Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là bệnh lý rối loạn di truyền tính trội trên nhiễm sắc thể thường liên quan đến quá trình chuyển hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoproteins - LDLs). Bệnh dẫn đến sự tích tụ và tăng cao bất thường của nồng độ Low Density Lipoprotein - Cholesterol (LDL - C) trong huyết tương, là nguyên nhân trực tiếp làm tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch sớm như xơ vữa động mạch (Coronary Artery Disease - CAD), bệnh mạch vành (Coronary Heart Disease - CHD) và đột quỵ.

Nguyên nhân phân tử cốt lõi của bệnh FH và các rối loạn chuyển hóa liên quan bắt nguồn từ các đột biến hoặc đa hình nucleotide trên các gen chủ chốt:

  • Gen PCSK9 (Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin - 9): Mã hóa enzym protease serine điều hòa thụ thể LDL (LDLR). Các đột biến tăng chức năng (Gain of Function - GOF) thúc đẩy thoái giáng LDLR ở gan, làm giảm hấp thu và tăng nồng độ LDL - C trong máu.
  • Gen MTHFR (Methylenetetrahydrofolate Reductase): Mã hóa enzyme xúc tác phản ứng chuyển hóa 5,10-methylenetetrahydrofolate thành 5-methyltetrahydrofolate phục vụ tái methyl hóa homocysteine thành methionine. Đột biến điểm C677T tại exon 4 làm suy giảm hoạt tính enzyme, dẫn đến tăng nồng độ homocysteine huyết tương – một yếu tố nguy cơ độc lập gây xơ vữa động mạch, tổn thương nội mạc mạch máu và huyết khối.

Mục tiêu nghiên cứu: Bước đầu tìm hiểu sự tương quan giữa đặc điểm phân tử về các dạng biến thể (đa hình/đột biến điểm) xuất hiện trên gen MTHFR, gen PCSK9 và một số bệnh lý rối loạn chuyển hóa cùng bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình.

Nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu cụ thể:

  1. Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp (meta-analysis) nhằm xác định sự tương quan giữa sự xuất hiện các dạng biến thể trên gen MTHFR, gen PCSK9 và các bệnh lý rối loạn chuyển hóa (bệnh FH và các bệnh tim mạch).
  2. Khảo sát trên máy tính (in silico) nhằm tìm hiểu, thiết kế và kiểm tra các thông số vật lý của bộ mồi phù hợp với quy trình PCR kết hợp giải trình tự để xác định các dạng biến thể trên gen MTHFR và PCSK9 trên DNA bộ gen người.
  3. Kế thừa kết quả từ nhóm nghiên cứu, tiến hành thực nghiệm tách chiết DNA bộ gen từ một số mẫu máu bệnh phẩm, thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng exon 2 gen PCSK9 và giải trình tự nucleotide sản phẩm PCR để phân tích đặc điểm phân tử exon 2 gen PCSK9 trên DNA bộ gen người Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Dữ liệu công bố quốc tế về đột biến trên gen PCSK9 (2.308 mẫu từ 17 công trình) và biến thể C677T trên gen MTHFR (4.484 mẫu từ 14 công trình); các trình tự tham chiếu trên NCBI/LOVD; 3 mẫu bệnh phẩm máu (M1, M2, M3) từ bệnh nhân có chỉ số cholesterol máu cao tại Thành phố Hồ Chí Minh.
  • Phạm vi không gian và thời gian: Dữ liệu phân tích tổng hợp được thu thập, trích xuất cập nhật đến tháng 4 năm 2019; thực nghiệm sinh học phân tử được triển khai tại Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, hoàn thành vào tháng 6 năm 2019.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình nghiên cứu

  • Đặc điểm phân tử gen PCSK9: Định vị tại nhiễm sắc thể 1p32, gồm 13 exon. Tiền chất ProPCSK9 (75 kDa) tự biến đổi trong lưới nội chất thành protein PCSK9 trưởng thành (62 kDa) gồm vùng peptide tín hiệu (1–30 aa), prodomain (31–152 aa), miền xúc tác (153–421 aa) và miền C-terminal (422–692 aa).
  • Đặc điểm phân tử gen MTHFR: Định vị tại nhiễm sắc thể 1p36.3, gồm 12 exon, mã hóa protein dimeric (77 kDa, 656 aa). Biến thể C677T tại exon 4 thay thế nucleotide C bằng T, làm đổi amino acid Alanine thành Valine tại vị trí 222 (Ala222Val), làm enzyme kém bền nhiệt và suy giảm hoạt tính.
  • Bệnh học FH: Thể dị hợp tử (HeFH) có tần số mắc 1:500, nồng độ cholesterol toàn phần 350–550 mg/dL; thể đồng hợp tử (HoFH) có tần số 1:1.000.000, nồng độ cholesterol toàn phần 650–1.000 mg/dL.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

  • Phương pháp phân tích tổng hợp (Meta-analysis): Thực hiện quy trình 8 bước theo Basu et al. (2017). Đánh giá biến số nhị phân qua chỉ số tỷ lệ (Proportion) và tỷ suất chênh (Odds Ratio - OR) với khoảng tin cậy 95% CI. Sử dụng phần mềm MedCalc (phiên bản 18.1):
    • Áp dụng mô hình ảnh hưởng bất biến (Fixed effects model - F) khi $I^2 < 50%$ và $P \ge 0,1$.
    • Áp dụng mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model - R) khi $I^2 > 50%$ và $P < 0,1$.
    • Đánh giá tính bất đồng nhất bằng chỉ số $I^2$ và tính thiên vị công bố qua đồ thị Funnel plot, kết quả biểu diễn trên đồ thị Forest plot.
  • Phương pháp khảo sát trên máy tính (In silico): Thu thập trình tự chuẩn từ NCBI (NC_000001.11, NG_009061.1, NM_005957.4, NM_174936.3). Đánh giá thông số lý hóa mồi (Tm, %GC, năng lượng tự do $\Delta G$ cấu trúc kẹp tóc, self-dimer, hetero-dimer trong ngưỡng $-9 < \Delta G < 9$ kcal/mol) bằng OligoAnalyzer 3.1 và Annhyb 4.946; kiểm tra độ tương đồng bằng BLASTN.
  • Phương pháp thực nghiệm sinh học phân tử:
    • Tách chiết DNA bộ gen: Phương pháp Phenol/Chloroform (Chomczynski & Sacchi, 1987) với dung dịch ly giải (NaCl 0,45M, Tris-HCl 10mM pH 8,2, EDTA 1M pH 8, SDS 10%), xử lý bằng Proteinase K (20 mg/ml) ở 56°C trong 1 giờ, tủa bằng Ammonium acetate 5M và Ethanol tuyệt đối lạnh.
    • Định lượng và kiểm tra chất lượng DNA: Đo độ hấp thụ quang phổ tại bước sóng 260 nm và 280 nm, tính nồng độ theo công thức $C = 50 \times A_{260} \times d$, đánh giá độ tinh sạch qua tỷ số $A_{260}/A_{280}$ (ngưỡng 1,8–2,0).
    • Phản ứng PCR: Thể tích 50 µl (Master mix 2X: 25 µl; mỗi mồi 0,5 µl nồng độ 10 µg/ml; DNA khuôn: 2 µl; nước cất: 22 µl). Chu trình nhiệt: biến tính ban đầu 95°C trong 5 phút; 40 chu kỳ gồm (95°C trong 30 giây, gắn mồi 64°C trong 35 giây, kéo dài 72°C trong 30 giây); kéo dài cuối cùng 72°C trong 10 phút.
    • Điện di và giải trình tự: Điện di trên gel agarose 1,5% nhuộm GelRed tại điện thế 70V trong 30 phút, đọc trên hệ thống Gel Doc XR (BioRad). Giải trình tự Sanger sản phẩm PCR kích thước 477 bp; phân tích dữ liệu bằng phần mềm CodonCode Aligner v8.0, Chromas v2.5, BioEdit v7.4.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Tổng quan

Trình bày cơ sở lý thuyết về bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình (FH), nguy cơ bệnh lý tim mạch và đột quỵ. Hệ thống hóa cấu trúc phân tử, chức năng sinh học và bệnh học của gen PCSK9 và gen MTHFR. Điểm luận các công trình quốc tế về các đột biến mất chức năng (LOF: Y142X, C679X) và tăng chức năng (GOF: Ser636Arg) trên PCSK9, cùng đột biến C677T trên MTHFR. Trình bày nguyên lý phương pháp phân tích tổng hợp meta-analysis và kỹ thuật PCR - giải trình tự.

Phần II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Liệt kê các phần mềm chuyên dụng (Annhyb 4.946, Medcalc 18.1, Chromas 2.5, CLC Main Workbench 8.1, BioEdit 7.4, CodonCode Aligner 8.0) và cơ sở dữ liệu trực tuyến (NCBI, BLAST, GeneCards, IDT OligoAnalyzer). Mô tả quy trình trích xuất dữ liệu bài báo khoa học, các tiêu chí thiết kế mồi in silico, chi tiết hóa chất, thành phần hóa nghiệm, chu trình luân nhiệt phản ứng PCR và quy trình tách chiết DNA mẫu máu bằng Phenol/Chloroform.

Phần III: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương trình bày toàn bộ kết quả phân tích theo 3 nhóm nội dung chính:

1. Kết quả khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp (Meta-analysis)

  • Đột biến gen PCSK9 (17 công trình, 2.308 bệnh nhân):
    • Tỷ lệ xuất hiện đột biến chung trên thế giới là 15,489% (95% CI: 9,386–22,786; $P < 0,0001$; mô hình R; $I^2 = 93,83%$).
    • Phân theo châu lục: Châu Mỹ đạt cao nhất 41,279% (95% CI: 33,57–48,74), tiếp đến là châu Phi 26,566%, châu Á 14,212%, châu Âu 11,420% và châu Đại Dương 3,509%.
    • Phân theo loại bệnh: Bệnh nhân FH có tỷ lệ đột biến là 17,561% (95% CI: 9,425–27,567), cao hơn tăng cholesterol tự phát (6,575%) và giảm LDL (12,222%).
    • Phân theo exon: Exon 7 có tỷ lệ đột biến cao nhất (42,647%), kế tiếp là exon 9 (27,911%), exon 1 (24,942%), exon 2 (22,588%), exon 4 (17,183%), exon 12 (13,641%), exon 3 (10,872%), exon 8 (10,851%), exon 6 (6,642%) và exon 10 (6,144%).
  • Biến thể gen MTHFR C677T (14 công trình, 4.484 bệnh nhân):
    • Tỷ lệ xuất hiện biến thể chung là 58,818% (95% CI: 43,105–73,660; $P < 0,0001$; mô hình R; $I^2 = 98,87%$). Nhóm bệnh nhân châu Á có tỷ lệ cao nhất (60,752%), châu Phi (54,313%) và châu Âu (45,312%).
    • Tỷ suất chênh (Odds Ratio - OR) từ 13 công trình: OR chung của người bệnh so với người lành là 1,388 (95% CI: 1,029–1,872; $P = 0,032$).
    • Phân theo kiểu gen: Kiểu gen đồng hợp đột biến TT làm tăng nguy cơ mắc bệnh rõ rệt với OR = 1,628 (95% CI: 1,176–2,252; $P = 0,003$); kiểu gen dị hợp CT có OR = 1,008 ($P = 0,940$); kiểu gen đồng hợp hoang dại CC có OR = 0,772 ($P = 0,018$).
    • Phân theo bệnh: Bệnh nhân rối loạn homocysteine có OR = 1,458 (95% CI: 1,019–2,087; $P = 0,039$).

2. Kết quả khảo sát In silico

  • Gen MTHFR: Khảo sát 5 bộ mồi khuếch đại exon 4 bao quanh vị trí C677T. Cặp mồi được lựa chọn là M_F1 (5'-TGGCAGGTTACCCCA-3', 15 bp, Tm 53°C, GC 60%) và M_R1 (5'-TGATGCCCATGTCGGTGC-3', 18 bp, Tm 58,5°C, GC 61,1%), cho kích thước sản phẩm khuếch đại dự kiến là 165 bp, mức năng lượng liên kết tự do cấu trúc bậc hai tối ưu nằm trong khoảng $-9 < \Delta G < 9$ kcal/mol.
  • Gen PCSK9: Khảo sát 3 bộ mồi khuếch đại exon 2. Cặp mồi được lựa chọn là PCSK9_MF3 (5'-ATCATCTACTATACTCTGTTGTGTCTCT-3', 28 bp, Tm 54,6°C, GC 35,7%) và PCSK9_MR3 (5'-ACAGAAAGCCAGTAGTTACTGTGCT-3', 25 bp, Tm 58,1°C, GC 44%), kích thước sản phẩm khuếch đại dự kiến là 477 bp, độ tương đồng BLAST đạt 100% trên trình tự tham chiếu NC_000001.11 và NG_009061.1.

3. Kết quả thực nghiệm trên mẫu bệnh phẩm Việt Nam

  • Tách chiết thành công DNA bộ gen từ mẫu máu bệnh phẩm, tỷ số $A_{260}/A_{280}$ dao động trong khoảng 1,8–2,0 đạt tiêu chuẩn tinh sạch.
  • Phản ứng PCR với cặp mồi PCSK9_MF3/PCSK9_MR3 cho sản phẩm khuếch đại đơn băng, sáng rõ ở kích thước 477 bp trên gel agarose 1,5% cho cả 3 mẫu bệnh phẩm (M1, M2, M3).
  • Giải trình tự Sanger và căn gióng bằng CodonCode Aligner ghi nhận:
    • Mẫu M1 (bệnh nhân nữ, 63 tuổi, cholesterol 5,58 mmol/L, HDL-C 1,13 mmol/L, LDL-C 2,9 mmol/L, Triglyceride 1,34 mmol/L): Không phát hiện biến thể nào trên vùng exon 2 và intron 2 của gen PCSK9.
    • Mẫu M2: Phát hiện 1 đột biến sai nghĩa trong vùng intron 2 gen PCSK9 chưa được ghi nhận trên hệ thống cơ sở dữ liệu LOVD.
    • Mẫu M3: Phát hiện đồng thời nhiều đột biến sai nghĩa tại vùng mã hóa exon 2 dẫn đến thay đổi amino acid tại các vị trí 73, 116 và 120 (chưa công bố trên LOVD); đột biến thay thế nucleotide c.399+70G>A trên intron 2; và dạng đột biến dị hợp c.218G>A (thay thế nucleotide G thành A tại vị trí 9307 trên NG_009061.1 / vị trí 55043852 trên NC_000001.11).

Phần IV: Kết luận và đề nghị

Tóm tắt các kết quả đạt được từ phân tích tổng hợp dịch tễ học, thiết kế mồi in silico và kết quả phát hiện đột biến thực nghiệm trên mẫu người Việt Nam. Đề xuất mở rộng nghiên cứu thực nghiệm trên quy mô mẫu lớn hơn và khảo sát thêm các exon khác của gen PCSK9 cũng như exon 4 gen MTHFR.

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp số liệu phân tích tổng hợp (Meta-analysis)

Yếu tố phân tích Phân nhóm Số nghiên cứu (N) Chỉ số thống kê (Proportion / OR) Khoảng tin cậy (95% CI) Mô hình Giá trị P Chỉ số $I^2$ (%)
Đột biến gen PCSK9 Tổng thể 17 15,489% 9,386 – 22,786 R < 0,0001 93,83
(Tỷ lệ Proportion) Châu Mỹ 1 41,279% 33,570 – 48,740 NA 0,0182 NA
Châu Phi 3 26,566% 3,407 – 61,101 R 0,0002 88,52
Châu Á 5 14,212% 8,015 – 21,821 R 0,0009 78,58
Châu Âu 7 11,420% 5,267 – 19,542 R < 0,0001 89,90
Bệnh nhân FH 12 17,561% 9,425 – 27,567 R < 0,0001 94,86
Exon 7 6 42,647% 10,506 – 78,866 R < 0,0001 89,89
Exon 2 7 22,588% 7,410 – 42,968 R < 0,0001 80,39
Đột biến MTHFR C677T Tổng thể 14 58,818% 43,105 – 73,660 R < 0,0001 98,87
(Tỷ lệ Proportion) Châu Á 11 60,752% 42,252 – 77,779 R < 0,0001 99,11
Tỷ suất chênh MTHFR Tổng thể (Chung) 13 OR = 1,388 1,029 – 1,872 R 0,0320 81,78
(Odds Ratio - OR) Đồng hợp đột biến TT 13 OR = 1,628 1,176 – 2,252 R 0,0030 68,02
Dị hợp tử CT 13 OR = 1,008 0,816 – 1,246 R 0,9400 70,04
Đồng hợp hoang dại CC 13 OR = 0,772 0,622 – 0,870 R 0,0180 69,79
Nhóm bệnh Homocysteine 11 OR = 1,458 1,019 – 2,087 R 0,0390 84,66

Bảng tổng hợp thông số các cặp mồi tối ưu được lựa chọn qua khảo sát In silico

Gen mục tiêu Tên mồi Trình tự nucleotide (5' $\rightarrow$ 3') Chiều dài (bp) Tm (°C) %GC Kích thước PCR (bp) Vị trí tham chiếu
MTHFR (Exon 4) M_F1 TGGCAGGTTACCCCA 15 53,0 60,0 165 NC_000001.103
M_R1 TGATGCCCATGTCGGTGC 18 58,5 61,1
PCSK9 (Exon 2) PCSK9_MF3 ATCATCTACTATACTCTGTTGTGTCTCT 28 54,6 35,7 477 NG_009061.1
PCSK9_MR3 ACAGAAAGCCAGTAGTTACTGTGCT 25 58,1 44,0 (vị trí 9348–9488)

Đóng góp khoa học và giải pháp đề xuất

  • Đóng góp khoa học: Cung cấp bức tranh dịch tễ học phân tử toàn cầu dựa trên bằng chứng định lượng về tỷ lệ đột biến gen PCSK9 (15,489%) và đa hình MTHFR C677T (58,818%). Chứng minh kiểu gen đồng hợp tử TT của MTHFR C677T làm tăng nguy cơ bệnh lý rối loạn chuyển hóa gấp 1,628 lần ($P = 0,003$). Thiết lập thành công quy trình kỹ thuật khuếch đại và giải trình tự exon 2 gen PCSK9 trên người Việt Nam; bước đầu phát hiện các đột biến sai nghĩa mới tại codon 73, 116, 120 và đột biến c.218G>A dị hợp, c.399+70G>A trên bệnh nhân Việt Nam chưa từng được công bố trên hệ thống dữ liệu quốc tế LOVD.
  • Giải pháp kiến nghị: Đề xuất ứng dụng cặp mồi PCSK9_MF3/PCSK9_MR3 và quy trình phản ứng PCR - giải trình tự chuẩn hóa để sàng lọc biến thể exon 2 gen PCSK9 phục vụ chẩn đoán sớm nguy cơ tăng cholesterol máu có tính gia đình tại các cơ sở y tế.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu:
    • Cỡ mẫu thực nghiệm sinh học phân tử còn nhỏ ($n = 3$ mẫu máu bệnh phẩm), mới chỉ mang tính thăm dò bước đầu, chưa đủ để khái quát hóa tỷ lệ xuất hiện đột biến cho toàn bộ quần thể người Việt Nam.
    • Về mặt thực nghiệm, nghiên cứu mới thực hiện khuếch đại và giải trình tự trên vùng exon 2 của gen PCSK9; nội dung khảo sát gen MTHFR (exon 4) và các exon còn lại của gen PCSK9 mới dừng lại ở bước sàng lọc in silico, chưa triển khai kiểm chứng thực nghiệm trên mẫu bệnh phẩm.
    • Các nghiên cứu đưa vào phân tích tổng hợp có tính bất đồng nhất cao ($I^2 > 80%$), do sự khác biệt về thiết kế nghiên cứu (đoàn hệ, ca chứng) và chủng tộc bệnh nhân giữa các công bố quốc tế.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Mở rộng thu thập mẫu bệnh phẩm máu với quy mô lớn hơn ở bệnh nhân tăng cholesterol máu và bệnh nhân tim mạch tại Việt Nam.
    • Triển khai thực nghiệm phản ứng PCR và giải trình tự vùng exon 4 gen MTHFR sử dụng cặp mồi M_F1/M_R1 đã được tối ưu hóa.
    • Khảo sát mở rộng toàn bộ 13 exon của gen PCSK9 và kết hợp phân tích các gen liên quan khác (LDLR, ApoB) để xác định toàn diện nguyên nhân di truyền gây bệnh FH.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng thụ hưởng:
    • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ Sinh học Y Dược, Di truyền học người, Hóa sinh lâm sàng và Y học phân tử.
    • Các bác sĩ tim mạch, chuyên viên xét nghiệm di truyền và các nhóm nghiên cứu về bệnh lý rối loạn chuyển hóa lipid và tim mạch.
  • Nội dung có giá trị tham khảo cao:
    • Quy trình 8 bước phân tích tổng hợp (Meta-analysis): Tài liệu hướng dẫn phương pháp xử lý số liệu tỷ lệ (Proportion) và tỷ suất chênh (Odds Ratio) bằng phần mềm MedCalc cho các nghiên cứu dịch tễ di truyền.
    • Quy trình In silico thiết kế mồi: Bộ thông số nhiệt động học và phương pháp đánh giá tính đặc hiệu của mồi khuếch đại gen người bằng công cụ Annhyb, BLAST và OligoAnalyzer.
    • Quy trình thực nghiệm chuẩn: Chi tiết các bước tách chiết DNA máu bằng Phenol/Chloroform và chu trình luân nhiệt phản ứng PCR khuếch đại exon 2 gen PCSK9 với độ đặc hiệu cao.

Câu hỏi thường gặp

1. Đột biến MTHFR C677T ảnh hưởng như thế nào đến nguy cơ mắc bệnh chuyển hóa theo kết quả phân tích tổng hợp?
Đột biến C677T trên exon 4 gen MTHFR thay thế nucleotide Cytosine bằng Thymine, làm biến đổi amino acid Alanine thành Valine tại vị trí 222 (Ala222Val), làm suy giảm hoạt tính enzyme MTHFR và gây ứ đọng homocysteine trong máu. Phân tích tổng hợp 13 công trình ghi nhận kiểu gen đồng hợp đột biến TT làm tăng nguy cơ mắc bệnh có ý nghĩa thống kê với tỷ suất chênh $\text{OR} = 1,628$ ($95%\text{ CI: } 1,176\text{--}2,252;\ P = 0,003$), trong khi kiểu gen dị hợp CT có $\text{OR} = 1,008$ ($P = 0,940$) và kiểu gen hoang dại CC có $\text{OR} = 0,772$ ($P = 0,018$).

2. Tỷ lệ đột biến gen PCSK9 phân bố như thế nào giữa các exon theo dữ liệu meta-analysis?
Từ 17 công bố quốc tế, tỷ lệ xuất hiện đột biến phân bố không đều giữa các exon: cao nhất ở exon 7 đạt $42,647%$ ($95%\text{ CI: } 10,506\text{--}78,866%$), tiếp theo là exon 9 ($27,911%$), exon 1 ($24,942%$), exon 2 ($22,588%$), exon 4 ($17,183%$), exon 12 ($13,641%$), exon 3 ($10,872%$), exon 8 ($10,851%$), exon 6 ($6,642%$) và thấp nhất ở exon 10 ($6,144%$).

3. Cặp mồi nào được lựa chọn tối ưu để khuếch đại exon 2 gen PCSK9 và có thông số kỹ thuật ra sao?
Nghiên cứu lựa chọn cặp mồi PCSK9_MF3 (5'-ATCATCTACTATACTCTGTTGTGTCTCT-3', 28 bp) và PCSK9_MR3 (5'-ACAGAAAGCCAGTAGTTACTGTGCT-3', 25 bp). Mồi có nhiệt độ nóng chảy $T_m$ lần lượt là 54,6°C và 58,1°C, tỷ lệ %GC là 35,7% và 44%, năng lượng tự do $\Delta G$ cấu trúc bậc hai nằm trong ngưỡng tối ưu ($-9 < \Delta G < 9$ kcal/mol), khuếch đại đặc hiệu phân đoạn 477 bp trên trình tự NG_009061.1 tại nhiệt độ gắn mồi 64°C.

4. Kết quả giải trình tự exon 2 gen PCSK9 trên 3 mẫu bệnh phẩm máu người Việt Nam ghi nhận những biến thể cụ thể nào?
Mẫu M1 không mang biến thể trên exon 2 và intron 2. Mẫu M2 xuất hiện 1 đột biến sai nghĩa tại intron 2 chưa có trên LOVD. Mẫu M3 xuất hiện các đột biến sai nghĩa tại vùng mã hóa exon 2 làm thay đổi amino acid ở các vị trí 73, 116 và 120 (chưa công bố trên LOVD), đột biến thay thế nucleotide c.399+70G>A tại intron 2, và đột biến thể dị hợp c.218G>A (thay thế G thành A tại vị trí 9307 trên NG_009061.1 / vị trí 55043852 trên NC_000001.11).

5. Tại sao mẫu bệnh phẩm M1 có nồng độ cholesterol máu cao (>5 mmol/L) nhưng không phát hiện đột biến trên exon 2 gen PCSK9?
Tác giả nhận định bệnh nhân M1 (nữ, 63 tuổi, cholesterol 5,58 mmol/L) có biểu hiện tăng cholesterol máu nhưng không mang biến thể trên exon 2 và intron 2 của PCSK9. Hiện tượng này có thể do nguyên nhân bệnh lý xuất phát từ đột biến trên các exon khác của gen PCSK9 hoặc đột biến trên các gen chuyển hóa lipid khác như gen thụ thể LDL (LDLR) hoặc gen Apolipoprotein B (ApoB).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Thị Mộng Tuyền đã tổng hợp và phân tích định lượng toàn diện về dịch tễ học phân tử của các đột biến trên gen PCSK9 và đa hình MTHFR C677T liên quan đến bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình và các rối loạn chuyển hóa tim mạch. Thông qua khảo sát in silico, đề tài đã chuẩn hóa thành công các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại exon 4 gen MTHFR (165 bp) và exon 2 gen PCSK9 (477 bp). Nghiên cứu đã bước đầu triển khai thực nghiệm quy trình tách chiết DNA, phản ứng PCR và giải trình tự Sanger trên mẫu máu bệnh phẩm người Việt Nam, phát hiện các biến thể sai nghĩa mới trên exon 2 và intron 2 của gen PCSK9 chưa từng được công bố trên cơ sở dữ liệu quốc tế LOVD.