Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo hạt giả virus lở mồm long móng type O trong sản xuất vaccine

• Tác giả: Nguyễn Phương Hoa
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Kim Cúc
• Trường học: Viện Công Nghệ Sinh Học
• Chuyên ngành: Hóa Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tạo Hạt Giả Virus Lở Mồm Long Móng Type O Để Sản Xuất Vaccine
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Bệnh lở mồm long móng
• 1.2. Giới thiệu chung về bệnh lở mồm long móng
• 1.3. Tình hình dịch bệnh LMLM trên thế giới
• 1.4. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam
• 1.5. Virus gây bệnh LMLM
• 1.6. Cấu trúc của virus LMLM
• 1.7. Các type huyết thanh của Virus LMLM
• 1.8. Chẩn đoán bệnh LMLM
• 1.9. Đặc tính của virus LMLM ở mức độ phân type
• 1.10. Vaccine phòng bệnh LMLM
• 1.11. Hạt giả virus (VLP) và vaccine phát triển bằng công nghệ VLP
• 1.11.1. Khái niệm về VLP
• 1.11.2. Phương pháp tạo hạt giả virus VLP
• 1.11.3. Các hệ thống biểu hiện tạo VLP
• 1.11.4. Các loại vaccine VLP
• 1.11.5. Hệ biểu hiện VLP cho virus LMLM
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp RT-PCR tạo cDNA
• 2.2.2. Thiết kế các primer để nhân dòng các gen VP0, VP1-2A và VP3
• 2.2.3. Tách dòng các gen VP0, VP1-2A và VP3, giải trình tự
• 2.2.4. Thiết kế vector pFastBacTM Dual mang gen VP0 và VP1-2A-VP3
• 2.2.5. Tạo bacmid tái tổ hợp trong tế bào E. coli DH10Bac
• 2.2.6. Biểu hiện các cụm gen VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng
• 2.2.7. Tối ưu biểu hiện hai cụm gen VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng tạo VLP-LMLM lớn nhất
• 2.2.8. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamid
• 2.2.9. Phương pháp Western Blot
• 2.2.10. Phương pháp thu hồi VLP
• 2.2.11. Phương pháp soi kính hiển vi điện tử truyền qua
• 2.2.12. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM
• 2.2.13. Đánh giá đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM trên chuột
• 2.2.14. Đánh giá gây đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM trên bê
• 2.2.15. Kiểm tra độc tính của VLP-LMLM trên chuột thí nghiệm
• 2.2.16. Đánh giá hiệu giá kháng thể của VLP-LMLM
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập các gen cấu trúc VP0, VP1-2A và VP3
• 3.2. Thiết kế các primer cho 3 gen VP0, VP1-2A và VP3
• 3.3. Tổng hợp cDNA
• 3.4. Lựa chọn chủng làm nguyên liệu nghiên cứu
• 3.5. Tách dòng và giải trình tự các gen VP0, VP1-2A và VP3
• 3.6. Tối ưu các gen VP0, VP1-2A và VP3 tạo thành hai cụm gen VP0, VP1-2A-VP3
• 3.7. Thiết kế vector pFastBacTM Dual mang gen VP0 và VP1-2A-VP3
• 3.8. Kết quả tạo vector pFastBacTM Dual mang cụm gen VP1-2A-VP3
• 3.9. Tạo vector pFastBacTM DualVP1-2A-VP3 mang gen VP0
• 3.10. Tạo bacmid tái tổ hợp mang gen VP1-2A-VP3 và VP0 trong tế bào E. coli DH10Bac
• 3.11. Biểu hiện gen VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng tạo VLP
• 3.12. Nuôi cấy tăng sinh lượng lớn tế bào côn trùng. Nhiễm bacmid tái tổ hợp vào tế bào côn trùng tạo Bac stock P1
• 3.13. Biểu hiện Bac stock P2 trong tế bào côn trùng. Kiểm tra sự tạo thành VLP bằng kính hiển vi điện tử TEM
• 3.14. Tối ưu biểu hiện Bac stock P2 trong tế bào côn trùng. Xác định dòng tế bào thích hợp nhiễm biểu hiện tạo VLP-LMLM lớn nhất
• 3.15. Xác định nồng độ tế bào côn trùng và khoảng thời gian thích hợp để lượng VLP-LMLM thu được lớn nhất
• 3.16. Kiểm tra protein trên gel polyacrylamid và Western blot
• 3.17. Đánh giá khả năng gây miễn dịch của VP-LMLM trên động vật. Kết quả gây miễn dịch của VLP-LMLM trên chuột lang
• 3.18. Kết quả kiểm tra độc tính của VLP-LMLM trên chuột thí nghiệm. Kết quả đánh giá đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM trên bê
• 3.19. Nghiên cứu thử nghiệm liều sinh miễn dịch trên bê
• 3.20. Đánh giá hiệu giá kháng thể của VLP-LMLM
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ
• 4.1. Phân lập các gen cấu trúc VP0, VP1-2A và VP3
• 4.2. Tối ưu codon trong hai cụm gen VP0 và VP1-2A-VP3
• 4.3. Biểu hiện hai gen VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng
• 4.4. Thử nghiệm VLP-LMLM trên động vật thí nghiệm
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ
• TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về virus lở mồm long móng

Bệnh lở mồm long móng (LMLM) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virus lở mồm long móng gây ra, ảnh hưởng đến nhiều loài động vật móng guốc chẵn như trâu, bò, lợn, và dê. Bệnh này có khả năng lây lan nhanh chóng và gây thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi. Theo Tổ chức Thú y thế giới (OIE), bệnh LMLM được xếp vào danh sách các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất. Virus gây bệnh có khả năng biến đổi cao, dẫn đến việc vaccine hiện tại chỉ có hiệu quả khi chủng virus trong vaccine tương đồng với chủng virus gây bệnh ngoài thực địa. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển vaccine mới là rất cần thiết.

1.1. Tình hình dịch bệnh LMLM trên thế giới

Tính đến năm 2018, bệnh LMLM vẫn là một trong những bệnh gây hại nhất cho động vật trên toàn cầu. Nhiều quốc gia đã báo cáo sự xuất hiện của dịch bệnh này, với hàng ngàn ổ dịch được ghi nhận. Sự gia tăng dịch bệnh có thể liên quan đến thương mại xuyên biên giới và nhu cầu thịt từ động vật. Đặc biệt, các chủng virus như type O và type A đang lưu hành phổ biến, gây ra nhiều khó khăn trong việc kiểm soát dịch bệnh.

1.2. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam

Tại Việt Nam, bệnh LMLM đã xuất hiện hơn 100 năm và thường xuyên bùng phát. Chính phủ đã triển khai nhiều chương trình phòng chống dịch bệnh, tuy nhiên, dịch bệnh vẫn diễn biến phức tạp. Các ổ dịch mới liên tục xuất hiện, đặc biệt là ở các tỉnh miền Bắc. Việc tiêm vaccine phòng bệnh là một trong những biện pháp quan trọng, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc kiểm soát dịch bệnh.

II. Công nghệ tạo hạt giả virus

Công nghệ tạo hạt giả virus (VLP) đang nổi lên như một giải pháp tiềm năng trong sản xuất vaccine. Hạt giả virus được tạo ra từ các protein cấu trúc của virus, có cấu trúc tương tự như virus tự nhiên nhưng không mang vật liệu di truyền, do đó không có khả năng gây bệnh. VLP có thể kích thích hệ thống miễn dịch của vật chủ, tạo ra đáp ứng miễn dịch tương tự như khi bị nhiễm virus tự nhiên. Công nghệ này đã được áp dụng thành công trong sản xuất vaccine viêm gan B và vaccine ung thư cổ tử cung.

2.1. Phương pháp tạo hạt giả virus VLP

Phương pháp tạo hạt giả virus VLP bao gồm việc tách dòng các gen mã hóa protein cấu trúc của virus, sau đó sử dụng hệ thống biểu hiện baculovirus để sản xuất VLP. Các gen VP0, VP1-2A và VP3 của virus LMLM type O được tách dòng và tối ưu hóa để biểu hiện trong tế bào côn trùng. Quá trình này không chỉ giúp tạo ra VLP mà còn đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của vaccine.

2.2. Ứng dụng của VLP trong sản xuất vaccine

VLP có tiềm năng lớn trong việc phát triển vaccine mới cho nhiều loại bệnh truyền nhiễm. Việc sử dụng VLP trong sản xuất vaccine LMLM type O có thể giúp tăng cường hiệu lực và tính an toàn của vaccine. Nghiên cứu này không chỉ mở ra hướng đi mới trong công nghệ vaccine mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe động vật và an toàn thực phẩm.

III. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của VLP LMLM

Nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm VLP-LMLM trên động vật thí nghiệm như chuột lang và bê để đánh giá khả năng sinh kháng thể. Kết quả cho thấy VLP-LMLM có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch, tạo ra kháng thể chống lại virus LMLM. Việc xác định liều tiêm phù hợp và hiệu giá kháng thể đạt được cao nhất là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả của vaccine trong thực tế.

3.1. Thử nghiệm trên động vật thí nghiệm

Thử nghiệm trên chuột lang cho thấy VLP-LMLM có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ. Các chỉ số kháng thể được đo lường và so sánh với các mẫu đối chứng. Kết quả cho thấy VLP-LMLM có thể tạo ra kháng thể với hiệu giá cao, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong sản xuất vaccine phòng bệnh LMLM.

3.2. Đánh giá độc tính của VLP LMLM

Đánh giá độc tính của VLP-LMLM trên chuột thí nghiệm cho thấy không có dấu hiệu gây hại cho sức khỏe động vật. Điều này cho thấy VLP-LMLM an toàn để sử dụng trong nghiên cứu và phát triển vaccine. Việc đảm bảo tính an toàn của vaccine là yếu tố quan trọng trong việc phát triển sản phẩm mới cho ngành chăn nuôi.