Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm a h7n9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá nicotiana benthamiana thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Nghiên cứu kháng nguyên tái tổ hợp virus cúm A H7N9 qua biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá Nicotiana benthamiana bằng Agrobacterium tumefaciens.

• Tác giả: Lê Thị Thủy
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Bích Ngọc
• Trường học: Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Tạo Kháng Nguyên Tái Tổ Hợp Virus Cúm A/H7N9 Bằng Phương Pháp Biểu Hiện Tạm Thời Trong Cây Thuốc Lá
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu kháng nguyên virus cúm A H7N9

Nghiên cứu về kháng nguyên virus cúm A/H7N9 là một lĩnh vực quan trọng trong y học và công nghệ sinh học. Virus cúm A/H7N9, được phát hiện lần đầu tại Trung Quốc vào năm 2013, đã gây ra nhiều ca bệnh nghiêm trọng và tử vong. Việc phát triển các phương pháp sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp từ virus này là cần thiết để tạo ra vaccine hiệu quả. Nghiên cứu này tập trung vào việc sử dụng cây thuốc lá như một hệ thống biểu hiện tạm thời để sản xuất kháng nguyên HA của virus cúm A/H7N9.

1.1. Đặc điểm của virus cúm A H7N9 và tầm quan trọng của nghiên cứu

Virus cúm A/H7N9 thuộc họ Orthomyxoviridae, có khả năng lây lan nhanh và gây tử vong cao. Việc nghiên cứu virus cúm A/H7N9 giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và tính chất kháng nguyên của nó, từ đó phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu kháng nguyên virus cúm

Mục tiêu chính của nghiên cứu là biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên HA từ virus cúm A/H7N9 trong cây thuốc lá. Nội dung nghiên cứu bao gồm thiết kế vector chuyển gen, biểu hiện protein và đánh giá hoạt tính sinh học của kháng nguyên.

II. Thách thức trong việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp virus cúm A H7N9

Việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp từ virus cúm A/H7N9 gặp nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là hiệu suất biểu hiện protein trong cây thuốc lá. Hệ thống biểu hiện tạm thời cần được tối ưu hóa để đạt được hàm lượng protein cao và chất lượng tốt. Ngoài ra, việc tinh sạch protein cũng là một bước quan trọng để đảm bảo tính hiệu quả của kháng nguyên.

2.1. Vấn đề về hiệu suất biểu hiện protein trong cây thuốc lá

Hiệu suất biểu hiện protein trong cây thuốc lá thường không cao, điều này ảnh hưởng đến khả năng sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp. Cần có các chiến lược tối ưu hóa để cải thiện tình trạng này.

2.2. Khó khăn trong quá trình tinh sạch kháng nguyên

Quá trình tinh sạch kháng nguyên từ cây thuốc lá có thể gặp khó khăn do sự hiện diện của các protein không mong muốn. Việc phát triển các phương pháp tinh sạch hiệu quả là cần thiết để thu được kháng nguyên chất lượng cao.

III. Phương pháp biểu hiện tạm thời kháng nguyên virus cúm A H7N9

Phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được áp dụng để sản xuất kháng nguyên HA của virus cúm A/H7N9. Phương pháp này cho phép biểu hiện nhanh chóng và hiệu quả, giúp tạo ra kháng nguyên với hàm lượng cao trong thời gian ngắn. Hệ thống này có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống.

3.1. Quy trình biểu hiện tạm thời qua Agrobacterium

Quy trình biểu hiện tạm thời bao gồm việc chuyển gen mã hóa kháng nguyên vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Phương pháp này giúp tăng cường hiệu suất biểu hiện và giảm thời gian sản xuất.

3.2. Ưu điểm của phương pháp biểu hiện tạm thời

Phương pháp biểu hiện tạm thời có nhiều ưu điểm như thời gian sản xuất ngắn, hàm lượng protein cao và khả năng biểu hiện trong các mô đã biệt hóa. Điều này giúp tăng cường khả năng sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy kháng nguyên HA tái tổ hợp từ virus cúm A/H7N9 có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch tốt trên động vật thí nghiệm. Việc sản xuất kháng nguyên này không chỉ có ý nghĩa trong việc phát triển vaccine mà còn mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu và sản xuất vaccine từ thực vật. Các kháng nguyên này có thể được sử dụng để phát triển vaccine tiểu đơn vị hiệu quả.

4.1. Đánh giá hoạt tính sinh học của kháng nguyên HA

Kháng nguyên HA tái tổ hợp đã được đánh giá về khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch trên chuột. Kết quả cho thấy kháng nguyên này có khả năng tạo ra kháng thể IgG đặc hiệu, điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng trong vaccine.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất vaccine phòng bệnh cúm

Kháng nguyên HA tái tổ hợp có thể được sử dụng để phát triển vaccine phòng bệnh cúm A/H7N9. Việc sản xuất vaccine từ thực vật không chỉ tiết kiệm chi phí mà còn đảm bảo an toàn cho người sử dụng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về kháng nguyên virus cúm A/H7N9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển vaccine. Kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng lớn trong việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp với hiệu suất cao và khả năng kích thích miễn dịch tốt. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất và đánh giá hiệu quả của vaccine trên quy mô lớn.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong bối cảnh dịch bệnh

Trong bối cảnh dịch bệnh ngày càng gia tăng, việc nghiên cứu và phát triển vaccine là rất cần thiết. Nghiên cứu này góp phần quan trọng trong việc chuẩn bị cho các tình huống khẩn cấp liên quan đến dịch cúm.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực vaccine thực vật

Hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc cải thiện hiệu suất biểu hiện và phát triển các kháng nguyên mới từ virus cúm. Việc kết hợp công nghệ nano với kháng nguyên tái tổ hợp cũng là một lĩnh vực tiềm năng để nâng cao hiệu quả vaccine.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. 1 1 Tính cấp thiết của đề tài. 1 2 Mục tiêu nghiên cứu. 3 3 Nội dung nghiên cứu.

3 4 Những đóng góp mới của luận án. 3 5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án. 4 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.1 Đặc điểm cấu trúc của virus cúm A/ H7N9.1 Nguồn gốc virus cúm A/H7N9.2 Đặc điểm cấu trúc virus cúm A/H7N9.3 Đa hợp tạo nên phân type A/H7N9.4 Đặc điểm kháng nguyên bề mặt của virus cúm A/H7N9.5 Tình hình dịch cúm A/H7N9.2 Vacxin phòng chống bệnh cúm A.1 Một số loại vacxin phòng bệnh cúm A hiện nay.2 Vacxin tái tổ hợp từ thực vật.3 Vacxin phòng bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam.4 Một số nghiên cứu về vắc xin cúm ở Việt Nam 21 1.3 Biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vật thông qua Agrobacterium.1 Hệ thống biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vât.2 Quá trình biểu hiện tạm thời thông qua Agrobacterium.3 Các chiến lƣợc tăng cƣờng biểu hiện protein tái tổ hơp ở thực vật……….4 Tinh sạch protein tái tổ hợp ở thực vật……………………………….4 Nano kim cƣơng (NDs) và những ứng dụng tiềm năng trong công nghệ sinh học.1 Giới thiệu chung về vật liệu nano kim cƣơng.2 Ứng dụng của Nanodiamons trong khoa học sự sống và công nghệ sinh học. 37 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.1 Chủng vi khuẩn.2 Các vector và vật liệu thực vật, động vật.3 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.2 Phƣơng pháp nghiên cứu.1 Các phƣơng pháp thiết kế gen, thiết kế vector chuyển gen và tạo chủng A.

tumefaciens cho biểu hiện tạm thời.2 Thiết kế cấu trúc vector mang gen HA phục vụ chuyển gen.3 Các phƣơng pháp trong biểu hiện tạm thời và đánh giá mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp trong lá thuốc lá.4 Tách chiết và tinh sạch protein tái tổ hợp …………………………….5 Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính sinh học của protein kháng nguyên tinh sạch……………………………………………………………….6 Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm……………………………… 55 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NHIÊN CỨU.1 Tổng hợp nhân tạo và thiết kế vector hỗ trợ biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên HA…………………………………………………….1 Tổng hợ nhân tạo gen mã hóa kháng nguyên HA…………………….2 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA mono_ELP.3 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric_ELP .4 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric.5 Tạo cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA trimeric-IgMFc. Tối ƣu các điểu kiện biểu hiện và tinh sạch protein HA tái tổ hợp.1 Tối ƣu các điểu kiện biểu hiện protein HA tái tổ hợp………………… 71 3.2 Kết quả biểu hiện và tinh sạch protein HA…………………………….3 Kết quả đánh giá khả năng hình thành oligomer của protein HA trimeric bằng phản ứng liên kết ngang……………………………….3 Kết quả tạo phức hệ, khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của kháng nguyên HA và phức hệ HA trimeric:ND .1 Kết quả tạo phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND.2 Đánh giá khả năng ngƣng kết hồng cầu của protein tinh sạch HA trimeric-IgMFc.3 Đánh giá khả năng ngƣng kết hồng cầu của protein tinh sạch HA mono_ELP và HA trimeric_ELP…………………………………….4 Đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA và phức hệ HA trimeric:ND trên động vật………….1 Kết quả thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch trên chuột…………….2 Khả năng kích thích tạo kháng thể IgG đặc hiệu với HA…………. 92 Chƣơng 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.1 Tổng hợp nhân tạo và thiết kế vector hỗ trợ biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên HA…………………………………………………….1 Lựa chọn gen trong thiết kế vector biểu hiện. Cấu trúc vector biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên HA .2 Biểu hiện tạm thời gen mã hóa kháng nguyên HA thông qua vi khuẩn Agrobacterium……………………………………………….1 Mức độ biểu hiện tạm thời các kháng nguyên tái tổ hợp.2 Khả năng hình thành oligomer.3 Khả năng tạo phức hệ và gây ngƣng kết hồng cầu của kháng nguyên HA .1 Khả năng tạo phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND.2 Khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của kháng nguyên HA và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND(1:12).4 Khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột.

105 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 108 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 110 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH. 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

115 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2b CMV Cucumber mosaic virus , (Protein 2b của virus khảm dƣa chuột) 35S Ter 35S Terminator (Trình tự kết thúc phiên mã) Aa Amino acid (axit amin) Bp Base pair (Cặp base) BSA Bovine serum albumin CaMV Cauliflower mosaic virus (Virus khảm súp lơ) Cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme linked immunosorbent assay ELP Elastin-like polypeptide ER Endoplasmic reticulum (Lƣới nội chất) Fc Fragment crystallizable HA Hemagglutinin HAU Hemagglutination unit HC-Pro Helper component protease (Protein hỗ trợ) HRP Horseradish peroxidase IgG Immunoglobulin G Immobilized Metal Affinity Chromatoraphy (sắc khí ái lực) IMAC Kb Kilobase KDa Kilodalton LB Luria-Bertani (Môi trƣờng nuôi vi khuẩn) mITC Membrane-based ITC (phƣơng pháp tinh sạch qua màng) NA Neuraminidase OD Optical density (Mật độ quang) PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction viii PCS Polycloning site ARN Ribonucleic acid RNase Ribonuclease SAP Shrimp alkaline phosphatase ScFv Single chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis TAE Tris Acetate EDTA TaqDNA Thermus aquaticus DNA polymerase polymerase TSP Total soluble protein (Protein tổng hợp) v/p vòng/phút VLP Virus-like particle WHO World Health Oganization WT Wild type (Cây không chuyển gen) viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số thay đổi axit amin liên quan đến khả năng lây nhiễm, gây bệnh và tính nhạy cảm với thuốc kháng virus của virus cúm gia cầm A(H7N9) phân lập từ đợt dịch thứ năm……………….2 Danh sách một số giống gốc vắc xin cúm A/H7N9 chuyển giao cho cơ sở có nhu cầu sản xuất………………………………….3 Sự so sánh các đặc trƣng kỹ thuật giữa CVD diamons, Titanium và thép không gỉ.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu gen HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc.2 Thành phần phản ứng PCR.3 Thành phần phản ứng nối ghép gen.4 Thiết kế thí nghiệm dãy trực giao L9 (34)……………………….1 Nồng độ protein HA trong mẫu lá biểu hiện tạm thời protein HA khi không sử dụng vector hỗ trợ và có sử dụng vector hỗ trợ HcPro PRSV/2b CMV………………………………………….2 Kết quả phân tích phƣơng sai của các công thức thí nghiệm trong thí nghiệm trực giao……………………………………….3 Mức độ biểu hiện và khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của protein HA. 90 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc virus cúm A.2 Nguồn ngôc các phân đoạn gen của chủng virus H7N9 tái tổ hợp.3 Mô hình cấu trúc Hemagglutinin.4 Sơ đồ mô tả bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm thời thông qua Agrobacterium………………………………………………………….5 Quy trình tinh sạch protein bằng phƣơng pháp mITC…………….6 Cấu trúc tinh thể của Nanodiamons……………………………….7 Hình ảnh minh họa cho ứng dụng ND trong dẫn thuốc………….1 Chuyển gen vào lá cây thuốc lá bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm thời nhờ A.2 Cơ chế gây phản ứng ngƣng kết hồng cầu. Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột bạch BALB/C.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen HA.2 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector pRTRA_HA mono_ELP.3 Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_ HA mono_ELP.4 Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_ HA mono_ELP.5 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme giới hạn BamHI/PspOMI.6 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric_ELP.7 Kết quả kiểm tra vector pCB301_35S_ HA trimeric_ELP bằng enzyme cắt giới hạn.8 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme giới hạn BamHI/PspOMI.9 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric.10 Kết quả kiểm tra vector pCB301_35S_ HA trimeric.11 Kết quả thiết kế vector pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric- IgMFc. 12 Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc.

13 Kết quả đánh giá biểu hiện kháng nguyên HA.14 Kết quả biểu hiện protein HA tại các điều kiện thí nghiệm khác nhau……………………………………………………………….15 Kết quả tối ƣu nồng độ PEG cho protein HA trimeric _ ELP……………………………………………………………… 77 Hình 3.16 Kết quả biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh học protein HA trimeric…………….17 Kết quả Western blot đánh giá sự biểu hiện của kháng nguyên HA.18 Kết quả tinh sạch HA trimeric-IgMFc bằng sắc ký ái lực.19 Đánh giá kết quả tinh sạch protein HA mono_ELP bằng SDS- PAGE và lai miễn dịch.20 Đánh giá kết quả tinh sạch protein HA trimeric_ELP bằng SDS- PAGE và lai miễn dịch ………………………………………….21 Kết quả kiểm tra khả năng hình thành oligomer của protein HA trimeric…….22 Kết quả tổng hợp và đặc điểm hạt NDs.23 Kết quả tổng hợp và tính chất vật lý của HA trimeric- ND.24 Kết quả sàng lọc tỷ lệ trộn HA trimeric và hạt ND đƣợc đánh giá bằng lai miễn dịch với kháng thể kháng cmyc.25 Kết quả phản ứng gây ngƣng kết hồng HA trimeric- IgFMc…………………………………………………………… 88 xi Hình 3.26 Kết quả ngƣng kết hồng cầu Hemagglutinin HA.27 Sơ đồ gây đáp ứng miễn dịch trên chuột……………………….28 Kết quả thì nghiệm gây đáp ứng miễn dịch trên chuột………….29 Đáp ứng kháng thể ở chuột đƣợc xác định bằng ELISA………. Tính cấp thiết của đề tài Virus cúm A/H7N9 là chủng virus cúm gia cầm đƣợc phát hiện tại Trung Quốc từ năm 2013. Cúm A/H7N9 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ gây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh (Gao và cs. Virus cúm A/H7N9 là một phân type trong nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae.

Trên bề mặt capsid của hạt virus có protein Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên HA có 18 type (ký hiệu từ H1 đến H18) và kháng nguyên NA có 11 type (ký hiệu từ N1 đến N11). Kháng nguyên HA đƣợc mã hóa bởi phân đoạn 4 của hệ gen virus cúm A, có đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng của tế bào nhiễm và phân đoạn 6 mã hóa cho neuraminidase (NA) là những protein nằm trên bề mặt có tính kháng nguyên và gây bệnh. HA có khả năng đột biến trong gen tạo nên sự khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, đặc biệt là điểm cắt của enzym protease ở vị trí có sự glycosyl hóa đã đƣợc xác định bao gồm Asn30, Asn46, Asn249 trên tiểu phần HA1 và Asn421, Asn493 trên tiểu phần HA2.

Cả 5 vị trí này đều có tính bảo thủ cao trên kháng nguyên H7 của các chủng virus H7N9 gây bệnh trên ngƣời và gia cầm, Gen HA gồm 2 đoạn là HA1 và HA2 nối với nhau bằng chuỗi oligopeptide, mã hóa cho gồm một dãy các amino acid là arginine và lysine (-RRRKK-), tạo nên điểm cắt của protease. Đây là vùng quyết định độc lực của virus hay tính gây bệnh của virus cúm. Phần HA1 và HA2 bộc lộ ra ngoài màng và có khả năng làm ngƣng kết hồng cầu và chịu trách nhiệm cho việc gắn kết virus vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ trong giai đoạn đầu tiên của quá trình xâm nhiễm (Svedda và cs.