ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là bệnh lý rối loạn di truyền, liên quan đến quá trình chuyển hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoproteins - LDLs). Bệnh FH là nguyên nhân dẫn đến tăng nguy cơ mắc sớm một số bệnh lý về tim mạch: bệnh mạch vành, xơ vữa động mạch… (Klose et al. Nguyên nhân dẫn đến bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình là do sự xuất hiện tính chất đột biến trên một số gen có vai trò trong chuyển hóa cholesterol và lipid, điển hình là gen PCSK9 (Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin - 9 (Soutar et al. Hơn nữa, một số công bố khoa học ghi nhận về sự tương quan giữa tính chất đa hình trên gen Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) và bệnh lý thừa cân, béo phì và rối loạn mỡ máu ở bệnh nhân Trung Quốc (Zhi et al.
Tăng homocysteine (Hcy) gây ra các bệnh lý về tim mạch và não, dẫn đến tử vong sớm do các biến chứng mạch máu (Mudd et al. McCully quan sát thấy các tổn thương động mạch xảy ra ở những trường hợp trẻ em bị rối loạn bẩm sinh sự chuyển hóa (McCully et al. Theo công bố của Mudd và cộng sự (1983), Hcy có vai trò trong sự hình thành xơ vữa động mạch và có thể cải thiện tình trạng rối loạn Hcy bằng cách bổ sung vitamin B ở những bệnh nhân “Cystathionine b-synthase - CBS”. Liệu pháp giảm Hcy được áp dụng có thể giúp phòng ngừa bệnh não do thiếu Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) (Strauss et al.
Gen PCSK9 mã hóa proprotein convertase subtilisin/kexin loại 9a (PCSK9), một thành viên của phân họ proteinase K, giữ vai trò quan trọng trong cơ chế chuyển hóa cholesterol và acid béo. Gen PCKS9 gồm 13 exon. Những đột biến trong gen PCSK9 gây ra một dạng tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình ở thể trội (NCBI, GeneCard). Gen Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) mã hóa protein xúc tác sự chueyern hóa 5,10 - methylenetetrahydrofolate thành 5 - methyltetrahydrofolate, và sự tái gắn methyl hóa trên phân tử homocysteine để chuyển thành methionine.
Một số dạng biến thể xuất hiện trên gen MTHFR (C677T.), dẫn đến nồng độ homocysteine huyết tương cao bất thường (NCBI, GeneCards). viii PHẦN I: TỔNG QUAN Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp Nhằm tiếp cận về hướng nghiên cứu về đặc điểm phân tử của một số bệnh lý rối loạn chuyển hóa cholesterol, lipid và bệnh lý liên quan đến tim mạch, trong pham vi chuyên đề khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tính chất đột biến nổi trội trên gen MTHFR (exon 4) và gen PCSK9 (exon 2) đối với một số mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) của người Việt Nam”. Mục tiêu: bước đầu tìm hiểu sự tương quan giữa đặc điểm phân tử về các dạng biến thể (đa hình/đột biến điểm) xuất hiện trên gen MTHFR, gen PCSK9 và một số bệnh lý rối loạn chuyển hóa và bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình. Nội dung nghiên cứu: − Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp để xác định về sự tương quan giữa sự xuất hiện các dạng biến thể trên gen MTHFR, gen PCSK9 và các dạng bệnh lý rối loạn chuyển hóa, cụ thể là bệnh lý bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình và các bệnh lý tim mạch,.
− Tìm hiểu và kiểm tra lại thông số của bộ mồi phù hợp với quy trình PCR kết hợp với giải trình tự để xác định các dạng biến thể trên gen MTHFR và gen PCSK9 trên DNA bộ gen người. − Trong điều kiện thực tế, tiếp tục kế thừa kết quả cùng nhóm nghiên cứu, thực hiện quy trình tách chiết DNA bộ gen từ một số mẫu máu và phản ứng PCR khuếch đại trình tự mục tiêu: exon 2 gen PCSK9 và gửi giải trình tự các sản phẩm PCR có kích thước dự kiến. Từ đó, hướng đến việc phân tích đặc điểm phân tử của vùng trình tự exon 2 gen PCSK9 thuộc DNA bộ gen của người Việt Nam. ix Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp PHẦN I: TỔNG QUAN 1.
Bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình (Familial Hypercholesterolaemia - FH) cũng như một số bệnh lý liên quan: mạch máu, đột quỵ Bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình (Familial Hypercholesterolaemia - FH) là bệnh lý di truyền tính trội trên nhiễm sắc thể thường, dẫn đến sự rối loạn chuyển hóa cholesterol trong máu và có biểu hiện bởi sự tăng cao bất thường lượng Low Density Lipoprotein - Cholesterol (LDL - C) trong huyết tương/máu. Bệnh FH chính là nguy cơ cao dẫn đến bệnh lý xơ vữa động mạch và động mạch vành (Cardiovascular disease - CVD) (Hartgers et al., 2015; Brown et al. Nguyên nhân chính dẫn đến bệnh lý FH là tính chất đa hình, đột biến xuất hiện trên gen mã hóa protein chuyển hóa lipid trong máu: Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR), Apolipoprotein B (ApoB) hoặc Protein convertase subtilisin/kexin 9 (PCSK9), Methyltetrahydrofolate reductase (MTHFR) (Hovingh et al., 2013; Kawashiri et al. Bệnh lý FH ở hai dạng là thể dị hợp tử (Heterozygous Familial hypercholesterolaemia - HeFH) và thể đồng hợp tử (Homozygous Familial Hypercholesterolaemia - HoFH).
Tỷ lệ mắc bệnh HeFH là 1:500 và HoFH là 1:1. Ở bệnh nhân mắc bệnh lý HeFH, lượng cholesterol toàn phần và lượng LDL - C lần lượt trong khoảng 350-550 mg/dL và 200-400 mg/dL. Trong khi ở bệnh nhân mắc bệnh lý HoFH, lượng cholesterol toàn phần và lượng LDL - C lần lượt trong khoảng 650-1000 mg/dL và > 600 mg/dL (Hovingh et al., 2013; Patel et al. Hơn nữa, bệnh lý FH dẫn đến nguy cơ mắc bệnh CHD lớn hơn 50% ở tuổi 50 của nam giới và nguy cơ mắc bệnh CHD cao hơn 30% ở tuổi 60 của phụ nữ (Patel et al., 2015) và mắc sớm bệnh lý CAD và CVD (Nordestgaard et al.
Tỷ lệ bệnh nhân FH mắc các bệnh lý khác xấp xỉ trong khoảng 1:300 – 1:500 (Hopkins et al. Tổ chức EAS (European Athetosclerosis Society) ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh FH được chẩn đoán là 71% ở Hà Lan, 43% ở Na Uy và 6% ở Tây Ban Nha (Najam and Ray, 2015).000 bệnh nhân mắc FH (Hopkins et al. Ở các 1 Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp quần thể người Canada gốc Pháp và người Phi gốc Phi, tỷ lệ mắc bệnh FH có thể lên đến 1:100 (Hopkins et al. Công bố khoa học của Hopkins (2011) xác định nguy cơ mắc bệnh CHD cao hơn khoảng 20 lần ở những bệnh nhân FH không được điều trị.
Tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh FH do bị đột biến trên gen LDLR. có nguy cơ cao mắc bệnh xơ vữa động mạch với biểu hiện tăng rất cao lượng cholesterol trong máu (Hopkins et al. Nordestgaard và cộng sự (2013) ghi nhận các trường hợp mắc bệnh FH thể dị hợp tử (HeFH) nếu không được điều trị thì có nguy cơ mắc bệnh tim mạch vành sớm (Coronary Heart Disease - CHD) ở nam giới và nữ giới lần lượt trước 55 và 60 tuổi, các trường hợp mắc bệnh FH này có lượng cholesterol toàn phần từ 8-15 mmol/L (310-580 mg/dL). Đồng thời, trường hợp mắc bệnh FH ở thể đồng hợp tử (HoFH) nếu không được điều trị thì có nguy cơ mắc bệnh CHD sớm ở nam giới và nữ giới trước 20 tuổi, các bệnh nhân này có lượng cholesterol 12-30 mmol/L (460-1160 mg/dL).
Vì vậy, việc phân tích/xác định đặc điểm phân tử bệnh lý FH, tập trung trên các gen tham gia hoặc liên quan đến sự chuyển hóa cholesterol trong máu là rất cần thiết để làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, xơ vữa động mạch (Coronary Artery Disease - CAD) và CHD (Nordestgaard et al. Gen Proprotein convertase subtilisin/kexin 9 (PCSK9) 2.1 Đặc điểm chính Gen PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin 9) định vị trên nhiễm sắc thể người 1p32, gồm 13 exon (Abifadel et al., 2003; Seidah et al. Gen PCSK9 mã hóa protein PCSK9 – là một dạng protease serine, được sản xuất bởi tế bào gan (Najam & Ray, 2015).2 Chức năng PCSK9 có vai trò trong cơ chế chuyển hóa cholesterol trong cơ thể người, thông qua quá trình tái chuyển hóa/kiểm soát lượng LDLR trên bề mặt tế bào và kiểm soát lượng LDL - C (Miyake et al. Ở trạng thái tiền chất: “ProPCSK9” là thể “Subtilisin kexin isoenzyme - 1 (SKI - 1)/ site - 1 - protease (S1P)” có trọng lượng 75 kiloDalton.
ProPCSK9 có vai trò quan trọng trong quá trình cân bằng nội môi cholesterol thông qua việc xử lý các protein 2 Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp liên kết nguyên tố điều hòa Sterol (Abifadel et al. “ProPCSK9” được biến đổi trong lưới nội chất theo cơ chế tự xúc tác (Autocatalyse) để tạo thành PCSK9 trưởng thành có trọng lượng 62 kiloDalton với cấu trúc protein gồm có: vùng peptide tín hiệu (1-30 amino acid), một prodomain (31-152 amino acid), một xúc tác (153-421 amino acid) và một miền C-terminal (422-692 amino acid) (Nozue et al. Protein PCSK9 chủ yếu được sinh tổng hợp bởi tế bào gan và biểu hiện cao trong ruột và thận (Nozue et al. PCSK9 tăng cường hoạt động dẫn đến thúc đẩy hoạt động thủy giải protein thụ thể LDLR trong thể endosome và lysosome ở gan thụ thể lipoprotein mật độ thấp (LDLR), dẫn đến tăng nồng độ LDL - C trong huyết thanh (Nozue et al.
Sự rối loạn ở cấp độ phân tử: nucleic acid (gen, mRNA) và protein đối với gen PCSK9 là nguyên nhân dẫn đến rối loạn nồng độ LDL – C trong máu (Nozue et al.3 Tính chất đột biến trên gen PCSK9 và bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình Tính chất đột biến trên gen PCSK9 là một trong những nguyên nhân di truyền, dẫn đến bệnh lý cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình ở thể trội (NCBI; GeneCard). Theo công bố khoa học của Nordestgaard (2013) có khoảng 20 dạng đột biến xuất hiện gen PCSK9 và tỷ lệ mắc bệnh FH do đột biến trên gen PCSK9 chiếm khoảng 1% (Nordestgaard et al.4 Tình hình nghiên cứu đột biến của gen PCSK9 trên thế giới Di Taranto và cộng sự (2017) xác định một số dạng biến thể xuất hiện trên gen PCSK9 gây nên bệnh lý FH: (1) Dạng rối loạn làm giảm chức năng protein PCSK9 (Loss Of Function - LOF) gây nên tăng lượng LDLR trên màng tế bào và thúc đẩy sự chuyển hóa và giải phóng cholesteorl vào máu; (2) Dạng rối loạn làm tăng chức năng protein PCSK9 (Gain Of Function - GOF) dẫn đến làm giảm lượng LDLR và làm tăng lượng LDL - C (Patel et al., 2015; Di Taranto et al. Công trình nghiên cứu của Rashid và cộng sự (2005) sử dụng mô hình chuột để chứng minh tính chất đột biến ở gen PCSK9 làm gián đoạn chức năng bình thường của PCSK9 và còn làm giảm lượng LDL - cholesterol và làm tăng tác dụng hạ lipid máu của statin (Rashid et al. Năm 2005, Cohen và cộng sự nghiên cứu và phát hiện 3 Chuyên Đề Khóa Luận Tốt Nghiệp hai đột biến vô nghĩa Y142X và C679X trong PCSK9 có liên quan tới việc giảm 40% nồng độ LDL – C.