Luận án tiến sĩ về đột biến gen ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu đột biến gen trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng dụng trong lĩnh vực tại Việt Nam.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thơm
• Người hướng dẫn: PGS. Đặng Thị Ngọc Dung
• Trường học: Trường Đại Học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa sinh
• Đề tài: Nghiên Cứu Đột Biến Gen Trong U Nguyên Bào Thần Kinh Đệm
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ y học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đại cương về u nguyên bào thần kinh đệm
• 1.2. Tình hình mắc u nguyên bào thần kinh đệm trong nước và trên thế giới
• 1.3. Phân loại u nguyên bào thần kinh đệm
• 1.4. Dự phòng
• 1.5. Nguyên nhân và cơ chế sinh bệnh u nguyên bào thần kinh đệm
• 1.6. Đặc điểm người bệnh U nguyên bào thần kinh đệm phát hiện thấy đột biến gen và thời gian sống sau điều trị
• 1.7. Kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen trong u nguyên bào thần kinh đệm
• 1.7.1. Kỹ thuật PCR
• 1.7.2. Kỹ thuật khuếch đại DNA đầu dò - MLPA
• 1.7.3. Kỹ thuật giải trình tự gen
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Tiêu chuẩn chọn mẫu
• 2.3. Tiêu chuẩn loại trừ
• 2.4. Cách tiến hành chọn mẫu nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6. Thiết kế nghiên cứu
• 2.7. Cỡ mẫu nghiên cứu
• 2.8. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất nghiên cứu
• 2.9. Các bước nghiên cứu
• 2.10. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 2.10.1. Thời gian nghiên cứu
• 2.10.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.11. Xử lý số liệu
• 2.12. Đạo đức trong nghiên cứu
• 2.13. Biện pháp tránh sai số
• 2.14. Kinh phí thực hiện đề tài
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Đặc điểm về tuổi
• 3.3. Đặc điểm về giới
• 3.4. Kết quả xác định một số đột biến trên gen TP53, EGFR, FGFR ở người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm
• 3.5. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu mô paraffin
• 3.6. Một số hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân bản các exon nghiên cứu của gen TP53, EGFR, FGFR
• 3.7. Kết quả giải trình tự gen xác định đột biến trên gen TP53
• 3.8. Kết quả xác định đột biến trên gen EGFR
• 3.9. Kết quả giải trình tự phát hiện đột biến trên exon 12 và exon 13 gen FGFR
• 3.10. Tổng hợp các đột biến trên 3 gen nghiên cứu: gen TP53, EGFR, FGFR
• 3.11. Tổng hợp các đột biến kép trên 3 gen nghiên cứu: gen TP53, EGFR, FGFR
• 3.12. Một số đặc điểm của người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm phát hiện thấy đột biến gen
• 3.13. Đặc điểm về tuổi và giới của người bệnh phát hiện thấy đột biến gen
• 3.14. Đặc điểm về kích thước khối u của người bệnh đột biến gen
• 3.15. Đặc điểm về thể bệnh nguyên phát và thứ phát
• 3.16. Phân bố thời gian sống của người bệnh phát hiện thấy đột biến gen có điều trị xạ trị, hóa chất
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu
• 4.2. Đặc điểm đột biến trên các gen nghiên cứu
• 4.3. Đặc điểm DNA tách chiết từ mẫu mô paraffin
• 4.4. Đặc điểm về kết quả PCR nhân bản các exon xác định đột biến điểm của các gen nghiên cứu
• 4.5. Đặc điểm đột biến điểm trên exon 7, exon 8 gen TP53
• 4.6. Đặc điểm đột biến từ exon 2 đến exon 7 gen EGFR
• 4.7. Đặc điểm đột biến điểm trên exon 12, exon 13 gen FGFR
• 4.8. Một số đặc điểm của người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm phát hiện thấy đột biến gen
• 4.9. Đặc điểm tuổi và giới của người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm phát hiện thấy đột biến gen
• 4.10. Đặc điểm về kích thước khối u ở người thấy đột biến gen trong bệnh UNBTKĐ
• 4.11. Đặc điểm hai thể bệnh nguyên phát và thứ phát của UNBTKĐ
• 4.12. Đặc điểm về thời gian sống của người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm phát hiện thấy đột biến gen
• PHỤ LỤC
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Đặt Vấn Đề

U nguyên bào thần kinh đệm (UNBTKĐ) là một trong những loại u não ác tính phổ biến nhất, với tỷ lệ mắc cao và tiên lượng sống rất thấp. Đột biến gen là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự phát triển của UNBTKĐ. Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định các đột biến gen như TP53, EGFR, và FGFR, những gen có vai trò quan trọng trong cơ chế sinh bệnh và điều trị. Việc hiểu rõ về đột biến gen sẽ giúp cải thiện tiên lượng và phương pháp điều trị cho bệnh nhân. Theo thống kê, tỷ lệ sống sót sau 5 năm của bệnh nhân UNBTKĐ chỉ khoảng 5,5%, cho thấy sự cần thiết phải nghiên cứu sâu hơn về nguyên bào thần kinh đệm.

II. Tổng Quan Về U Nguyên Bào Thần Kinh Đệm

U nguyên bào thần kinh đệm được phân loại thành nhiều loại khác nhau dựa trên vị trí và mô bệnh học. Tổ chức não và thần kinh trung ương rất đa dạng, và mỗi loại tế bào khi bị tổn thương sẽ có biểu hiện khác nhau. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc UNBTKĐ đang gia tăng, đặc biệt ở nam giới và người cao tuổi. Các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc UNBTKĐ ở Việt Nam có thể cao hơn so với một số quốc gia khác. Việc phân loại u theo mô bệnh học giúp xác định chính xác loại tế bào bị tổn thương và hướng điều trị phù hợp. Các gen như TP53, EGFR, FGFR có liên quan chặt chẽ đến sự phát triển của UNBTKĐ và là mục tiêu nghiên cứu chính trong luận án này.

III. Đặc Điểm Đột Biến Gen Trong U Nguyên Bào Thần Kinh Đệm

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến gen TP53, EGFR, và FGFR có tỷ lệ cao trong bệnh nhân UNBTKĐ. Đột biến TP53 thường liên quan đến tiên lượng xấu và làm tăng nhạy cảm với hóa chất trong điều trị. Gen EGFR và FGFR mã hóa cho các thụ thể có vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự tăng sinh và sống còn của tế bào. Sự rối loạn hoạt động của các gen này do đột biến có thể dẫn đến sự phát triển ác tính của tế bào. Việc xác định các đột biến gen này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế sinh bệnh mà còn mở ra hướng điều trị mới cho bệnh nhân UNBTKĐ.

IV. Phương Pháp Nghiên Cứu

Phương pháp nghiên cứu bao gồm việc thu thập mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân UNBTKĐ và áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, MLPA, và giải trình tự gen để xác định các đột biến gen. Các tiêu chuẩn chọn mẫu và loại trừ được thiết lập rõ ràng để đảm bảo tính chính xác của kết quả. Nghiên cứu cũng chú trọng đến việc xử lý số liệu và đảm bảo đạo đức trong nghiên cứu. Kết quả từ nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quý giá cho việc điều trị và tiên lượng bệnh nhân UNBTKĐ.

V. Kết Quả Nghiên Cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đột biến gen TP53, EGFR, và FGFR ở bệnh nhân UNBTKĐ là khá cao. Đặc biệt, đột biến trên gen TP53 có liên quan đến thời gian sống còn của bệnh nhân. Các hình ảnh điện di và kết quả giải trình tự gen đã xác nhận sự hiện diện của các đột biến gen này. Thời gian sống của bệnh nhân có đột biến gen thường ngắn hơn so với những bệnh nhân không có đột biến. Những phát hiện này không chỉ có giá trị trong việc hiểu rõ hơn về bệnh lý mà còn có thể ứng dụng trong lâm sàng để cải thiện điều trị cho bệnh nhân.

VI. Bàn Luận

Bàn luận về các đặc điểm của bệnh nhân UNBTKĐ và mối liên hệ giữa đột biến gen và tiên lượng sống. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng đột biến gen có thể ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị và thời gian sống của bệnh nhân. Việc xác định các đột biến gen này có thể giúp các bác sĩ đưa ra quyết định điều trị chính xác hơn. Hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc phát triển các liệu pháp điều trị nhắm vào các đột biến gen cụ thể, nhằm nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân UNBTKĐ.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

U nguyên bào thần kinh đệm (UNBTKĐ) là khối u phát sinh từ các tế bào thần kinh đệm chưa biệt hóa hoặc biệt hóa thấp trong hệ thần kinh trung ương. Tế bào thần kinh đệm đóng vai trò như mô liên kết trong não, có số lượng nhiều gấp 10 đến 50 lần so với tế bào neuron thần kinh. Về mặt bệnh học, UNBTKĐ là dạng u não có mức độ ác tính cao nhất (100% mang tính chất ác tính) và được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp vào nhóm u ác tính độ IV. Thống kê dịch tễ cho thấy tỷ lệ mắc mới hàng năm khoảng 3,2/100.000 dân, chiếm tỷ lệ cao nhất trong các loại u não ác tính nguyên phát (46,6%). Bệnh tiến triển rất nhanh, thời gian sống trung bình của người bệnh chỉ dao động từ 6 tháng đến 1 năm dù đã được áp dụng các biện pháp điều trị tích cực, và tỷ lệ sống sau 5 năm chỉ đạt khoảng 5,5%.

Cơ chế bệnh sinh ở mức độ phân tử của UNBTKĐ liên quan mật thiết đến sự tích tụ các đột biến gen, gây rối loạn thông tin di truyền dẫn đến việc tế bào tăng sinh và phân chia không kiểm soát. Quá trình này bao gồm sự kích hoạt bất thường của các gen sinh ung thư (như EGFR, FGFR, IDH) và sự bất hoạt của các gen ức chế khối u (như TP53, PTEN). Trong số đó, các gen TP53, EGFR và FGFR được xác định là các dấu ấn phân tử then chốt liên quan đến cơ chế bệnh sinh, phân loại thể bệnh, đánh giá tiên lượng và định hướng các liệu pháp điều trị đích ức chế hoạt tính tyrosin kinase. Tuy nhiên, trước thời điểm thực hiện đề tài, tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu hệ thống nào xác định đặc điểm đột biến đồng thời trên ba gen này ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.

Xuất phát từ thực tiễn trên, tác giả Nguyễn Thị Thơm (Nghiên cứu sinh khóa 34, chuyên ngành Hóa sinh, mã số 62720112) đã thực hiện luận án tiến sĩ y học với đề tài: "Nghiên cứu đột biến gen trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm" dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Đặng Thị Ngọc Dung tại Trường Đại học Y Hà Nội (hoàn thành năm 2019).

Luận án xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Xác định đột biến gen TP53, EGFR, FGFR trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm.
2. Phân tích một số đặc điểm của người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm phát hiện thấy đột biến gen.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu bao gồm các bệnh nhân được chẩn đoán mắc u nguyên bào thần kinh đệm, sử dụng mẫu bệnh phẩm mô đúc khối paraffin thu thập tại Bệnh viện Việt Đức và tiến hành các xét nghiệm sinh học phân tử tại Trường Đại học Y Hà Nội.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng kết tình hình dịch tễ học u nguyên bào thần kinh đệm trên phạm vi quốc tế và trong nước:

• Trên thế giới: Tỷ lệ mắc bệnh có sự chênh lệch giữa các châu lục. Tại Mỹ, tỷ lệ mắc mới hàng năm theo cơ quan đăng ký u não CBTRUS là 3,2/100.000 dân, trong đó nhóm tuổi trên 75 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất (24,43%). Tại Anh, tỷ lệ mắc ghi nhận ở mức 4,64/100.000 dân/năm. Các nước Bắc Âu có tỷ lệ mắc dao động từ 3,3 - 5,1/100.000 ở nam giới và 2,1 - 3,5/100.000 ở nữ giới, với mức gia tăng trung bình hàng năm là 9,2% ở nam và 8,8% ở nữ. Tại Phần Lan, tỷ lệ mắc là 2,0/100.000 dân. Tại Ấn Độ, tỷ lệ u não và hệ thần kinh trung ương là 5 - 10/100.000 dân, trong đó UNBTKĐ chiếm 22,8%. Tại Hàn Quốc, tỷ lệ mắc được ghi nhận ở mức thấp là 0,66/100.000 dân/năm. Nhìn chung, tỷ lệ mắc ở nam giới cao hơn nữ giới và người da trắng có tỷ lệ mắc cao hơn người da màu.
• Tại Việt Nam: Thống kê của Lê Xuân Trung và Nguyễn Như Bằng (1975) tại Bệnh viện Việt Đức ghi nhận UNBTKĐ chiếm 18% trong tổng số 408 ca mổ u não. Kiều Đình Hùng (2006) chỉ ra UNBTKĐ chiếm 62,7% trong nhóm các u thần kinh đệm ác tính. Trần Chiến (2011) công bố tỷ lệ UNBTKĐ chiếm 39,3% các u tế bào hình sao, độ tuổi trung bình là 43,03 ± 3,37 tuổi, gặp nhiều nhất ở nhóm 51 - 60 tuổi. Dương Đại Hà và Hà Kim Trung (2014) ghi nhận UNBTKĐ chiếm 33,3% và là nhóm có độ tuổi trung bình cao nhất trong các loại u thần kinh đệm. Độ tuổi mắc bệnh trung bình ở Việt Nam trẻ hơn so với các nước phương Tây.

Về phân loại bệnh học, luận án điểm lại lịch sử phân loại từ Virchow (1835), Bailey và Cushing (1926), Kernohan (1949), cho đến các bảng phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) các năm 1993, 2000, 2007 và 2016. Phân loại WHO 2007 chia UNBTKĐ thành hai biến thể mô bệnh học chính gồm UNBTKĐ tế bào khổng lồ và sarcom nguyên bào thần kinh đệm (gliosarcom). Phân loại WHO 2016 tích hợp dấu ấn mô bệnh học và di truyền, chia thành: thể UNBTKĐ IDH hoang dã (chiếm khoảng 90%, chủ yếu là u nguyên phát ở người trên 55 tuổi), thể UNBTKĐ IDH đột biến (chiếm khoảng 10%, chủ yếu là u thứ phát ở người trẻ tuổi), và thể không xác định (NOS).

Các nghiên cứu quốc tế về dấu ấn phân tử được luận án tổng thuật bao gồm:

• Công trình của Wang và cộng sự về vai trò của đột biến gen TP53 liên quan đến đáp ứng điều trị với hóa chất Temozolomide.
• Nghiên cứu của Jeffrey C. Lee và cộng sự (2006) về tỷ lệ đột biến điểm trên gen EGFR (chiếm 14,4%, trong đó exon 7 chiếm 5,3%, exon 3 chiếm 3,8%) và chứng minh khả năng sinh u trên chuột của các đột biến R108K, T263P, A289V.
• Nghiên cứu của Shinojima Naoki và cộng sự tại Đại học Y Kumamoto phát hiện 46% bệnh nhân UNBTKĐ có đột biến EGFR, trong đó 45% là biến thể xóa đoạn EGFRvIII. Youngmin Choi ghi nhận 43,8% bệnh nhân mang đột biến EGFRvIII.
• Nghiên cứu của Rand và cộng sự (trên 19 bệnh nhân) phát hiện hai đột biến điểm N546K và R576W trong miền kinase của thụ thể FGFR1 làm thay đổi cấu trúc bề mặt protein và gây tự phosphoryl hóa.
• Nghiên cứu của Anna Luisa Di Stefano về đột biến chuyển đoạn dung hợp gen FGFR3-TACC3 và thử nghiệm chất ức chế thụ thể FGFR (JNJ-42756493) trên mô hình chuột và bệnh nhân UNBTKĐ tái phát.
• Nghiên cứu của Watanabe K. (trên 49 mẫu sinh thiết) chứng minh đột biến gen TP53 (chiếm 67% ở thể thứ phát và 11% ở thể nguyên phát) và sự biểu hiện quá mức của EGFR (chiếm 63% ở thể nguyên phát và 10% ở thể thứ phát) là hai sự kiện mang tính loại trừ lẫn nhau trong tiến trình tiến hóa khối u.

Vị trí của luận án: Luận án bổ sung khoảng trống dữ liệu thực nghiệm tại Việt Nam bằng cách khảo sát đồng thời ba gen quan trọng (TP53, EGFR, FGFR) trên bệnh phẩm mô paraffin của bệnh nhân UNBTKĐ, phân tích mối liên quan giữa các biến đổi phân tử này với đặc điểm lâm sàng và thời gian sống sau can thiệp điều trị.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở sinh học phân tử về cấu trúc, chức năng và cơ chế sinh bệnh của ba gen:

• Gen TP53: Nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 17 (17p13.1), kích thước 20 kb, gồm exon 1 không mã hóa và intron 1 dài 10 kb. Gen mã hóa cho protein p53 có trọng lượng phân tử 53 kDa gồm 393 acid amin với ba vùng chức năng: vùng hoạt hóa N tận, vùng C tận và vùng điều hòa. Protein p53 giữ vai trò áp chế khối u, kiểm soát chu kỳ tế bào tại pha G1/S, kích hoạt cơ chế sửa chữa DNA hoặc khởi động chu trình chết tế bào (apoptosis). Đột biến gen TP53 trong UNBTKĐ tập trung chủ yếu ở các exon từ 5 đến 8, đặc biệt tại các bộ ba mã hóa codon-175, -248, -273 và -282. Luận án tập trung khảo sát đột biến điểm trên hai exon 7 và 8.
• Gen EGFR: Nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 7 (vị trí 7p12), kích thước khoảng 237 kb, gồm 28 exon, mã hóa cho protein thụ thể xuyên màng gồm 1210 acid amin với trọng lượng 134 kDa. Thụ thể EGFR mang hoạt tính tyrosin kinase, kích hoạt hai con đường truyền tín hiệu nội bào chính là RAS/RAF/MEK/ERK và PI3K/AKT. Dạng đột biến hay gặp nhất là EGFRvIII (đột biến mất đoạn từ exon 2 đến exon 7, tương ứng mất 801 bp từ nucleotide 275 đến 1075 trên cDNA và mất acid amin 6 đến 273 trên protein) cùng các đột biến điểm nằm tại vùng liên kết ngoại bào (exon 2, 3, 7). Luận án khảo sát đột biến xóa đoạn từ exon 2 đến exon 7 và các đột biến điểm trên các exon 2, 3, 7 của gen EGFR.
• Gen FGFR: Nhóm gen mã hóa thụ thể yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi. Gen FGFR1 nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 8 (8p11.23, dài 57 kb, gồm 24 exon, mã hóa protein 822 acid amin). Gen FGFR3 nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 4 (4p16.3, dài 15 kb, gồm 19 exon, mã hóa protein 806 acid amin). Hoạt hóa FGFR dẫn đến tự phosphoryl hóa vùng nội bào và kích hoạt các con đường tín hiệu PI3K/Akt và Ras/MAPK. Các đột biến điểm nghiên cứu gồm N546K (exon 12) và R576W (exon 13) thuộc miền tyrosin kinase.

Phương pháp nghiên cứu thực hiện:

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp theo dõi dọc.
• Đối tượng và bệnh phẩm: Bệnh nhân được chẩn đoán xác định u nguyên bào thần kinh đệm theo tiêu chuẩn mô bệnh học của WHO 2007 (do Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Việt Đức tại thời điểm thực hiện chưa áp dụng phân loại WHO 2016). Mẫu nghiên cứu là các khối nến mô paraffin chứa tế bào u.
• Kỹ thuật tách chiết và đo nồng độ DNA: Tách chiết DNA tổng số từ mô paraffin; đánh giá độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) trên máy NanoDrop 1000.
• Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction): Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản các phân đoạn exon mục tiêu: exon 7 và 8 của gen TP53; exon 2, 3 và 7 của gen EGFR; exon 12 và 13 của gen FGFR. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose.
• Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) và điện di mao quản: Sử dụng đầu dò chuyên biệt và chạy điện di mao quản nhằm phát hiện đột biến xóa đoạn từ exon 2 đến exon 7 (biến thể EGFRvIII) của gen EGFR.
• Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp (Sanger sequencing): Thực hiện giải trình tự chuỗi nucleotide để xác định các đột biến điểm trên các exon mục tiêu của gen TP53, EGFR và FGFR.
• Phương pháp xử lý số liệu: Phân tích thống kê y học mô tả và suy luận, đánh giá các tỷ lệ đột biến đơn, đột biến kép, so sánh các đặc điểm dịch tễ lâm sàng và phân bố thời gian sống sau điều trị phẫu thuật, xạ trị và hóa chất.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý luận và y văn về u nguyên bào thần kinh đệm:

• Trình bày đặc điểm giải phẫu và mô học của tế bào thần kinh đệm; định nghĩa, dịch tễ học và mức độ ác tính độ IV của UNBTKĐ theo WHO.
• Khái quát lịch sử phân loại u não từ Virchow (1835), Bailey - Cushing (1926), Kernohan (1949), WHO 1993, WHO 2000, WHO 2007 (phân chia thành UNBTKĐ tế bào khổng lồ và sarcom nguyên bào thần kinh đệm) đến bản cập nhật WHO 2016 (phân chia UNBTKĐ IDH hoang dã, UNBTKĐ IDH đột biến và UNBTKĐ NOS).
• Trình bày triệu chứng lâm sàng (hội chứng tăng áp lực nội sọ, hội chứng thần kinh khu trú), các công cụ chẩn đoán cận lâm sàng (cắt lớp vi tính, cộng hưởng từ IRM, mô bệnh học làm tiêu chuẩn vàng, xét nghiệm sinh học phân tử).
• Tổng quan các phương pháp điều trị: phẫu thuật lấy bỏ tối đa khối u; xạ trị gia tốc liều 1,8 - 2,0 Gy/ngày x 5 ngày/tuần (tổng liều 6000 cGy); hóa trị liệu bổ trợ với Temozolomide (liều 7,5 mg/m²/ngày x 6 tuần, duy trì 150 mg/m² x 5 ngày/tháng trong 6 tháng), Carmustine BCNU (mảng cấy phân hủy sinh học 7,7 mg x 8 mảng đặt tại khoang cắt u), Bevacizumab (kháng thể đơn dòng 10 mg/2 tuần); và các hướng nghiên cứu liệu pháp điều trị đích ức chế tyrosin kinase.
• Phân tích cơ chế bệnh sinh phân tử, cấu trúc và chức năng của gen áp chế khối u TP53, gen thụ thể EGFR và gen FGFR; vai trò của đột biến điểm, đột biến mất đoạn EGFRvIII và đột biến dung hợp FGFR3-TACC3.
• Tổng quan nguyên lý các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu gồm PCR, MLPA và giải trình tự gen.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu:

• Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ: Lựa chọn bệnh nhân có chẩn đoán mô bệnh học là u nguyên bào thần kinh đệm theo tiêu chuẩn WHO 2007 có đầy đủ mẫu bệnh phẩm mô đúc paraffin và hồ sơ lâm sàng.
• Thiết kế nghiên cứu và cỡ mẫu: Nghiên cứu mô tả, cắt ngang và theo dõi dọc thuần tập bệnh nhân sau phẫu thuật.
• Thiết bị và hóa chất: Máy đo quang phổ NanoDrop 1000, hệ thống máy nhân gen PCR, máy điện di mao quản, hệ thống giải trình tự gen, hóa chất tách chiết DNA từ mô paraffin, bộ kít phản ứng MLPA, các cặp mồi khuếch đại đặc hiệu cho các exon của TP53, EGFR, FGFR.
• Quy trình các bước nghiên cứu: Cắt mô paraffin, tách chiết DNA, đo nồng độ và độ tinh sạch DNA; tối ưu hóa phản ứng PCR nhân bản exon 7, 8 gen TP53, exon 2, 3, 7 gen EGFR, exon 12, 13 gen FGFR; thực hiện phản ứng lai và khuếch đại gắn đầu dò MLPA để phát hiện xóa đoạn exon 2-7 gen EGFR; giải trình tự Sanger để xác định các đột biến điểm.
• Địa điểm và thời gian: Thu thập mẫu tại Bệnh viện Việt Đức, thực hiện xét nghiệm phân tử tại Trường Đại học Y Hà Nội.
• Xử lý số liệu, đạo đức nghiên cứu và kiểm soát sai số: Ứng dụng các thuật toán thống kê y học, đảm bảo tính bảo mật thông tin bệnh nhân và độ chính xác trong thao tác kỹ thuật sinh học phân tử.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu và phát hiện cụ thể của luận án:

• Đặc điểm chung của đối tượng: Thống kê phân bố độ tuổi, độ tuổi trung bình của đối tượng nghiên cứu và tỷ lệ phân bố theo giới tính nam/nữ.
• Kết quả tách chiết DNA và phản ứng PCR: Kết quả đo OD của mẫu DNA tách chiết từ mô paraffin trên máy NanoDrop 1000 cho thấy DNA đạt chất lượng cho các phản ứng tiếp theo; hình ảnh điện di sản phẩm PCR cho thấy các vạch khuếch đại rõ nét, đúng kích thước thiết kế cho các exon của gen TP53, EGFR và FGFR.
• Kết quả xác định đột biến gen TP53: Tỷ lệ phát hiện đột biến điểm trên đoạn exon 7 và exon 8 của gen TP53 qua phân tích đồ thị giải trình tự gen.
• Kết quả xác định đột biến gen EGFR: Phát hiện các đột biến điểm trên exon 2, exon 3, exon 7 qua giải trình tự chuỗi nucleotide; xác định tỷ lệ và kiểu xóa đoạn từ exon 2 đến exon 7 (dạng biến thể EGFRvIII) bằng kỹ thuật MLPA và điện di mao quản; tổng hợp số lượng và tỷ lệ các dạng đột biến trên gen EGFR.
• Kết quả xác định đột biến gen FGFR: Tỷ lệ phát hiện đột biến điểm trên exon 12 (đột biến N546K) và exon 13 (đột biến R576W) của gen FGFR qua phân tích kết quả giải trình tự.
• Tổng hợp các dạng đột biến: Tỷ lệ đột biến chung trên từng gen riêng rẽ (TP53, EGFR, FGFR); tỷ lệ xuất hiện các đột biến kép (đồng thời mang đột biến trên hai hoặc ba gen nghiên cứu).
• Mối liên quan giữa đột biến gen và đặc điểm người bệnh:
  • Phân tích phân bố tuổi trung bình và tỷ lệ giới tính ở nhóm bệnh nhân có đột biến gen EGFR, FGFR hoặc mang đột biến ít nhất một trong ba gen.
  • Phân bố kích thước khối u ở nhóm bệnh nhân mang đột biến từng gen và nhóm có đột biến một trong ba gen.
  • Tỷ lệ bệnh nhân thuộc thể nguyên phát và thể thứ phát; phân tích tuổi trung bình, thời gian từ khi phát hiện bệnh đến khi phẫu thuật giữa hai thể bệnh.
• Phân bố thời gian sống của người bệnh có đột biến gen được điều trị xạ trị, hóa chất: Phân tích thời gian sống sau phẫu thuật và thời gian sống toàn bộ (từ khi phát hiện bệnh đến khi tử vong) ở các nhóm bệnh nhân mang đột biến gen FGFR, EGFR hoặc đột biến một trong ba gen có điều trị phối hợp.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tiến hành phân tích, đối chiếu các kết quả thu được với các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước:

• Về mặt kỹ thuật: Đánh giá hiệu quả của phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô đúc khối paraffin lưu trữ, tính khả thi và độ tin cậy của việc kết hợp phản ứng PCR, MLPA và giải trình tự gen trong xác định đột biến vi mô và đột biến cấu trúc.
• Về đặc điểm đột biến gen:
  • Bàn luận về tần suất và vị trí đột biến điểm trên exon 7, exon 8 của gen TP53, liên hệ với vai trò làm mất chức năng ức chế khối u và ảnh hưởng đến tính nhạy cảm với hóa chất Temozolomide.
  • Phân tích cơ chế và tần suất xóa đoạn từ exon 2 đến exon 7 gen EGFR (EGFRvIII) cùng các đột biến điểm vùng ngoại bào (exon 2, 3, 7); đối chiếu với dữ liệu quốc tế của Jeffrey C. Lee và Shinojima Naoki về hiện tượng khuếch đại thụ thể và kích thích tăng sinh tế bào ác tính.
  • Đánh giá ý nghĩa của các đột biến điểm N546K (exon 12) và R576W (exon 13) trên gen FGFR; bàn luận về sự biến đổi điện tích bề mặt phân tử protein kinase theo nghiên cứu của Rand và tiềm năng đáp ứng với chất ức chế thụ thể FGFR (như JNJ-42756493 theo nghiên cứu của Anna Luisa Di Stefano).
• Về đặc điểm lâm sàng và thời gian sống: Phân tích sự khác biệt về độ tuổi, tỷ lệ giới tính, kích thước khối u; bàn luận sâu về sự phân chia hai thể lâm sàng nguyên phát và thứ phát theo cơ chế biến đổi gen; đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến thời gian sống sau phẫu thuật và điều trị bổ trợ ở bệnh nhân mang các đột biến gen nghiên cứu.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án mang lại các đóng góp cụ thể về mặt lý luận và thực tiễn y học:

• Đóng góp về lý luận và dữ liệu khoa học: Đây là nghiên cứu hệ thống tại Việt Nam xác định đồng thời đặc tính đột biến trên ba gen quan trọng (TP53, EGFR, FGFR) ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm. Công trình cung cấp bằng chứng thực nghiệm về tần suất đột biến điểm trên exon 7, 8 gen TP53; đột biến điểm trên exon 2, 3, 7 và đột biến mất đoạn exon 2-7 (EGFRvIII) gen EGFR; cũng như đột biến điểm trên exon 12, 13 gen FGFR.
• Đóng góp về thực tiễn và ứng dụng lâm sàng: Xây dựng và chuẩn hóa quy trình phân tích sinh học phân tử kết hợp giữa PCR, giải trình tự Sanger và kỹ thuật MLPA từ nguồn mẫu mô paraffin thường quy. Kết quả cung cấp cơ sở phân tử giúp các thầy thuốc lâm sàng tiên lượng bệnh và định hướng nghiên cứu áp dụng các phác đồ điều trị đích kháng tyrosin kinase.

Dưới đây là bảng tổng hợp tiêu chuẩn phân biệt hai thể bệnh u nguyên bào thần kinh đệm nguyên phát và thứ phát theo phân loại WHO 2016 được luận án sử dụng làm cơ sở đối chiếu lý thuyết:

Đặc điểm so sánh	Thể nguyên phát	Thể thứ phát
Phân loại phân tử theo WHO 2016	UNBTKĐ IDH hoang dã	UNBTKĐ IDH đột biến
Tỷ lệ gặp trong quần thể	Khoảng 90%	Khoảng 10%
Độ tuổi trung bình mắc bệnh	62 tuổi	44 tuổi
Tỷ lệ Nam / Nữ	1,42	1,05
Thời gian tiến triển lâm sàng	4 tháng	15 tháng
Thời gian sống sau Phẫu thuật + Xạ trị	9,9 tháng	14 tháng
Thời gian sống sau Phẫu thuật + Xạ trị + Hóa chất	15 tháng	31 tháng
Tỷ lệ đột biến gen TP53	27%	81%
Tỷ lệ khuếch đại gen EGFR	35%	Hiếm gặp
Tỷ lệ đột biến gen ATRX	Hiếm gặp	71%
Tỷ lệ đột biến vùng khởi động TERT	72%	26%
Tỷ lệ đột biến gen PTEN	24%	Hiếm gặp

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi và nội dung trình bày trong văn bản luận án, các hạn chế và định hướng nghiên cứu được ghi nhận:

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Phạm vi phân tích đột biến mới tập trung vào một số exon chọn lọc có tần suất biến đổi cao (exon 7, 8 của TP53; exon 2, 3, 7 và xóa đoạn exon 2-7 của EGFR; exon 12, 13 của FGFR) chứ chưa tiến hành giải trình tự toàn bộ các exon của cả ba gen.
  • Chưa tiến hành khảo sát dạng đột biến chuyển đoạn dung hợp gen FGFR3-TACC3 do giới hạn về điều kiện kỹ thuật và phạm vi đề tài.
  • Tại thời điểm nghiên cứu, Khoa Giải phẫu bệnh Bệnh viện Việt Đức chưa áp dụng phân loại tích hợp di truyền của WHO 2016 trong chẩn đoán mô bệnh học thường quy, do đó luận án sử dụng tiêu chuẩn phân loại của WHO 2007.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng giải trình tự toàn bộ các vùng mã hóa của các gen sinh ung thư và ức chế khối u trên cỡ mẫu lớn hơn.
  • Triển khai kỹ thuật xác định đột biến dung hợp gen FGFR3-TACC3 ở bệnh nhân UNBTKĐ.
  • Đưa hệ thống phân loại tích hợp mô bệnh học và sinh học phân tử theo chuẩn cập nhật của WHO vào quy trình chẩn đoán lâm sàng tại Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

• Đối tượng phục vụ: Bác sĩ chuyên khoa Ngoại thần kinh, Ung bướu, Giải phẫu bệnh, Hóa sinh Y học, cùng các nghiên cứu sinh, học viên cao học, bác sĩ nội trú thuộc các chuyên ngành Y sinh học.
• Nội dung đáng tham khảo:
  • Quy trình thực nghiệm tách chiết DNA từ mẫu mô đúc paraffin và các thông số kỹ thuật tối ưu hóa cho phản ứng PCR, MLPA và giải trình tự gen.
  • Hệ thống dữ liệu đối chiếu về cơ chế bệnh sinh phân tử của các thụ thể tyrosin kinase (EGFR, FGFR) và gen ức chế khối u TP53.
  • Phương pháp luận trong việc phân tích mối liên quan giữa các biến đổi phân tử với đặc điểm lâm sàng và thời gian sống sau điều trị phối hợp.

Câu hỏi thường gặp

1. Khối u nguyên bào thần kinh đệm được WHO xếp vào cấp độ ác tính nào và tiên lượng sống ra sao?
U nguyên bào thần kinh đệm phát triển từ tế bào thần kinh đệm chưa biệt hóa hoặc biệt hóa thấp, 100% mang tính chất ác tính và được WHO xếp vào độ IV. Bệnh tiến triển nhanh, thời gian sống trung bình của bệnh nhân chỉ từ 6 tháng đến 1 năm dù được điều trị tích cực; tỷ lệ sống sau 5 năm rất thấp, chỉ khoảng 5,5%.

2. Đột biến xóa đoạn EGFRvIII trên gen EGFR có đặc điểm cấu trúc phân tử như thế nào?
Biến thể EGFRvIII là dạng đột biến mất đoạn từ exon 2 đến exon 7 của gen EGFR, tương ứng với việc mất 801 cặp base (từ nucleotide 275 đến 1075 trên cDNA) và mất đoạn acid amin từ vị trí 6 đến 273 trên phân tử protein thụ thể EGFR.

3. Sự khác biệt về tỷ lệ đột biến gen TP53 và khuếch đại EGFR giữa hai thể bệnh UNBTKĐ nguyên phát và thứ phát theo WHO 2016 là gì?
Ở thể nguyên phát (IDH hoang dã), tỷ lệ đột biến TP53 chỉ chiếm khoảng 27% trong khi khuếch đại EGFR chiếm khoảng 35%. Ngược lại, ở thể thứ phát (IDH đột biến), tỷ lệ đột biến gen TP53 chiếm tới 81% nhưng hiện tượng khuếch đại EGFR lại rất hiếm gặp.

4. Hai đột biến điểm được khảo sát trên gen FGFR1 trong luận án là gì và gây biến đổi gì trên phân tử protein?
Hai đột biến điểm được khảo sát là N546K (nằm trên exon 12) và R576W (nằm trên exon 13). Hai đột biến này làm thay đổi cấu trúc bề mặt phân tử protein FGFR1 tại vùng hoạt tính tyrosin kinase, làm giảm điện tích dương và phá vỡ các liên kết nội phân tử, từ đó kích hoạt hiện tượng tự phosphoryl hóa bất thường của thụ thể.

5. Các loại hóa chất điều trị bổ trợ chính cho bệnh nhân UNBTKĐ được nêu trong văn bản gồm những loại nào và liều dùng ra sao?
Các hóa chất gồm: Temozolomide (liều 7,5 mg/m²/ngày trong 6 tuần, sau đó duy trì 150 mg/m² x 5 ngày/tháng trong 6 tháng); Carmustine (BCNU dạng mảng cấy phân hủy sinh học 7,7 mg x 8 mảng đặt tại khoang mổ cắt u); và Bevacizumab (kháng thể đơn dòng truyền tĩnh mạch liều 10 mg định kỳ 2 tuần một lần).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Thơm đã thực hiện khảo sát đặc điểm đột biến trên ba gen TP53, EGFR và FGFR ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm tại Việt Nam bằng kỹ thuật PCR, MLPA và giải trình tự gen từ mẫu mô paraffin. Công trình làm rõ mối liên quan giữa các biến đổi phân tử này với các đặc điểm lâm sàng như độ tuổi, giới tính, kích thước khối u, phân loại thể bệnh nguyên phát/thứ phát và thời gian sống sau điều trị phối hợp phẫu thuật, xạ trị, hóa chất. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học phục vụ chẩn đoán mô bệnh học - phân tử, đánh giá tiên lượng và định hướng ứng dụng các liệu pháp điều trị đích trong thực hành y học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. Đại cương về u nguyên bào thần kinh đệm 1. Tình hình mắc u nguyên bào thần kinh đệm trong nước và trên thế giới Tổng thể về điều tra mắc UNBTKĐ trên thế giới chưa đồng đều, ví dụ ở Mỹ năm nào cũng có nghiên cứu báo cáo về tình hình mắc bệnh, hay ở Anh, Phần lan, Đan mạch thường 5 năm báo cáo một lần…, song ở các châu lục khác, như châu Á hay châu Phi, thống kê về bệnh còn lẻ tẻ và rất ít. Qua các báo cáo cho thấy tỷ lệ mắc UNBTKĐ không giống nhau giữa các châu lục, ở các nước Châu Âu và Mỹ có tỷ lệ mắc cao hơn các nước châu Á, tại Mỹ tỉ lệ mắc mới hàng năm là 3,2/100000 dân [4], tỷ lệ mắc cao nhất là ở Anh (4,64/100.000 dân/năm) [19], và các nước Bắc Âu số người mắc bệnh giao động từ 3,3 - 5,1/100.000 đối với nam giới và 2,1-3,5/100.000 phụ nữ, tỷ lệ mắc bệnh gia tăng hàng năm, tăng trung bình hàng năm ở nam giới: 9,2% và phụ nữ: 8,8%, sự gia tăng cao nhất ở nhóm tuổi già nhất, nam là 12,4%, nữ là 10,5% [20], tỷ lệ mắc thấp hơn ở Phần Lan 2,0/100.

Tại Ấn độ hàng năm có từ 5-10/100,000 dân mắc u não và thần kinh trung ương, trong đó tỷ lệ mắc UNBTKĐ chiếm 22,8% [22]. Tỷ lệ mắc bệnh rất thấp ở Hàn quốc 0,66/100000 dân/năm [23]. Nam giới thường mắc UNBTKĐ nhiều hơn nữ giới, và người da trắng có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn người da màu [4]. Tại Việt Nam chưa thấy có báo cáo về tỷ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đệm trong cả nước, một số các nghiên cứu đã đưa ra kết quả cho thấy tỉ lệ bệnh khá cao: theo thống kê của Lê Xuân Trung và Nguyễn Như Bằng năm 1975, u nguyên bào thần kinh đệm chiếm 18% trong 408 ca mổ u não tại bệnh luan an 5 viện Việt Đức [24].

Nghiên cứu của Kiều Đình Hùng (2006), trong các loại u thần kinh đệm ác tính thì UNBTKĐ chiểm tỷ lệ cao nhất 62,7% [25]. Nghiên cứu của Trần Chiến (2011) tỉ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đệm là 39,3% trong số các u thần kinh đệm hình sao, nam mắc bệnh cao hơn nữ, tuổi trung bình 43,03 ± 3,37, tuổi hay gặp nhất từ 51-60 tuổi, thấp nhất 13 tuổi, cao nhất 71 tuổi [26]. Theo Dương Đại Hà và Hà Kim Trung (2014), u nguyên bào thần kinh đệm chiếm 33,3%, có độ tuổi trung bình cao nhất trong các loại u thần kinh đệm [27]. Tất cả các nghiên cứu đều kết luận nam giới mắc bệnh UNBTKĐ cao hơn nữ giới, tỷ lệ mắc tăng theo lứa tuổi [ 4],[19],[20],[25].

Về độ tuổi mắc ở Việt nam trẻ hơn so với các nước: tuổi trung bình mắc UNBTKĐ là 43 ± 3,71, tuổi hay gặp nhất từ 51-60 tuổi (28,8%) [ 26], trong khi đó ở Mỹ tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là nhóm trên 75 tuổi chiếm 24,43% [4]. Nhìn chung bệnh u nguyên bào thần kinh đệm ngày càng gia tăng, gặp nhiều ở tuổi trung niên trở lên, nam mắc bệnh cao hơn nữ, rất ác tính và tỉ lệ sống thường rất thấp, khoảng 5,5% sống qua 5 năm [4],[19],[21],[26]… 1. Phân loại u nguyên bào thần kinh đệm Tổ chức não và thần kinh trung ương khá đa dạng, bao gồm nhiều tuyến, nhiều loại tế bào; khi tổn thương cũng rất đa dạng, tùy vị trí, chức năng mà các tế bào đảm nhiệm sẽ gây ra các bệnh lý khác nhau, cùng gọi là u não song với mỗi loại tế bào khi bị bệnh sẽ có biểu hiện một dạng hình thái tổn thương.