Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ sinh học với đề tài "Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (Nicotiana benthamiana) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens", chuyên ngành Sinh lý học thực vật (mã số 9 42 01 12), do nghiên cứu sinh Lê Thị Thủy thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Phạm Bích Ngọc và PGS. Chu Hoàng Hà tại Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào năm 2019.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Virus cúm A/H7N9 là một phân type trong nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, được phát hiện lần đầu tại Trung Quốc vào tháng 3 năm 2013. Bệnh do phân type này gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh và tỷ lệ tử vong cao ở gia cầm cũng như ở người. Trong đợt dịch đầu tiên (31/03/2013 đến 09/06/2013), virus đã lan ra 11 tỉnh thành của Trung Quốc, ghi nhận 131 ca nhiễm và 39 ca tử vong (WHO, 2013). Tính đến tháng 01/2018, trải qua 5 đợt dịch, Tổ chức Y tế Thế giới ghi nhận 1.624 trường hợp mắc cúm H7N9 ở người với ít nhất 621 ca tử vong tại Trung Quốc; đợt dịch thứ 5 (10/2016 đến 10/2017) có quy mô lớn nhất với 541 ca nhiễm. Thiệt hại đối với ngành công nghiệp gia cầm tại Trung Quốc ước tính lên tới 2,7 tỷ USD (Flannery, 2013). Dù Việt Nam chưa ghi nhận ca nhiễm cúm A/H7N9 trên người và gia cầm tại thời điểm nghiên cứu, nguy cơ xâm nhập rất lớn do đường biên giới trải dài giáp Trung Quốc.

Về mặt công nghệ vắc xin, phương pháp sản xuất vắc xin cúm truyền thống dựa trên phôi trứng gà vô trùng đòi hỏi thời gian chuẩn bị kéo dài từ 5 đến 6 tháng và phụ thuộc vào nguồn cung hàng trăm triệu quả trứng sạch bệnh mỗi năm (Kang và cs.; Wright, 2008). Trong khi đó, việc sản xuất protein tái tổ hợp bằng phương pháp tạo cây trồng chuyển gen ổn định thường gặp hạn chế do thời gian tạo dòng thuần kéo dài (3-9 tháng), mức độ tích lũy protein mục tiêu thấp (chỉ đạt 0,1% - 1,0% tổng lượng protein hòa tan - TSP) và quy trình tinh sạch tốn kém, phức tạp (Hood và cs.; Twyman và cs.). Để giải quyết khoảng trống này, hệ thống biểu hiện tạm thời (transient expression) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên cây mô hình Nicotiana benthamiana kết hợp công nghệ dung hợp polypeptide và vật liệu nano kim cương (Nanodiamonds - NDs) được lựa chọn để sản xuất kháng nguyên Hemagglutinin (HA) tái tổ hợp với tốc độ nhanh (1-2 tháng), năng suất tích lũy cao và quy trình tinh sạch đơn giản.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Biểu hiện và xác định được đặc điểm cấu trúc của kháng nguyên HA và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND (Nanodiamond).
  2. Đánh giá được hoạt tính sinh học, khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm của kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric và phức hệ HA trimeric:ND.

Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện các mục tiêu trên, luận án triển khai 4 nội dung nghiên cứu:

  • Nội dung 1: Thu thập thông tin, tổng hợp gen mã hóa kháng nguyên và thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên HA.
  • Nội dung 2: Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên HA của virus H7N9 ở lá cây thuốc lá.
  • Nội dung 3: Nghiên cứu tạo phức hệ và khả năng gây ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên HA và HA trimeric:ND (1:12).
  • Nội dung 4: Nghiên cứu khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND trên động vật thí nghiệm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Gen mã hóa kháng nguyên bề mặt Hemagglutinin (HA) của chủng virus cúm A/H7N9 (dựa trên trình tự của các chủng đại diện phân lập năm 2013 như A/Shanghai/2/2013 và A/Anhui/1/2013); các vector tách dòng pRTRA và vector biểu hiện thực vật pCB301; chủng vi khuẩn Escherichia coli và Agrobacterium tumefaciens; cây thuốc lá Nicotiana benthamiana; vật liệu nano kim cương (NDs); chuột bạch BALB/c phục vụ thử nghiệm sinh học.
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng Thử nghiệm sinh học thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
  • Phạm vi thời gian: Luận án phân tích dữ liệu dịch tễ từ khi dịch cúm A/H7N9 bùng phát năm 2013 đến năm 2018 và hoàn thành công trình thực nghiệm vào năm 2019.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được điểm lại trong văn bản

  1. Cấu trúc sinh học phân tử và nguồn gốc virus cúm A/H7N9: Virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, hệ gen gồm 8 phân đoạn ARN sợi đơn âm mã hóa cho 11 protein (Murphy và Webster, 1996; Rabadan và cs.). Kháng nguyên bề mặt gồm Hemagglutinin (HA, phân đoạn 4) và Neuraminidase (NA, phân đoạn 6) với tỷ lệ phân bố khoảng 4HA/1NA (Bender và cs., 1999; Zhou và cs.; Wagner và cs., 2002). Virus cúm A/H7N9 phân lập năm 2013 là dạng tái tổ hợp phân đoạn gen từ 3 nguồn: gen HA từ virus cúm vịt A/H7N3 (đại diện chủng A/duck/Zhejiang/12/2011), gen NA từ virus cúm chim hoang dã A/H7N9 (đại diện chủng A/wild bird/Korea/A14/2011) và 6 phân đoạn gen nội (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) từ chủng cúm gà A/H9N2 (đại diện chủng A/brambling/Beijing/16/2012) (Gao và cs., 2013; Liu và cs., 2013; Yang và cs., 2013; Cui và cs., 2014; Feng và cs., 2013; Yu và cs., 2014). Vị trí phân cắt protease giữa HA1 và HA2 của virus H7N9 là PEIPKGR/GLF, không mang mạch liên tục các axit amin kiềm như ở các chủng H5N1 độc lực cao (Senne và cs., 1996; Subbarao và cs.; Li và cs.). Tuy nhiên, đột biến thay thế axit amin Q226L trên HA1 làm tăng ái lực liên kết với thụ thể liên kết alpha-2,6 của tế bào động vật có vú và người thay vì thụ thể alpha-2,3 của gia cầm (Paulson và cs.; Herfst và cs., 2012; Imai và cs.).
  2. Công nghệ phát triển vắc xin cúm: Bên cạnh vắc xin bất hoạt nuôi cấy trên trứng gà (Kilbourne, 1969; Fiore và cs., 2009; Hickling và D'Hondt, 2006) và vắc xin ADN (Kodihalli và cs.), công nghệ di truyền ngược đã tạo ra các giống gốc vắc xin cúm A/H7N9 từ chủng A/Shanghai/2/2013 và A/Anhui/1/2013 (như NIBRG-267, NIBRG-268, NIIDRG-10.1, IDCDC-RG32A, IDCDC-RG33A do CDC Hoa Kỳ, NIBSC Anh, NIID Nhật Bản phát triển) (WHO; Gao và cs.). Vắc xin tiểu đơn vị hạt tương tự virus (VLP) được Novavax sản xuất trên tế bào côn trùng thông qua baculovirus tái tổ hợp (Fries và cs., 2013).
  3. Tình hình vắc xin cúm gia cầm tại Việt Nam: Dịch cúm A/H5N1 xuất hiện tại Việt Nam từ cuối năm 2003 với sự lưu hành phức tạp của nhiều phân nhánh (clade 1, clade 2.1A, clade 2.1B, clade 2.1C) và sự xuất hiện của phân type H5N6 từ năm 2014 (Nguyễn Hoàng Đăng và cs., 2016; Nguyễn Đăng Thọ và cs., 2016; Cục Thú y, 2014-2017). Các nghiên cứu đánh giá hiệu lực vắc xin thương mại (Navet-vifluvac, Re-5, Re-6) chống lại biến chủng cường độc H5N1 clade 2.1C cho thấy tỷ lệ bảo hộ đạt lần lượt 80%, 40% và 90% (Tô Long Thành và cs., 2014; Trần Xuân Hạnh và cs., 2013; Nguyễn Ngọc Tiến và cs., 2011, 2013).
  4. Biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật (Molecular farming): Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên trong thực vật được khởi xướng bởi Curtiss và Cardineau (1990) với kháng nguyên SpaA của Streptococcus, và Mason và cs. (1992) với kháng nguyên HBsAg. Hệ thống thực vật có ưu thế biến đổi sau dịch mã như glycosyl hóa (Cabanes-Macheteau và cs.; Bakker và cs.), chi phí sản xuất thấp (bằng 2-10% hệ thống lên men và 0,1% nuôi cấy tế bào động vật) và không bị tạp nhiễm virus động vật (Fischer và cs., 2000; Daniell và cs.; Schillberg và cs.; Twyman và cs.). Phương pháp biểu hiện tạm thời thông qua thâm nhập A. tumefaciens (agroinfiltration) vào gian bào lá giúp thu nhận protein mục tiêu sau 2-5 ngày mà không phụ thuộc vào vị trí xen chèn gen vào nhiễm sắc thể (Kapila và cs., 1997; Santi và cs.; Rivera và cs.; Peyret và cs., 2013; Voinnet và cs.).
  5. Chiến lược tối ưu hóa tích lũy và tinh sạch: Sử dụng promoter CaMV 35S mạnh (Sun và cs., 2002; Tepfer và cs., 2004); gắn tín hiệu lưu giữ mạng lưới nội chất (KDEL) ở đầu C để tăng độ bền và giảm thủy phân protease (Conrad và Fiedler, 1998; Hellwig và cs.; Wirth và cs.); dung hợp với chuỗi Elastin-like polypeptides (ELP, motif VPGXG lặp lại) giúp tăng mức tích lũy protein và cho phép tinh sạch bằng chu kỳ chuyển pha nghịch đảo dựa trên màng (mITC) mà không cần dùng sắc ký cột tốn kém (Meyer và Chilkoti, 1999, 2002a, 2002b; Ge và cs., 2006; Conley và cs., 2009; Joensuu và cs., 2009, 2010; Hoang Trong Phan và Conrad, 2011; Floss và cs., 2009).
  6. Vật liệu nano kim cương (NDs): Hạt NDs có kích thước 2-8 nm, cấu trúc tinh thể lập phương xen kẽ liên kết lai hóa sp2 và sp3, có tính tương thích sinh học cao và khả năng hấp phụ phân tử sinh học để phân phối kháng nguyên (Sheemah Kazi, 2014; Rohit và cs.).

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Luận án giải quyết vấn đề tạo nguồn kháng nguyên HA của virus cúm A/H7N9 có cấu trúc oligomer (dạng trimer tự nhiên) với hàm lượng biểu hiện cao trong mô lá N. benthamiana, tối ưu hóa quy trình tinh sạch qua màng mITC và sắc ký ái lực IMAC, đồng thời phát triển phức hệ kháng nguyên kích thước nano giữa HA trimeric và hạt nano kim cương (HA trimeric:ND) nhằm nâng cao hoạt tính ngưng kết hồng cầu và khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể trên mô hình động vật.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm áp dụng

  • Cấu trúc bậc bốn của protein Hemagglutinin: Kháng nguyên HA của virus cúm tồn tại tự nhiên dưới dạng homotrimer hình trụ dài khoảng 130 Å. Cấu trúc trimer gồm vùng đầu hình cầu HA1 (chứa vị trí liên kết thụ thể bề mặt tế bào) và vùng thân HA2 neo màng (Wagner và cs., 2002; Bosch và cs.; Chen và cs.).
  • Hệ thống biểu hiện tạm thời thông qua chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens: Đoạn T-DNA mang cụm biểu hiện gen HA được vi khuẩn chuyển vào nhân tế bào thực vật, thực hiện phiên mã mức độ cao dưới sự điều khiển của promoter CaMV 35S và kết thúc bởi trình tự 35S Terminator. Đoạn tín hiệu bài tiết (SP) hướng protein vào mạng lưới nội chất (ER) và motif KDEL ở đầu C giữ protein tại ER.
  • Dung hợp ELP và nguyên lý chuyển pha mITC: Chuỗi polypeptide ELP có khả năng chuyển pha thuận nghịch khi thay đổi nhiệt độ và nồng độ muối (NaCl 2M), cho phép thu hồi protein tái tổ hợp thông qua lọc màng cellulose acetate 0,2 µm.
  • Khái niệm tạo phức hệ nano kháng nguyên (VLP-like complex): Gắn kết vật lý protein HA trimeric lên bề mặt hạt nano kim cương NDs nhằm tăng kích thước cấu trúc và diện tích bề mặt trình diện kháng nguyên, mô phỏng cấu trúc của hạt virus tự nhiên.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

  1. Phương pháp thiết kế gen và cấu trúc vector: Gen HA của virus cúm A/H7N9 được tổng hợp nhân tạo và tối ưu hóa codon. Luận án thiết kế và tạo dòng 4 cấu trúc biểu hiện trên nền vector pRTRA và vector biểu hiện thực vật pCB301:
    • pCB301_35S_HA mono_ELP: Mang gen HA đơn phân dung hợp chuỗi ELP và c-myc tag.
    • pCB301_35S_HA trimeric_ELP: Mang gen HA chứa domain tạo trimer dung hợp chuỗi ELP và c-myc tag.
    • pCB301_35S_HA trimeric: Mang gen HA chứa domain tạo trimer, c-myc tag và 6xHis tag.
    • pCB301_35S_SP_His_HA trimeric-IgMFc: Mang gen HA chứa domain tạo trimer dung hợp domain tạo polymer của chuỗi nặng kháng thể IgMFc. Các cấu trúc được biến nạp vào chủng Agrobacterium tumefaciens qua phương pháp sốc nhiệt hoặc điện biến nạp.
  2. Phương pháp biểu hiện tạm thời và tối ưu hóa: Nuôi cấy các chủng A. tumefaciens, thu sinh khối tế bào, pha huyền phù vi khuẩn và tiêm vào gian bào lá cây thuốc lá N. benthamiana từ 5-6 tuần tuổi bằng bơm kim tiêm. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện thông qua thiết kế thí nghiệm dãy trực giao Taguchi $L_9 (3^4)$ khảo sát 4 yếu tố: nồng độ vi khuẩn (OD600), thời gian thu hoạch (ngày sau tiêm - dpi), việc sử dụng vector hỗ trợ ức chế hiện tượng câm lặng gen sau phiên mã (Hc-Pro PRSV hoặc 2b CMV).
  3. Phương pháp tách chiết và tinh sạch protein:
    • Tinh sạch qua màng mITC (Membrane-based Inverse Transition Cycling): Đồng hóa mô lá, xử lý dịch chiết thô với NaCl 2M và nồng độ PEG tối ưu, cho qua màng lọc cellulose acetate kích thước lỗ 0,2 µm dưới áp lực hút chân không (Vacuubrand), rửa sạch protein tạp bằng dung dịch muối cao và hòa tan thu hồi protein đích bằng nước cất lạnh.
    • Sắc ký ái lực ion kim loại cố định IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography): Sử dụng cột sắc ký gắn ion Niken ($Ni^{2+}$) liên kết đặc hiệu với đuôi 6xHis trên protein HA trimeric và HA trimeric-IgMFc, giải hấp bằng imidazole hoặc hạ pH.
  4. Phương pháp phân tích hóa sinh và miễn dịch học:
    • Điện di SDS-PAGE và Western blot: Phân tích khối lượng phân tử và nhận diện protein bằng kháng thể kháng c-myc hoặc kháng His gắn enzyme HRP.
    • Phản ứng liên kết ngang (Cross-linking assay): Sử dụng hóa chất liên kết chéo (như BS3/glutaraldehyde) để xác định sự hình thành cấu trúc oligomer/trimer của protein HA.
    • Phản ứng gây ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination assay - HA test): Xác định hiệu giá HAU (Hemagglutination Unit) của các kháng nguyên tinh sạch trên hồng cầu gà pha loãng 1%.
  5. Phương pháp tạo phức hệ HA trimeric:ND: Trộn protein HA trimeric tinh sạch với dung dịch huyền phù nano kim cương NDs (kích thước 2-8 nm) theo các tỷ lệ khối lượng khác nhau, kiểm tra sự gắn kết qua Western blot và đánh giá hoạt tính ngưng kết hồng cầu.
  6. Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch in vivo: Tiêm kháng nguyên HA trimeric và phức hệ HA trimeric:ND (1:12) trên chuột bạch BALB/c theo sơ đồ tiêm nhắc lại; thu thập mẫu huyết thanh chuột ở các thời điểm và xác định hàm lượng kháng thể IgG đặc hiệu kháng HA bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp (Enzyme-linked Immunosorbent Assay).
  7. Xử lý số liệu thống kê: Phân tích phương sai (ANOVA) các công thức thí nghiệm trong ma trận trực giao $L_9 (3^4)$ bằng phần mềm chuyên dụng.

Bảng tổng hợp các cấu trúc vector và đặc tính kỹ thuật

Tên cấu trúc vector Promoter / Terminator Trình tự đích & Thẻ dung hợp Phương pháp tinh sạch Dạng cấu trúc dự kiến
pCB301_35S_HA mono_ELP CaMV 35S / 35S Ter SP, KDEL, c-myc, ELP tag mITC (qua màng 0,2 µm) Monomer
pCB301_35S_HA trimeric_ELP CaMV 35S / 35S Ter SP, KDEL, c-myc, Trimer domain, ELP tag mITC (qua màng 0,2 µm) Trimer dung hợp ELP
pCB301_35S_HA trimeric CaMV 35S / 35S Ter SP, KDEL, c-myc, Trimer domain, 6xHis tag IMAC ($Ni^{2+}$ resin) Trimer
pCB301_35S_SP_His_HA trimeric-IgMFc CaMV 35S / 35S Ter SP, KDEL, 6xHis, Trimer domain, IgMFc domain IMAC ($Ni^{2+}$ resin) Oligomer / Polymer bậc cao

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1 tổng thuật chi tiết 4 nhóm nội dung lý thuyết và thực tiễn:

  1. Đặc điểm cấu trúc của virus cúm A/H7N9: Phân tích cơ sở di truyền học phân tử của 8 phân đoạn ARN sợi đơn âm; cơ chế tái tổ hợp tạo phân type H7N9 từ 3 chủng cúm tiền thân (H7N3 vịt, H7N9 chim hoang dã và H9N2 gia cầm); các vị trí đột biến axit amin quan trọng liên quan đến khả năng thích ứng trên tế bào người và tăng độc lực trên mô hình động vật thí nghiệm (Bảng 1.1 trong văn bản: G186V, Q226L/I trên gen HA; E627K, D701N, K702R trên gen PB2; I368V trên gen PB1; L336M, K356R, S409N trên gen PA; D92A, N205S trên gen NS1); diễn biến 5 đợt dịch tại Trung Quốc (2013-2018) với 1.624 ca nhiễm và 621 ca tử vong.
  2. Vắc xin phòng chống bệnh cúm A: Phân tích ưu nhược điểm của 3 hướng vắc xin chính (vắc xin bất hoạt, vắc xin tiểu đơn vị, vắc xin DNA); tổng hợp các chủng giống gốc vắc xin cúm A/H7N9 được chuyển giao quốc tế (IDCDC-RG32A, NIBRG-268...); điểm lại tình hình tiến hóa các nhánh cúm A/H5N1 tại Việt Nam (clade 1, 2.1A, 2.1B, 2.1C) và hiệu lực bảo hộ của vắc xin Navet-vifluvac, Re-5, Re-6 trước biến chủng cường độc; tiềm năng sản xuất vắc xin trong thực vật (molecular farming).
  3. Biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vật thông qua Agrobacterium: Trình bày nguyên lý chuyển gen tạm thời vào mô lá N. benthamiana; phân tích các yếu tố nâng cao năng suất protein gồm promoter CaMV 35S, trình tự tín hiệu dẫn định vị lưới nội chất KDEL, vai trò của protein hỗ trợ ức chế câm lặng gen Hc-Pro và 2b; nguyên lý dung hợp ELP và quy trình tinh sạch mITC so sánh với phương pháp sắc ký ái lực IMAC.
  4. Nano kim cương (NDs) và những ứng dụng tiềm năng: Trình bày cấu trúc tinh thể cacbon lai hóa sp2/sp3 kích thước 2-8 nm, tính chất cơ lý, tính tương thích sinh học và ứng dụng làm chất mang phân phối phân tử sinh học và kháng nguyên trong công nghệ sinh học.

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 trình bày chi tiết vật liệu sinh học, thiết kế kỹ thuật và các quy trình thực nghiệm:

  • Vật liệu: Các chủng vi khuẩn E. coli, A. tumefaciens; các vector dòng mẹ pRTRA, pCB301; cây thuốc lá Nicotiana benthamiana; hạt nano kim cương NDs (2-8 nm); chuột bạch BALB/c; các cặp mồi PCR đặc hiệu khuếch đại gen HA và kiểm tra cấu trúc vector (Bảng 2.1).
  • Phương pháp: Quy trình thiết kế và lắp ráp 4 cấu trúc gen HA vào vector pCB301; phương pháp biến nạp và nuôi cấy A. tumefaciens; quy trình tiêm lá thuốc lá (agroinfiltration); thiết kế thí nghiệm trực giao Taguchi $L_9 (3^4)$ để tối ưu hóa đồng thời 4 yếu tố biểu hiện; quy trình tinh sạch mITC dựa trên xử lý nhiệt độ, muối NaCl 2M, nồng độ PEG và lọc qua màng cellulose acetate 0,2 µm; quy trình tinh sạch IMAC trên cột Ni-NTA; quy trình phân tích SDS-PAGE, Western blot với kháng thể kháng c-myc/His-tag; phản ứng liên kết ngang xác định cấu trúc trimer; phản ứng ngưng kết hồng cầu gà 1% (HA test); quy trình tạo phức hệ HA trimeric:ND theo các tỷ lệ khối lượng; quy trình tiêm miễn dịch trên chuột BALB/c và kỹ thuật ELISA gián tiếp xác định chuẩn độ kháng thể IgG; phương pháp xử lý số liệu và phân tích phương sai ANOVA.

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được theo 4 nội dung:

  1. Tổng hợp nhân tạo và thiết kế vector biểu hiện mang gen HA: Nhân dòng thành công gen HA từ sản phẩm tổng hợp nhân tạo; xây dựng thành công 4 vector chuyển gen thực vật gồm pCB301_35S_HA mono_ELP, pCB301_35S_HA trimeric_ELP, pCB301_35S_HA trimeric và pCB301_35S_SP_His_HA trimeric-IgMFc; kiểm tra tính chính xác của các cấu trúc bằng PCR và cắt enzyme giới hạn BamHI/PspOMI (Hình 3.1 đến Hình 3.12).
  2. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện và tinh sạch protein HA tái tổ hợp:
    • Thí nghiệm trực giao $L_9 (3^4)$ và phân tích phương sai (ANOVA) xác định việc đồng biểu hiện với vector hỗ trợ ức chế câm lặng gen Hc-Pro PRSV hoặc 2b CMV làm tăng rõ rệt nồng độ protein HA trong lá thuốc lá (Bảng 3.1, Bảng 3.2).
    • Tối ưu hóa thành công nồng độ PEG và muối cho quy trình mITC (Hình 3.15); tinh sạch thành công HA mono_ELP và HA trimeric_ELP bằng mITC với độ tinh sạch cao, không bị phân hủy bởi protease thực vật (Hình 3.19, Hình 3.20); tinh sạch thành công HA trimeric và HA trimeric-IgMFc bằng cột sắc ký ái lực IMAC (Hình 3.16, Hình 3.18).
    • Phản ứng liên kết ngang (cross-linking) chứng minh protein HA trimeric biểu hiện trong thực vật có khả năng tự lắp ráp tạo thành cấu trúc trimer ổn định (Hình 3.21).
  3. Tạo phức hệ và đánh giá khả năng ngưng kết hồng cầu:
    • Kết hợp thành công protein HA trimeric với hạt nano kim cương NDs; sàng lọc Western blot xác định tỷ lệ phối trộn tối ưu HA trimeric:ND là 1:12 (Hình 3.24).
    • Đánh giá hoạt tính ngưng kết hồng cầu gà (HA test): Protein HA mono_ELP không có hoạt tính ngưng kết; HA trimeric_ELP và HA trimeric đạt hiệu giá ngưng kết 2 HAU; HA trimeric-IgMFc có hoạt tính ngưng kết; đặc biệt phức hệ HA trimeric:ND (tỷ lệ 1:12) đạt hiệu giá ngưng kết hồng cầu lên tới 1024 HAU tại nồng độ 5 µg protein ở giếng đầu tiên (Bảng 3.3, Hình 3.25, Hình 3.26).
  4. Khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm:
    • Thử nghiệm tiêm trên chuột BALB/c (Hình 3.27, Hình 3.28); kết quả ELISA định lượng kháng thể trong huyết thanh cho thấy cả HA trimeric và phức hệ HA trimeric:ND (1:12) đều kích thích chuột sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng HA, trong đó phức hệ HA trimeric:ND (1:12) tạo đáp ứng kháng thể IgG cao hơn rõ rệt so với HA trimeric dạng tự do (Hình 3.29).

Bảng tổng hợp mức độ biểu hiện và hiệu giá ngưng kết hồng cầu của các dạng kháng nguyên HA

Dạng kháng nguyên tái tổ hợp Phương pháp tinh sạch Khả năng hình thành Trimer/Oligomer Hiệu giá ngưng kết hồng cầu (HAU) (5 µg protein giếng đầu) Khả năng kích thích sinh kháng thể IgG trên chuột
HA mono_ELP mITC Không (Monomer) 0 HAU (Không ngưng kết) Chưa đánh giá in vivo
HA trimeric_ELP mITC Có (Trimer) 2 HAU Chưa đánh giá in vivo
HA trimeric IMAC Có (Trimer) 2 HAU Có sinh kháng thể IgG đặc hiệu
HA trimeric-IgMFc IMAC Có (Oligomer bậc cao) Dương tính Chưa đánh giá in vivo
Phức hệ HA trimeric:ND (1:12) Phối trộn vật lý Có (Phức hệ hạt nano) 1024 HAU Sinh kháng thể IgG đặc hiệu ở mức cao

Chương 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 4 tập trung biện luận chuyên sâu 4 vấn đề:

  1. Chiến lược thiết kế gen và vector biểu hiện: Lựa chọn trình tự HA tối ưu; tính ưu việt của việc bổ sung domain trimerization giúp protein tái tổ hợp tự cuộn gấp đúng cấu hình không gian bậc bốn; cơ chế dung hợp thẻ ELP và IgMFc trong hỗ trợ biểu hiện và tinh sạch.
  2. Biểu hiện tạm thời trong lá thuốc lá: Phân tích cơ chế hoạt động của các protein hỗ trợ (suppressor) Hc-Pro PRSV và 2b CMV trong việc ức chế con đường câm lặng gen qua trung gian RNAi của tế bào thực vật, giúp kéo dài thời gian phiên mã và tích lũy protein đích; tính ổn định của protein khi được lưu giữ trong mạng lưới nội chất nhờ tín hiệu KDEL.
  3. Đặc tính hóa sinh và hoạt tính ngưng kết hồng cầu: Giải thích nguyên nhân dạng đơn phân HA mono_ELP không có hoạt tính ngưng kết hồng cầu do thiếu cấu trúc trimer liên kết đa điểm; dạng HA trimeric đạt 2 HAU; sự gia tăng hiệu giá lên 1024 HAU ở phức hệ HA trimeric:ND (1:12) được chứng minh là do các phân tử HA trimeric gắn kết dày đặc trên bề mặt hạt nano kim cương, mô phỏng cấu trúc gai kháng nguyên của hạt virus tự nhiên, tạo ái lực liên kết chéo mạnh mẽ với các thụ thể trên bề mặt hồng cầu.
  4. Đáp ứng miễn dịch in vivo: Phân tích cơ chế kích thích miễn dịch dịch thể của phức hệ nano HA trimeric:ND; hạt nano kim cương đóng vai trò như một chất mang/tá dược phân phối kháng nguyên, tăng cường khả năng bắt giữ và trình diện kháng nguyên của các tế bào trình diện kháng nguyên (APC), dẫn đến chuẩn độ kháng thể IgG đặc hiệu trong huyết thanh chuột tăng cao.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

  1. Đã thiết kế thành công 4 cấu trúc vector biểu hiện thực vật gồm pCB301/HA mono_ELP, pCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimeric-IgMFc mang gen HA được tổng hợp nhân tạo từ chủng virus cúm A/H7N9, đồng thời tạo được các chủng Agrobacterium tumefaciens mang các vector tương ứng phục vụ biểu hiện tạm thời.
  2. Biểu hiện và tinh sạch thành công các dạng protein HA tái tổ hợp (HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric, HA trimeric-IgMFc) trong lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana bằng hai phương pháp mITC và IMAC.
  3. Đã xác định được cấu trúc trimeric của kháng nguyên HA và chứng minh khả năng gây ngưng kết hồng cầu của protein tái tổ hợp: dạng HA trimeric_ELP và HA trimeric đạt hiệu giá 2 HAU; dạng phức hệ nano kim cương HA trimeric:ND (tỷ lệ 1:12) đạt hiệu giá ngưng kết hồng cầu 1024 HAU (ở lượng 5 µg protein tại giếng đầu tiên).
  4. Chứng minh các kháng nguyên HA dạng HA trimeric và phức hệ HA trimeric:ND (1:12) đều có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên mô hình chuột BALB/c, trong đó phức hệ HA trimeric:ND (1:12) kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh hơn rõ rệt so với HA trimeric đơn thuần.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

  • Ý nghĩa khoa học: Cung cấp dẫn liệu khoa học về việc thiết kế vector biểu hiện đa dạng mang gen kháng nguyên HA cúm A/H7N9; chứng minh tính khả thi của hệ thống biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá để sản xuất protein gai virus cúm có cấu trúc bậc bốn chính xác; cung cấp cơ sở sinh học phân tử về việc sử dụng hạt nano kim cương làm chất mang tăng cường hoạt tính sinh học và tính sinh miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp.
  • Ý nghĩa thực tiễn: Các cấu trúc vector và chủng A. tumefaciens tạo ra là nguồn vật liệu phục vụ nghiên cứu và phát triển vắc xin tiểu đơn vị phòng virus cúm; quy trình biểu hiện tạm thời và tinh sạch mITC/IMAC được tối ưu hóa có thể ứng dụng để sản xuất nhanh kháng nguyên cúm trong vòng 1-2 tháng khi có dịch bùng phát; phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND là ứng viên tiềm năng cho việc phát triển vắc xin tiểu đơn vị phòng bệnh cúm gia cầm tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Do điều kiện an toàn sinh học cấp cao đối với chủng virus cúm gia cầm A/H7N9 sống, luận án mới dừng lại ở việc đánh giá hoạt tính ngưng kết hồng cầu in vitro và định lượng chuẩn độ kháng thể IgG đặc hiệu kháng HA bằng ELISA trên chuột, chưa tiến hành thử nghiệm công cường độc (challenge test) bằng virus sống để đánh giá tỷ lệ bảo hộ sống sót trực tiếp trên động vật.
  • Phương pháp biểu hiện tạm thời trong luận án chủ yếu thực hiện bằng kỹ thuật tiêm áp lực qua bơm kim tiêm trên từng lá đơn ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa triển khai trên quy mô lớn bằng hệ thống buồng hút chân không công nghiệp.
  • Thử nghiệm sinh miễn dịch mới thực hiện trên động vật mô hình (chuột bạch BALB/c), chưa tiến hành thử nghiệm trực tiếp trên vật chủ đích là gia cầm (gà, vịt).

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng quy mô biểu hiện tạm thời trên sinh khối lớn cây N. benthamiana bằng hệ thống buồng hút chân không (vacuum infiltration).
  • Tiến hành thử nghiệm đáp ứng miễn dịch, khả năng bảo hộ và giảm bài thải virus của phức hệ HA trimeric:ND trên gia cầm (gà, vịt).
  • Hợp tác với các phòng thí nghiệm an toàn sinh học phù hợp để thực hiện thử nghiệm công cường độc với chủng virus cúm A/H7N9 phân lập thực tế.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên môn giá trị cho nhiều nhóm đối tượng và lĩnh vực nghiên cứu:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên: Chuyên ngành Sinh lý học thực vật, Công nghệ sinh học thực vật, Di truyền học và Vi sinh vật học có thể tham khảo phương pháp luận thiết kế vector biểu hiện thực vật mang các trình tự chức năng (domain tạo trimer, tín hiệu dẫn KDEL, thẻ dung hợp ELP, IgMFc), kỹ thuật agroinfiltration và phương pháp tối ưu hóa điều kiện thí nghiệm bằng dãy trực giao Taguchi $L_9 (3^4)$.
  • Các nhà nghiên cứu công nghệ sinh học dược phẩm và vắc xin: Có thể ứng dụng quy trình tinh sạch đảo pha dựa trên màng (mITC) để thu hồi nhanh protein dung hợp ELP với chi phí thấp mà không cần sử dụng hệ thống sắc ký cột đắt tiền; tham khảo kỹ thuật phối trộn và tạo phức hệ kháng nguyên với hạt nano kim cương (NDs) để tăng cường hoạt tính sinh học.
  • Các cơ sở nghiên cứu thú y và y tế dự phòng: Có thể tiếp nhận các cấu trúc vector và chủng vi khuẩn tái tổ hợp để phục vụ nghiên cứu chế tạo vắc xin tiểu đơn vị dự phòng nguy cơ bùng phát dịch cúm gia cầm A/H7N9 tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lựa chọn hệ thống biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá (Nicotiana benthamiana) thay vì t