạt chuẩn an toàn sinh học.
    2. Tích hợp bổ sung các chất bổ trợ miễn dịch (adjuvant) thích hợp để kéo dài thời gian bảo hộ của kháng thể.
    3. Mở rộng thiết kế các hạt giả virus mang kháng nguyên đa type (O, A, Asia1).

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành: Là tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp thiết kế vector đa promoter (pFastBac™ Dual), kỹ thuật tạo bacmid trong hệ Bac-to-Bac, và quy trình biểu hiện protein virus tự lắp ráp thành hạt VLP trong tế bào côn trùng.
  • Đối với các nhà nghiên cứu miễn dịch và vaccine học thú y: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về tính kháng nguyên, liều lượng sinh miễn dịch của VLP-LMLM type O trên động vật có vú (chuột lang, bê), phục vụ cho việc phát triển các dòng vaccine thế hệ mới an toàn.
  • Đối với các đơn vị sản xuất sinh phẩm y - sinh - dược: Làm tài liệu cơ sở công nghệ về quy trình tạo kháng nguyên VLP, có thể chuyển giao hoặc phát triển tiếp quy trình sản xuất vaccine và sinh phẩm chẩn đoán DIVA.

Câu hỏi thường gặp

1. Hạt giả virus (VLP) khác biệt như thế nào so với virus LMLM tự nhiên và vaccine vô hoạt truyền thống?
VLP chứa đầy đủ các protein cấu trúc bề mặt ($VP0$, $VP1$, $VP3$) tự lắp ráp thành hình thái capsid đa diện đều tương tự virus tự nhiên, kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh. Tuy nhiên, VLP hoàn toàn không chứa vật liệu di truyền (RNA), do đó không có khả năng nhân lên hay gây nhiễm, loại bỏ nguy cơ mất an toàn sinh học của virus sống trong sản xuất vaccine vô hoạt.

2. Luận án đã sử dụng vector và chủng tế bào nào để tạo VLP-LMLM?
Tác giả sử dụng vector chuyển pFastBac™ Dual mang hai promoter polh và p10, tạo bacmid tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli DH10Bac, sau đó chuyển nhiễm và biểu hiện trong hệ tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda (Sf9 và Sf21).

3. Làm thế nào để chứng minh hạt giả virus VLP-LMLM đã được hình thành thành công?
Sự hình thành VLP được xác nhận bằng sự hiện diện của các băng protein capsid trên điện di SDS-PAGE gel 12%, phản ứng đặc hiệu trên Western blot và quan sát trực tiếp cấu trúc hạt hình đa diện kích thước ~25–30 nm dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).

4. Khả năng sinh miễn dịch của VLP-LMLM được đánh giá trên những động vật nào và kết quả ra sao?
VLP-LMLM được thử nghiệm trên chuột lang và bê. Kết quả cho thấy chế phẩm an toàn, không gây độc tính trong 10 ngày theo dõi, kích thích sản sinh hiệu giá kháng thể đặc hiệu cao (tính theo chỉ số ức chế PI qua ELISA) ở liều kháng nguyên thử nghiệm.

Kết luận

Luận án của NCS. Nguyễn Phương Hoa đã thực hiện thành công việc phân lập các gen cấu trúc $VP0$, $VP1\text{-}2A$, $VP3$ của virus LMLM type O tại Việt Nam và biểu hiện tái tổ hợp trong hệ baculovirus/tế bào côn trùng để tạo hạt giả virus VLP-LMLM. Hạt VLP thu được có hình thái đa diện tương đồng với virus tự nhiên, không chứa vật liệu di truyền, bảo đảm tính an toàn tuyệt đối và có khả năng kích thích đáp ứng sinh kháng thể đặc hiệu cao trên chuột lang và bê. Công trình đóng góp nền tảng công nghệ quan trọng trong việc làm chủ quy trình chế tạo hạt giả virus, mở ra triển vọng phát triển vaccine LMLM thế hệ mới an toàn và hiệu quả cho ngành chăn nuôi.