Khóa luận tốt nghiệp ứng dụng kĩ thuật realtime pcr để phát hiện đột biến jak2 v617f trong hội chứng tăng sinh tủy

Khóa luận tốt nghiệp ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR phát hiện đột biến JAK2 V617F trong hội chứng tăng sinh tủy, hỗ trợ chẩn đoán bệnh hiệu quả.

• Tác giả: Bùi Quang Công
• Người hướng dẫn: TS. Dương Quốc Chính
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội - Trường Đại học Y Dược
• Chuyên ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học
• Đề tài: Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR để phát hiện đột biến JAK2-V617F trong hội chứng tăng sinh tủy
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về hội chứng tăng sinh tủy
• 1.1.1. Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học của hội chứng tăng sinh tủy
• 1.1.2. Tổng quan và cơ chế bệnh về gen liên quan đến hội chứng tăng sinh tủy
• 1.1.3. Tổng quan về gen JAK2-V617F
• 1.1.4. Đột biến gen JAK2
• 1.1.5. Một số kỹ thuật phát hiện các đột biến gen trong hội chứng tăng sinh tủy
• 1.1.5.1. Polymerase chain reaction (PCR) và AS - PCR
• 1.1.5.2. Nguyên lý kỹ thuật Real - time PCR. Taqman probe (Đầu dò) sử dụng trong Realtime - PCR
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 2.4. Thời gian địa điểm nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Thiết kế nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.2. Đánh giá nồng độ và chất lượng ADN trên máy quang phổ Nano Drop
• 2.5.3. Xét nghiệm phát hiện đột biến gen JAK2-V617F
• 2.5.4. Quản lý và phân tích số liệu
• 2.5.5. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Mô tả đặc điểm của đối tượng nghiên cứu
• 3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới
• 3.2. Taqpath sử dụng cho xét nghiệm Realtime-PCR phát hiện đột biến JAK2-V617F
• 3.3. Tối ưu chu trình nhiệt cho xét nghiệm Realtime-PCR phát hiện đột biến JAK2-V617F
• 3.4. Khảo sát độ nhạy của quy trình Realtime - PCR phát hiện đột biến JAK2-V617F
• 3.5. Ứng dụng quy trình Realtime-PCR phát hiện đột biến JAK2-V617F
• 3.6. Phân bố tỷ lệ đột biến trong nghiên cứu. Kết quả phân bố tỷ lệ thể bệnh dương tính với JAK2-V617F
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu
• 4.2. Hoàn thiện quy trình xét nghiệm gen JAK2-V617F trong hội chứng tăng sinh tủy
• 4.3. Ứng dụng quy trình Realtime - PCR phát hiện đột biến JAK2-V617F
• KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC – DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU

Tóm tắt

I. Đột biến JAK2 V617F và hội chứng tăng sinh tủy

Đột biến JAK2 V617F là một đột biến điểm phổ biến trong hội chứng tăng sinh tủy (HCTST), bao gồm các bệnh lý như bệnh đa hồng cầu (ĐHC), tăng tiểu cầu nguyên phát (TTCNP), và hội chứng xơ tủy (HCXT). Đột biến này được phát hiện ở 65-97% bệnh nhân ĐHC, 23-57% bệnh nhân TTCNP, và 35-57% bệnh nhân HCXT. Đột biến JAK2 V617F làm thay đổi cấu trúc protein JAK2, dẫn đến tăng sinh không kiểm soát các tế bào máu, gây ra các triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng.

1.1. Cơ chế bệnh sinh của đột biến JAK2 V617F

Đột biến JAK2 V617F xảy ra ở vị trí codon 617 trên exon 14 của gen JAK2, thay thế valine bằng phenylalanine. Điều này làm mất khả năng tự điều hòa của protein JAK2, dẫn đến tăng hoạt tính tyrosine kinase. Kết quả là các tế bào máu tăng sinh không kiểm soát, gây ra các rối loạn trong hội chứng tăng sinh tủy. Đột biến này cũng liên quan đến nguy cơ cao của các biến chứng huyết khối và xuất huyết.

1.2. Tầm quan trọng của đột biến JAK2 V617F trong chẩn đoán

Việc phát hiện đột biến JAK2 V617F đã cải thiện đáng kể quy trình chẩn đoán bệnh tủy. Đột biến này được coi là một dấu ấn sinh học quan trọng trong việc phân loại và điều trị các bệnh lý thuộc hội chứng tăng sinh tủy. Các phương pháp xét nghiệm di truyền như Realtime PCR đã được áp dụng rộng rãi để phát hiện đột biến này một cách chính xác và nhanh chóng.

II. Kỹ thuật Realtime PCR trong phát hiện đột biến JAK2 V617F

Kỹ thuật Realtime PCR là một phương pháp hiện đại và hiệu quả để phát hiện đột biến JAK2 V617F. Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với các phương pháp truyền thống như AS-PCR. Realtime PCR cho phép phát hiện đột biến trong thời gian ngắn, giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm chéo và tiết kiệm chi phí.

2.1. Nguyên lý hoạt động của Realtime PCR

Realtime PCR sử dụng đầu dò TaqMan để phát hiện sự khuếch đại DNA trong thời gian thực. Khi DNA đích được khuếch đại, đầu dò TaqMan phát ra tín hiệu huỳnh quang, cho phép xác định sự hiện diện của đột biến JAK2 V617F. Kỹ thuật này không cần thêm bước điện di sau phản ứng, giúp rút ngắn thời gian xét nghiệm.

2.2. Ưu điểm của Realtime PCR so với các phương pháp khác

So với AS-PCR, Realtime PCR có nhiều ưu điểm vượt trội như độ nhạy cao, thời gian thực hiện ngắn, và giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm chéo. Kỹ thuật này cũng cho phép định lượng mức độ đột biến, hỗ trợ trong việc theo dõi tiến triển bệnh và đánh giá hiệu quả điều trị.

III. Ứng dụng của Realtime PCR trong chẩn đoán hội chứng tăng sinh tủy

Realtime PCR đã được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán đột biến gen JAK2 V617F ở bệnh nhân hội chứng tăng sinh tủy. Kỹ thuật này không chỉ giúp chẩn đoán chính xác mà còn hỗ trợ trong việc phân loại bệnh và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp.

3.1. Phân tích di truyền trong chẩn đoán bệnh tủy

Phân tích di truyền bằng Realtime PCR cho phép xác định sự hiện diện của đột biến JAK2 V617F trong các mẫu bệnh phẩm. Điều này giúp chẩn đoán sớm và chính xác các bệnh lý thuộc hội chứng tăng sinh tủy, từ đó cải thiện hiệu quả điều trị và tiên lượng bệnh.

3.2. Giá trị thực tiễn của Realtime PCR trong lâm sàng

Realtime PCR đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong các phòng xét nghiệm di truyền. Kỹ thuật này không chỉ giúp phát hiện đột biến JAK2 V617F mà còn hỗ trợ trong việc theo dõi tiến triển bệnh và đánh giá hiệu quả điều trị. Điều này mang lại lợi ích lớn cho cả bệnh nhân và nhân viên y tế.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Hội chứng tăng sinh tủy (Myeloproliferative Neoplasms - MPNs) là một nhóm rối loạn dị dòng ác tính của hệ tạo máu, đặc trưng bởi sự tăng sinh không kiểm soát của một hoặc nhiều dòng tế bào máu trong tủy xương. Nhóm bệnh lý này bao gồm bốn thể kinh điển: Bệnh đa hồng cầu nguyên phát (ĐHC/Polycythemia Vera - PV), Bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát (TTCNP/Essential Thrombocythemia - ET), Hội chứng xơ tủy (HCXT/Primary Myelofibrosis - PMF) và Bệnh bạch cầu kinh dòng tủy (BCKDT/Chronic Myeloid Leukemia - CML). Về mặt dịch tễ học, đa hồng cầu nguyên phát có tỷ lệ mắc hàng năm khoảng 1–3/100.000 dân, thường gặp ở độ tuổi 60–70; tăng tiểu cầu nguyên phát có tỷ lệ mắc từ 0,6–2,5/100.000 dân, chủ yếu ở lứa tuổi 30–60; trong khi hội chứng xơ tủy có tỷ lệ khoảng 0,5–1,5/100.000 dân với độ tuổi chẩn đoán trung bình trên 70 tuổi. Thời gian sống sót trung bình của bệnh nhân mắc ĐHC là 13,5 năm, TTCNP là 19,8 năm và HCXT là 5,9 năm, kèm theo nguy cơ cao chuyển dạng thành lơ xê mi cấp hoặc xơ tủy tiến triển, gây gánh nặng y tế và kinh tế nặng nề.

Về mặt di truyền phân tử, đột biến điểm $JAK2\text{-}V617F$ (thay thế Guanine bằng Thymine tại vị trí nucleotide 1849 trên exon 14 của gen JAK2, làm biến đổi acid amin Valine thành Phenylalanine tại codon 617) được xác định là tiêu chuẩn vàng mang tính chất quyết định trong tiêu chuẩn chẩn đoán các khối u tân sinh dòng tủy theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO 2016). Tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương cũng như nhiều cơ sở xét nghiệm tại Việt Nam, xét nghiệm thường quy phát hiện đột biến này chủ yếu dựa trên kỹ thuật PCR alen đặc hiệu (Allele-Specific PCR - AS-PCR). Tuy nhiên, AS-PCR bộc lộ các nhược điểm thực tế: quy trình nhiều bước thủ công, thời gian kéo dài, tiêu tốn nhiều hóa chất, độ nhạy hạn chế ở mức 7,5% và nguy cơ ngoại nhiễm, lây nhiễm chéo cao trong quá trình mở nắp điện di gel agarose sau PCR. Kỹ thuật Realtime PCR (RT-PCR) sử dụng mẫu dò TaqMan vận hành trong hệ thống kín, tích hợp khuếch đại và nhận tín hiệu huỳnh quang đồng thời, giúp rút ngắn thời gian và hạn chế ngoại nhiễm.

Xuất phát từ thực tiễn trên, khóa luận xác định 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến $JAK2\text{-}V617F$ bằng kỹ thuật Realtime-PCR.
2. Ứng dụng quy trình xét nghiệm gen $JAK2\text{-}V617F$ xác định đột biến gen ở bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính bằng kỹ thuật Realtime-PCR.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: 200 mẫu ADN tách chiết từ các bệnh nhân người Việt Nam được chẩn đoán mắc hội chứng tăng sinh tủy mạn tính theo tiêu chuẩn WHO 2016 tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương (bao gồm 133 bệnh nhân TTCNP, 48 bệnh nhân ĐHCNP, 6 bệnh nhân HCXT và 13 bệnh nhân HCTST chưa phân loại). Tiêu chuẩn loại trừ gồm các bệnh nhân có nhiễm sắc thể Philadelphia dương tính ($\text{Ph}^+$) hoặc tăng sinh tủy thứ phát.
• Phạm vi không gian: Khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương.
• Phạm vi thời gian: Thu thập mẫu từ tháng 01/2021 đến tháng 12/2021; thời gian thực hiện nghiên cứu từ tháng 06/2021 đến tháng 05/2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên nền tảng sinh học phân tử về con đường truyền tín hiệu nội bào JAK-STAT. Gen JAK2 định vị tại nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 9 (9p24), kích thước khoảng 152 kb gồm 15 exon, mã hóa protein Janus kinase 2 nặng 130 kDa gồm 1132 acid amin. Protein này cấu tạo bởi 7 vùng chức năng (JH1–JH7), trong đó JH1 mang hoạt tính xúc tác tyrosine kinase và JH2 là miền pseudokinase có chức năng tự ức chế kìm hãm JH1. Đột biến soma $JAK2\text{-}V617F$ tại exon 14 làm phá vỡ chức năng ức chế của miền JH2, dẫn đến việc kích hoạt liên tục và tự phát hoạt tính tyrosine kinase của JAK2 ngay cả khi không có sự gắn kết của các phối tử (ligand) ngoại bào như Erythropoietin (EPO), Thrombopoietin (TPO) hay G-CSF. Tín hiệu này phosphoryl hóa thụ thể và các protein STAT, kích thích phiên mã không kiểm soát các gen tăng sinh và biệt hóa tế bào máu dòng tủy.

Về nguyên lý kỹ thuật, nghiên cứu áp dụng phương pháp Realtime PCR định tính sử dụng mẫu dò TaqMan (TaqMan probe). Mẫu dò là một đoạn oligonucleotide (24–30 nucleotide) đặc hiệu cho trình tự đích, mang chất phát huỳnh quang (Reporter) ở đầu 5' và chất hấp phụ huỳnh quang (Quencher) ở đầu 3'. Khi phản ứng kéo dài chuỗi diễn ra, hoạt tính $5'\rightarrow 3'$ exonuclease của enzyme Taq DNA polymerase sẽ thủy phân mẫu dò gắn trên mạch khuôn, giải phóng Reporter ra khỏi Quencher, làm phát tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng bản sao ADN được tổng hợp qua từng chu kỳ nhiệt.

Phương pháp nghiên cứu thực tế bao gồm:

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang mô tả kết hợp hồi cứu trên mẫu lưu trữ.
• Đo lường nồng độ và chất lượng ADN: Sử dụng máy quang phổ NanoDrop dựa trên định luật Beer-Lambert ($A = \varepsilon C L$) đo mật độ quang ở bước sóng 260 nm và 280 nm; đánh giá độ tinh sạch qua tỷ số $A_{260}/A_{280}$ (chuẩn từ 1,8 đến 2,0).
• Thử nghiệm hóa chất và tối ưu hóa điều kiện phản ứng: Thử nghiệm đối chứng giữa hai loại hóa chất TaqPath Multiplex Master Mix và TaqPath qPCR Master Mix; tối ưu hóa chu trình nhiệt (nhiệt độ và thời gian gắn mồi - kéo dài) trên máy QuantStudio 5 để loại trừ tín hiệu dương tính giả ở các chu kỳ muộn ($C_t > 32$).
• Đánh giá ngưỡng phát hiện (LOD): Khảo sát độ nhạy qua dãy pha loãng nồng độ mẫu ADN đối chứng mang đột biến so với phương pháp AS-PCR truyền thống.
• Thành phần phản ứng chuẩn hóa (tổng thể tích 15 $\mu\text{l}$): TaqPath qPCR Master Mix (7,5 $\mu\text{l}$); Mồi xuôi kiểu dại Primer JAK2_wt_F (1,0 $\mu\text{l}$); Mồi ngược kiểu dại Primer JAK2_wt_R (1,0 $\mu\text{l}$); Mồi xuôi đột biến Primer JAK2-V617F_mut_F (1,0 $\mu\text{l}$); Mồi ngược đột biến Primer JAK2V617F_R (1,0 $\mu\text{l}$); Probe JAK2_wt_P (0,5 $\mu\text{l}$); Probe JAK2-V617F_P (0,5 $\mu\text{l}$); ADN khuôn 100 ng (2,5 $\mu\text{l}$).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 hệ thống hóa các kiến thức cơ bản về dịch tễ học, cơ chế bệnh sinh học phân tử và tiêu chuẩn chẩn đoán hội chứng tăng sinh tủy theo WHO 2016. Tác giả trình bày chi tiết về cấu trúc phân tử gen JAK2, cơ chế tự ức chế của miền JH2 đối với miền xúc tác JH1 và hậu quả của đột biến điểm nucleotide $1849\text{G}>\text{T}$ dẫn đến đột biến acid amin $V617F$. Bên cạnh JAK2, chương này cũng khái quát các đột biến liên quan khác như BCR-ABL, CALR (chiếm 25–30% trong TTCNP, hơn 30% trong HCXT) và MPL (chiếm 2–5% trong TTCNP, 5–10% trong HCXT). Ngoài ra, tác giả phân tích nguyên lý, ưu điểm và hạn chế của các phương pháp sinh học phân tử hiện có: giải trình tự Sanger/NGS, phản ứng chuỗi polymerase alen đặc hiệu (AS-PCR) và kỹ thuật Realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu. Bộ mẫu gồm 200 mẫu ADN lưu trữ tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương từ tháng 01/2021 đến tháng 12/2021. Quy trình gồm các bước: đo nồng độ và độ tinh sạch ADN bằng máy NanoDrop; thử nghiệm lựa chọn Master Mix; tối ưu hóa chu trình nhiệt trên hệ thống QuantStudio 5; xác định giới hạn phát hiện (LOD) của RT-PCR so với AS-PCR; và ứng dụng quy trình phân tích trên toàn bộ 200 bệnh nhân. Chương này cũng trình bày chi tiết danh mục trang thiết bị, vật liệu (E.A Blood DNA Mini Kit, TaqPath qPCR Master Mix, chứng dương POS, chứng âm NC, chứng trắng $\text{H}_2\text{O}$) và các nguyên tắc đạo đức nghiên cứu y sinh học.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được qua các giai đoạn nghiên cứu:

• Đặc điểm nhóm bệnh nhân: Tỷ lệ giới tính gồm 99 nam (49%) và 101 nữ (51%). Độ tuổi trung bình là $59,03 \pm 15,21$ tuổi (từ 5 đến 91 tuổi), trong đó nhóm 51–70 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất (47%, $n=94$), nhóm $\le 50$ tuổi chiếm 29,5% ($n=59$) và nhóm $\ge 71$ tuổi chiếm 23,5% ($n=47$). Phân bố thể bệnh: TTCNP chiếm 66,5% ($n=133$), ĐHCNP chiếm 24,0% ($n=48$), HCXT chiếm 3,0% ($n=6$) và HCTST chưa phân loại chiếm 6,5% ($n=13$).
• Đánh giá ADN: Nồng độ ADN đo được trên NanoDrop đều đạt $> 100\text{ ng/}\mu\text{l}$, tỷ số $A_{260}/A_{280}$ nằm trong giới hạn tinh sạch từ 1,87 đến 1,92.
• Lựa chọn Master Mix: TaqPath Multiplex Master Mix cho tín hiệu huỳnh quang không ổn định trên kênh nội kiểm FAM (mẫu chứng dương POS xuất hiện ở chu kỳ 24, chứng âm NC xuất hiện ở chu kỳ 22). Ngược lại, TaqPath qPCR Master Mix cho đường cong khuếch đại rõ nét, tín hiệu huỳnh quang ổn định, không có tín hiệu ở mẫu trắng $\text{H}_2\text{O}$.
• Tối ưu hóa chu trình nhiệt: Chu trình nhiệt chuẩn ($95^\circ\text{C}$ trong 2 giây $\rightarrow 95^\circ\text{C}$ trong 15 giây, $60^\circ\text{C}$ trong 60 giây $\times 40$ chu kỳ) xuất hiện tín hiệu huỳnh quang muộn ở chu kỳ $>32$ của kênh đột biến trên các mẫu âm tính. Sau khi điều chỉnh sang chu trình tối ưu: Khởi đầu $50^\circ\text{C}$ (2 phút), Biến tính $60^\circ\text{C}$ (30 giây), Hoạt hóa $95^\circ\text{C}$ (5 phút), sau đó chạy 40 chu kỳ gồm $95^\circ\text{C}$ (15 giây) và $61^\circ\text{C}$ (40 giây), phản ứng đã loại trừ hoàn toàn tín hiệu dương tính giả ở các mẫu âm tính, trong khi các mẫu dương tính cho tín hiệu rõ ràng từ chu kỳ 21.
• Khảo sát ngưỡng phát hiện (LOD): Kỹ thuật AS-PCR có LOD là 7,5% (khảo sát trên 13 mẫu pha loãng), trong khi kỹ thuật Realtime PCR tối ưu đạt LOD là 1%.
• Ứng dụng trên 200 bệnh nhân: Phát hiện 113/200 mẫu dương tính với đột biến $JAK2\text{-}V617F$ (56,5%) và 87/200 mẫu âm tính (43,5%). Kỹ thuật RT-PCR phát hiện thêm 2 mẫu dương tính (mẫu số 51 và 89) mà trước đó AS-PCR cho kết quả âm tính.

Thể bệnh	Tổng số mẫu ($n$)	Số mẫu $JAK2\text{-}V617F$ (+)	Tỷ lệ dương tính (%)
Đa hồng cầu nguyên phát (ĐHC)	48	24	50,00%
Tăng tiểu cầu nguyên phát (TTCNP)	133	76	57,14%
Hội chứng xơ tủy (HCXT)	6	4	66,67%
Tăng sinh tủy chưa phân loại	13	7	53,85%
Tổng cộng	200	113	56,50%

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tập trung phân tích ý nghĩa của các phát hiện thực nghiệm. Tác giả đối chiếu đặc điểm dịch tễ của nhóm nghiên cứu với y văn quốc tế, khẳng định giới tính không ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc HCTST. Về mặt kỹ thuật, việc nâng nhiệt độ gắn mồi/kéo dài chuỗi từ $60^\circ\text{C}$ lên $61^\circ\text{C}$ và giảm thời gian từ 60 giây xuống 40 giây đã tăng cường tính đặc hiệu liên kết của mồi và mẫu dò TaqMan, triệt tiêu hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu gây dương tính giả ở các chu kỳ muộn. Ngưỡng phát hiện LOD 1% của quy trình hoàn toàn tương đương với các nghiên cứu công bố trên tạp chí The Journal of Molecular Diagnostics (LOD 0,01–5%), chứng minh tính khả thi khi triển khai thường quy. Tỷ lệ đột biến phát hiện trong thể TTCNP (57,14%) và HCXT (66,67%) phù hợp với các công bố quốc tế, trong khi tỷ lệ ở thể ĐHC (50%) có sự khác biệt nhất định so với y văn thế giới do đặc thù phân bố quần thể mẫu thu thập.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

• Đã thiết lập và tối ưu hóa thành công quy trình Realtime PCR sử dụng hóa chất TaqPath qPCR Master Mix và mẫu dò TaqMan trên hệ thống QuantStudio 5 để phát hiện đột biến $JAK2\text{-}V617F$.
• Chu trình nhiệt tối ưu được chuẩn hóa: Giai đoạn giữ nhiệt $50^\circ\text{C}$ (2 phút), $60^\circ\text{C}$ (30 giây), $95^\circ\text{C}$ (5 phút), tiếp nối bởi 40 chu kỳ gồm $95^\circ\text{C}$ (15 giây) và $61^\circ\text{C}$ (40 giây).
• Xác định ngưỡng phát hiện nhỏ nhất (LOD) của quy trình Realtime PCR đạt 1%, vượt trội hơn so với phương pháp AS-PCR truyền thống (LOD đạt 7,5%).
• Ứng dụng quy trình trên 200 mẫu bệnh nhân HCTST, xác định tỷ lệ dương tính chung là 56,5% (113/200 ca); phát hiện thêm 2 trường hợp mang đột biến (mẫu 51 và mẫu 89) bị bỏ sót bởi phương pháp AS-PCR.

Phương pháp	Ngưỡng phát hiện (LOD)	Thời gian và thao tác sau PCR	Nguy cơ ngoại nhiễm
AS-PCR (Thường quy)	7,5%	Kéo dài; phải mở nắp chạy điện di gel agarose	Cao (do sản phẩm khuếch đại phát tán)
Realtime PCR (Nghiên cứu)	1,0%	Nhanh; đọc tín hiệu huỳnh quang trực tiếp trong ống kín	Rất thấp (hệ thống ống kín hoàn toàn)

Đóng góp của đề tài

• Cung cấp một quy trình kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử có độ nhạy cao, độ đặc hiệu tốt, thao tác khép kín và an toàn sinh học, khắc phục nguy cơ lây nhiễm chéo của phương pháp AS-PCR tại các phòng xét nghiệm huyết học.
• Đóng góp số liệu thực nghiệm về tỷ lệ đột biến $JAK2\text{-}V617F$ trên các phân nhóm bệnh tăng sinh tủy tại Việt Nam, phục vụ trực tiếp cho công tác chẩn đoán phân biệt theo tiêu chuẩn WHO 2016.

Kiến nghị của tác giả

• Ứng dụng quy trình kỹ thuật Realtime PCR đã tối ưu vào thực hành xét nghiệm thường quy để nghiên cứu sâu hơn các đặc điểm di truyền của gen đột biến JAK2.
• Tiếp tục mở rộng nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp phát hiện đột biến $JAK2\text{-}V617F$ trực tiếp trên mẫu bệnh phẩm ARN.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Cỡ mẫu ở một số thể bệnh hiếm còn tương đối nhỏ (Hội chứng xơ tủy chỉ có 6 ca, thể chưa phân loại có 13 ca), chưa phản ánh toàn diện bức tranh dịch tễ học phân tử của toàn bộ các phân nhóm HCTST; nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở phân tích định tính trên mẫu ADN, chưa thực hiện định lượng gánh nặng alen đột biến (allele burden) và chưa mở rộng khảo sát các đột biến đồng thời khác như CALR hay MPL.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng nghiên cứu quy trình phát hiện đột biến trên mẫu ARN; nghiên cứu phát triển các quy trình định lượng tỷ lệ alen đột biến $JAK2\text{-}V617F$ nhằm theo dõi đáp ứng điều trị và đánh giá tồn dư tối thiểu của bệnh.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên môn giá trị cho:

• Sinh viên và học viên sau đại học ngành Kỹ thuật Xét nghiệm Y học, Y sinh học phân tử và Huyết học: Cung cấp tài liệu thực hành chi tiết về các bước tối ưu hóa phản ứng Realtime PCR, phương pháp đánh giá đường cong khuếch đại, xác định LOD và xử lý hiện tượng dương tính giả.
• Kỹ thuật viên và chuyên viên phòng xét nghiệm sinh học phân tử: Cung cấp thông số kỹ thuật cụ thể (thành phần mồi, mẫu dò TaqMan, chu trình nhiệt $61^\circ\text{C}$ - 40 giây) để chuyển đổi từ kỹ thuật AS-PCR thủ công sang Realtime PCR khép kín, nâng cao năng lực chẩn đoán hội chứng tăng sinh tủy theo chuẩn WHO.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao kỹ thuật Realtime PCR trong khóa luận lại có ngưỡng phát hiện (LOD) tốt hơn AS-PCR?

Kỹ thuật Realtime PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang TaqMan đặc hiệu kép kết hợp với hệ thống nhận diện quang học nhạy cảm cao của máy QuantStudio 5, cho phép ghi nhận tín hiệu khuếch đại ngay từ những chu kỳ đầu. Trong nghiên cứu này, Realtime PCR đạt ngưỡng phát hiện LOD 1%, trong khi AS-PCR phụ thuộc vào việc phát hiện băng điện di trên gel agarose có độ nhạy thấp hơn nhiều (LOD 7,5%), dẫn đến việc bỏ sót các mẫu có tỷ lệ tế bào mang đột biến thấp.

2. Tác giả đã xử lý hiện tượng dương tính giả ở các chu kỳ muộn như thế nào trong quá trình tối ưu chu trình nhiệt?

Khi áp dụng chu trình nhiệt chuẩn, kênh huỳnh quang đột biến xuất hiện tín hiệu muộn ở chu kỳ $>32$ trên các mẫu âm tính do hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu của mồi. Tác giả đã khắc phục bằng cách tăng nhiệt độ giai đoạn bắt cặp - kéo dài từ $60^\circ\text{C}$ lên $61^\circ\text{C}$ và rút ngắn thời gian phản ứng từ 60 giây xuống 40 giây, giúp tăng tính chọn lọc liên kết đặc hiệu của mồi và mẫu dò, loại bỏ hoàn toàn tín hiệu giả trên các mẫu âm tính.

3. Nguyên nhân khiến hóa chất TaqPath qPCR Master Mix được chọn thay vì TaqPath Multiplex Master Mix?

Trong các thử nghiệm ban đầu, TaqPath Multiplex Master Mix cho tín hiệu huỳnh quang không ổn định trên kênh nội kiểm FAM (mẫu chứng dương POS xuất hiện tín hiệu ở chu kỳ 24 trong khi chứng âm NC xuất hiện ở chu kỳ 22). Ngược lại, TaqPath qPCR Master Mix tạo ra đường cong khuếch đại điển hình, tín hiệu huỳnh quang giữa các kênh màu ổn định, kiểm soát nội kiểm rõ nét và không sinh tín hiệu ở mẫu chứng trắng $\text{H}_2\text{O}$.

4. Quy trình Realtime PCR đã phát hiện sự khác biệt cụ thể nào khi đối chiếu với kết quả AS-PCR trên 200 mẫu bệnh nhân?

Trong tổng số 200 mẫu thử nghiệm, quy trình Realtime PCR cho kết quả hoàn toàn trùng khớp với AS-PCR ở 198 mẫu, đồng thời phát hiện thêm 2 mẫu (mẫu số 51 và mẫu số 89) dương tính với đột biến $JAK2\text{-}V617F$ mà phương pháp AS-PCR thường quy trước đó đã kết luận âm tính. Điều này minh chứng cho ưu thế của quy trình mới trong việc giảm thiểu tỷ lệ âm tính giả.

5. Tỷ lệ phân bố đột biến $JAK2\text{-}V617F$ ở từng thể bệnh trong nghiên cứu này đạt kết quả ra sao?

Kết quả xét nghiệm trên 200 bệnh nhân cho thấy tỷ lệ dương tính với $JAK2\text{-}V617F$ lần lượt là: 50,00% ở bệnh đa hồng cầu nguyên phát (24/48 ca), 57,14% ở bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát (76/133 ca), 66,67% ở hội chứng xơ tủy (4/6 ca) và 53,85% ở nhóm tăng sinh tủy chưa phân loại (7/13 ca).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Bùi Quang Công đã hoàn thiện thành công quy trình kỹ thuật Realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan để phát hiện đột biến $JAK2\text{-}V617F$ trong hội chứng tăng sinh tủy với ngưỡng phát hiện đạt LOD 1%. Việc điều chỉnh chu trình nhiệt tại giai đoạn gắn mồi - kéo dài chuỗi ($61^\circ\text{C}$ trong 40 giây) đã khắc phục triệt để hiện tượng dương tính giả và loại bỏ nguy cơ lây nhiễm chéo so với kỹ thuật AS-PCR truyền thống. Ứng dụng quy trình trên 200 bệnh nhân tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đã xác định tỷ lệ mang đột biến chung là 56,5%, đồng thời phát hiện thêm các ca bệnh có tỷ lệ đột biến thấp bị bỏ sót trong thực hành thường quy. Công trình cung cấp một quy trình xét nghiệm sinh học phân tử tin cậy, có giá trị ứng dụng thực tiễn cao trong chẩn đoán và quản lý các bệnh lý tăng sinh tủy mạn tính.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về hội chứng tăng sinh tủy 1.1 Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học của hội chứng tăng sinh tủy Hội chứng tăng sinh tủy (HCTST) là bệnh ảnh hưởng đến cách các tế bào máu được sản xuất trong cơ thể. Các bệnh tăng sinh tủy được coi là rối loạn về dòng tế bào. Rối loạn về dòng tế bào xảy ra khi ADN của một tế bào gốc trong tủy xương có nhiều thay đổi. Các tế bào gốc tạo máu là loại tế bào máu non có khả năng phát triển thành một trong ba dòng tế bào máu chính: hồng cầu, bạch cầu hay tiểu cầu.

Các thay đổi ở tế bào gốc (tạo máu) khiến cho tế bào này sinh sản liên tục, tạo ra các tế bào bất thường, từ đó chúng phát triển thành một hay nhiều loại tế bào máu. Bệnh tăng sinh tủy thường tiến triển nặng hơn qua thời gian do số lượng tế bào máu dư thừa tích lũy ở tủy xương và máu ngoại vi. Cơ thể chúng ta thường sản xuất hàng tỷ tế bào máu mỗi ngày. Quá trình này xảy ra bên trong tủy xương.

Tủy xương chứa các tế bào gốc phát triển và trưởng thành thành tất cả các tế bào máu mà cơ thể cần: Hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu. Mỗi loại tế bào này có một công việc cụ thể để thực hiện bên trong cơ thể. Khi một người được chẩn đoán mắc HCTST, có điều gì đó không ổn trong quá trình sản xuất tế bào máu của họ. Tủy xương bắt đầu sản xuất quá nhiều tế bào máu hoặc đôi khi quá ít.

HCTST được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào loại ung thư máu vì tủy xương đang sản xuất các tế bào máu một cách không kiểm soát được. Bốn loại HCTST phổ biến được chia thành các rối loạn khác nhau vì mỗi loại ảnh hưởng đến mức độ tế bào máu theo một cách khác nhau. Bốn loại được chẩn đoán thường xuyên nhất này là: 1TTCNP, 2ĐHC, 3HCXT, 4 Bệnh bạch cầu kinh dòng tủy (BCKDT). Bệnh TTCNP là một loại ung thư tăng sinh tủy được đặc trưng bởi sự gia tăng số lượng tiểu cầu, tăng sản megakaryocytic và xu hướng xuất huyết 3 hoặc huyết khối.

Triệu chứng và dấu hiệu có thể bao gồm yếu, đau đầu, dị cảm đầu chi, chảy máu, và hồng ban với thiếu máu cục bộ. Hầu hết những người phát triển TTCNP được chẩn đoán ở tuổi 60 trở lên, nhưng có vẻ như chứng rối loạn này đang trở nên phổ biến hơn ở những người trẻ tuổi, đặc biệt là phụ nữ dưới 40 tuổi. Bệnh ĐHC là một rối loạn tăng sinh tủy mạn tính được đặc trưng bởi sự gia tăng hồng cầu bình thường về hình thái (dấu hiệu), nhưng cũng có các tế bào trắng và tiểu cầu. 10 đến 30% bệnh nhân cuối cùng tiến triển thành xơ tủy và suy tủy; 1,0 đến 2,5% chuyển lơ xê mi cấp.

Tăng nguy cơ xuất huyết và huyết khối động tĩnh mạch. Các biểu hiện thông thường gồm có lách to, các biến cố mạch máu lớn và vi mạch (ví dụ, các thiếu máu cục bộ thoáng qua, ban đỏ đau, đau nửa đầu mắt) và ngứa dưới nước không rõ nguyên nhân (ngứa khi tiếp xúc với nước nóng). Đa hồng cầu nguyên phát là bệnh phổ biến nhất trong các rối loạn tăng sinh tủy, tỷ lệ mắc ở Mỹ ước tính là 1,9/100.000 với tỷ lệ mắc tăng theo tuổi tác. Nó chủ yếu ảnh hưởng đến người trung niên và người cao tuổi và hầu như không được chẩn đoán ở trẻ em.

Hội chứng xơ tủy (HCXT) là một chứng rối loạn ảnh hưởng đến cách các tế bào máu được sản xuất trong cơ thể. Những người trên 60 tuổi có nhiều khả năng mắc bệnh này nhất, nam và nữ đều có nguy cơ mắc bệnh như nhau. HCXT ảnh hưởng đến tủy xương, “nhà máy” bên trong cơ thể chúng ta sản xuất tế bào máu. Bệnh nhân mắc HCXT thường có số lượng hồng cầu, bạch cầu và/hoặc tiểu cầu thấp dẫn đến thiếu máu, giảm bạch cầu trung tính và giảm tiểu cầu tương ứng.

HCXT được coi là một bệnh hiếm gặp. Số người được chẩn đoán mắc HCXT mỗi năm sẽ là hai đến ba trường hợp trên 100.000 và bệnh này phổ biến như nhau ở nam và nữ. Nó chủ yếu ảnh hưởng đến người trung niên và người cao tuổi và hiếm khi được chẩn đoán ở trẻ em. Bệnh bạch cầu kinh dòng tủy xuất hiện khi tế bào gốc vạn năng chuyển dạng ác tính và tăng sinh tủy, dẫn tới một sự sản xuất thừa quá mức các hạt bạch cầu hạt chưa trưởng thành.

Ước tính tại Hoa Kỳ vào năm 2020 sẽ có khoảng 8.450 trường hợp mắc bệnh bạch cầu kinh dòng tủy mới và khoảng 1.130 trường hợp tử vong. Tuổi trung bình của bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu kinh dòng tủy là 64 tuổi. Nguy cơ trung bình suốt đời của bệnh bạch cầu kinh 4 dòng tủy ở Hoa Kỳ ở cả hai giới là khoảng 0,19% (1 trong 526). Tổng quan và cơ chế bệnh về gen liên quan đến hội chứng tăng sinh tủy Hội chứng tăng sinh tủy đã được chứng minh là có liên quan đến một số đột biến gen như BCR-ABL và JAK2-V617F.

Trong đó, BCR-ABL là nguyên nhân gây ra bệnh bạch cầu mạn dòng tủy, JAK2-V617F gây bệnh đa hồng cầu, tăng tiểu cầu tiên phát và xơ tủy tiên phát. Việc xác định các đột biến soma của gen JAK2-V617F được tìm thấy ở khoảng 90% bệnh nhân đã cải thiện đáng kể phương pháp chẩn đoán cho rối loạn này. Cho đến nay, việc ngăn ngừa các biến cố về mạch máu là mục tiêu chính của điều trị và quản lý bệnh nhân mắc bệnh TTCPNP. Ngoài ra, một số phương pháp điều trị tế bào học chủ yếu được dùng cho những bệnh nhân có nguy cơ cao bị biến chứng mạch máu.

Các loại thuốc kích thích tế bào hiện đang được sử dụng bao gồm hydroxyurea, chủ yếu được sử dụng ở bệnh nhân lớn tuổi và interferon α được dùng chủ yếu ở bệnh nhân trẻ tuổi. Cả JAK2 và MPL đều là các protein điều chỉnh quá trình sản xuất tế bào máu. Calreticulin tham gia vào dòng canxi trong tế bào, điều này cũng rất quan trọng trong các tín hiệu tăng trưởng. Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng trong bệnh TTCNP khoảng 50-60% bệnh nhân có đột biến (hoặc thay đổi) trong protein JAK2, 25-30% có đột biến gen CALR và 2-5% bệnh nhân khác có đột biến protein MPL.

Khoảng 50-60% người mắc HCXT có đột biến (hoặc thay đổi) trong protein JAK2. Hơn 30% bệnh nhân có đột biến ở gen CALR, khoảng 5-10% bệnh nhân có đột biến ở thụ thể hormone tiểu cầu MPL. Trong bệnh PV khoảng 95% những người có đột biến gen JAK2-V617F. Hơn 2% bệnh nhân có đột biến ở một phần khác của gen JAK2 được gọi là exon 12.

5 Trên thực tế, rất nhiều bệnh nhân có thể chuyển từ dạng này sang dạng khác trong hội chứng tăng sinh tủy trong thời gian điều trị. Từ năm 2005, trên thế giới đã biết đến vai trò của gen JAK2 với điểm đột biến V617F trong cơ chế bệnh sinh của hội chứng tăng sinh tủy. Đột biến gen JAK2-V617F gặp hầu hết ở bệnh đa hồng cầu thực, gây bệnh tăng sinh tủy khoảng 50% ở tăng tiểu cầu tiên phát và xơ tủy. Bình thường gen JAK2 có vai trò trong sự phát triển dòng tủy bình thường do truyền các tín hiệu từ các receptor của các Cytokin và các yếu tố phát triển như Interleukin 3 (IL- 3), các yếu tố tạo máu như Erythropoietin, yếu tố kích thích tạo cụm đồng hạt và mônô (GM- CSF, G- CS.

Đột biến gen JAK2-V617F làm mất vai trò tự điều hòa của JAK2 gây tăng sinh không kiểm soát các tế bào máu. Tuy nhiên tại sao từ một đột biến có thể gây các bệnh tăng sinh tủy các dòng khác nhau thì vẫn chưa rõ ràng. Hiện nay, có rất nhiều báo cáo đã được công bố góp phần chẩn đoán bệnh di truyền hoặc định hướng chữa bệnh trong lâm sàng, Từ những phát hiện về cấu trúc và chức năng sinh học của các thành phần cấu tạo nên ADN, nhân loại đã từng bước khám phá được nhiều vấn đề khác nhau, đặt nền tảng cho nhiều nghiên cứu khác. Các acid deoxyribonucleic tạo nên gen, giúp duy trì các chức năng của tế bào dưới mức độ phân tử, cũng như quy định cấu trúc di truyền sinh học của tế bào.

Cần phân biệt thường biến và biến dị di truyền, thường biến là các biến dị biểu hiện ra ở kiểu hình do tác động của điều kiện môi trường, nó thể hiện mức phản ứng của kiểu gen đối với điều kiện môi trường, thường biến không di truyền. Biến dị di truyền là các biến đổi trong kiểu gen có thể được biểu hiện hoặc không ra kiểu hình, nguyên nhân có thể do ngẫu nhiên hoặc do cơ chế tái tổ hợp trong hệ gen hoặc do tác nhân đột biến lên ADN hay Nhiễm sắc thể như tác nhân hoá học, vật lý, sinh học. Đột biến gen là những biến đổi trong cấu trúc của gen, những biến đổi này có thể xảy ra trong quá trình giảm phân tạo giao tử ở tế bào sinh dục hoặc đột biến trong quá trình phát triển của tế bào sinh dưỡng, hay còn gọi là đột biến soma. Đột biến soma gây nên các biến đổi kiểu hình thể hiện ở mức độ mô hoặc cơ quan trong thế hệ một cá thể chứ không di truyền cho thế hệ sau qua 6 giao tử, thông thường những đột biến gen ít khi tạo ưu thế tiến hoá vì khả năng phá vỡ tính ổn định của bộ gen sinh vật, thay vào đó đột biến thường trung tính hoặc có hại, đối với động vật và con người các đột biến soma thường gây nên các hư hỏng ở mức độ tế bào, mô hoặc cơ quan nào đó ví dụ như ung thư.

Qua giao tử đột biến soma được ứng dụng nhiều nhất trong ghép cành, chiết cành ở thực vật, đặc biệt là những cây ăn quả, để đạt giống tốt, chống chịu sâu bệnh và các điều kiện khắc nghiệt khác. Nếu đột biến gen trội và được biểu hiện ra ngoài cơ thể thì được gọi là thể khảm. Tổng quan về gen JAK2-V617F 1. Gen JAK2 Janus kinase 2 (JAK2) là một protein thuộc nhóm Janus kinase (JAK1, JAK2, JAK3 và TYK2) có hoạt tính tyrosine kinase trong tế bào chất, là thành phần quan trọng, tham gia vào quá trình truyền tín hiệu từ các receptor của các yếu tố kích thích tạo máu (growth factor) và đóng vai trò chủ chốt trong con đường JAK-STAT (truyền tín hiệu và hoạt hóa phiên mã).

Gen JAK2 nằm trên cánh ngắn của NST số 9, (9p24) gồm 15 exon, dài khoảng 152kb, chứa các trình tự nucleotid mã hóa cho việc tổng hợp protein JAK2.