Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp trên dòng tế bào E. coli trong điều kiện GMP

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hay nghiên cứu sản xuất interleukin 2 người tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào escherichia, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Nguyễn Thị Minh Thu
• Người hướng dẫn: GS. Trương Nam Hải
• Trường học: Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 người tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào Escherichia coli trong điều kiện GMP
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình ung thƣ ở Việt Nam và trên thế giới
• 1.2. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ
• 1.3. Tổng quan về Interleukin-2
• 1.4. Cấu trúc của Interleukin-2
• 1.5. Cơ chế hoạt động và chức năng sinh học của Interleukin-2
• 1.6. Vai trò của Interleukin-2 trong điều trị ung thư
• 1.7. Hệ biểu hiện E.
• 1.8. Hệ biểu hiện E. Vector biểu hiện pET22b(+)
• 1.9. Lên men sản xuất protein tái tổ hợp trên hệ thống lên men Bioreactor
• 1.10. Tinh sạch protein bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
• 1.11. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2
• 1.12. Phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GMP
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Chủng giống và plasmid
• 2.3. Máy móc và thiết bị
• 2.4. Các môi trường và dung dịch
• 2.5. Môi trường sử dụng trong biểu hiện protein
• 2.6. Dung dịch sử dụng trong tiền tinh chế protein Interleukin-2
• 2.7. Dung dịch sử dụng trong chạy hệ thống sắc ký HPLC
• 2.8. Dung dịch sử dụng trong điện di SDS - PAGE
• 2.9. Dung dịch sử dụng để hiện kết quả điện di SDS – PAGE
• 2.10. Dung dịch sử dụng trong phản ứng Western blot
• 2.11. Dung dịch sử dụng trong phương pháp ELISA
• 2.12. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.13. Biểu hiện protein Interleukin-2 tái tổ hợp trong tế bào E. coli ở các hệ thống lên men 5 và 10 lít
• 2.14. Phá tế bào E. coli và xử lý IL-2 thô (tiền tinh chế)
• 2.15. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
• 2.16. Xác định hoạt tính sinh học protein Interleukin-2 trên dòng tế bào CTLL2
• 2.17. Kiểm tra tính đặc hiệu của protein bằng phương pháp Western blot
• 2.18. Kiểm tra độ sạch bằng phần mềm Quantity One
• 2.19. Kiểm tra nội độc tố bằng LAL kit
• 2.20. Xác định hàm lượng protein trong mẫu tinh chế bằng phương pháp ELISA
• 2.21. Điện di SDS-PAGE
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ƣu lên men chủng E. coli BL21 IL-2 trên quy mô nồi lên men 5 và 10 lít
• 3.2. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 5 lít
• 3.3. Khảo sát thành phần dinh dưỡng và nồng độ chất cảm ứng
• 3.4. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở quy mô hệ thống lên men 10 lít đợt 1
• 3.5. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở hệ thống lên men 10 lít đợt 2
• 3.6. Xử lý tiền tinh chế thu hồi IL-2 từ sinh khối tế bào lên men
• 3.7. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
• 3.8. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2
• 3.9. Xác định độ tinh sạch của protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế bằng phần mềm Quantity One
• 3.10. Xác định hàm lƣợng nội độc tố trong sản phẩm IL-2 sau tinh chế
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu sản xuất Interleukin 2 tái tổ hợp

Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp trên dòng E. coli trong điều kiện GMP là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Interleukin-2 là một cytokine có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch, giúp kích thích sự phát triển của tế bào T. Việc sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp không chỉ giúp giảm chi phí điều trị ung thư mà còn nâng cao hiệu quả điều trị.

1.1. Định nghĩa và vai trò của Interleukin 2 trong y học

Interleukin-2 (IL-2) là một cytokine được sản xuất chủ yếu bởi tế bào lympho T. IL-2 có vai trò quan trọng trong việc kích thích sự phát triển và hoạt động của các tế bào miễn dịch, đặc biệt là tế bào T và tế bào NK. IL-2 đã được chứng minh là có hiệu quả trong điều trị một số loại ung thư.

1.2. Tại sao cần nghiên cứu sản xuất IL 2 tái tổ hợp

Việc sản xuất IL-2 tái tổ hợp giúp giảm chi phí và tăng khả năng tiếp cận cho bệnh nhân. Sản phẩm IL-2 thương mại hiện tại có giá cao, do đó, nghiên cứu sản xuất trong nước là cần thiết để đáp ứng nhu cầu điều trị.

II. Thách thức trong sản xuất Interleukin 2 tái tổ hợp

Sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp trên dòng E. coli gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như độ tinh khiết của sản phẩm, hoạt tính sinh học và điều kiện nuôi cấy là những yếu tố quan trọng cần được kiểm soát. Đặc biệt, việc duy trì điều kiện GMP là rất cần thiết để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

2.1. Vấn đề về độ tinh khiết và hoạt tính sinh học

Độ tinh khiết của Interleukin-2 tái tổ hợp là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị. Các tạp chất có thể làm giảm hoạt tính sinh học của sản phẩm, do đó cần có các phương pháp tinh chế hiệu quả.

2.2. Điều kiện nuôi cấy và kiểm soát chất lượng

Điều kiện nuôi cấy E. coli cần được tối ưu hóa để đạt được năng suất cao nhất. Việc kiểm soát chất lượng trong suốt quá trình sản xuất là rất quan trọng để đảm bảo sản phẩm đạt tiêu chuẩn GMP.

III. Phương pháp sản xuất Interleukin 2 tái tổ hợp hiệu quả

Để sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp, các phương pháp như sử dụng vector biểu hiện, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và tinh chế bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được áp dụng. Những phương pháp này giúp tăng cường hiệu quả sản xuất và đảm bảo chất lượng sản phẩm.

3.1. Sử dụng vector biểu hiện pET22b

Vector pET22b(+) là một công cụ hữu ích trong việc biểu hiện Interleukin-2 tái tổ hợp. Vector này cho phép sản xuất protein với hiệu suất cao và dễ dàng tinh chế.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy trong bioreactor

Điều kiện nuôi cấy trong bioreactor cần được tối ưu hóa để đạt được mật độ tế bào cao và sản lượng protein tối đa. Các yếu tố như pH, nhiệt độ và nồng độ chất cảm ứng IPTG cần được điều chỉnh phù hợp.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của Interleukin 2

Kết quả nghiên cứu cho thấy sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học cao và đạt tiêu chuẩn chất lượng. Sản phẩm này có thể được ứng dụng trong điều trị ung thư và các bệnh lý khác liên quan đến hệ miễn dịch.

4.1. Xác định hoạt tính sinh học của IL 2 trên dòng tế bào CTLL2

Hoạt tính sinh học của Interleukin-2 được xác định thông qua các thử nghiệm trên dòng tế bào CTLL2. Kết quả cho thấy sản phẩm có khả năng kích thích sự phát triển của tế bào T.

4.2. Ứng dụng trong điều trị ung thư

Sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp có thể được sử dụng trong điều trị ung thư, đặc biệt là ung thư thận và ung thư da. Việc sử dụng sản phẩm này giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm chi phí cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp trên dòng E. coli trong điều kiện GMP mở ra nhiều triển vọng cho ngành công nghệ sinh học tại Việt Nam. Việc phát triển công nghệ sản xuất trong nước không chỉ giúp giảm chi phí mà còn nâng cao khả năng tiếp cận điều trị cho bệnh nhân.

5.1. Tương lai của sản xuất IL 2 tái tổ hợp

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp sẽ ngày càng trở nên phổ biến. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc cải thiện quy trình sản xuất và tối ưu hóa hoạt tính sinh học.

5.2. Đóng góp cho ngành y tế Việt Nam

Sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp sẽ góp phần quan trọng trong việc nâng cao chất lượng điều trị ung thư tại Việt Nam. Điều này không chỉ giúp cải thiện sức khỏe cộng đồng mà còn thúc đẩy sự phát triển của ngành công nghệ sinh học trong nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Sức khỏe cộng đồng và ung thƣ là những vấn đề ngày càng đƣợc quan tâmở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Trong đó, ung thƣ là nguyên nhân chủ yếu gây tử vong cho ngƣời bệnh và đang có xu hƣớng ngày càng gia tăng. Theo ghi nhận của tổ chức Y tế Thế giới (năm 2012), trên thế giới có 14,1 triệu ca ung thƣ mớiđƣợc phát hiện và 8,2 triệu ngƣời chết vì ung thƣ. Ƣớc tính tới năm 2030, mỗi năm sẽ có thêm 25 triệu ca mới mắc bệnh.

Tại Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế, trong năm 2010 số ca mắc ung thƣ mới tăng lên tới 126.307, ƣớc tính đến năm 2020 số ca mắc ung thƣ mới là 190. Nguyên nhân chính gây ung thƣ là do môi trƣờng bên ngoài cùng với chế độ sinh hoạt hằng ngày chiếm tới 90%. Hiện nay các phƣơng pháp nhƣ phẫu thuật, hóa trị, xạ trị…vẫn là những phƣơng pháp phổ biến nhất trong điều trị ung thƣ trên thế giới. Tuy nhiên, chúng còn một số nhƣợc điểm nhƣ là có thể gây tổn thƣơng cho các tế bào lành, ảnh hƣởng không tốt tới sức khỏe ngƣời bệnh.

Ngoài các phƣơng pháp điều trị trên thì liệu pháp miễn dịch là phƣơng pháp chữa trị hứa hẹn mang lại hiệu quả cao. Liệu pháp này có thể tiêu diệt tế bào ung thƣ, khống chế khả năng phát triển nhanh chóng của khối u và không làm tổn thƣơng các tế bào khỏe mạnh, tăng cƣờng khả năng miễn dịch cho bệnh nhân, kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lƣợng sống. Do đó,liệu pháp miễn dịch đƣợc coi là liệu pháp xanh vì có hiệu quả điều trị rõ rệt, không có tác dụng phụ, an toàn và dung nạp tốt, mở ra một hình thức điều trị hoàn toàn mới cho bệnh nhân ung thƣ. Liệu pháp miễn dịch sử dụng cytokine để kích hoạt hệ thống miễn dịch nhằm nhận biết và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh.Interleukin-2 (IL-2) là một cytokineđƣợc tiết bởi tế bào lympho T đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch của cơ thể.

Cytokine này tham gia vào quá trình kích thích hệ thống miễn dịch sản sinh ra các dòng tế bào T, đồng thời kích thích sự tăng sinh và biệt hóa các dòng tế bào NK và các đại thực bào nhằm tăng cƣờng khả năng miễn dịch của cơ thể. IL- 2 đã đƣợc sử dụng điều trị hiệu quả hai loại ung thƣ biểu mô thận và ung thƣ da. Ngoài ra, IL-2 còn đƣợc sử dụng hỗ trợ điều trị các bệnh ung thƣ khác nhƣ ung thƣ 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] phổi, ung thƣ bạch cầu, ung thƣ buồng trứng,… và có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch để chống bệnh nhiễm HIV. Năm 1992, Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã cho phép sử dụng IL-2 tái tổ hợp trong điều trị ung thƣ.

Hiện nay, chế phẩm IL-2 với tên thƣơng phẩm Proleukin® (Aldesleukin) đã đƣợc sản xuất bởi hãng Chiron và thƣơng mại hóa trên toàn thế giới, tuy nhiên giá thành của Proleukin® còn khá cao (khoảng 2,5 nghìn USD/ống 1,3 mg). Tại Việt Nam, việc sử dụng IL-2 tái tổ hợp nói riêng và sản phẩm protein tái tổ hợp trong điều trị nói chung vẫn còn bị bỏ ngỏ và chƣa có sản phẩm protein tái tổ hợp đƣợc triển khai áp dụng hoàn toàn từ quá trình nghiên cứu đến quá trình sản xuất. Để chủ động việc sản xuất IL -2 tái tổ hợp trong nƣớc và giảm giá thành sản xuất với chi phí thấp phục vụ cho việc điều trị bệnh ung thƣ ta ̣i Viê ̣t Nam , việc nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất IL-2 tái tổ hợp và chuyển giao sang công ty để sản xuất thử nghiệm là rất cần thiết. Trong quá trình nghiên cứusản xuất IL-2 ngƣời tái tổ hợp, trình tự amino acid của IL-2 đã đƣợc cải biến nhằm tạo ra đƣợc sản phẩm Interleukin-2 có trình tự giống với sản phẩm Proleukin đã đƣợc FDA công nhận.

Ngoài ra, việc cải biến trình tự amino acid sẽlàm tăng hoạt tính và tăng tính an toàn cho sản phẩm. Sản phẩm Proleukin còn có tên hóa học là desalanyl-1, serein-125 human interleukin-2 tƣơng ứng đột biến mất alanine ở vị trí amino acid số 1, thay thế cysteine ở vị trí 125 bằng serine. Để chuyển giao công nghệ sản xuất IL-2 tái tổ hợp từ quy mô phòng thí nghiệm sang phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP, chúng tôi đã tiến hành tối ƣu biểu hiện protein IL-2 trong hệ thống lên men 5 và 10 lít tại Viện Công nghệ sinh học và công ty VABIOTECH. Sau đó, sản phẩm lên men đƣợc tiến hành tiền xử lý và tinh chế bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sản phẩm Interleukin-2 sau tinh chế đƣợc tiến hành xác định hoạt tính sinh học và kiểm tra một số chỉ tiêu về độ sạch và độ an toàn, để đáp ứng yêu cầu của sản phẩm tái tổ hợp sử dụng trong điều trị trên ngƣời với giá thành thấp hơn thƣơng phẩm Proleukin.

Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào Escherichia coli trong điều kiện GMP”. Đề tài đƣợc thực hiện tại Công ty Vacxin và Sinh phẩm số 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 1, Bộ Y tế và phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Tình hình ung thƣ ở Việt Nam và trên thế giới Ung thƣ đang là một căn bệnh hết sức nguy hiểm khiến số lƣợng ngƣời tử vong cao nhất thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization, WHO), trong năm 2008 có khoảng 12,7 triệu ca ung thƣ mới (trong đó 6.000 nữ giới) và 7,6 triệu ngƣời đã tử vong do ung thƣ (4. Đến năm 2012, có khoảng 14,1 triệu ca ung thƣ mới (trong đó 7.000 nữ giới) và có 8,2 triệu ngƣời tử vong (4.000 nữ giới) [13], số ngƣời mặc bệnh ung thƣ tăng 11% so với 4 năm trƣớc. Ƣớc tính đến năm 2030 số ca mắc bệnh ung thƣ trên thế giới tăng 70% tƣơng đƣơng với 25 triệu ca mới.

Số liệu mới nhất theo thống kê của Hiệp hội ung thƣ Hoa Kỳ (American Cancer Society) cho thấy số ca ung thƣ mới tại Mỹ năm 2015 là 1.430 ngƣời tử vong, số lƣợng này đã giảm 0,43% so với năm 2014 số ca ung thƣ mới là 1.540 và số ngƣời tử vong là 589. Theo tổ chức nghiên cứu ung thƣ quốc tế (International Agency for Research on Cancer) ƣớc tính trên tổng số ca ung thƣ toàn cầu, có khoảng hơn một nửa số ca ung thƣ và hơn hai phần ba ca ung thƣ sẽ gia tăng và tập trung ở những nƣớc đang phát triển. Những bệnh ung thƣ chủ yếu nhƣ: ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ buồng trứng, ung thƣ gan, ung thƣ máu, ung thƣ thận, ung thƣ da,… Trong đó ung thƣ thận và ung thƣ da chiếm tỷ lệ khoảng 2 - 3% trên tổng số ca ung thƣ [31]. Việt Nam là một trong những nƣớc đang phát triển, theo đó là sự thay đổi về kinh tế, đời sống đƣợc nâng cao, các bệnh gây tử vong trƣớc đây nhƣ bệnh truyền nhiễm và suy dinh dƣỡng đã giảm mạnh.

Vấn đề không dừng lại ở đó, khi kinh tế phát triển nhanh đồng nghĩa với nhiều vấn đề xảy ra nhƣ: ô nhiễm môi trƣờng, chất lƣợng thức ăn, béo phì,… Dẫn đến việc gia tăng các bệnh tật nhƣ tiểu đƣờng, tim mạch và đặc biệt là ung thƣ. Theo nhƣ TS. Bùi Xuân Trƣờng, Bệnh viện Đa khoa Quốc tế VinMec cho biết, so với tỷ lệ chung trên thế giới thì Việt Nam thuộc 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] nhóm nƣớc có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất đối với: ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ dạ dày, ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ gan, ung thƣ đại-trực tràng [62]. Bên cạnh đó tỷ lệ ung thƣ gan tại Việt nam cũng thuộc mức cao nhất thế giới, đặc biệt ở nam giới [62].

Hầu hết các bệnh ung thƣ phổ biến thƣờng gặp tại Việt Nam đều chƣa có xu hƣớng giảm xuống và vẫn đang tiếp tục tăng lên [62]. Ƣớc tính khoảng 85% số bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam đƣợc phát hiện khi đã ở độ tuổi trên 40 [62]. Theo số liệu thống kê của bệnh viện K-Hà Nội và Trung tâm U bƣớu Thành phố Hồ Chí Minh, mỗi năm có 150.000 ngƣời mắc ung thƣ mớitrong đó có 75.000 ngƣời tử vong và tại bệnh viện K, tỷ lệ bệnh nhân mắc ung thƣ hằng năm tăng thêm khoảng 20-30% (PGS. Trần Văn Thuấn, Phó giám đốc bệnh viện K, Viện trƣởng Viện nghiên cứu phòng chống ung thƣ) [63].

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2008, dân số Việt Nam có khoảng 87 triệu ngƣời, số ca ung thƣ mới là 111.600 ngƣời (trong đó 55.000 ca tử vong (43.300 nữ giới) chiếm tới 73,5% tổng số bệnh nhân ung thƣ [14].Đặc biệt, theo thống kê mới nhất của Bộ Y tế, trong hội thảo “Phối hợp đa ngành trong phòng chống ung thƣ quốc gia” tổ chức ngày 8-12-2015, tại Hà Nội, trong năm 2010 số ca mắc ung thƣ mới tăng lên tới 126.307 và ƣớc tính đến năm 2020 số ca mắc ung thƣ mới là 190. Nhƣ vậy, việc tìm ra các phƣơng pháp phòng và điều trị ung thƣ nhằm giảm thiểu số ca mắc bệnh ung thƣ và tỉ lệ tử vong là rất cấp bách. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ Ung thƣ là một căn bệnh nguy hiểm và chiếm tỉ lệ tử vong rất cao, tuy nhiên nó có thể đƣợc chữa khỏi hoàn toàn nếu phát hiện và điều trị sớm bằng các phƣơng pháp khác nhau nhƣ: phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, liệu pháp miễn dịch và liệu pháp gen. Các phƣơng pháp có thể đƣợc sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau để đem lại hiệu quả điều trị tốt nhất với mục tiêu là chữa khỏi và giúp kiểm soát hoặc làm giảm nhẹ ung thƣ.Việc chọn lựa phƣơng pháp điều trị phụ thuộc vào từng dạng ung thƣ, vị trí khối u, giai đoạn của bệnh cũng nhƣ thể trạng của bệnh nhân.

Các phƣơng pháp điều trị truyền thống nhƣ phẫu thuật, xạ trị và hóa trị đều nhằm mục đích loại bỏ các tế bào ung thƣ, phá hủy chúng bằng thuốc hoặc các tác nhân khác.