Luận Văn Thạc Sĩ Công Nghệ Sinh Học: Nghiên Cứu Biểu Hiện OXA β-lactamase Ở Acinetobacter baumannii

Nghiên cứu biểu hiện OXA β-lactamase ở Acinetobacter baumannii trong luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học, phân tích vai trò kháng kháng sinh và ứng dụng thực tiễn.

• Tác giả: Nguyễn Thị Minh Tâm
• Người hướng dẫn: PGS. Hồ Huỳnh Thùy Dương
• Trường học: Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu sự biểu hiện OXA β-lactamase ở Acinetobacter baumannii
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Acinetobacter baumannii

Acinetobacter baumannii là một vi khuẩn Gram âm, cơ hội, thường được tìm thấy trong môi trường bệnh viện. Vi khuẩn này có khả năng gây ra các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng như viêm phổi, nhiễm trùng máu và nhiễm trùng vết mổ. A. baumannii đặc biệt nguy hiểm do khả năng kháng kháng sinh cao, đặc biệt là kháng β-lactam và carbapenem. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích sự biểu hiện của gen OXA β-lactamase trong A. baumannii, một enzyme quan trọng liên quan đến cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn này.

1.1. Phân loại và mô tả

Acinetobacter baumannii thuộc họ Moraxellaceae, là vi khuẩn Gram âm, không di động và không lên men. Vi khuẩn này thường được tìm thấy trong đất, nước và trên da người. A. baumannii có khả năng tồn tại lâu trong môi trường bệnh viện, làm tăng nguy cơ lây nhiễm. Vi khuẩn này đã trở thành một mối đe dọa lớn trong y tế do khả năng kháng đa kháng sinh, đặc biệt là kháng carbapenem.

1.2. Sự nguy hiểm của Acinetobacter baumannii

Acinetobacter baumannii là nguyên nhân chính gây ra các bệnh nhiễm trùng bệnh viện, đặc biệt là ở các khoa hồi sức tích cực. Vi khuẩn này có khả năng kháng lại hầu hết các loại kháng sinh hiện có, bao gồm β-lactam, aminoglycoside, và fluoroquinolone. Sự kháng kháng sinh của A. baumannii chủ yếu do sự biểu hiện của các gen OXA β-lactamase, đặc biệt là blaOXA-23 và blaOXA-51.

II. Tình hình kháng kháng sinh ở Acinetobacter baumannii

Acinetobacter baumannii đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong y tế toàn cầu do tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng. Vi khuẩn này có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh, bao gồm carbapenem, một loại kháng sinh mạnh thường được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng nặng. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích sự biểu hiện của các gen OXA β-lactamase trong A. baumannii, nhằm hiểu rõ hơn về cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn này.

2.1. Kháng kháng sinh trên thế giới

Tình trạng kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii đã được ghi nhận ở nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt là ở Châu Âu và Châu Á. Các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kháng carbapenem ở A. baumannii đang gia tăng nhanh chóng, gây ra nhiều khó khăn trong điều trị. Việc sử dụng rộng rãi kháng sinh trong y tế đã thúc đẩy sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng đa kháng sinh.

2.2. Cơ chế kháng kháng sinh

Cơ chế kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii chủ yếu liên quan đến sự biểu hiện của các gen OXA β-lactamase, đặc biệt là blaOXA-23 và blaOXA-51. Các gen này mã hóa các enzyme có khả năng thủy phân β-lactam, làm mất hiệu quả của kháng sinh. Ngoài ra, A. baumannii còn có khả năng thu nhận các gen kháng kháng sinh thông qua plasmid và transposon, làm tăng tính kháng của vi khuẩn.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để phân tích sự biểu hiện của gen OXA β-lactamase trong Acinetobacter baumannii. Các phương pháp bao gồm real-time PCR, RT-PCR, và cảm ứng biểu hiện gen. Nghiên cứu được thực hiện trên 252 mẫu thu thập từ ba bệnh viện tại Việt Nam, bao gồm Bệnh viện Đại học Y dược TP. HCM, Bệnh viện Đa khoa Đồng Nai và Bệnh viện Thống Nhất Đồng Nai.

3.1. Thu thập mẫu và phân tích gen

Các mẫu Acinetobacter baumannii được thu thập từ các bệnh viện và phân tích bằng phương pháp real-time PCR để xác định sự hiện diện của các gen OXA β-lactamase. Kết quả cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh của A. baumannii đối với các loại kháng sinh khác nhau dao động từ 60-80%. Các chủng mang gen blaOXA-23 và blaOXA-51 chiếm tỷ lệ cao nhất.

3.2. Cảm ứng biểu hiện gen

Quy trình cảm ứng biểu hiện gen OXA β-lactamase được thực hiện trên các chủng A. baumannii bằng cách sử dụng kháng sinh Penicillin G và Meropenem. Kết quả cho thấy các chủng mang cả hai gen blaOXA-23 và blaOXA-51 có mức độ biểu hiện gen cao hơn so với các chủng chỉ mang gen blaOXA-51.

IV. Kết quả và ứng dụng

Nghiên cứu này đã cung cấp những hiểu biết quan trọng về sự biểu hiện của gen OXA β-lactamase trong Acinetobacter baumannii. Kết quả cho thấy các chủng mang cả hai gen blaOXA-23 và blaOXA-51 có khả năng kháng kháng sinh mạnh hơn. Những phát hiện này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới và kiểm soát sự lây lan của A. baumannii trong môi trường bệnh viện.

4.1. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này đã góp phần làm sáng tỏ cơ chế kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii, đặc biệt là vai trò của các gen OXA β-lactamase. Những kết quả này có thể được ứng dụng trong việc phát triển các loại kháng sinh mới và các phương pháp điều trị hiệu quả hơn đối với các bệnh nhiễm trùng do A. baumannii gây ra.

4.2. Hướng nghiên cứu tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii, đặc biệt là vai trò của các gen OXA β-lactamase khác. Ngoài ra, cần phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác để phát hiện sớm các chủng A. baumannii kháng đa kháng sinh, từ đó giảm thiểu nguy cơ lây lan trong môi trường bệnh viện.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Mở Đầu 1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Thu thập mẫu lâm sàng Acinetobacter baumannii tại ba bệnh viện hợp tác: Bệnh viện Đại học Y dƣợc Tp. HCM, Bệnh viện đa khoa Đồng Nai và Bệnh viện Thống Nhất Đồng Nai.  Sử dụng qui trình monoplex Taq-Man real-time PCR phân nhóm gen bla OXA, xác định tỷ lệ từng nhóm và chọn lọc những nhóm phổ biến tiến hành khảo sát.

 Xây dựng qui trình duplex Taq-Man real-time RT-PCR sử dụng cho việc đánh giá biểu hiện tƣơng đối.  Xây dựng quy trình cảm ứng biểu hiện nhóm gen blaOXA-51 trên chủng chuẩn Acinetobacter baumannii ATCC 19606.  Đánh giá sự biểu hiện các nhóm gen blaOXA trên những chủng lâm sàng. 3 Chương 2: Tổng Quan Tài Liệu CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.

GIỚI THIỆU VỀ Acinetobacter baumannii 2. Phân loại, mô tả Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Moraxellaceae Loài: Acinetobacter baumannii Hình 2.1: Acinetobacter baumannii [39] Acinetobacter baumannii (A. baumannii), trƣớc đây có tên là Acinetobacter calcoaceticus, là vi khuẩn Gram âm cơ hội, hình cầu, nhỏ, không sinh nha bào, không di động, xếp đôi hoặc đám, hiếu khí, không lên men, mọc tốt trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. baumannii thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất, nƣớc, có thể tìm thấy trên da ngƣời khỏe mạnh, đặc biệt là nhân viên chăm sóc sức khỏe.

Có nhiều loại Acinetobacter và tất cả chúng đều có khả năng gây bệnh cho ngƣời, trong đó A. baumannii chiếm hơn 80% trƣờng hợp bị nhiễm bởi các chủng thuộc Acinetobacter [26,43]. Sự nguy hiểm của Acinetobacter baumannii A. baumannii thƣờng đƣợc coi là một tác nhân gây bệnh cơ hội với độc tính thấp.

Tuy nhiên, nó có thể tạo ra một loạt các nhiễm khuẩn nặng tại bệnh viện nhƣ viêm phổi và nhiễm khuẩn máu. Gần đây, ngƣời ta đã tìm thấy vi khuẩn này liên quan đến một số trƣờng hợp bệnh mắc phải tại cộng đồng và đa kháng kháng sinh 4 Chương 2: Tổng Quan Tài Liệu nhƣ hội chứng hoạt hóa đại thực bào (bệnh rối loạn hệ thống với tỷ lệ tử vong cao) sau nhiễm khuẩn huyết do A. baumannii đa kháng kháng sinh gây ra [41]. Vào những năm 70, vi khuẩn A.

baumannii nhạy cảm với hầu hết các loại kháng sinh, nhƣng hiện nay đã trở thành tác nhân chính gây nhiễm khuẩn bệnh viện trên toàn thế giới vì đặc tính thu nhận nhanh chóng những nhân tố kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau. Hiện nay, một số chủng A. baumannii đã trở nên kháng với tất cả các kháng sinh sẵn có, bằng cách thu nhận những plasmid, transposon hoặc integron mang cụm gen mã hóa tính kháng với nhiều họ kháng kháng sinh cùng lúc [33]. baumannii có khả năng tồn tại trên nhiều bề mặt môi trƣờng khác nhau, nhƣ trên áo phẫu thuật hoặc ống thông tiểu.

Gần đây, có sự gia tăng nhiễm trùng máu do A. baumannii kháng đa thuốc gây ra, kèm theo các triệu chứng viêm phổi, viêm đƣờng niệu, nhiễm trùng vết mổ. baumannii đã trở nên khó bị tiêu diệt nên hiểu biết về bộ gen của nó đặc biệt quan trọng để tiệt trừ hiệu quả, ngăn cản sự tồn tại và lan truyền của A. baumannii, đặc biệt trong môi trƣờng bệnh viện.

TÌNH HÌNH KHÁNG KHÁNG SINH Ở Acinetobacter baumannii Sự kháng kháng sinh đã và đang tăng lên từng ngày ở các vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy có mối liện hệ chặt chẽ giữa việc sử dụng kháng sinh và phát triển tính kháng ở vi sinh vật. Không có một nhóm kháng sinh nào hoàn toàn không bị kháng bởi một vi khuẩn nào đó. Acinetobacter baumannii đƣợc xem là tác nhân cơ hội quan trọng, chịu trách nhiệm cho hàng loạt các ca nhiễm khuẩn bệnh viện nhƣ viêm phổi, nhiễm trùng đƣờng tiểu, đặc biệt nguy hiểm đối với những bệnh nhân phải nằm viện lâu ngày hoặc đang điều trị trong các trƣờng hợp có sự can thiệp của kim tiêm, ống thở…Từ những năm 1970, nhiễm trùng A.

baumannii đã đƣợc điều trị thành công với gentamicin, minocyclin, nalidixic acid, ampicillins hoặc carbenicllin. Tuy nhiên, tình trạng sử dụng kháng sinh bừa bãi dẫn đến A. baumannii gần nhƣ kháng với hầu hết các loại kháng sinh. Carbapenem thuộc nhóm kháng sinh β-lactam gần đây đƣợc xem là loại kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng nhất, đƣợc dùng trong điều trị 5 Chương 2: Tổng Quan Tài Liệu nhiễm khuẩn nặng hoặc đa đề kháng, do vậy, carbapenem trở thành thuốc đƣợc lựa chọn chống lại nhiễm trùng A.

Tuy nhiên, một lần nữa, quá trình điều trị nhiễm khuẩn A. baumannii lại thất bại do sự xuất hiện của carbapenem – hydrolyzing class D β – lactamases (CHDLs) dẫn đến kháng carbapenem, gây ra nhiều trở ngại trong quá trình điều trị tại nhiều bệnh viện trong và ngoài nƣớc [9,22]. Trên thế giới Nhiễm trùng A. baumannii là một vấn đề đáng quan tâm tại nhiều nƣớc trong khu vực Châu Âu.

Kể từ đầu năm 1980, bắt đầu bùng phát nhiễm trùng A. baumannii tại các bệnh viện ở Châu Âu, đặc biệt ở Anh, Pháp, Ý, Tây Ban Nha, Hà Lan. Theo thông tin dịch tễ học, tỷ lệ kháng carbapenem ở các nƣớc Châu Âu cũng khác nhau, tỷ lệ kháng carbapenem cao ở Ý, Tây Ban Nha, Anh và thấp hơn ở Đức, Hà Lan. Một khảo sát từ 48 bệnh viện ở Châu Âu trong năm 2002-2004 cũng đã cho thấy tỷ lệ nhạy cảm với kháng sinh thuộc nhóm carbapenem có xu hƣớng giảm: mức độ nhạy cảm với meropenem chỉ còn 73,1%, imipenem 69,8%, mức độ nhạy cảm với các kháng sinh khác cũng rất thấp: ceftazixu 32,4%, ciprofloxacin 34%, gentamicin 47,6%.

Đồng thời, khảo sát cũng cho thấy tình trạng kháng kháng sinh dƣờng nhƣ ngày càng tăng trong khu vực Châu Âu [26]. Từ năm 1991-1992, tình trạng kháng carbapenem ở A. baumannii bắt đầu bùng phát tại một bệnh viện ở New York. Theo dữ liệu từ hệ thống giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện Quốc gia thu thập từ 1986-2003, tỷ lệ kháng kháng sinh ở những chủng Acinetobacter tăng đáng kể, amikacin 5% đến 20%, ceftazidime 25% đến 68%, imipenem 0% đến 20%.

Một khảo sát khác về tình hình kháng imipenem ở A. baumannii từ 2000 – 2009 trong khu vực Bắc Mỹ cũng cho thấy mức độ kháng tăng lên đáng kể, nhiều nơi kháng trên 50% với imipenem (hình 2. 6 Chương 2: Tổng Quan Tài Liệu Hình 2.2: Khảo sát tỷ lệ kháng Imipenem ở Hoa Kỳ từ 2000 – 2009[36] Dữ liệu thu nhận đƣợc từ việc phân lập chủng A. baumannii giới hạn trong khu vực Nam Phi đến năm 2007 cho thấy 30% chủng kháng carbapenem, 40% kháng cefepime và piperacilin – tazobactam, 30% kháng ciprofloxacin và levofloxacin [13].

Ở khu vực Châu Á và Trung Đông, sự bùng nổ kháng kháng sinh ở A. baumannii cũng đƣợc ghi nhận tại các bệnh viện trong khu vực này, tỷ lệ kháng vƣợt quá 25% đối với imipenem và meropenem, 40% đối với cefepime và ceftazidime, 40% đối với ampicillin – sulbactam, 35% đối với amilacin, 45% đối với ciproflocacin. Đặc biệt, kháng tigecycline và polymyxin B cũng bắt đầu xuất hiện trong khu vực này [26]. Theo dữ liệu thống kê về tình trạng bùng phát kháng carbapenem ở A.

baumannii trên thế giới đến năm 2008 cho thấy, tỷ lệ kháng bùng phát sớm xảy ra ở các nƣớc khu vực Châu Mỹ, Trung Quốc và một vài nƣớc trong khu vực Châu Âu (hình 2. 7 Chương 2: Tổng Quan Tài Liệu Hình 2.3: Những quốc gia bùng phát kháng carbapenem ở A. baumannii[26] Màu đỏ: Bùng phát kháng trước năm 2006, Màu vàng: sau năm 2006 Nhƣ vậy, tình trạng kháng kháng sinh ở A. baumannii đã và đang lan rộng trên toàn thế giới, là mối lo hàng đầu trong việc điều trị nhiễm khuẩn tại các bệnh viện.

Ở Việt Nam Ở Việt Nam, vấn đề kháng kháng sinh mới đƣợc quan tâm những năm gần đây và chỉ ở mức độ khảo sát tình trạng kháng kháng sinh. Năm 2010, công trình nghiên cứu “ Nhiễm khuẩn và đề kháng kháng sinh tại bệnh viện chợ rẫy năm 2008-2009”, với kết quả khảo sát, 5 vi khuẩn gây bệnh hàng đầu đƣợc tìm ra gồm E. baumannii (16%), Klebsiella spp. baumannii đặc biệt chiếm tỷ lệ cao và nổi trội ở các khoa điều trị tích cực [3].

Cũng năm 2010, công trình “ Khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn tại khoa hồi sức tích cực và chống độc bệnh viện cấp cứu Trƣng Vƣơng”, kết quả cho thấy vi khuẩn gây nhiễm bệnh chiếm tỷ lệ cao nhất là A. baumannii có mức đề kháng rất cao, hơn 80% với hầu hết các loại kháng sinh trong bệnh viện [4]. 8 Chương 2: Tổng Quan Tài Liệu Nhƣ vậy, việc tìm hiểu về A. baumannii và mức độ biểu hiện trên các gen kháng thuốc của A.

baumannii đối với các kháng sinh là vấn đề cấp thiết ở Việt Nam hiện nay. KHÁNG SINH, NHÓM KHÁNG SINH β-LACTAM VÀ CƠ CHẾ KHÁNG KHÁNG SINH 2. Kháng sinh và nhóm kháng sinh β-lactam Năm 1928, nhà khoa học Alexander Flemming ngƣời Scotland lần đầu tiên thấy trong môi trƣờng nuôi cấy tụ cầu vàng nếu có lẫn nấm penicillium thì khuẩn lạc gần nấm này sẽ không phát triển đƣợc, sau đó, chất penicillin đã đƣợc chiết xuất từ nấm để dùng trong điều trị. Vào năm 1941, penicillin trở thành kháng sinh đầu tiên đƣợc tìm ra và đƣợc sản xuất để dùng trong lâm sàng.

Về sau, với sự phát triển của khoa học, ngƣời ta đã có thể tổng hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên và nhân tạo. Tính đến năm 2010, có khoảng 17 nhóm thuốc kháng sinh với gần 500 tên thuốc, trong đó có 4 nhóm chuyên biệt: chống nấm, chống lao, chống phong, trị ung thƣ; còn lại 13 nhóm là thuốc trị các bệnh nhiễm khuẩn thông thƣờng. Mỗi nhóm lại có các phân nhóm hoặc các thế hệ khác nhau [37]. Nhóm kháng sinh dòng β-lactam chiếm khoảng 50% kháng sinh đƣợc sử dụng khắp thế giới, là một trong những loại kháng sinh quan trọng nhất của con ngƣời và là nhóm kháng sinh gia tăng liên tục về số lƣợng.

Hiện nay, β-lactam đã đƣợc sản xuất dƣới dạng bán tổng hợp. Dƣới đây là bảng phân loại kháng sinh với một số nhóm đại diện thuộc dòng kháng sinh β-lactam (bảng 2. 9 Chương 2: Tổng Quan Tài Liệu Bảng 2.1: Phân loại kháng sinh thuộc dòng β-lactam [37] Tên kháng sinh/nhóm kháng sinh Một số đại diện Các Penicillin (Dùng chữa các bệnh như nhiễm trùng do tụ cầu, liên cầu, nhiễm khuẩn đường hô hấp, nhiễm khuẩn huyết, hoại thư, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm nội tâm mạc, nhiễm trùng máu, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, đường ruột, đường sinh dục…) Penicillin G Penicillin G và Penicillin V Penicillin M Meticilin, Oxacillin, Cloxacilin, Nafeilin Penicillin A Ampicilin và tiền chất Amoxicilin Diệt P. aeru Carbenicilin, Ticarcilin, Piperacilin Các Cephalosporin: gồm 4 thế hệ I, II, III, IV.