Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo hạt giả virus lở mồm long móng type O trong sản xuất vaccine

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu tạo hạt giả virus lở mồm long móng type o trong hệ biểu hiện baculovirus tế bào côn, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

• Tác giả: Nguyễn Phương Hoa
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Kim Cúc
• Trường học: Viện Công Nghệ Sinh Học
• Chuyên ngành: Hóa Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tạo Hạt Giả Virus Lở Mồm Long Móng Type O Để Sản Xuất Vaccine
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Bệnh lở mồm long móng
• 1.2. Giới thiệu chung về bệnh lở mồm long móng
• 1.3. Tình hình dịch bệnh LMLM trên thế giới
• 1.4. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam
• 1.5. Virus gây bệnh LMLM
• 1.6. Cấu trúc của virus LMLM
• 1.7. Các type huyết thanh của Virus LMLM
• 1.8. Chẩn đoán bệnh LMLM
• 1.9. Đặc tính của virus LMLM ở mức độ phân type
• 1.10. Vaccine phòng bệnh LMLM
• 1.11. Hạt giả virus (VLP) và vaccine phát triển bằng công nghệ VLP
• 1.11.1. Khái niệm về VLP
• 1.11.2. Phương pháp tạo hạt giả virus VLP
• 1.11.3. Các hệ thống biểu hiện tạo VLP
• 1.11.4. Các loại vaccine VLP
• 1.11.5. Hệ biểu hiện VLP cho virus LMLM
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp RT-PCR tạo cDNA
• 2.2.2. Thiết kế các primer để nhân dòng các gen VP0, VP1-2A và VP3
• 2.2.3. Tách dòng các gen VP0, VP1-2A và VP3, giải trình tự
• 2.2.4. Thiết kế vector pFastBacTM Dual mang gen VP0 và VP1-2A-VP3
• 2.2.5. Tạo bacmid tái tổ hợp trong tế bào E. coli DH10Bac
• 2.2.6. Biểu hiện các cụm gen VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng
• 2.2.7. Tối ưu biểu hiện hai cụm gen VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng tạo VLP-LMLM lớn nhất
• 2.2.8. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamid
• 2.2.9. Phương pháp Western Blot
• 2.2.10. Phương pháp thu hồi VLP
• 2.2.11. Phương pháp soi kính hiển vi điện tử truyền qua
• 2.2.12. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM
• 2.2.13. Đánh giá đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM trên chuột
• 2.2.14. Đánh giá gây đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM trên bê
• 2.2.15. Kiểm tra độc tính của VLP-LMLM trên chuột thí nghiệm
• 2.2.16. Đánh giá hiệu giá kháng thể của VLP-LMLM
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập các gen cấu trúc VP0, VP1-2A và VP3
• 3.2. Thiết kế các primer cho 3 gen VP0, VP1-2A và VP3
• 3.3. Tổng hợp cDNA
• 3.4. Lựa chọn chủng làm nguyên liệu nghiên cứu
• 3.5. Tách dòng và giải trình tự các gen VP0, VP1-2A và VP3
• 3.6. Tối ưu các gen VP0, VP1-2A và VP3 tạo thành hai cụm gen VP0, VP1-2A-VP3
• 3.7. Thiết kế vector pFastBacTM Dual mang gen VP0 và VP1-2A-VP3
• 3.8. Kết quả tạo vector pFastBacTM Dual mang cụm gen VP1-2A-VP3
• 3.9. Tạo vector pFastBacTM DualVP1-2A-VP3 mang gen VP0
• 3.10. Tạo bacmid tái tổ hợp mang gen VP1-2A-VP3 và VP0 trong tế bào E. coli DH10Bac
• 3.11. Biểu hiện gen VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng tạo VLP
• 3.12. Nuôi cấy tăng sinh lượng lớn tế bào côn trùng. Nhiễm bacmid tái tổ hợp vào tế bào côn trùng tạo Bac stock P1
• 3.13. Biểu hiện Bac stock P2 trong tế bào côn trùng. Kiểm tra sự tạo thành VLP bằng kính hiển vi điện tử TEM
• 3.14. Tối ưu biểu hiện Bac stock P2 trong tế bào côn trùng. Xác định dòng tế bào thích hợp nhiễm biểu hiện tạo VLP-LMLM lớn nhất
• 3.15. Xác định nồng độ tế bào côn trùng và khoảng thời gian thích hợp để lượng VLP-LMLM thu được lớn nhất
• 3.16. Kiểm tra protein trên gel polyacrylamid và Western blot
• 3.17. Đánh giá khả năng gây miễn dịch của VP-LMLM trên động vật. Kết quả gây miễn dịch của VLP-LMLM trên chuột lang
• 3.18. Kết quả kiểm tra độc tính của VLP-LMLM trên chuột thí nghiệm. Kết quả đánh giá đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM trên bê
• 3.19. Nghiên cứu thử nghiệm liều sinh miễn dịch trên bê
• 3.20. Đánh giá hiệu giá kháng thể của VLP-LMLM
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ
• 4.1. Phân lập các gen cấu trúc VP0, VP1-2A và VP3
• 4.2. Tối ưu codon trong hai cụm gen VP0 và VP1-2A-VP3
• 4.3. Biểu hiện hai gen VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng
• 4.4. Thử nghiệm VLP-LMLM trên động vật thí nghiệm
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ
• TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về virus lở mồm long móng

Bệnh lở mồm long móng (LMLM) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virus lở mồm long móng gây ra, ảnh hưởng đến nhiều loài động vật móng guốc chẵn như trâu, bò, lợn, và dê. Bệnh này có khả năng lây lan nhanh chóng và gây thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi. Theo Tổ chức Thú y thế giới (OIE), bệnh LMLM được xếp vào danh sách các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất. Virus gây bệnh có khả năng biến đổi cao, dẫn đến việc vaccine hiện tại chỉ có hiệu quả khi chủng virus trong vaccine tương đồng với chủng virus gây bệnh ngoài thực địa. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển vaccine mới là rất cần thiết.

1.1. Tình hình dịch bệnh LMLM trên thế giới

Tính đến năm 2018, bệnh LMLM vẫn là một trong những bệnh gây hại nhất cho động vật trên toàn cầu. Nhiều quốc gia đã báo cáo sự xuất hiện của dịch bệnh này, với hàng ngàn ổ dịch được ghi nhận. Sự gia tăng dịch bệnh có thể liên quan đến thương mại xuyên biên giới và nhu cầu thịt từ động vật. Đặc biệt, các chủng virus như type O và type A đang lưu hành phổ biến, gây ra nhiều khó khăn trong việc kiểm soát dịch bệnh.

1.2. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam

Tại Việt Nam, bệnh LMLM đã xuất hiện hơn 100 năm và thường xuyên bùng phát. Chính phủ đã triển khai nhiều chương trình phòng chống dịch bệnh, tuy nhiên, dịch bệnh vẫn diễn biến phức tạp. Các ổ dịch mới liên tục xuất hiện, đặc biệt là ở các tỉnh miền Bắc. Việc tiêm vaccine phòng bệnh là một trong những biện pháp quan trọng, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc kiểm soát dịch bệnh.

II. Công nghệ tạo hạt giả virus

Công nghệ tạo hạt giả virus (VLP) đang nổi lên như một giải pháp tiềm năng trong sản xuất vaccine. Hạt giả virus được tạo ra từ các protein cấu trúc của virus, có cấu trúc tương tự như virus tự nhiên nhưng không mang vật liệu di truyền, do đó không có khả năng gây bệnh. VLP có thể kích thích hệ thống miễn dịch của vật chủ, tạo ra đáp ứng miễn dịch tương tự như khi bị nhiễm virus tự nhiên. Công nghệ này đã được áp dụng thành công trong sản xuất vaccine viêm gan B và vaccine ung thư cổ tử cung.

2.1. Phương pháp tạo hạt giả virus VLP

Phương pháp tạo hạt giả virus VLP bao gồm việc tách dòng các gen mã hóa protein cấu trúc của virus, sau đó sử dụng hệ thống biểu hiện baculovirus để sản xuất VLP. Các gen VP0, VP1-2A và VP3 của virus LMLM type O được tách dòng và tối ưu hóa để biểu hiện trong tế bào côn trùng. Quá trình này không chỉ giúp tạo ra VLP mà còn đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của vaccine.

2.2. Ứng dụng của VLP trong sản xuất vaccine

VLP có tiềm năng lớn trong việc phát triển vaccine mới cho nhiều loại bệnh truyền nhiễm. Việc sử dụng VLP trong sản xuất vaccine LMLM type O có thể giúp tăng cường hiệu lực và tính an toàn của vaccine. Nghiên cứu này không chỉ mở ra hướng đi mới trong công nghệ vaccine mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe động vật và an toàn thực phẩm.

III. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của VLP LMLM

Nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm VLP-LMLM trên động vật thí nghiệm như chuột lang và bê để đánh giá khả năng sinh kháng thể. Kết quả cho thấy VLP-LMLM có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch, tạo ra kháng thể chống lại virus LMLM. Việc xác định liều tiêm phù hợp và hiệu giá kháng thể đạt được cao nhất là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả của vaccine trong thực tế.

3.1. Thử nghiệm trên động vật thí nghiệm

Thử nghiệm trên chuột lang cho thấy VLP-LMLM có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ. Các chỉ số kháng thể được đo lường và so sánh với các mẫu đối chứng. Kết quả cho thấy VLP-LMLM có thể tạo ra kháng thể với hiệu giá cao, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong sản xuất vaccine phòng bệnh LMLM.

3.2. Đánh giá độc tính của VLP LMLM

Đánh giá độc tính của VLP-LMLM trên chuột thí nghiệm cho thấy không có dấu hiệu gây hại cho sức khỏe động vật. Điều này cho thấy VLP-LMLM an toàn để sử dụng trong nghiên cứu và phát triển vaccine. Việc đảm bảo tính an toàn của vaccine là yếu tố quan trọng trong việc phát triển sản phẩm mới cho ngành chăn nuôi.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bệnh lở mồm long móng (LMLM) được Tổ chức Thú y thế giới (OIE) xếp vào danh mục bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất cho chăn nuôi toàn cầu, với thiệt hại định lượng rõ ràng: gây sảy thai khoảng 25% động vật có chửa, giảm tới 25% sản lượng thịt, 50% sản lượng sữa và 25% năng suất lông cừu. Tại khu vực Đông Nam Á, trong giai đoạn 2007–2015 đã ghi nhận tổng cộng 4.961 ổ dịch từ sáu quốc gia gồm Campuchia, Lào, Malaysia, Myanmar, Thái Lan và Việt Nam, báo cáo qua Hệ thống thông tin thú y khu vực ASEAN (ARAHIS) và OIE. Tại Việt Nam, dịch LMLM xuất hiện trung bình 2–3 năm một đợt theo chu kỳ dịch tễ học đã được xác nhận; giai đoạn 2011–2015 ghi nhận mức giảm 52% số ổ dịch so với giai đoạn 2006–2010 nhờ Chương trình quốc gia phòng chống LMLM ba giai đoạn, song dịch vẫn tiếp tục tái phát với 48 ổ dịch tại 6 tỉnh thành từ tháng 12/2018.

Research gap cốt lõi: Tính đến thời điểm nghiên cứu, toàn bộ vaccine LMLM lưu hành tại Việt Nam và thế giới đều thuộc dạng vô hoạt (inactivated vaccine) sản xuất từ virus sống độc lực, đòi hỏi cơ sở sản xuất đạt chuẩn an toàn sinh học cao và không khắc phục được những hạn chế cố hữu về độ bảo hộ chéo, thời gian bảo quản ngắn, và nguy cơ thoát virus trong quá trình sản xuất. Quan trọng hơn, chưa có bất kỳ công trình nào tại Việt Nam ứng dụng công nghệ hạt giả virus (Virus-Like Particle – VLP) để phát triển vaccine LMLM. Luận án tiến sĩ của NCS. Nguyễn Phương Hoa, thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, lấp đầy khoảng trống nghiên cứu này một cách hệ thống.

Mục tiêu nghiên cứu được xác định rõ: (1) tạo thành công hạt giả virus LMLM type O (VLP-LMLM) trên hệ biểu hiện baculovirus/tế bào côn trùng từ các chủng phân lập tại Việt Nam; (2) đánh giá khả năng sinh kháng thể của VLP-LMLM trên chuột lang và bê; (3) xác định liều tiêm phù hợp đạt hiệu giá kháng thể cao nhất. Khung lý thuyết của nghiên cứu được xây dựng trên ba trụ cột: lý thuyết tự lắp ghép capsid virus (viral capsid self-assembly theory), nguyên lý kích hoạt miễn dịch thích nghi thông qua kháng nguyên đa phân (multivalent antigen immunology – Bachmann & Zinkernagel, 1997), và nền tảng công nghệ biểu hiện baculovirus/tế bào côn trùng (Bac-to-Bac® system, Invitrogen).

---

Literature Review và Positioning

Tổng quan tài liệu của nghiên cứu tổng hợp ba luồng văn liệu chính. Luồng thứ nhất liên quan đến dịch tễ học phân tử virus LMLM: Knowles và cs. (2005) xác lập hệ thống phân loại 11 genotype của FMDV type O bao gồm Euro-SA, ME-SA, SEA, Cathay (CHY), WA, EA-1 đến EA-4, ISA-1 và ISA-2; Muroga và cs. (2012) ghi nhận đợt dịch lớn serotype O topotype Mya-98 năm 2011 lan từ Đông Nam Á sang Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản. Jamal và Graham mô tả chi tiết cơ chế lắp ráp 60 bản sao của bốn protein capsid (VP1–VP4) tạo thành hạt virus hoàn chỉnh.

Luồng thứ hai tập trung vào công nghệ vaccine thế hệ mới. Kleid và cs. tiên phong biểu hiện VP1 tái tổ hợp trong E. coli tạo đáp ứng miễn dịch phòng hộ trên lợn và bò. Taboga và cs. (1997) đánh giá vaccine peptide quy mô lớn trên bò, chỉ ra mức bảo hộ tối đa 40% khi tuân thủ nghiêm ngặt quy trình gây miễn dịch — kết quả này cho thấy giới hạn căn bản của vaccine peptide do số lượng hạn chế epitope tương thích. Nghiên cứu so sánh của Rodriguez và cs. (2003) xác nhận hạn chế tương tự. Trong khi đó, Mao (2006) cùng Thrane và cs. chứng minh vaccine VLP ung thư cổ tử cung (HPV) tạo lượng kháng thể cao hơn ít nhất 10 lần so với lây nhiễm tự nhiên sau 4 năm theo dõi lâm sàng.

Luồng thứ ba xử lý các hệ thống biểu hiện VLP. Zdanowicz (2016), Lua và cs. (2014), cùng Zeltins và cs. (2013) hệ thống hóa ưu nhược điểm của từng nền tảng: vi khuẩn có năng suất cao nhưng tạo nội độc tố và không thực hiện được sửa đổi sau dịch mã; nấm men thiếu khả năng glycosyl hóa phức tạp; tế bào côn trùng đáp ứng đồng thời yêu cầu glycosyl hóa, hình thành cầu disulfide và phosphoryl hóa tương đương tế bào động vật có vú, trong thời gian ngắn và quy mô lớn.

Điểm tranh luận trong văn liệu: Sørensen và cs. (1998) cùng Bergmann và cs. (2000) đề xuất ELISA phát hiện kháng thể kháng protein không cấu trúc (NSP) làm nền tảng phân biệt động vật nhiễm/tiêm chủng (DIVA), song Brocchi và cs. (2006) phản bác rằng một số động vật nhiễm bệnh không thể hiện biến đổi huyết thanh đối với NSP, làm hạn chế giá trị chẩn đoán của phương pháp này. Luận án định vị rõ ràng trong bối cảnh này bằng cách phát triển VLP từ protein cấu trúc (structural proteins), do đó tránh hoàn toàn vấn đề nhiễm NSP mà vaccine vô hoạt truyền thống gặp phải.

So sánh với nghiên cứu quốc tế: hệ biểu hiện baculovirus tạo VLP-LMLM đã được triển khai tại các phòng thí nghiệm châu Âu và Bắc Mỹ, tuy nhiên các chủng virus sử dụng không phản ánh topotype lưu hành tại Việt Nam và Đông Nam Á. Công ty AVAC (Việt Nam) đã thành công với vaccine vô hoạt AVAC-V6 FMD Emulsion type O từ chủng thực địa, nhưng công nghệ VLP trong nước chưa được triển khai — đây là khoảng trống trực tiếp mà nghiên cứu này lấp đầy.

---

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Nghiên cứu mở rộng và kiểm chứng thực nghiệm lý thuyết tự lắp ghép capsid picornavirus trong điều kiện biểu hiện dị loài. Hệ gen FMDV chỉ có một khung đọc mở (ORF) lớn; polyprotein P1-2A mã hóa VP0, VP1 và VP3, trong khi đoạn 2A mã hóa protease StopGo (Glycin-Prolin) phân cắt tại điểm cuối 2A – đầu 2B — cơ chế này (Belsham, 2005) là chìa khóa để ba protein capsid tách rời và tự lắp ghép thành VLP mà không cần bộ máy sao chép virus. Luận án xác nhận cơ chế này hoạt động trong tế bào côn trùng Sf9 và Sf21 — hai dòng tế bào có nguồn gốc từ Spodoptera frugiperda và S. frugiperda 21 — bằng bằng chứng trực quan từ kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).

Về lý thuyết miễn dịch kháng nguyên đa phân (Bachmann & Zinkernagel, 1997; Thyagarajan và cs.), nghiên cứu cung cấp bằng chứng thực nghiệm trực tiếp rằng VLP-LMLM — với cấu trúc 60 bản sao protein capsid sắp xếp lặp lại — kích hoạt đáp ứng kháng thể đo được trên chuột lang ở liều 400 ng/0,5 mL và trên bê theo phác đồ thử nghiệm đa liều. Khung phân tích của luận án tích hợp ba lý thuyết: (1) Aphthovirus capsid assembly theory (Jamal & Graham); (2) Baculovirus expression vector system theory (Smith và cs., 1983); và (3) VLP immunogenicity framework (Kushnir và cs., 2012; Zdanowicz, 2016).

Khung phân tích độc đáo

Nghiên cứu thiết lập một quy trình tích hợp gồm bốn module kỹ thuật độc đáo: (i) tối ưu hóa codon hai cụm gen VP0 và VP1-2A-VP3 cho hệ biểu hiện côn trùng; (ii) thiết kế vector pFastBac™ Dual mang đồng thời hai cụm gen trên hai promoter polyhedrin và p10; (iii) tạo bacmid tái tổ hợp trong E. coli DH10Bac thông qua tái tổ hợp vị trí đặc hiệu (site-specific transposition); và (iv) tối ưu hóa điều kiện biểu hiện bao gồm lựa chọn dòng tế bào và mật độ tế bào–khoảng thời gian nhiễm để tối đa hóa lượng VLP thu được.

Điều kiện biên được phát biểu tường minh: kết quả chỉ áp dụng cho FMDV type O từ chủng phân lập tại Việt Nam; khả năng mở rộng sang type A, Asia1, SAT1-SAT3 cần nghiên cứu riêng biệt; và hiệu quả trên đại gia súc (bò trưởng thành) chưa được khẳng định do thử nghiệm mới dừng ở mức bê.

---

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu áp dụng triết học thực chứng (positivism) với thiết kế thực nghiệm (experimental design) đa bước, tích hợp sinh học phân tử, công nghệ biểu hiện protein và miễn dịch học thực nghiệm. Thiết kế đa cấp bao gồm: cấp phân tử (cloning, codon optimization, vector design), cấp tế bào (insect cell culture, baculovirus infection, protein expression), và cấp cơ thể sống (in vivo immunogenicity in guinea pigs and calves).

Quy trình nghiên cứu rigorous

Nguồn vật liệu: Mẫu bệnh phẩm virus LMLM thu thập từ các ổ dịch thực địa tại Việt Nam. RNA virus được tách chiết xác nhận bằng RT-PCR sử dụng cặp mồi chung FMDV-1F/1R. cDNA được tổng hợp bằng reverse transcriptase (RT).

Nhân dòng gen: Ba gen cấu trúc VP0, VP1-2A và VP3 được khuếch đại bằng PCR với các cặp mồi thiết kế đặc hiệu (thông tin chi tiết tại Bảng 3.2 trong luận án). Sản phẩm PCR kiểm tra bằng điện di gel agarose 1% và xác nhận trình tự. Tối ưu hóa codon thực hiện theo đặc điểm sử dụng codon của Spodoptera frugiperda để tăng hiệu suất biểu hiện.

Vector thiết kế: pFastBac™ Dual (Invitrogen/Bac-to-Bac® system) mang cụm gen VP1-2A-VP3 dưới promoter polyhedrin và gen VP0 dưới promoter p10. Cụm gen VP1-2A-VP3 được gắn vào vector trước (xác nhận bằng PCR và giải trình tự), sau đó VP0 được chèn vào tạo construct hoàn chỉnh pDual-VP1-2A-VP3-VP0.

Tạo bacmid: Vector chuyển được biến nạp vào E. coli DH10Bac. Khuẩn lạc tái tổ hợp chọn lọc trên môi trường chứa X-gal/IPTG/kháng sinh đa kháng (phân biệt màu trắng/xanh). Bacmid tái tổ hợp xác nhận bằng PCR sử dụng cặp mồi M13.

Biểu hiện trong tế bào côn trùng: Bacmid transfect vào tế bào Sf9 tạo Bac stock P1, sau đó khuếch đại thành P2. Hai dòng tế bào Sf9 và Sf21 được so sánh về hiệu suất biểu hiện. Điều kiện nuôi cấy được tối ưu hóa theo mật độ tế bào và thời điểm thu hoạch (24h, 48h, 72h, 96h sau nhiễm). Protein biểu hiện kiểm tra bằng SDS-PAGE 12% và Western blot sử dụng kháng thể đặc hiệu. VLP được thu hồi bằng gradient centrifugation và xác nhận hình thái bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).

Thử nghiệm động vật: Chuột lang được bố trí thí nghiệm gây miễn dịch đa nhóm liều; liều 400 ng/0,5 mL được xác định là phù hợp qua kết quả Bảng 3.5. Theo dõi chuột 10 ngày sau tiêm (Bảng 3.6) để đánh giá độc tính cấp. Thử nghiệm trên bê thực hiện với huyết thanh kiểm tra âm tính trước thử nghiệm (Bảng 3.7). Đánh giá hiệu giá kháng thể bằng kỹ thuật ELISA (chỉ số PI – Percentage Inhibition) và phân tích huyết thanh bê bằng phương pháp phù hợp tiêu chuẩn OIE.

Tam giác hóa được áp dụng theo ba hướng: tam giác hóa phương pháp (SDS-PAGE + Western blot + TEM), tam giác hóa động vật (chuột lang + bê), và tam giác hóa đánh giá miễn dịch (chỉ số PI qua ELISA + hiệu giá kháng thể).

---

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Phát hiện 1: Lần đầu tiên tại Việt Nam, ba gen cấu trúc VP0, VP1-2A và VP3 của FMDV type O lưu hành nội địa được phân lập thành công từ mẫu bệnh phẩm thực địa và nhân dòng riêng biệt, xác nhận qua giải trình tự. Kết quả RT-PCR dương tính với cặp mồi FMDV-1F/1R được trình bày tại Bảng 3.1 và Hình 3.1 của luận án.

Phát hiện 2: Hệ thống vector biểu hiện pFastBac™ Dual mang đồng thời VP0 và VP1-2A-VP3 hoạt động hiệu quả trong tế bào côn trùng. Protein VP0 và VP1-2A-VP3 được phát hiện qua SDS-PAGE 12% và Western blot tại các mốc thời gian 24h, 48h, 72h và 96h sau nhiễm (Hình 3.18 và 3.22).

Phát hiện 3: VLP-LMLM hình thành thực sự được xác nhận bằng hình ảnh TEM (Hình 3.19), chứng minh protein capsid tự lắp ghép thành hạt giả virus có hình thái tương đồng virus LMLM tự nhiên trong điều kiện biểu hiện dị loài. Đây là bằng chứng trực quan đầu tiên về VLP-LMLM được sản xuất từ chủng Việt Nam.

Phát hiện 4: VLP-LMLM ở liều 400 ng/0,5 mL kích thích sản sinh kháng thể đo được trên chuột lang (chỉ số PI ghi nhận tại Bảng 3.5). Thử nghiệm độc tính cấp trên chuột trong 10 ngày theo dõi (Bảng 3.6) không ghi nhận biểu hiện độc tính, xác nhận độ an toàn sinh học của VLP-LMLM.

Phát hiện 5: Trên bê, thử nghiệm liều sinh miễn dịch (Bảng 3.8) xác định được liều phù hợp và ghi nhận sự chuyển đổi huyết thanh học dương tính (Bảng 3.9, Hình 3.23), chứng minh VLP-LMLM có khả năng kích hoạt đáp ứng miễn dịch trên đại gia súc — đối tượng đích chính của vaccine LMLM thương mại. Serotype O và A lưu hành đồng thời tại Việt Nam (xác nhận qua ELISA theo Van Phan Le và cs.), nhưng đây là nghiên cứu đầu tiên tập trung sản xuất VLP từ type O phân lập nội địa.

So sánh với nghiên cứu quốc tế: trong khi các nhóm tại châu Âu và Mỹ đã tạo VLP-LMLM từ chủng chuẩn quốc tế (Pirbright reference strains), nghiên cứu này sử dụng chủng thực địa Việt Nam — yếu tố quyết định tính tương đồng kháng nguyên với virus gây dịch trong nước.

Implications đa chiều

Về đóng góp lý thuyết: kết quả xác nhận tính khả thi của cơ chế StopGo (2A peptide-mediated cleavage) trong hệ biểu hiện baculovirus, mở rộng hiểu biết về điều kiện cần thiết cho quá trình lắp ghép capsid picornavirus ngoài tế bào vật chủ tự nhiên. Nghiên cứu cũng bổ sung dữ liệu thực nghiệm cho lý thuyết miễn dịch kháng nguyên đa phân của Bachmann & Zinkernagel (1997) trong bối cảnh vaccine thú y.

Về ứng dụng thực tiễn: VLP-LMLM type O đã được chứng minh có khả năng sinh kháng thể trên cả chuột lang lẫn bê, tạo nền tảng cho giai đoạn thử nghiệm tiền lâm sàng mở rộng và tiến tới phát triển vaccine thương mại. Quy trình công nghệ được làm chủ có thể áp dụng ngay cho sản xuất thử nghiệm tại các cơ sở đạt tiêu chuẩn GMP.

Về khuyến nghị chính sách: Kết quả hỗ trợ cho luận điểm rằng Chương trình quốc gia phòng chống LMLM giai đoạn 2016–2020 (476/QĐ-BNN-TY) cần bổ sung hướng nghiên cứu vaccine thế hệ mới (VLP, DNA vaccine) song song với duy trì vaccine vô hoạt, đặc biệt trong bối cảnh topotype Mya-98 và các biến thể mới tiếp tục xuất hiện.

---

Limitations và Future Research

Hạn chế 1 – Phạm vi serotype: Nghiên cứu chỉ tập trung vào FMDV type O. Trong khi đó, serotype A và Asia1 cũng lưu hành đồng thời tại Việt Nam (Van Phan Le và cs.), với type A được xác nhận là type đa dạng kháng nguyên nhất trong 7 serotype (Tosh, 2002; Kitching, 2016). Vaccine đơn type chưa đáp ứng được nhu cầu bảo hộ toàn diện cho đàn gia súc.

Hạn chế 2 – Quy mô thử nghiệm động vật: Thử nghiệm trên bê được thực hiện ở quy mô nhỏ, chưa đạt cỡ mẫu đủ lớn để phân tích thống kê với độ tin cậy cao về hiệu giá kháng thể bảo hộ. Việc công cường độc (challenge test) với virus LMLM độc lực để xác nhận bảo hộ thực sự chưa được thực hiện do yêu cầu điều kiện an toàn sinh học cấp độ cao (BSL-3).

Hạn chế 3 – Chưa xác định điều kiện bảo quản: Nghiên cứu chưa đánh giá độ bền nhiệt và điều kiện bảo quản tối ưu của VLP-LMLM — yếu tố quan trọng cho chuỗi lạnh trong điều kiện Việt Nam, đặc biệt tại vùng sâu vùng xa có cơ sở hạ tầng hạn chế.

Hạn chế 4 – Chất bổ trợ (adjuvant): Thử nghiệm chưa tối ưu hóa loại và nồng độ adjuvant phối hợp với VLP-LMLM, trong khi dầu khoáng làm adjuvant cho vaccine vô hoạt LMLM đã được chuẩn hóa từ thập niên 1970 (Michelsen và cs.).

Hướng nghiên cứu tiếp theo: (1) Mở rộng sang VLP đa type (type O + A + Asia1) sử dụng vector biểu hiện đa gen hoặc cocktail VLP; (2) Thử nghiệm công cường độc trong cơ sở BSL-3 đạt chuẩn OIE để xác nhận hiệu lực bảo hộ thực sự; (3) Tối ưu hóa adjuvant và hệ phân phối (delivery system) để tăng cường và kéo dài đáp ứng miễn dịch; (4) Nghiên cứu độ ổn định và điều kiện bảo quản VLP-LMLM ở quy mô pilot; (5) Triển khai kết hợp chiến lược DIVA bằng cách tích hợp marker âm tính vào VLP để phân biệt động vật tiêm vaccine và động vật nhiễm tự nhiên.

---

Tác động và ảnh hưởng

Tác động học thuật: Công trình mở ra hướng nghiên cứu VLP hoàn toàn mới tại Việt Nam trong lĩnh vực vaccine thú y. Dữ liệu trình tự gen VP0, VP1-2A và VP3 của chủng FMDV type O lưu hành nội địa đóng góp vào cơ sở dữ liệu phân tử phục vụ giám sát dịch tễ học phân tử và lựa chọn chủng vaccine theo giá trị r1. Quy trình công nghệ được mô tả chi tiết có khả năng được tái lập trong các phòng thí nghiệm đạt chuẩn tương đương.

Tác động ngành: Kết quả tạo nền tảng kỹ thuật cho việc phát triển vaccine LMLM VLP thương mại tại Việt Nam, tiến tới giảm phụ thuộc vào vaccine nhập khẩu và tăng cường chủ quyền vaccine — mục tiêu chiến lược trong bối cảnh Việt Nam có ngành chăn nuôi đóng góp khoảng 32% GDP nông nghiệp. Công nghệ baculovirus/tế bào côn trùng được làm chủ có thể mở rộng sang sản xuất VLP cho các bệnh virus nguy hiểm khác như HIV, viêm gan B, bluetongue.

Tác động chính sách: Kết quả cung cấp bằng chứng khoa học thực nghiệm đầu tiên từ Việt Nam ủng hộ tính khả thi của VLP-LMLM làm vaccine thế hệ mới, hỗ trợ việc điều chỉnh Chương trình quốc gia phòng chống LMLM giai đoạn tiếp theo theo hướng đầu tư vào nghiên cứu và phát triển vaccine tiên tiến, song song với tăng cường giám sát sự biến đổi kháng nguyên của các chủng lưu hành.

---

Đối tượng hưởng lợi

Nhà nghiên cứu tiến sĩ và sau tiến sĩ: Công trình cung cấp quy trình hoàn chỉnh từ phân lập gen đến thử nghiệm động vật, với đầy đủ thông số kỹ thuật về primer, chu trình nhiệt PCR, thành phần phản ứng và điều kiện biểu hiện — nền tảng để tái lập và mở rộng sang các serotype FMDV khác hoặc sang virus khác thuộc họ Picornaviridae.

Nhà khoa học cấp cao trong lĩnh vực vaccine học: Khung lý thuyết tích hợp ba lý thuyết (capsid self-assembly, baculovirus expression, VLP immunogenicity) cùng dữ liệu thực nghiệm từ hệ biểu hiện baculovirus/tế bào côn trùng cung cấp góc nhìn so sánh giá trị đối với các nhà khoa học đang phát triển VLP cho các mầm bệnh khác.

Ngành công nghiệp vaccine thú y: Quy trình sản xuất VLP-LMLM được mô tả đủ chi tiết để các đơn vị như AVAC Việt Nam hay Navetco đánh giá khả năng chuyển giao công nghệ và đầu tư phát triển sản phẩm vaccine thế hệ mới cạnh tranh với vaccine nhập khẩu.

Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách: Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Cục Thú y, và các Chi cục Thú y vùng có bằng chứng khoa học đầu tiên từ Việt Nam về tính khả thi của vaccine VLP-LMLM, làm cơ sở đề xuất đầu tư ngân sách cho giai đoạn thử nghiệm lâm sàng và đăng ký vaccine tiếp theo.

---

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất là gì? Xác nhận thực nghiệm rằng cơ chế phân cắt StopGo của 2A peptide (Belsham, 2005) đủ để ba protein capsid VP0, VP1 và VP3 của FMDV type O tự lắp ghép thành VLP có cấu trúc nano hoàn chỉnh trong hệ biểu hiện baculovirus/tế bào côn trùng Sf9 và Sf21 — mở rộng lý thuyết tự lắp ghép capsid picornavirus sang điều kiện biểu hiện dị loài với chứng minh bằng hình ảnh TEM.

2. Đổi mới phương pháp so với các nghiên cứu trước? So với các nghiên cứu quốc tế sử dụng chủng chuẩn Pirbright, nghiên cứu này sử dụng chủng phân lập thực địa Việt Nam và thiết kế vector pFastBac™ Dual biểu hiện đồng thời hai cụm gen dưới hai promoter độc lập — tăng hiệu suất lắp ghép VLP so với chiến lược biểu hiện tuần tự. So với Kleid và cs. (biểu hiện đơn protein VP1 trong E. coli), thiết kế này cho phép tạo VLP đa protein hoàn chỉnh, sát với cấu trúc virus tự nhiên hơn.

3. Phát hiện bất ngờ nhất? VLP-LMLM kích thích sản sinh kháng thể ở liều rất thấp 400 ng/0,5 mL trên chuột lang — phù hợp với lý thuyết của Bachmann & Zinkernagel (1997) về việc kháng nguyên đa phân kích thích tế bào B ở nồng độ thấp hơn nhiều so với kháng nguyên đơn phân, và tương đồng với kết quả Mao (2006) trên vaccine VLP HPV tạo kháng thể cao hơn 10 lần so với lây nhiễm tự nhiên.

4. Giao thức tái lập được cung cấp? Có. Luận án mô tả đầy đủ: trình tự mồi (Bảng 2.3), chu trình nhiệt PCR (Bảng 2.4, 2.7), thành phần phản ứng (Bảng 2.2, 2.5), thành phần gel SDS-PAGE 12% (Bảng 2.8), phác đồ gây miễn dịch (Bảng 2.9), đủ để các nhóm nghiên cứu khác tái lập.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm? Được phác thảo: mở rộng VLP đa type (O + A + Asia1), thử nghiệm công cường độc BSL-3, tối ưu adjuvant, nghiên cứu bảo quản, tích hợp chiến lược DIVA, và triển khai pilot sản xuất quy mô công nghiệp theo tiêu chuẩn GMP.

---

Kết luận

Nghiên cứu của NCS. Nguyễn Phương Hoa tạo ra sáu đóng góp xác định được:

1. Lần đầu tiên tại Việt Nam phân lập và nhân dòng thành công ba gen cấu trúc VP0, VP1-2A và VP3 của FMDV type O từ chủng lưu hành nội địa, cung cấp nguồn vật liệu di truyền chuẩn cho nghiên cứu vaccine trong nước.

2. Thiết lập thành công hệ thống vector biểu hiện pFastBac™ Dual mang đồng thời hai cụm gen VP0 và VP1-2A-VP3, tối ưu hóa codon cho S. frugiperda — giải pháp kỹ thuật đầu tiên thuộc loại này được ghi nhận trong văn liệu khoa học Việt Nam.

3. Chứng minh bằng TEM rằng VLP-LMLM type O từ chủng Việt Nam hình thành thành công trong tế bào côn trùng Sf9 và Sf21, xác nhận cơ chế tự lắp ghép capsid picornavirus trong điều kiện biểu hiện dị loài.

4. Xác định điều kiện biểu hiện tối ưu gồm lựa chọn dòng tế bào, mật độ tế bào và thời điểm thu hoạch để tối đa hóa lượng VLP-LMLM, tạo nền tảng cho mở rộng quy mô sản xuất.

5. Cung cấp bằng chứng miễn dịch học đầu tiên rằng VLP-LMLM type O kích thích sản sinh kháng thể đặc hiệu ở cả chuột lang (liều 400 ng/0,5 mL, không ghi nhận độc tính sau 10 ngày) và bê (chuyển đổi huyết thanh học xác nhận), không gây độc tính cấp.

6. Làm chủ quy trình công nghệ VLP lần đầu tiên tại Việt Nam, mở ra ba hướng nghiên cứu mới: vaccine VLP đa type LMLM, ứng dụng công nghệ tương tự cho các virus nguy hiểm khác (HIV, bluetongue, Ebola), và phát triển nền tảng DIVA tích hợp cho giám sát dịch tễ học.

Thành tựu này đánh dấu sự chuyển dịch paradigm trong nghiên cứu vaccine thú y tại Việt Nam: từ phụ thuộc hoàn toàn vào công nghệ vaccine vô hoạt truyền thống sang tiếp cận vaccine thế hệ mới dựa trên công nghệ nano sinh học VLP — một bước tiến có ý nghĩa không chỉ cho phòng chống LMLM mà còn cho an ninh vaccine quốc gia trước các đại dịch thú y trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu là AUG. Vùng không dịch mã đầu 3’(3’UTR) có khoảng 190 nt và đuôi poly (A) có 10-100 nt (Fry, 2005; Caovà cs. Toàn bộ hệ gen của virus LMLM mã hóa cho một protein lớn. Sau khi dịch mã, protein này phân cắt thành 4 sản phẩm sơ cấp, được đặt tên là: Lpro, P1-2A, P2 và P3.pro (Leaderprotease) là một protein đầu N-tận cùng (N- terminal) của chuỗi polyprotein.

Vùng mã hóa protein L chứa 2 mã khởi đầu và tạo ra 2 protein riêng biệt gọi là Lab và Lb (Carrillo và cs., 2005; Sangar và cs. Lpro có vai trò ức chế việc tổng hợp protein của tế bào chủ nhờ sự cắt protein IF4G của tế bào chủ, đây là yếu tố khởi đầu cần thiết cho quá trình phiên mã các mRNA tế bào chủ đã được gắn mũ (capped cellular mRNAs). Nhờ đó mà RNA của virus LMLM có thể tự do sử dụng bộ máy tổng hợp protein của tế bào chủ phục vụ cho việc tổng hợp protein của virus bởi vì vùng IRES của virus LMLM có thể phản ứng với phân đoạn đầu C-tận cùng (C-terminal fragment) của eIF4G. Trong virus tự nhiên sự phân tách của polyprotein cấu trúc P1-2A với polyprotein không cấu trúc P2 của virus LMLM xảy ra tại điểm cuối 2A va đầu 2B tại cấu trúc đặc trưng là Glycin-Prolin (StopGo) (Belsham, 2005).

Trong phần lớn các picornavirus, sự phân cắt ở điểm nối giữa protein cấu trúc và phi cấu trúc qua trung gian bởi protein 2A, tuy nhiên kích thước và chức năng của 2A khác nhau giữa các chi khác nhau (Luke et al. Trong quá trình lắp ráp hệ gen của virus tạo lớp vỏ, VP0 sẽ được cắt thành VP4 và VP2. 11 luan an 12 VP4 bị ẩn hoàn toàn vào trong hạt virus (Belsham et al., 1991), trong khi đó VP1, VP2 và VP3 được bộc lộ ra ngoài hạt virus và góp phần tạo nên tính kháng nguyên của virus (Jackson và cs. VP1 chứa tối thiểu 2 quyết định kháng nguyên quan trọng ở các thòng lọng G-H (G-H loop) thuộc vị trí của các amino acid 141-160 và 200-213.

Thòng lọng G-H có trong motif arginine-glycine-aspartic acid (RGD) là cực kỳ quan trọng cho việc gắn virus vào thụ thể tế bào vật chủ (Fox và cs, 1989; Jackson và cs 1997). Tuy nhiên, virus cũng có thể xâm nhập vào tế bào không qua con đường nhận biết thụ thể nhờ RGD motif mà có thể nhiễm vào tế bào qua một một phân tử khác ví dụ như các thụ thể heparan sulphate proteoglycan (HSPG) (Fowler và cs. Các trình tự nucleotide của vùng mã hóa VP1 đã được sử dụng để đánh giá các đặc tính di truyền của các chủng virus LMLM, bởi vì vùng này đóng vai trò quan trọng nhất trong việc gắn kết và xâm nhập của virus vào tế bào vật chủ. Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự VP1 đã được sử dụng rộng rãi để đánh giá quá trình tiến hóa cũng như mối liên quan về mặt dịch tễ học của các dòng di truyền và nguồn gốc của các chủng gây nên những vụ dịch mới bùng phát.

Các vùng P2 và P3 của polyprotein được phân cắt thành các protein phi cấu trúc (NSPs). Vùng P2 sẽ tạo ra các protein 2B và 2C, trong khi đó vùng P3 sẽ phân cắt để tạo thành các protein 3A, ba phiên bản khác nhau của VPg (3B1-3), 3Cpro và 3Dpol. Các protein được mã hóa bởi P2 và P3 gồm protein liên quan tới quá trình chế biến (3Cpro) và các protein sao chép hệ gen (2B, 2C, 3A, 3B1-3 (VPg) và 3Dpol). 3Cpro chịu trách nhiệm phân cắt P1-2A thành VP0, VP1, VP3 cũng như hình thành các protein phi cấu trúc khác nhau.

Vùng đầu 3’ không dịch mã (3′ UTR) ngắn hơn nhiều so với vùng đầu 5’ không dịch mã (5′ UTR). Nó chỉ dài khoảng 90 nt và gấp nếp để tạo ra một cấu trúc thòng lọng (stem-loop) đặc trưng, tiếp theo là đuôi 12 luan an 13 polyA với độ dài khác nhau. Vùng 3’ không dịch mã (3′ UTR) có thể đóng vai trò quan trọng trong việc sao chép hệ gen của virus. Các type huyết thanh (serotype) của virus LMLM Virus LMLM được xác định là có bảy type huyết thanh riêng biệt, bao gồm O, A, C, Asia1 và các type huyết thanh Nam Phi (SAT) là SAT1, SAT2 và SAT3 (Rweyemamu và cs.

Virus LMLM type A đã được xác định là một trong những type đa dạng nhất về mặt kháng nguyên trong số bảy type huyết thanh (Tosh, 2002; Kitching, 2016). Type huyết thanh A đã được phân loại thành 10 kiểu gen (genotype) chính (được xác định là I đến X) dựa trên các cây phát sinh loài xây dựng trên trình tự gen VP1 (Tosh và cs., 2002; Kitching và cs. Virus LMLM type O được phân thành 11 genotype, được xác định là Châu Âu-Nam Mỹ (Euro-SA), Trung Đông-Nam Á (ME- SA), Đông Nam Á (ĐNÁ), Cathay(CHY), Tây Phi (WA), Đông Phi 1 (EA-1), Đông Phi2 (EA-2), Đông Phi 3 (EA-3), Đông Phi 4 (EA-4), Indonesia-1 (ISA-1) và Indonesia-2 (ISA-2) (Knowles và cs., 2005; Ayelet và cs. Virus LMLMtype Asia1 được phân thành bảy genotype (được xác định là I đến VII) (Jamal và cs.

Bệnh LMLM là một bệnh thường gặp và phổ biến ở châu Phi, châu Á và là mối đe dọa trực tiếp đến các khu vực không có bệnh LMLM như châu Mỹ, châu Âu và Châu Úc (OIE-FAO. Ở Việt Nam, Nông nghiệp đóng một vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân, trong đó sản xuất động vật đóng góp khoảng 32 % vào tổng GDP. Bệnh LMLM được coi là quan trọng nhất về kinh tế do bệnh truyền nhiễm ảnh hưởng đến gia súc quan trọng như trâu, bò và lợn. Sự lưu hành đồng thời của các type huyết thanh O, A và Asia1, trong đó type huyết thanh O là phổ biến nhất và là nguyên nhân gây ra các vụ dịch bệnh lớn (Kitching và cs., 13 luan an 14 2007; Jamal và cs.

Type huyết thanh O và sự bùng phát dịch LMLM do type này ở Việt Nam lần đầu tiên được mô tả trong nghiên cứu học thuật từ năm 1996 đến 2001 (Gleeson, 2002). Virus LMLM type Asia1 và A đã được phát hiện lần lượt vào năm 2005 và 2009 (Le và cs., 2010; Le và cs. Vào năm 2008 và đầu tháng 2 năm 2009, các type huyết thanh O và A đã được báo cáo là type huyết thanh phổ biến và gây ra khoảng 166 vụ dịch LMLM tại 128 xã thuộc 47 huyện của 14 tỉnh trong cả nước (Nguyen Van Hoang và cs. Chẩn đoán bệnh LMLM Do sự gia tăng nhanh chóng của dịch LMLM, nên việc chẩn đoán nhanh, chính xác và xác định type huyết thanh cũng như sự tương đồng kháng nguyên của chủng virus LMLM liên quan đến dịch bệnh là vấn đề được đặc biệt quan tâm.

Bệnh LMLM được chẩn đoán dựa trên các dấu hiệu lâm sàng, bao gồm sốt cao, chảy nước dãi quá nhiều, hình thành túi dịch trên niêm mạc miệng, trên mũi, trên bàn chân. Tuy nhiên, nếu chỉ dựa trên các dấu hiệu lâm sàng thì có thể nhầm lẫn với các bệnh khác (ví dụ như bệnh thoái hóa khớp và bệnh mụn nước (vesicular) ở lợn và do đó cần phải có các chẩn đoán trong phòng thí nghiệm. Hơn nữa, giữa các type huyết thanh khác nhau không có sự bảo vệ chéo, điều này không thể được xác định trên cơ sở các dấu hiệu lâm sàng. Do đó việc xác định các type huyết thanh liên quan đến sự bùng phát của bệnh LMLM ở hiện trường phải được xác minh trong phòng thí nghiệm để thực hiện các chương trình kiểm soát/tiêm phòng vaccine thích hợp.

Nhiều kỹ thuật đã được sử dụng để chẩn đoán bệnh và để xác định type huyết thanh của virus LMLM (Donaldson và Kitching, 1989). Các phương pháp hiện tại được sử dụng bao gồm: 14 luan an 15 1. Phản ứng trung hòa virus Các xét nghiệm trung hòa virus hiện được coi là "tiêu chuẩn vàng" để phát hiện kháng thể đối với protein cấu trúc của virus LMLM và là một xét nghiệm quy định đối với chứng nhận xuất nhập khẩu động vật/sản phẩm động vật (OIE, 2012). Tuy nhiên, do xét nghiệm trung hòa được thực hiện trên các tế bào có độ nhạy khác nhau nên kết quả xét nghiệm có thể không đồng nhất so với các xét nghiệm huyết thanh học khác.

Hơn nữa, xét nghiệm trung hòa mất nhiều thời gian, dễ bị nhiễm và đòi hỏi phải có điều kiện an toàn sinh học nghiêm ngặt do phải sử dụng virus chưa được bất hoạt, trong khi đó, các xét nghiệm huyết thanh học khác, có thể sử dụng các virus đã bất hoạt để làm kháng nguyên. Thường tiến hành trong môi trường nuôi cấy tế bào trong các phiến nhựa vi lượng (Microplates) đáy bằng, sử dụng các dòng tế bào mẫn cảm như IB-RS-2, BHK-21 hoặc tế bào tiên phát của thận lợn hoặc thận cừu.Huyết thanh được pha tỉ lệ 3/4, xử lý ở 56 ºC trong 30 phút sau đó pha loãng theo hệ số 2 trong phiến nhựa vi lượng. Virus với hiệu giá định trước ở nồng độ 100 liều TCID50 được bổ sung vào giếng của phiến vi lượng và để ở nhiệt độ 37 ºC trong 60 phút để phản ứng trung hòa diễn ra. Phản ứng trung hòa virus rất đặc hiệu và nhạy, chỉ cần 2- 3 ngàylà có kết quả.

Tuy nhiên, ở độ pha loãng huyết thanh thấp, nếu không xử lý tốt để loại bỏ chất ức chế không đặc hiệu có trong huyết thanh thì hiện tượng dương tính giả có thểxảy ra. Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT) Dùng kháng thể chuẩn để xác định type huyết thanh O, A, C trong bệnh phẩm. Phản ứng nhanh, cho kết quả trong khoảng 12 giờ, đơn giản giúp khẳng định hoặc loại trừ nghi ngờ bệnh LMLM. Phản ứng này cũng đã được hoàn thiện và nếu sử dụng thành thục sẽ là một phương pháp hữu hiệu để chẩn đoán phân biệt giữa virus LMLM và các virus gây viêm mụn nước khác.

15 luan an 16 Phản ứng kết hợp bổ thể dùng hai hệ thống: i) Hệ thống phản ứng (kháng nguyên kết hợp đặc hiệu với kháng thể) và ii) Hệ thống phát hiện (hệ thống dung huyết, thường là hồng cầu cừu đã phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng hồng cầu cừu) có sự tham gia của bổ thể. Huyết thanh miễn dịch của từng type được bào chế trên chuột lang bằng phương pháp gây miễn dịch. Tiêm vaccine LMLM của từng type huyết thanh vào trong da dưới gan bàn chân chuột lang (mỗi type một chuột) hai lần mỗi lần cách nhau một tháng, sau đó lấy máu, chắt huyết thanh có chứa kháng thể. Kháng nguyên là máu gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc bệnh phẩm cấy vào trong môi trường nuôi cấy tế bào tuyến yên của bò hoặc lợn, tế bào thận bê, thận cừu non hay các dòng tế bào thường trực có độ nhạy tương đương.