Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp trên dòng tế bào E. coli trong điều kiện GMP

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hay nghiên cứu sản xuất interleukin 2 người tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào escherichia, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Nguyễn Thị Minh Thu
• Người hướng dẫn: GS. Trương Nam Hải
• Trường học: Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 người tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào Escherichia coli trong điều kiện GMP
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình ung thƣ ở Việt Nam và trên thế giới
• 1.2. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ
• 1.3. Tổng quan về Interleukin-2
• 1.4. Cấu trúc của Interleukin-2
• 1.5. Cơ chế hoạt động và chức năng sinh học của Interleukin-2
• 1.6. Vai trò của Interleukin-2 trong điều trị ung thư
• 1.7. Hệ biểu hiện E.
• 1.8. Hệ biểu hiện E. Vector biểu hiện pET22b(+)
• 1.9. Lên men sản xuất protein tái tổ hợp trên hệ thống lên men Bioreactor
• 1.10. Tinh sạch protein bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
• 1.11. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2
• 1.12. Phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GMP
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Chủng giống và plasmid
• 2.3. Máy móc và thiết bị
• 2.4. Các môi trường và dung dịch
• 2.5. Môi trường sử dụng trong biểu hiện protein
• 2.6. Dung dịch sử dụng trong tiền tinh chế protein Interleukin-2
• 2.7. Dung dịch sử dụng trong chạy hệ thống sắc ký HPLC
• 2.8. Dung dịch sử dụng trong điện di SDS - PAGE
• 2.9. Dung dịch sử dụng để hiện kết quả điện di SDS – PAGE
• 2.10. Dung dịch sử dụng trong phản ứng Western blot
• 2.11. Dung dịch sử dụng trong phương pháp ELISA
• 2.12. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.13. Biểu hiện protein Interleukin-2 tái tổ hợp trong tế bào E. coli ở các hệ thống lên men 5 và 10 lít
• 2.14. Phá tế bào E. coli và xử lý IL-2 thô (tiền tinh chế)
• 2.15. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
• 2.16. Xác định hoạt tính sinh học protein Interleukin-2 trên dòng tế bào CTLL2
• 2.17. Kiểm tra tính đặc hiệu của protein bằng phương pháp Western blot
• 2.18. Kiểm tra độ sạch bằng phần mềm Quantity One
• 2.19. Kiểm tra nội độc tố bằng LAL kit
• 2.20. Xác định hàm lượng protein trong mẫu tinh chế bằng phương pháp ELISA
• 2.21. Điện di SDS-PAGE
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ƣu lên men chủng E. coli BL21 IL-2 trên quy mô nồi lên men 5 và 10 lít
• 3.2. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 5 lít
• 3.3. Khảo sát thành phần dinh dưỡng và nồng độ chất cảm ứng
• 3.4. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở quy mô hệ thống lên men 10 lít đợt 1
• 3.5. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở hệ thống lên men 10 lít đợt 2
• 3.6. Xử lý tiền tinh chế thu hồi IL-2 từ sinh khối tế bào lên men
• 3.7. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
• 3.8. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2
• 3.9. Xác định độ tinh sạch của protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế bằng phần mềm Quantity One
• 3.10. Xác định hàm lƣợng nội độc tố trong sản phẩm IL-2 sau tinh chế
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu sản xuất Interleukin 2 tái tổ hợp

Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp trên dòng E. coli trong điều kiện GMP là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Interleukin-2 là một cytokine có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch, giúp kích thích sự phát triển của tế bào T. Việc sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp không chỉ giúp giảm chi phí điều trị ung thư mà còn nâng cao hiệu quả điều trị.

1.1. Định nghĩa và vai trò của Interleukin 2 trong y học

Interleukin-2 (IL-2) là một cytokine được sản xuất chủ yếu bởi tế bào lympho T. IL-2 có vai trò quan trọng trong việc kích thích sự phát triển và hoạt động của các tế bào miễn dịch, đặc biệt là tế bào T và tế bào NK. IL-2 đã được chứng minh là có hiệu quả trong điều trị một số loại ung thư.

1.2. Tại sao cần nghiên cứu sản xuất IL 2 tái tổ hợp

Việc sản xuất IL-2 tái tổ hợp giúp giảm chi phí và tăng khả năng tiếp cận cho bệnh nhân. Sản phẩm IL-2 thương mại hiện tại có giá cao, do đó, nghiên cứu sản xuất trong nước là cần thiết để đáp ứng nhu cầu điều trị.

II. Thách thức trong sản xuất Interleukin 2 tái tổ hợp

Sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp trên dòng E. coli gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như độ tinh khiết của sản phẩm, hoạt tính sinh học và điều kiện nuôi cấy là những yếu tố quan trọng cần được kiểm soát. Đặc biệt, việc duy trì điều kiện GMP là rất cần thiết để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

2.1. Vấn đề về độ tinh khiết và hoạt tính sinh học

Độ tinh khiết của Interleukin-2 tái tổ hợp là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị. Các tạp chất có thể làm giảm hoạt tính sinh học của sản phẩm, do đó cần có các phương pháp tinh chế hiệu quả.

2.2. Điều kiện nuôi cấy và kiểm soát chất lượng

Điều kiện nuôi cấy E. coli cần được tối ưu hóa để đạt được năng suất cao nhất. Việc kiểm soát chất lượng trong suốt quá trình sản xuất là rất quan trọng để đảm bảo sản phẩm đạt tiêu chuẩn GMP.

III. Phương pháp sản xuất Interleukin 2 tái tổ hợp hiệu quả

Để sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp, các phương pháp như sử dụng vector biểu hiện, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và tinh chế bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được áp dụng. Những phương pháp này giúp tăng cường hiệu quả sản xuất và đảm bảo chất lượng sản phẩm.

3.1. Sử dụng vector biểu hiện pET22b

Vector pET22b(+) là một công cụ hữu ích trong việc biểu hiện Interleukin-2 tái tổ hợp. Vector này cho phép sản xuất protein với hiệu suất cao và dễ dàng tinh chế.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy trong bioreactor

Điều kiện nuôi cấy trong bioreactor cần được tối ưu hóa để đạt được mật độ tế bào cao và sản lượng protein tối đa. Các yếu tố như pH, nhiệt độ và nồng độ chất cảm ứng IPTG cần được điều chỉnh phù hợp.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của Interleukin 2

Kết quả nghiên cứu cho thấy sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học cao và đạt tiêu chuẩn chất lượng. Sản phẩm này có thể được ứng dụng trong điều trị ung thư và các bệnh lý khác liên quan đến hệ miễn dịch.

4.1. Xác định hoạt tính sinh học của IL 2 trên dòng tế bào CTLL2

Hoạt tính sinh học của Interleukin-2 được xác định thông qua các thử nghiệm trên dòng tế bào CTLL2. Kết quả cho thấy sản phẩm có khả năng kích thích sự phát triển của tế bào T.

4.2. Ứng dụng trong điều trị ung thư

Sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp có thể được sử dụng trong điều trị ung thư, đặc biệt là ung thư thận và ung thư da. Việc sử dụng sản phẩm này giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm chi phí cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp trên dòng E. coli trong điều kiện GMP mở ra nhiều triển vọng cho ngành công nghệ sinh học tại Việt Nam. Việc phát triển công nghệ sản xuất trong nước không chỉ giúp giảm chi phí mà còn nâng cao khả năng tiếp cận điều trị cho bệnh nhân.

5.1. Tương lai của sản xuất IL 2 tái tổ hợp

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp sẽ ngày càng trở nên phổ biến. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc cải thiện quy trình sản xuất và tối ưu hóa hoạt tính sinh học.

5.2. Đóng góp cho ngành y tế Việt Nam

Sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp sẽ góp phần quan trọng trong việc nâng cao chất lượng điều trị ung thư tại Việt Nam. Điều này không chỉ giúp cải thiện sức khỏe cộng đồng mà còn thúc đẩy sự phát triển của ngành công nghệ sinh học trong nước.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư hiện là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới và tại Việt Nam. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, toàn cầu ghi nhận khoảng 14,1 triệu ca mắc mới và 8,2 triệu ca tử vong mỗi năm, với dự báo tăng lên 25 triệu ca mắc mới vào năm 2030. Tại Việt Nam, số ca mắc mới đã tăng từ 126.307 ca năm 2010 lên ước tính khoảng 190.000 ca vào năm 2020. Trong bối cảnh các phương pháp truyền thống như hóa trị hay xạ trị thường gây nhiều tổn thương mô lành, liệu pháp miễn dịch sử dụng cytokine Interleukin-2 tái tổ hợp mở ra hướng điều trị trúng đích hiệu quả cho ung thư biểu mô tế bào thận và u hắc tố ác tính.

Mặc dù chế phẩm thương mại Proleukin đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ phê duyệt từ năm 1992, giá thành điều trị vẫn ở mức rất cao, dao động khoảng 2.500 USD cho một lọ 1,3 mg. Tại Việt Nam, nguồn cung sinh phẩm này hoàn toàn phụ thuộc vào nhập khẩu. Luận văn tập trung giải quyết vấn đề tự chủ công nghệ thông qua việc tối ưu hóa quy trình biểu hiện và tinh chế Interleukin-2 người tái tổ hợp dạng cải biến trên chủng vi khuẩn Escherichia coli BL21(DE3).

Nghiên cứu được triển khai tại Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam kết hợp cùng Công ty TNHH Một thành viên Vắc xin và Sinh phẩm số 1 trong giai đoạn 2013-2015. Mục tiêu trọng tâm là hoàn thiện quy trình lên men quy mô 5 lít và 10 lít, tinh sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đạt độ tinh khiết trên 95%, kiểm soát nội độc tố dưới 0,5 EU/ml và xác nhận hoạt tính sinh học đặc hiệu, tạo cơ sở chuyển giao sản xuất sinh phẩm đạt chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới với giá thành hợp lý.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên nền tảng lý thuyết miễn dịch học khối u và công nghệ DNA tái tổ hợp. Cytokine Interleukin-2 tự nhiên là một glycoprotein có khối lượng phân tử khoảng 15 kDa gồm 133 amino acid, đóng vai trò kích hoạt sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào lympho T gây độc, tế bào giết tự nhiên và đại thực bào nhằm tiêu diệt tế bào ác tính.

Trong cấu trúc không gian, phân tử Interleukin-2 chứa 3 gốc cysteine tại các vị trí 58, 105 và 125. Cầu nối disulfide giữa cysteine 58 và 105 quyết định trực tiếp hoạt tính sinh học. Việc đột biến thay thế cysteine tại vị trí 125 bằng serine giúp ngăn chặn hiện tượng hình thành sai cầu disulfide nội phân tử mà vẫn bảo toàn 100% hoạt tính. Đồng thời, kỹ thuật loại bỏ gốc alanine ở đầu N giúp triệt tiêu vị trí glycosyl hóa tự nhiên, giảm thiểu độc tính khi sử dụng liều cao trên người.

Hệ thống biểu hiện sử dụng vector pET22b(+) mang promoter T7 mạnh kết hợp chủng chủ vi khuẩn Escherichia coli BL21(DE3). Quá trình phiên mã được kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside thông qua cơ chế giải ức chế operon lac.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ các mẻ lên men lặp lại của chủng Escherichia coli BL21 mang vector tái tổ hợp pET22-il2 cải biến. Cỡ mẫu nghiên cứu được thiết kế đồng bộ với 6 công thức bổ sung dinh dưỡng ở quy mô 5 lít và 2 đợt thử nghiệm độc lập ở quy mô nồi lên men 10 lít. Đối với các phép thử sinh học và hóa sinh, mẫu được thu thập theo chuỗi thời gian định kỳ mỗi giờ và thực hiện lặp lại 3 lần độc lập nhằm đảm bảo độ tin cậy thống kê.

Phương pháp chọn mẫu phân tích tuân thủ nguyên tắc lấy mẫu ngẫu nhiên phân tầng tại các thời điểm trước và sau cảm ứng. Quy trình xử lý thể vùi tế bào được tiến hành qua các bước siêu âm phá vỡ màng, rửa tủa bằng đệm chứa 0,1% Triton X-100 và 20% sucrose, sau đó biến tính hoàn toàn trong Guanidine Hydrochloride 7M trước khi hạ nồng độ xuống 3M có bổ sung 15 mM 2-Mercaptoethanol để thu hồi protein tan.

Phương pháp sắc ký pha đảo trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột Bio Wide Pore C5 kích thước 10 mm x 250 mm, kích thước hạt 10 μm, tốc độ dòng 20 ml/phút với gradient dung môi phân cực nước và isopropanol chứa 0,5% acid citric. Lý do lựa chọn hệ sắc ký pha đảo C5 là do tính chọn lọc kỵ nước tối ưu cho các protein tái tổ hợp khó tan.

Hoạt tính sinh học được xác định thông qua thử nghiệm MTT trên dòng tế bào lympho T chuột CTLL-2 từ ngân hàng tế bào chuẩn ATCC. Nồng độ gây đáp ứng 50% tối đa được tính toán bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0. Độ sạch được định lượng bằng phần mềm Quantity One trên ảnh điện di SDS-PAGE, và mức độ an toàn chí nhiệt tố được kiểm tra bằng bộ kit Limulus Amebocyte Lysate theo tiêu chuẩn Dược điển Hoa Kỳ.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình khảo sát điều kiện nuôi cấy trên hệ thống lên men 5 lít đã xác định được công thức dinh dưỡng tối ưu. Khi bổ sung 1% glucose kết hợp 0,5% cao nấm men và cảm ứng bằng 0,5 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside ở thời điểm chỉ số oxy hòa tan giảm dưới 20%, mật độ quang học OD600 đạt 6,26, tăng khoảng 363% so với đối chứng âm không bổ sung dinh dưỡng đạt OD600 là 1,35. Năng suất sinh tổng hợp Interleukin-2 đạt 0,523 mg/ml, cao hơn 200,5% so với mức 0,174 mg/ml của mẫu đối chứng.

Việc nâng quy mô lên hệ thống nồi lên men 10 lít trong điều kiện phòng sạch chuẩn công nghiệp ghi nhận sự sinh trưởng ổn định của chủng vi khuẩn. Sau 6 giờ cảm ứng ở nhiệt độ 47°C, sinh khối tế bào thu được đạt giá trị mật độ quang học từ 15 đến 20, tạo lượng thể vùi dồi dào phục vụ cho các bước xử lý hạ nguồn.

Quy trình tinh sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo trên cột C5 cho phép tách phân đoạn Interleukin-2 tinh khiết trong khoảng thời gian lưu từ phút thứ 9 đến phút thứ 12 của chu trình chạy 20 phút. Phân tích mật độ quang học trên phần mềm Quantity One từ bản gel điện di SDS-PAGE 12,6% chứng minh độ tinh sạch của protein mục tiêu đạt trên 95%, đáp ứng tiêu chuẩn khắt khe đối với dược phẩm tiêm truyền.

Kiểm tra an toàn và hoạt tính khẳng định chế phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp đạt hàm lượng nội độc tố vi khuẩn dưới ngưỡng 0,5 EU/ml qua phép thử đông gel Limulus Amebocyte Lysate. Đồng thời, thử nghiệm MTT trên dòng tế bào phụ thuộc CTLL-2 cho thấy protein tái tổ hợp kích thích tăng sinh tế bào mạnh mẽ với giá trị nồng độ hiệu dụng 50% tương đương mẫu chuẩn quốc tế.

Thảo luận kết quả

Các phát hiện thực nghiệm chứng minh glucose là nguồn carbon và năng lượng vượt trội hơn glycerol trong quá trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp của chủng Escherichia coli BL21. Dữ liệu đối sánh giữa các nghiệm thức có thể được mô hình hóa trực quan thông qua biểu đồ cột thể hiện tương quan giữa nồng độ cơ chất và hàm lượng protein đích thu nhận, kết hợp với đồ thị đường cong sinh trưởng biểu diễn biến thiên mật độ tế bào theo thời gian lên men.

Việc giảm nồng độ chất cảm ứng từ 1,0 mM xuống 0,5 mM không làm suy giảm hiệu suất tổng hợp protein (0,523 mg/ml so với 0,487 mg/ml), giúp tiết kiệm 50% chi phí hóa chất cảm ứng đắt tiền ở quy mô sản xuất lớn. Kết quả sắc ký đồ ghi nhận pic hấp thụ đơn sắc nét tại bước sóng 280 nm, phản ánh sự phân tách triệt để các tạp chất nội bào nhờ cơ chế tương tác kỵ nước trên nền pha tĩnh C5.

So với các công bố quốc tế về biểu hiện cytokine trong vi khuẩn, quy trình cải biến cấu trúc desAla-1 và Ser-125 đã loại bỏ triệt để hiện tượng đa dạng hóa sản phẩm do glycosyl hóa không đồng nhất và kết tụ sai cấu trúc, khẳng định tính khả thi của công nghệ sản xuất sinh phẩm y tế tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện và đưa kết quả nghiên cứu vào ứng dụng thực tiễn điều trị, các giải pháp cụ thể được đề xuất như sau:

Thứ nhất, mở rộng quy mô sản xuất lên hệ thống bioreactor 30 lít đến 100 lít. Công ty TNHH Một thành viên Vắc xin và Sinh phẩm số 1 phối hợp cùng Viện Công nghệ Sinh học tiến hành nâng cấp quy mô trong thời gian 12-18 tháng, hướng tới mục tiêu duy trì mật độ tế bào OD600 đạt trên 20 và hiệu suất thu hồi protein đạt trên 50 mg cho mỗi lít dịch nuôi cấy.

Thứ hai, tự động hóa quy trình sắc ký tinh sạch và tái cuộn gấp protein. Bộ phận Nghiên cứu và Phát triển tại doanh nghiệp sinh dược phẩm cần hoàn thiện hệ thống cột sắc ký công nghiệp trong vòng 6-9 tháng, nhằm rút ngắn thời gian tinh chế xuống dưới 15 phút mỗi mẻ, nâng độ tinh khiết lên trên 98% và giảm 20% lượng dung môi hữu cơ tiêu thụ.

Thứ ba, triển khai đánh giá độc tính tiền lâm sàng và thử nghiệm in vivo. Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam kết hợp cùng các bệnh viện chuyên khoa ung bướu thực hiện đánh giá hoạt tính ức chế khối u trên mô hình động vật trong giai đoạn 2026-2027, đảm bảo tỷ lệ đáp ứng miễn dịch đạt trên 70% trước khi bước vào thử nghiệm lâm sàng.

Thứ tư, xây dựng chính sách định giá và chuyển giao công nghệ sinh phẩm điều trị ung thư. Bộ Y tế và Bộ Khoa học và Công nghệ cần ban hành khung pháp lý hỗ trợ thương mại hóa sinh phẩm trong nước trong vòng 24 tháng, đặt chỉ tiêu giảm giá thành điều trị xuống thấp hơn 30-40% so với mức giá 2.500 USD của biệt dược ngoại nhập, mở rộng cơ hội tiếp cận thuốc cho người bệnh.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho 4 nhóm đối tượng chính:

Nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học và Sinh học Thực nghiệm: Luận văn cung cấp tài liệu chi tiết về kỹ thuật thiết kế vector tái tổ hợp pET22b(+), kiểm soát operon lac và phương pháp xử lý thể vùi bằng Guanidine Hydrochloride kết hợp chất khử 2-Mercaptoethanol.

Kỹ sư công nghệ lên men và chuyên viên phát triển sản phẩm tại các doanh nghiệp dược sinh học: Tiếp cận quy trình vận hành hệ thống bioreactor 5-10 lít đạt chuẩn thực hành tốt sản xuất sinh phẩm của Tổ chức Y tế Thế giới, tối ưu hóa các thông số nhiệt độ, tốc độ khuấy, cấp khí và nồng độ oxy hòa tan.

Bác sĩ chuyên khoa ung bướu và dược sĩ lâm sàng: Nắm bắt cơ chế tác động của liệu pháp cytokine cải biến (desAla-1, Ser-125 rhIL-2) trong kích hoạt tế bào T và tế bào diệt tự nhiên, hiểu rõ các tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng về nội độc tố dưới 0,5 EU/ml và hoạt tính sinh học trên tế bào CTLL-2.

Học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Khoa học Sự sống: Sử dụng làm tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp phân tích định lượng bằng ELISA, Western blot, sắc ký lỏng hiệu năng cao, kỹ thuật MTT assay và xử lý số liệu chuyên sâu bằng phần mềm sinh học.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao cần biến đổi gốc cysteine 125 thành serine trong cấu trúc Interleukin-2?

Phân tử Interleukin-2 tự nhiên chứa 3 gốc cysteine ở các vị trí 58, 105 và 125. Trong đó, liên kết disulfide giữa vị trí 58 và 105 giữ vai trò quyết định hoạt tính sinh học. Cysteine 125 tự do dễ tạo liên kết chéo sai lệch làm suy giảm hoạt tính tới 250 lần. Đột biến thay thế bằng serine giúp cố định cấu trúc không gian chính xác mà không làm thay đổi hoạt tính sinh học.

Việc loại bỏ alanine ở đầu N của chuỗi polypeptide mang lại lợi ích gì?

Trình tự 3 amino acid đầu tiên Ala-Pro-Thr là vị trí nhận biết quá trình glycosyl hóa tự nhiên. Dạng protein glycosyl hóa có tính thấm màng cao và dễ gây phù phổi hoặc hội chứng rò rỉ mao mạch khi dùng liều cao. Việc loại bỏ gốc alanine đầu N giúp loại bỏ nguy cơ này, tạo ra sản phẩm tương đương biệt dược Proleukin được quốc tế công nhận.

Hệ thống biểu hiện vi khuẩn Escherichia coli BL21(DE3) có ưu thế gì trong sản xuất protein tái tổ hợp?

Chủng vi khuẩn này sở hữu tốc độ phân chia nhanh, môi trường nuôi cấy LB chi phí thấp và năng suất biểu hiện cao khi cảm ứng bằng IPTG 0,5 mM. Chủng đã được làm khuyết các gene mã hóa protease màng như ompT và hệ thống hạn chế hsdS, giúp bảo vệ phân tử protein tái tổ hợp không bị phân hủy nội bào trong suốt quá trình nuôi cấy.

Làm thế nào để kiểm soát mức độ chí nhiệt tố trong chế phẩm tiêm truyền?

Nghiên cứu kiểm soát nghiêm ngặt điều kiện phòng sạch theo tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc và sử dụng bộ kit đông gel Limulus Amebocyte Lysate. Kết quả xác nhận nồng độ nội độc tố của mẫu Interleukin-2 sau tinh chế luôn duy trì dưới ngưỡng 0,5 EU/ml, đảm bảo an toàn tuyệt đối cho hệ tuần hoàn và bạch huyết theo Dược điển Hoa Kỳ.

Hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp được định lượng bằng cách nào?

Hoạt tính được đo lường thông qua phép thử MTT trên dòng tế bào lympho T chuột CTLL-2, vốn phụ thuộc tuyệt đối vào Interleukin-2 để duy trì sự sống. Bằng cách đo mật độ quang học ở bước sóng 595 nm trên dãy nồng độ pha loãng và tính toán giá trị nồng độ hiệu dụng 50% trên phần mềm GraphPad Prism 5.0, hoạt tính sinh học riêng của sản phẩm được quy đổi chính xác theo đơn vị quốc tế IU/mg.

Kết luận

• Luận văn đã xây dựng thành công quy trình sản xuất Interleukin-2 người tái tổ hợp dạng cải biến (desAla-1, Ser-125) trên chủng vi khuẩn Escherichia coli BL21(DE3) ở quy mô nồi lên men 5 lít và 10 lít.
• Xác lập điều kiện dinh dưỡng tối ưu với 1% glucose, 0,5% cao nấm men và 0,5 mM IPTG, nâng giá trị OD600 lên 6,26 và hàm lượng protein đạt 0,523 mg/ml.
• Hoàn thiện công nghệ tiền xử lý thể vùi bằng Guanidine Hydrochloride và tinh sạch bằng sắc ký pha đảo HPLC cột C5, đạt độ tinh khiết trên 95%.
• Kiểm chứng chất lượng sản phẩm đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn quốc tế với mức nội độc tố dưới 0,5 EU/ml và hoạt tính sinh học tương đương mẫu chuẩn thương mại.
• Tạo nền tảng công nghệ vững chắc phục vụ sản xuất sinh phẩm điều trị ung thư biểu mô tế bào thận và u hắc tố ác tính tại Việt Nam với chi phí tối ưu.

Trong giai đoạn 2026-2027, công nghệ cần tiếp tục được thử nghiệm mở rộng ở quy mô bioreactor 30-100 lít và hoàn tất các thủ tục đăng ký tiền lâm sàng. Các đơn vị nghiên cứu, cơ sở y tế và doanh nghiệp quan tâm có thể khai thác toàn văn luận văn tại Viện Công nghệ Sinh học và Công ty VABIOTECH để thúc đẩy quá trình chuyển giao công nghệ sinh dược phẩm quốc gia.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Sức khỏe cộng đồng và ung thƣ là những vấn đề ngày càng đƣợc quan tâmở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Trong đó, ung thƣ là nguyên nhân chủ yếu gây tử vong cho ngƣời bệnh và đang có xu hƣớng ngày càng gia tăng. Theo ghi nhận của tổ chức Y tế Thế giới (năm 2012), trên thế giới có 14,1 triệu ca ung thƣ mớiđƣợc phát hiện và 8,2 triệu ngƣời chết vì ung thƣ. Ƣớc tính tới năm 2030, mỗi năm sẽ có thêm 25 triệu ca mới mắc bệnh.

Tại Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế, trong năm 2010 số ca mắc ung thƣ mới tăng lên tới 126.307, ƣớc tính đến năm 2020 số ca mắc ung thƣ mới là 190. Nguyên nhân chính gây ung thƣ là do môi trƣờng bên ngoài cùng với chế độ sinh hoạt hằng ngày chiếm tới 90%. Hiện nay các phƣơng pháp nhƣ phẫu thuật, hóa trị, xạ trị…vẫn là những phƣơng pháp phổ biến nhất trong điều trị ung thƣ trên thế giới. Tuy nhiên, chúng còn một số nhƣợc điểm nhƣ là có thể gây tổn thƣơng cho các tế bào lành, ảnh hƣởng không tốt tới sức khỏe ngƣời bệnh.

Ngoài các phƣơng pháp điều trị trên thì liệu pháp miễn dịch là phƣơng pháp chữa trị hứa hẹn mang lại hiệu quả cao. Liệu pháp này có thể tiêu diệt tế bào ung thƣ, khống chế khả năng phát triển nhanh chóng của khối u và không làm tổn thƣơng các tế bào khỏe mạnh, tăng cƣờng khả năng miễn dịch cho bệnh nhân, kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lƣợng sống. Do đó,liệu pháp miễn dịch đƣợc coi là liệu pháp xanh vì có hiệu quả điều trị rõ rệt, không có tác dụng phụ, an toàn và dung nạp tốt, mở ra một hình thức điều trị hoàn toàn mới cho bệnh nhân ung thƣ. Liệu pháp miễn dịch sử dụng cytokine để kích hoạt hệ thống miễn dịch nhằm nhận biết và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh.Interleukin-2 (IL-2) là một cytokineđƣợc tiết bởi tế bào lympho T đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch của cơ thể.

Cytokine này tham gia vào quá trình kích thích hệ thống miễn dịch sản sinh ra các dòng tế bào T, đồng thời kích thích sự tăng sinh và biệt hóa các dòng tế bào NK và các đại thực bào nhằm tăng cƣờng khả năng miễn dịch của cơ thể. IL- 2 đã đƣợc sử dụng điều trị hiệu quả hai loại ung thƣ biểu mô thận và ung thƣ da. Ngoài ra, IL-2 còn đƣợc sử dụng hỗ trợ điều trị các bệnh ung thƣ khác nhƣ ung thƣ 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] phổi, ung thƣ bạch cầu, ung thƣ buồng trứng,… và có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch để chống bệnh nhiễm HIV. Năm 1992, Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã cho phép sử dụng IL-2 tái tổ hợp trong điều trị ung thƣ.

Hiện nay, chế phẩm IL-2 với tên thƣơng phẩm Proleukin® (Aldesleukin) đã đƣợc sản xuất bởi hãng Chiron và thƣơng mại hóa trên toàn thế giới, tuy nhiên giá thành của Proleukin® còn khá cao (khoảng 2,5 nghìn USD/ống 1,3 mg). Tại Việt Nam, việc sử dụng IL-2 tái tổ hợp nói riêng và sản phẩm protein tái tổ hợp trong điều trị nói chung vẫn còn bị bỏ ngỏ và chƣa có sản phẩm protein tái tổ hợp đƣợc triển khai áp dụng hoàn toàn từ quá trình nghiên cứu đến quá trình sản xuất. Để chủ động việc sản xuất IL -2 tái tổ hợp trong nƣớc và giảm giá thành sản xuất với chi phí thấp phục vụ cho việc điều trị bệnh ung thƣ ta ̣i Viê ̣t Nam , việc nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất IL-2 tái tổ hợp và chuyển giao sang công ty để sản xuất thử nghiệm là rất cần thiết. Trong quá trình nghiên cứusản xuất IL-2 ngƣời tái tổ hợp, trình tự amino acid của IL-2 đã đƣợc cải biến nhằm tạo ra đƣợc sản phẩm Interleukin-2 có trình tự giống với sản phẩm Proleukin đã đƣợc FDA công nhận.

Ngoài ra, việc cải biến trình tự amino acid sẽlàm tăng hoạt tính và tăng tính an toàn cho sản phẩm. Sản phẩm Proleukin còn có tên hóa học là desalanyl-1, serein-125 human interleukin-2 tƣơng ứng đột biến mất alanine ở vị trí amino acid số 1, thay thế cysteine ở vị trí 125 bằng serine. Để chuyển giao công nghệ sản xuất IL-2 tái tổ hợp từ quy mô phòng thí nghiệm sang phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP, chúng tôi đã tiến hành tối ƣu biểu hiện protein IL-2 trong hệ thống lên men 5 và 10 lít tại Viện Công nghệ sinh học và công ty VABIOTECH. Sau đó, sản phẩm lên men đƣợc tiến hành tiền xử lý và tinh chế bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sản phẩm Interleukin-2 sau tinh chế đƣợc tiến hành xác định hoạt tính sinh học và kiểm tra một số chỉ tiêu về độ sạch và độ an toàn, để đáp ứng yêu cầu của sản phẩm tái tổ hợp sử dụng trong điều trị trên ngƣời với giá thành thấp hơn thƣơng phẩm Proleukin.

Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào Escherichia coli trong điều kiện GMP”. Đề tài đƣợc thực hiện tại Công ty Vacxin và Sinh phẩm số 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 1, Bộ Y tế và phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Tình hình ung thƣ ở Việt Nam và trên thế giới Ung thƣ đang là một căn bệnh hết sức nguy hiểm khiến số lƣợng ngƣời tử vong cao nhất thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization, WHO), trong năm 2008 có khoảng 12,7 triệu ca ung thƣ mới (trong đó 6.000 nữ giới) và 7,6 triệu ngƣời đã tử vong do ung thƣ (4. Đến năm 2012, có khoảng 14,1 triệu ca ung thƣ mới (trong đó 7.000 nữ giới) và có 8,2 triệu ngƣời tử vong (4.000 nữ giới) [13], số ngƣời mặc bệnh ung thƣ tăng 11% so với 4 năm trƣớc. Ƣớc tính đến năm 2030 số ca mắc bệnh ung thƣ trên thế giới tăng 70% tƣơng đƣơng với 25 triệu ca mới.

Số liệu mới nhất theo thống kê của Hiệp hội ung thƣ Hoa Kỳ (American Cancer Society) cho thấy số ca ung thƣ mới tại Mỹ năm 2015 là 1.430 ngƣời tử vong, số lƣợng này đã giảm 0,43% so với năm 2014 số ca ung thƣ mới là 1.540 và số ngƣời tử vong là 589. Theo tổ chức nghiên cứu ung thƣ quốc tế (International Agency for Research on Cancer) ƣớc tính trên tổng số ca ung thƣ toàn cầu, có khoảng hơn một nửa số ca ung thƣ và hơn hai phần ba ca ung thƣ sẽ gia tăng và tập trung ở những nƣớc đang phát triển. Những bệnh ung thƣ chủ yếu nhƣ: ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ buồng trứng, ung thƣ gan, ung thƣ máu, ung thƣ thận, ung thƣ da,… Trong đó ung thƣ thận và ung thƣ da chiếm tỷ lệ khoảng 2 - 3% trên tổng số ca ung thƣ [31]. Việt Nam là một trong những nƣớc đang phát triển, theo đó là sự thay đổi về kinh tế, đời sống đƣợc nâng cao, các bệnh gây tử vong trƣớc đây nhƣ bệnh truyền nhiễm và suy dinh dƣỡng đã giảm mạnh.

Vấn đề không dừng lại ở đó, khi kinh tế phát triển nhanh đồng nghĩa với nhiều vấn đề xảy ra nhƣ: ô nhiễm môi trƣờng, chất lƣợng thức ăn, béo phì,… Dẫn đến việc gia tăng các bệnh tật nhƣ tiểu đƣờng, tim mạch và đặc biệt là ung thƣ. Theo nhƣ TS. Bùi Xuân Trƣờng, Bệnh viện Đa khoa Quốc tế VinMec cho biết, so với tỷ lệ chung trên thế giới thì Việt Nam thuộc 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] nhóm nƣớc có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất đối với: ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ dạ dày, ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ gan, ung thƣ đại-trực tràng [62]. Bên cạnh đó tỷ lệ ung thƣ gan tại Việt nam cũng thuộc mức cao nhất thế giới, đặc biệt ở nam giới [62].

Hầu hết các bệnh ung thƣ phổ biến thƣờng gặp tại Việt Nam đều chƣa có xu hƣớng giảm xuống và vẫn đang tiếp tục tăng lên [62]. Ƣớc tính khoảng 85% số bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam đƣợc phát hiện khi đã ở độ tuổi trên 40 [62]. Theo số liệu thống kê của bệnh viện K-Hà Nội và Trung tâm U bƣớu Thành phố Hồ Chí Minh, mỗi năm có 150.000 ngƣời mắc ung thƣ mớitrong đó có 75.000 ngƣời tử vong và tại bệnh viện K, tỷ lệ bệnh nhân mắc ung thƣ hằng năm tăng thêm khoảng 20-30% (PGS. Trần Văn Thuấn, Phó giám đốc bệnh viện K, Viện trƣởng Viện nghiên cứu phòng chống ung thƣ) [63].

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2008, dân số Việt Nam có khoảng 87 triệu ngƣời, số ca ung thƣ mới là 111.600 ngƣời (trong đó 55.000 ca tử vong (43.300 nữ giới) chiếm tới 73,5% tổng số bệnh nhân ung thƣ [14].Đặc biệt, theo thống kê mới nhất của Bộ Y tế, trong hội thảo “Phối hợp đa ngành trong phòng chống ung thƣ quốc gia” tổ chức ngày 8-12-2015, tại Hà Nội, trong năm 2010 số ca mắc ung thƣ mới tăng lên tới 126.307 và ƣớc tính đến năm 2020 số ca mắc ung thƣ mới là 190. Nhƣ vậy, việc tìm ra các phƣơng pháp phòng và điều trị ung thƣ nhằm giảm thiểu số ca mắc bệnh ung thƣ và tỉ lệ tử vong là rất cấp bách. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ Ung thƣ là một căn bệnh nguy hiểm và chiếm tỉ lệ tử vong rất cao, tuy nhiên nó có thể đƣợc chữa khỏi hoàn toàn nếu phát hiện và điều trị sớm bằng các phƣơng pháp khác nhau nhƣ: phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, liệu pháp miễn dịch và liệu pháp gen. Các phƣơng pháp có thể đƣợc sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau để đem lại hiệu quả điều trị tốt nhất với mục tiêu là chữa khỏi và giúp kiểm soát hoặc làm giảm nhẹ ung thƣ.Việc chọn lựa phƣơng pháp điều trị phụ thuộc vào từng dạng ung thƣ, vị trí khối u, giai đoạn của bệnh cũng nhƣ thể trạng của bệnh nhân.

Các phƣơng pháp điều trị truyền thống nhƣ phẫu thuật, xạ trị và hóa trị đều nhằm mục đích loại bỏ các tế bào ung thƣ, phá hủy chúng bằng thuốc hoặc các tác nhân khác.