Luận văn: Phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB bằng kit nhuộm

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu ứng dụng bộ kit nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn fab, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện pháp hoàn

• Tác giả: Đoàn Văn Thuyết
• Người hướng dẫn: TS. Trần Văn Tính
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: ỨNG DỤNG BỘ KÍT NHUỘM HÓA HỌC TẾ BÀO ĐỂ PHÂN LOẠI BỆNH BẠCH CẦU CẤP THEO TIÊU CHUẨN FAB
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm về phân loại bạch cầu cấp FAB

Phân loại bạch cầu cấp FAB (French-American-British) là tiêu chuẩn quốc tế được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán các bệnh bạch cầu cấp. Tiêu chuẩn này được phát triển bởi hội các nhà huyết học Pháp, Mỹ và Anh, nhằm cung cấp một hệ thống phân loại thống nhất cho bệnh bạch cầu cấp dòng lympho và bệnh bạch cầu cấp dòng tủy. Việc phân loại chính xác là vô cùng quan trọng để xác định phương pháp điều trị phù hợp và tiên lượng bệnh. Hệ thống FAB giúp các bác sĩ lâm sàng có cơ sở khoa học vững chắc để đưa ra quyết định điều trị hiệu quả, từ đó nâng cao tỷ lệ chữa khỏi cho bệnh nhân.

1.1. Định nghĩa bệnh bạch cầu cấp

Bạch cầu cấp (Acute Leukemia) là một bệnh lý ác tính của hệ tạo máu, đặc trưng bởi sự phát triển nhanh chóng và không kiểm soát của các tế bào bạch cầu chưa trưởng thành. Bệnh này chia thành hai dòng chính: ALL (Acute Lymphoblastic Leukemia) và AML (Acute Myeloid Leukemia). Quá trình sinh máu bị xáo trộn, dẫn đến sự gia tăng bất thường của các lymphoblast hoặc myeloblast trong máu và tủy xương.

1.2. Tầm quan trọng của tiêu chuẩn FAB

Tiêu chuẩn FAB cung cấp một hệ thống phân loại chi tiết, giúp phân biệt các thể bệnh bạch cầu cấp khác nhau (L1, L2, L3 cho dòng lympho và M0-M7 cho dòng tủy). Phân loại chính xác theo FAB giúp xác định tiên lượng, lựa chọn liệu pháp và dự đoán kết quả điều trị, từ đó cải thiện chất lượng chăm sóc bệnh nhân.

II. Phương pháp nhuộm hóa học tế bào trong chẩn đoán

Nhuộm hóa học tế bào (Cytochemistry) là một trong những phương pháp cơ bản và quan trọng nhất để phân loại bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB. Bộ kit nhuộm HICYTEC được ứng dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm huyết học để xác định các đặc tính hóa học của bạch cầu bệnh qua việc nhuộm các enzyme cụ thể. Các kỹ thuật nhuộm khác nhau như nhuộm peroxidaza (PER), nhuộm Periodic-Axit Schiff (PAS), nhuộm esteraza và nhuộm photphataza cung cấp thông tin bổ sung để phân biệt giữa bạch cầu cấp dòng tủy và bạch cầu cấp dòng lympho. Phương pháp này có độ chính xác cao, chi phí hợp lý và dễ thực hiện.

2.1. Các kỹ thuật nhuộm chính

Nhuộm peroxidaza (PER) phát hiện hoạt động peroxidaza ở các hạt của bạch cầu cấp dòng tủy. Nhuộm PAS giúp xác định glycogen tích tụ trong tế bào. Nhuộm esteraza và nhuộm photphataza cung cấp thông tin về hoạt động enzyme đặc trưng của các loại bạch cầu khác nhau. Mỗi kỹ thuật có ý nghĩa riêng trong việc phân loại bệnh bạch cầu cấp.

2.2. Ứng dụng bộ kit nhuộm HICYTEC

Bộ kit HICYTEC được thiết kế để thực hiện đồng thời các kỹ thuật nhuộm khác nhau, giúp phân loại bạch cầu cấp một cách nhanh chóng và chính xác. Kit này chứa các dung dịch nhuộm chuẩn hóa, đảm bảo kết quả ổn định và tái lập được cao. Sử dụng HICYTEC cho phép các thể bệnh bạch cầu được xác định một cách chi tiết theo tiêu chuẩn FAB.

III. Phân loại bạch cầu cấp dòng lympho

Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho (ALL) được chia thành ba thể chính theo tiêu chuẩn FAB: L1, L2 và L3. Phân loại này dựa trên hình thái học, kích thước và đặc điểm hóa học của lymphoblast. Thể L1 là loại blast nhỏ, đồng nhất, thường gặp ở trẻ em. Thể L2 là loại blast không đồng nhất, có kích thước trung bình đến lớn, thường gặp ở người lớn. Thể L3 hay loại Burkitt là loại blast lớn, đồng nhất, có hình dạng đặc trưng. Việc sử dụng nhuộm hóa học tế bào giúp phân biệt rõ ràng các thể này, đặc biệt là thông qua nhuộm photphataza axit để xác định loại lympho T.

3.1. Đặc điểm các thể bạch cầu cấp dòng lympho

Thể L1 có lymphoblast nhỏ, hạt nhân tròn, hiếm nucloli. Thể L2 có lymphoblast lớn hơn, hạt nhân không đều, nhiều nucloli. Thể L3 có đặc điểm riêng biệt với lymphoblast lớn, cytoplasm xanh lam, có vacuole. Các bạch cầu cấp này có tiên lượng và đáp ứng điều trị khác nhau.

3.2. Vai trò nhuộm photphataza axit trong xác định lympho T

Nhuộm photphataza axit là một công cụ quan trọng để phân biệt bạch cầu cấp dòng lympho T với các loại khác. Lympho T sẽ cho kết quả dương tính với nhuộm này, giúp xác định nguồn gốc của bệnh bạch cầu cấp và hỗ trợ lựa chọn liệu pháp điều trị phù hợp.

IV. Phân loại bạch cầu cấp dòng tủy và đánh giá kết quả

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy (AML) được chia thành các thể từ M0 đến M7 theo tiêu chuẩn FAB, dựa trên mức độ biệt hóa và dòng tế bào chủ yếu. M0 là biệt hóa tối thiểu, M1 và M2 không có hoặc có tế bào trưởng thành, M3 là promyelocytic, M4 và M5 liên quan đến monocytic. Sử dụng nhuộm hóa học tế bào với bộ kit HICYTEC giúp xác định chính xác từng thể bạch cầu cấp dòng tủy. Các kỹ thuật như nhuộm peroxidaza, nhuộm esteraza, nhuộm photphataza kiềm và nhuộm sắt cung cấp thông tin toàn diện. Mức độ phù hợp giữa kết quả phân loại bằng nhuộm hóa học tế bào và chẩn đoán của các chuyên gia huyết học là rất cao, khẳng định giá trị chẩn đoán của phương pháp này trong thực hành lâm sàng.

4.1. Các thể bạch cầu cấp dòng tủy chính

M1 có myeloblast không có biệt hóa. M2 có myeloblast với maturasi granulocytic. M3 là promyelocytic với tế bào đặc biệt. M4 và M5 là myelomonocytic và monocytic. Mỗi thể bệnh bạch cầu có đặc tính nhuộm riêng biệt, giúp phân biệt chính xác bằng nhuộm hóa học tế bào.

4.2. Đánh giá độ chính xác của phương pháp nhuộm

Phân loại bạch cầu cấp sử dụng bộ kit HICYTEC cho độ chính xác cao, thường đạt trên 85% mức độ phù hợp với chẩn đoán của viện huyết học chuyên sâu. Phương pháp có khả năng phân loại các thể bệnh bạch cầu cấp một cách tin cậy, hỗ trợ hiệu quả công tác chẩn đoán và điều trị bệnh nhân trong thực hành lâm sàng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bệnh bạch cầu cấp là nhóm bệnh máu ác tính của hệ thống tạo máu với đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong máu và tủy xương. Bạch cầu cấp được chia thành 2 nhóm là bạch cầu cấp dòng tủy và bạch cầu cấp dòng lympho. Bạch cầu cấp dòng tủy là kết quả của sự tích lũy tế bào non bất thường trong tủy xương. Bạch cầu cấp dòng lympho là bệnh tăng sinh ác tính trong quá trình tạo máu dòng lympho.

Những tế bào này lấn át sự sinh máu bình thường trong tủy xương, chúng có thể thoát ra ngoài máu ngoại vi và thâm nhiễm vào các cơ quan nội tạng [23]. Bệnh có các hội chứng: Thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng và dẫn tới tử vong nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Vì vậy, việc xác định chính xác thể bệnh cũng như dòng tế bào bị ung thư có vai trò quyết định trong điều trị. Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào và thể bệnh bạch cầu cấp dựa trên một trong hai tiêu chuẩn là FAB và WHO.

Tiêu chuẩn FAB do các nhà Huyết học Pháp-Anh-Mỹ đưa ra năm 1976 là tổng hợp kết quả hình thái học và hóa học tế bào, năm 1986 tiêu chuẩn này đã bổ sung thêm kết quả miễn dịch và di truyền [15, 17]. Nhuộm hóa học tế bào gồm 8 kỹ thuật: Periodic-Acid Schiff (PAS), sudan black (SD), peroxidaza (PER), esteraza đặc hiệu, esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF và không ức chế, photphataza kiềm và axit. Ưu điểm của phương pháp nhuộm hóa học tế bào: Rẻ tiền, giá thành chỉ bằng 1/4 so với phương pháp miễn dịch và bằng 1/10 so với phương pháp di truyền, không cần máy móc hiện đại, dễ triển khai. Hiện nay, các bộ kít nhuộm có bán trên thị trường là các kít đơn, giá thành cao và có những nhược điểm: kỹ thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, quy trình nhuộm khác nhau về thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác nhau, bước tẩy màu của kỹ thuật nhuộm Sudan và Periodic - Acid Schiff khó đồng nhất, nhuộm nền thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan trong dầu soi kính nên khó hội chẩn tiêu bản nhiều lần.

Tại Việt Nam, các thuốc thử hầu hết là tự pha kết hợp với các yếu điểm trên nên độ nhạy, độ đặc hiệu còn thấp. Theo Trần Ngọc Vũ và cộng sự (2014) tỷ lệ phù hợp chẩn đoán giữa hình thái học-hóa học tế bào và miễn dịch là 89,1%, giá trị dự báo đối với bệnh bạch cầu cấp dòng lympho là 88,88% và độ đặc 1 hiệu là 73,77% [25]. Theo tác giả Nguyễn Hữu Toàn thì việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch và di truyền [19. Hiện nay, tác giả Trần Văn Tính, Trung tâm Huyết học- Truyền máu, Bộ Công an đã nghiên cứu và chế tạo thành công kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC gồm 10 kỹ thuật: Giemsa, Periodic-Axit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axit, Perls.

Bộ kít đã cơ bản khắc phục được các yếu điểm ở trên. Nhằm đánh giá giá trị sử dụng của bộ kít, tiến tới có thể thay thế hàng nhập ngoại, đề tài “Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB” là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn, kinh tế - xã hội cấp thiết. Mục tiêu của đề tài là: Đánh giá sự phù hợp của bộ kít nhuộm hóa học tế bào trong phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học và di truyền trên những bệnh nhân bạch cầu cấp đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB (1986). Nội dung nghiên cứu:  Thống kê đặc điểm bệnh bạch cầu cấp trên các bệnh nhân được chọc tủy lần đầu tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương.

 Đánh giá tính phù hợp của phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC 10 kỹ thuật so với phương pháp hình thái học, miễn dịch và di truyền trên các bệnh nhân đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB.  Đánh giá giá trị của kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC, khi nhuộm photphataza kiềm, nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm Perls trên bệnh nhân bạch cầu cấp. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Quá trình sinh máu 1.

Cơ quan sinh máu Cơ quan tạo máu bao gồm: tủy xương, tổ chức lympho (lách, hạch, tuyến ức) và tổ chức võng mô. Thời kì phôi thai, cơ quan tạo máu gồm có gan, lách, hạch. Sau khi sinh, quá trình tạo máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) chỉ xảy ra ở tủy đỏ của các xương. Đến tuổi trưởng thành, quá trình sinh máu chỉ còn diễn ra tại đầu các xương dẹt, đầu xương đùi, xương cánh tay và một vài khu vực sinh máu ngoài tủy biệt hóa các dòng lympho T và B [6].

Quá trình sinh máu Hiện nay nhiều công trình đã chứng minh, các dòng tế bào máu được sinh ra từ tế bào gốc vạn năng. Quá trình biệt hóa qua nhiều giai đoạn và tùy theo sự kích thích đặc hiệu mà tế bào gốc vạn năng biệt hóa để tạo thành những tế bào có chức năng cần thiết [11]. Ba kích thích tố chính tạo máu gồm: Erythropoietin tạo hồng cầu, thrombopoietin tạo tiểu cầu và colony-stimulating factors cùng với interleukin (IL) kích thích tạo bạch cầu. Quá trình sinh máu được điều hòa bởi yếu tố di truyền đặc biệt là các tế bào bị chết theo chương trình [13].

Bệnh bạch cầu cấp 1. Khái niệm chung Bệnh bạch cầu cấp là tình trạng bệnh lý cấp tính của tế bào sinh máu với đặc điểm chính là tăng số lượng bạch cầu bất thường ở cả trong tủy xương và ở ngoài máu ngoại vi, tủy xương có trên 3 % tế bào non (blast) trong tổng số tế bào có nhân, phá hủy quá trình sinh máu bình thường trong tủy và xâm nhiễm vào các cơ quan [12]. Dịch tễ học  Theo công bố của Rebecca Siegel MPH và cộng sự (2015) trong năm 2 14, ở Mỹ ghi nhận 6.250 ca mắc mới bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Tỷ lệ nam (3.150) gần bằng nhau, số tử vong gây ra bởi bệnh này là 1.450 người [52]; 3  Tại Mỹ, hàng năm xuất hiện mới khoảng 2,2 trường hợp bạch cầu cấp dòng tủy trên 100.000 dân và có khoảng 3.

trường hợp bạch cầu cấp dòng lympho mới trên toàn quốc [44];  Tại Việt Nam, tuy chưa có nghiên cứu nào tiến hành đầy đủ về dịch tễ học của bệnh bạch cầu cấp trên toàn quốc nhưng theo tổng kết tại Viện Huyết học-Truyền máu, Bệnh viện Bạch Mai thì thấy bệnh bạch cầu cấp gặp tỷ lệ cao nhất (32.1%) trong số các bệnh máu đến khám và điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai [7]. Các nguyên nhân gây bệnh Cho tới nay nguyên nhân gây bệnh chưa được sáng tỏ. Tuy nhiên qua nhiều nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố liên quan tới phát sinh bệnh:  Tia xạ: Những người tiếp xúc nhiều với tia ion hóa hay tia xạ thường có nguy cơ bị bạch cầu cấp;  Hóa chất: Những người nhiễm mạn tính benzen hay sử dụng hóa chất để chữa bệnh ác tính dễ mắc bệnh bạch cầu cấp;  Virus: Human T-cell lymphotropic virus gây bạch cầu cấp dòng lympho, Epstein-Barr virus (EBV) gây ung thư vòm.  Yếu tố di truyền: Những bệnh nhân bị một số bệnh di truyền như hội chứng Down, hội chứng Bloom, thiếu máu Fanconi có nguy cơ cao bị bạch cầu cấp [12].

Cơ chế bệnh sinh  Sự hoạt động của các gen ung thƣ (oncogene): Các gen bình thường do yếu tố nào đó tác động trở thành các gen bất thường gây ung thư gọi là gen ung thư. Sản phẩm của các gen ung thư là các protein bất thường, có hoạt tính mạnh, gây rối loạn quá trình sinh sản và biệt hóa của tế bào;  Gen ức chế ung thƣ: Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh được trong tế bào bình thường có những gen kiểm soát sự tăng sinh, nếu mất các gen này sẽ dẫn đến mất kiểm soát phân chia tế bào, gây ra u;  Hoạt hóa các oncogen trong bệnh bạch cầu cấp: Một số gen hoạt hóa và kích thích tăng sinh tế bào. Khi các gen này được giải phóng và kết hợp với 4 gen ức chế bị kìm hãm sẽ làm tăng trưởng mạnh sự phát triển khối u và làm các tế bào bình thường trở thành ác tính [2, 21, 37].  Một số biến đổi gen thường gặp trong bạch cầu cấp dòng lympho được thể hiện trên Bảng 1.

Biến đổi di truyền và tiên lượng trong bạch cầu cấp dòng lympho. Tiên lƣợng Loại bất thƣờng Tốt Trên lưỡng bội: >50 NST; Chuyển đoạn t(12;21) Trên lưỡng bội từ 47-50 NST; 46XX/XY (bộ NST bình Trung bình thường); Chuyển đoạn t(1;19) Thiểu bội, mất NST; Chuyển đoạn t(9;22); Chuyển đoạn Xấu t(11q23), t(4;11); Chuyển đoạn t(5;14). Phân loại  Xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy: Trong Bảng xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy theo FAB 1976. Bạch cầu cấp dòng tủy được chia làm các thể từ M1 đến M7:  Thể M1: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào kém biệt hóa;  Thể M2: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào biệt hóa;  Thể M3: lơ xê mi cấp tiền tủy bào tăng hạt đặc hiệu và chia làm 2 nhóm:  M3h: chứa các hạt đặc hiệu lớn;  M3v: chứa các hạt đặc hiệu nhỏ.

 Thể M4: lơ xê mi cấp hỗn hợp chia làm 2 nhóm:  M4: lơ xê mi cấp tủy - mono;  M4eo: lơ xê mi cấp tủy - mono có tăng bạch cầu ái toan.  Thể M5: lơ xê mi cấp dòng mono:  M5a: ≥8 % tế bào mono là monoblast;  M5b:<8 % tế bào mono là monoblast.  Thể M6: Thể bạch cầu cấp dòng tủy với hội chứng loạn sản hồng cầu;  Thể M7: lơ xê mi cấp nguyên mẫu tiểu cầu.  Xếp loại bạch cầu cấp dòng lympho: Theo xếp loại FAB, bạch cầu cấp dòng lympho được chia làm 3 thể từ L1 đến L3 thể hiện trên bảng 1.

Xếp loại bạch cầu cấp cấp dòng lympho theo FAB.