Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp trên dòng tế bào E. coli trong điều kiện GMP

• Tác giả: Nguyễn Thị Minh Thu
• Người hướng dẫn: GS. Trương Nam Hải
• Trường học: Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 người tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào Escherichia coli trong điều kiện GMP
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình ung thƣ ở Việt Nam và trên thế giới
• 1.2. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ
• 1.3. Tổng quan về Interleukin-2
• 1.4. Cấu trúc của Interleukin-2
• 1.5. Cơ chế hoạt động và chức năng sinh học của Interleukin-2
• 1.6. Vai trò của Interleukin-2 trong điều trị ung thư
• 1.7. Hệ biểu hiện E.
• 1.8. Hệ biểu hiện E. Vector biểu hiện pET22b(+)
• 1.9. Lên men sản xuất protein tái tổ hợp trên hệ thống lên men Bioreactor
• 1.10. Tinh sạch protein bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
• 1.11. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2
• 1.12. Phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GMP
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Chủng giống và plasmid
• 2.3. Máy móc và thiết bị
• 2.4. Các môi trường và dung dịch
• 2.5. Môi trường sử dụng trong biểu hiện protein
• 2.6. Dung dịch sử dụng trong tiền tinh chế protein Interleukin-2
• 2.7. Dung dịch sử dụng trong chạy hệ thống sắc ký HPLC
• 2.8. Dung dịch sử dụng trong điện di SDS - PAGE
• 2.9. Dung dịch sử dụng để hiện kết quả điện di SDS – PAGE
• 2.10. Dung dịch sử dụng trong phản ứng Western blot
• 2.11. Dung dịch sử dụng trong phương pháp ELISA
• 2.12. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.13. Biểu hiện protein Interleukin-2 tái tổ hợp trong tế bào E. coli ở các hệ thống lên men 5 và 10 lít
• 2.14. Phá tế bào E. coli và xử lý IL-2 thô (tiền tinh chế)
• 2.15. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
• 2.16. Xác định hoạt tính sinh học protein Interleukin-2 trên dòng tế bào CTLL2
• 2.17. Kiểm tra tính đặc hiệu của protein bằng phương pháp Western blot
• 2.18. Kiểm tra độ sạch bằng phần mềm Quantity One
• 2.19. Kiểm tra nội độc tố bằng LAL kit
• 2.20. Xác định hàm lượng protein trong mẫu tinh chế bằng phương pháp ELISA
• 2.21. Điện di SDS-PAGE
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ƣu lên men chủng E. coli BL21 IL-2 trên quy mô nồi lên men 5 và 10 lít
• 3.2. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 5 lít
• 3.3. Khảo sát thành phần dinh dưỡng và nồng độ chất cảm ứng
• 3.4. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở quy mô hệ thống lên men 10 lít đợt 1
• 3.5. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở hệ thống lên men 10 lít đợt 2
• 3.6. Xử lý tiền tinh chế thu hồi IL-2 từ sinh khối tế bào lên men
• 3.7. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
• 3.8. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2
• 3.9. Xác định độ tinh sạch của protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế bằng phần mềm Quantity One
• 3.10. Xác định hàm lƣợng nội độc tố trong sản phẩm IL-2 sau tinh chế
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN
• PHỤ LỤC

I. Tổng quan về nghiên cứu sản xuất Interleukin 2 tái tổ hợp

Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp trên dòng E. coli trong điều kiện GMP là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Interleukin-2 là một cytokine có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch, giúp kích thích sự phát triển của tế bào T. Việc sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp không chỉ giúp giảm chi phí điều trị ung thư mà còn nâng cao hiệu quả điều trị.

1.1. Định nghĩa và vai trò của Interleukin 2 trong y học

Interleukin-2 (IL-2) là một cytokine được sản xuất chủ yếu bởi tế bào lympho T. IL-2 có vai trò quan trọng trong việc kích thích sự phát triển và hoạt động của các tế bào miễn dịch, đặc biệt là tế bào T và tế bào NK. IL-2 đã được chứng minh là có hiệu quả trong điều trị một số loại ung thư.

1.2. Tại sao cần nghiên cứu sản xuất IL 2 tái tổ hợp

Việc sản xuất IL-2 tái tổ hợp giúp giảm chi phí và tăng khả năng tiếp cận cho bệnh nhân. Sản phẩm IL-2 thương mại hiện tại có giá cao, do đó, nghiên cứu sản xuất trong nước là cần thiết để đáp ứng nhu cầu điều trị.

II. Thách thức trong sản xuất Interleukin 2 tái tổ hợp

Sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp trên dòng E. coli gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như độ tinh khiết của sản phẩm, hoạt tính sinh học và điều kiện nuôi cấy là những yếu tố quan trọng cần được kiểm soát. Đặc biệt, việc duy trì điều kiện GMP là rất cần thiết để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

2.1. Vấn đề về độ tinh khiết và hoạt tính sinh học

Độ tinh khiết của Interleukin-2 tái tổ hợp là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị. Các tạp chất có thể làm giảm hoạt tính sinh học của sản phẩm, do đó cần có các phương pháp tinh chế hiệu quả.

2.2. Điều kiện nuôi cấy và kiểm soát chất lượng

Điều kiện nuôi cấy E. coli cần được tối ưu hóa để đạt được năng suất cao nhất. Việc kiểm soát chất lượng trong suốt quá trình sản xuất là rất quan trọng để đảm bảo sản phẩm đạt tiêu chuẩn GMP.

III. Phương pháp sản xuất Interleukin 2 tái tổ hợp hiệu quả

Để sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp, các phương pháp như sử dụng vector biểu hiện, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và tinh chế bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được áp dụng. Những phương pháp này giúp tăng cường hiệu quả sản xuất và đảm bảo chất lượng sản phẩm.

3.1. Sử dụng vector biểu hiện pET22b

Vector pET22b(+) là một công cụ hữu ích trong việc biểu hiện Interleukin-2 tái tổ hợp. Vector này cho phép sản xuất protein với hiệu suất cao và dễ dàng tinh chế.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy trong bioreactor

Điều kiện nuôi cấy trong bioreactor cần được tối ưu hóa để đạt được mật độ tế bào cao và sản lượng protein tối đa. Các yếu tố như pH, nhiệt độ và nồng độ chất cảm ứng IPTG cần được điều chỉnh phù hợp.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của Interleukin 2

Kết quả nghiên cứu cho thấy sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học cao và đạt tiêu chuẩn chất lượng. Sản phẩm này có thể được ứng dụng trong điều trị ung thư và các bệnh lý khác liên quan đến hệ miễn dịch.

4.1. Xác định hoạt tính sinh học của IL 2 trên dòng tế bào CTLL2

Hoạt tính sinh học của Interleukin-2 được xác định thông qua các thử nghiệm trên dòng tế bào CTLL2. Kết quả cho thấy sản phẩm có khả năng kích thích sự phát triển của tế bào T.

4.2. Ứng dụng trong điều trị ung thư

Sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp có thể được sử dụng trong điều trị ung thư, đặc biệt là ung thư thận và ung thư da. Việc sử dụng sản phẩm này giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm chi phí cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp trên dòng E. coli trong điều kiện GMP mở ra nhiều triển vọng cho ngành công nghệ sinh học tại Việt Nam. Việc phát triển công nghệ sản xuất trong nước không chỉ giúp giảm chi phí mà còn nâng cao khả năng tiếp cận điều trị cho bệnh nhân.

5.1. Tương lai của sản xuất IL 2 tái tổ hợp

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp sẽ ngày càng trở nên phổ biến. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc cải thiện quy trình sản xuất và tối ưu hóa hoạt tính sinh học.

5.2. Đóng góp cho ngành y tế Việt Nam

Sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp sẽ góp phần quan trọng trong việc nâng cao chất lượng điều trị ung thư tại Việt Nam. Điều này không chỉ giúp cải thiện sức khỏe cộng đồng mà còn thúc đẩy sự phát triển của ngành công nghệ sinh học trong nước.