Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu biểu hiện tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein ha5 1 tái tổ hợp biểu hiệu trong escherichia coli

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nghiên cứu biểu hiện tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein ha5 1 tái, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Trần Thị Nhài
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh Học
• Đề tài: Nghiên cứu Biểu Hiện, Tinh Chế Và Đánh Giá Khả Năng Sinh Đáp Ứng Miễn Dịch Của Protein HA5-1 Tái Tổ Hợp Biểu Hiện Trong Escherichia Coli
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM
• 1.1.1. Sơ lƣợc về cấu trúc và khả năng gây bệnh của virus cúm
• 1.1.2. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ
• 1.1.3. Cấu trúc, chức năng của HA và NA
• 1.1.4. Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A
• 1.1.5. Vaccine phòng cúm A/H5N1
• 1.2. BIỂU HIỆN GEN
• 1.2.1. Hệ biểu hiện E.
• 1.2.2. Chủng biểu hiện E.
• 1.2.3. Vector biểu hiện pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin
• 1.3. Các chủng sinh vật và plasmid
• 1.4. Hóa chất và enzym
• 1.5. Máy móc và thiết bị
• 1.6. Môi trƣờng nuôi cấy
• 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Xử lý cắt DNA plasmid bằng enzym cắt giới hạn
• 2.2. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào plasmid
• 2.3. Biến nạp sản phẩm ghép gen vào tế bào E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
• 2.4. Tách chiết plasmid DNA từ tế bào E.
• 2.5. Điện di DNA trên gel agarose
• 2.6. Thu nhận băng DNA từ gel agarose
• 2.7. Điện di protein trên gel polyacrylamide
• 2.8. Biểu hiện protein tái tổ hợp
• 2.9. Tinh chế sơ bộ protein tái tổ hợp bằng dung dịch đệm urê
• 2.10. Kiểm tra tính kháng nguyên của TrxHA5-1
• 2.11. Kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên gà
• 3. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET22TRXHA5-1
• 3.2. Chuyển gen ha5-1 vào vector biểu hiện pET22trx
• 3.3. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-l bằng enzyme cắt giới hạn
• 3.4. BIỂU HIỆN GEN HA5-1 TRONG CHỦNG VI KHUẨN E.
• 3.5. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1 TRONG E.
• 3.5.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự biểu hiện của gen ha5-l
• 3.5.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG đến sự biểu hiện của gen ha5-l
• 3.5.3. Lựa chọn thời điểm thu mẫu thích hợp
• 3.6. TINH CHẾ SƠ BỘ PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1
• 3.7. KIỂM TRA TÍNH SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP HA5-1
• PHỤ LỤC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu protein HA5 1 tái tổ hợp trong E

Nghiên cứu protein HA5-1 tái tổ hợp trong E. coli là một lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử và công nghệ sinh học. Protein HA5-1, một thành phần chính của virus cúm A, có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ. Việc sản xuất protein này trong E. coli không chỉ giúp tiết kiệm chi phí mà còn tăng hiệu suất sản xuất. Nghiên cứu này nhằm mục đích phát triển vaccine hiệu quả cho gia cầm, đặc biệt là trong bối cảnh dịch cúm gia cầm đang gia tăng.

1.1. Đặc điểm của protein HA5 1 và vai trò trong miễn dịch

Protein HA5-1 là một glycoprotein có vai trò quan trọng trong việc kích thích hệ thống miễn dịch. Nó giúp cơ thể nhận diện và tiêu diệt virus cúm A. Nghiên cứu cho thấy rằng protein này có khả năng tạo ra kháng thể đặc hiệu, từ đó bảo vệ gia cầm khỏi sự xâm nhập của virus.

1.2. Lợi ích của việc sử dụng E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp

E. coli là một hệ thống biểu hiện phổ biến nhờ vào tốc độ sinh trưởng nhanh và khả năng sản xuất protein tái tổ hợp hiệu quả. Việc sử dụng E. coli giúp giảm thiểu thời gian và chi phí trong quá trình sản xuất protein HA5-1, đồng thời đảm bảo chất lượng và tính khả dụng của sản phẩm.

II. Thách thức trong nghiên cứu protein HA5 1 tái tổ hợp

Mặc dù có nhiều lợi ích, việc nghiên cứu và sản xuất protein HA5-1 tái tổ hợp trong E. coli cũng gặp phải một số thách thức. Các vấn đề như sự biểu hiện không ổn định, khả năng tái cấu trúc protein và khả năng sinh đáp ứng miễn dịch là những yếu tố cần được xem xét kỹ lưỡng.

2.1. Vấn đề biểu hiện không ổn định của protein

Một trong những thách thức lớn nhất là việc protein HA5-1 có thể không được biểu hiện ổn định trong E. coli. Điều này có thể dẫn đến sự giảm hiệu suất sản xuất và chất lượng protein. Cần có các phương pháp tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để cải thiện tình trạng này.

2.2. Khả năng tái cấu trúc protein và ảnh hưởng đến miễn dịch

Protein tái tổ hợp có thể không đạt được cấu trúc ba chiều đúng như protein tự nhiên, điều này ảnh hưởng đến khả năng sinh đáp ứng miễn dịch. Việc nghiên cứu các phương pháp tinh chế và điều chỉnh cấu trúc protein là cần thiết để đảm bảo tính hiệu quả của vaccine.

III. Phương pháp nghiên cứu protein HA5 1 tái tổ hợp trong E

Để nghiên cứu protein HA5-1, các phương pháp như cắt DNA plasmid, ghép nối gen và biến nạp vào E. coli được áp dụng. Những phương pháp này giúp tạo ra các chủng E. coli có khả năng biểu hiện protein HA5-1 một cách hiệu quả.

3.1. Cắt DNA plasmid và ghép nối gen

Quá trình cắt DNA plasmid bằng enzym cắt giới hạn cho phép tạo ra các đoạn gen cần thiết để ghép nối với gen HA5-1. Sau đó, các đoạn gen này được ghép nối vào plasmid để tạo ra vector biểu hiện.

3.2. Biến nạp sản phẩm ghép gen vào E. coli

Phương pháp sốc nhiệt được sử dụng để biến nạp plasmid chứa gen HA5-1 vào tế bào E. coli. Quá trình này giúp tế bào E. coli tiếp nhận và biểu hiện protein tái tổ hợp một cách hiệu quả.

IV. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5 1

Kết quả nghiên cứu cho thấy protein HA5-1 tái tổ hợp có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ ở gia cầm. Các thí nghiệm cho thấy sự gia tăng nồng độ kháng thể đặc hiệu sau khi tiêm vaccine chứa protein này.

4.1. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên gà

Các thí nghiệm trên gà cho thấy protein HA5-1 tái tổ hợp có khả năng kích thích sản xuất kháng thể cao, từ đó bảo vệ gia cầm khỏi virus cúm A. Kết quả này mở ra triển vọng cho việc phát triển vaccine hiệu quả.

4.2. So sánh hiệu quả giữa vaccine tái tổ hợp và vaccine truyền thống

Nghiên cứu so sánh cho thấy vaccine chứa protein HA5-1 tái tổ hợp có hiệu quả cao hơn so với vaccine truyền thống. Điều này chứng tỏ rằng việc sử dụng protein tái tổ hợp là một hướng đi tiềm năng trong việc phát triển vaccine phòng cúm A.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu protein HA5 1

Nghiên cứu protein HA5-1 tái tổ hợp trong E. coli không chỉ mở ra hướng đi mới trong việc phát triển vaccine phòng cúm A mà còn góp phần nâng cao hiểu biết về cơ chế miễn dịch. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học và nông nghiệp.

5.1. Tương lai của vaccine phòng cúm A

Vaccine phòng cúm A dựa trên protein HA5-1 tái tổ hợp có tiềm năng lớn trong việc ngăn chặn dịch bệnh. Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và đánh giá hiệu quả lâu dài của vaccine.

5.2. Ứng dụng công nghệ sinh học trong phát triển vaccine

Công nghệ sinh học sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các loại vaccine mới. Việc áp dụng các kỹ thuật hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả và độ an toàn của vaccine, từ đó bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch cúm gia cầm độc lực cao do virus cúm A/H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra là một trong những mối đe dọa sinh học nghiêm trọng nhất đối với ngành chăn nuôi và sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Theo số liệu thống kê từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tính đến tháng 01/2012, toàn cầu đã ghi nhận 583 trường hợp người nhiễm chủng virus này với 344 ca tử vong (tỷ lệ tử vong lên tới 59%), đồng thời dẫn tới sự tiêu hủy của hơn 120 triệu gia cầm tại hơn 50 quốc gia. Virus cúm A sở hữu 16 phân type kháng nguyên Hemagglutinin (HA từ H1 đến H16) và 9 phân type Neuraminidase (NA từ N1 đến N9), liên tục biến đổi thông qua cơ chế lệch kháng nguyên và trôi dạt di truyền.

Tại Việt Nam, các loại vaccine vô hoạt truyền thống nuôi cấy trên phôi gà bộc lộ nhiều hạn chế lớn về thời gian sản xuất kéo dài, chi phí cao và nguy cơ an toàn sinh học khi phải thao tác trực tiếp với virus sống cường độc. Đặc biệt, hiệu lực bảo hộ của các dòng vaccine cũ suy giảm rõ rệt trước các phân nhánh virus mới như Clade 2.2 (nhánh 2.2-B chỉ đạt hiệu quả bảo hộ khoảng 50%). Trước thách thức đó, việc phát triển vaccine dưới đơn vị (subunit vaccine) sử dụng protein tái tổ hợp trở thành hướng đi chiến lược.

Đề tài được thực hiện tại Phòng Kỹ thuật Di truyền thuộc Viện Công nghệ Sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) nhằm mục tiêu thiết kế thành công hệ vector biểu hiện, tối ưu hóa quy trình lên men, tinh chế protein tái tổ hợp HA5-1 trong vi khuẩn Escherichia coli và đánh giá khả năng kích thích sinh kháng thể đặc hiệu trên mô hình gia cầm thực nghiệm. Nghiên cứu mở ra triển vọng chủ động sản xuất vaccine tái tổ hợp quy mô lớn với hiệu suất sinh khối cao, dao động từ 50 mg/l đến 500 mg/l, giúp hạ giá thành sản phẩm và gia tăng tính an toàn trong phòng chống dịch bệnh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng sinh học phân tử và miễn dịch học virus học hiện đại, tập trung vào ba khung lý thuyết trọng tâm:

Thứ nhất là lý thuyết về cấu trúc kháng nguyên và cơ chế xâm nhiễm của virus cúm A. Hạt virus có đường kính 80-120 nm với khoảng 500 gai glycoprotein bề mặt, trong đó tỷ lệ giữa NA và HA là 1:4. Phân tử HA tồn tại dưới dạng trimer với mỗi monomer cấu tạo từ hai tiểu phần HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa) liên kết qua cầu nối disulfide. Tiểu phần HA1 chứa vị trí gắn thụ thể đặc hiệu (chủ yếu là acid sialic liên kết Gal α-2,3) tại acid amin 226, đóng vai trò quyết định tính sinh miễn dịch và kích thích cơ thể sản sinh kháng thể trung hòa chủ yếu.

Thứ hai là lý thuyết biểu hiện protein dung hợp trong vi khuẩn Escherichia coli. Đoạn gen mã hóa peptide Thioredoxin (TrxA gồm 109 acid amin, khối lượng phân tử 11,675 kDa) được dung hợp ở đầu N của kháng nguyên mục tiêu. Thioredoxin đóng vai trò như một phân tử mang (chaperone-like) giúp tăng độ bền cấu trúc, hạn chế sự phân cắt của protease nội bào và hoạt hóa đáp ứng miễn dịch tự nhiên khi đưa vào cơ thể vật chủ.

Thứ ba là mô hình điều hòa biểu hiện gen qua hệ thống T7 Promoter và Lac Operator trên vector plasmid pET22b(+). Mô hình này sử dụng chất cảm ứng Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) để giải phóng sự kìm hãm của protein LacI, kích hoạt T7 RNA polymerase phiên mã mạnh mẽ gen đích.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu kết hợp chặt chẽ giữa các kỹ thuật di truyền tái tổ hợp, hóa sinh protein và đánh giá miễn dịch in vivo:

Về quy trình tạo dòng và biểu hiện: Gen ha5-1 (kích thước khoảng 1000 bp) được cắt tách từ plasmid pCRha5-1 và gắn nối định hướng vào vector pET22trx bằng cặp enzyme cắt giới hạn NcoI và BamHI dưới xúc tác của T4 DNA ligase ở 16°C trong 3 giờ. Sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42°C trong 90 giây để nhân dòng và giải trình tự DNA khẳng định độ chính xác. Plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-1 sau đó được chuyển vào chủng biểu hiện Escherichia coli BL21 (chủng khuyết hai protease nội bào quan trọng là lon và ompT).

Về quy trình tinh chế và phân tích: Tế bào sau lên men được phá vỡ cấu trúc màng bằng phương pháp siêu âm cường độ cao. Protein tái tổ hợp TrxHA5-1 tồn tại chủ yếu ở dạng thể vùi (không tan) được tách rửa tạp chất bằng hệ đệm B1 (Tris 20 mM, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM, pH 8,0) và hòa tan chọn lọc trong đệm B2 bổ sung Urea 2 M cùng DTT 10 mM. Khối lượng và độ tinh sạch của protein được phân tích qua điện di biến tính SDS-PAGE 12%, tính đặc hiệu kháng nguyên được thẩm định bằng kỹ thuật Western Blot với kháng thể thỏ kháng HA5 pha loãng 5000 lần và kháng thể thứ cấp kháng IgG thỏ gắn enzyme peroxidase pha loãng 10000 lần.

Về mô hình thử nghiệm miễn dịch: Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm 20 cá thể gà giống Lương Phượng khỏe mạnh, nuôi cách ly đạt 14 ngày tuổi, được phân ngẫu nhiên thành 4 lô thí nghiệm (5 cá thể mỗi lô) theo phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên phân tầng nhằm đảm bảo tính đồng nhất sinh học:

• Lô 1: Đối chứng âm, tiêm dung dịch đệm PBS.
• Lô 2: Đối chứng âm sinh học, tiêm dịch lên men từ chủng vi khuẩn mang vector rỗng.
• Lô 3: Tiêm dưới da cổ 100 µg protein TrxHA5-1 phối hợp tá chất Freund toàn phần ở liều 1 (ngày 0) và tá chất Freund bán toàn phần ở liều nhắc lại (ngày 14).
• Lô 4: Nhỏ trực tiếp qua niêm mạc mắt và mũi 100 µg protein TrxHA5-1 phối hợp 15 µg tá chất tả Ctb (Cholera Toxin B) ở cả 2 lần gây miễn dịch.

Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch được theo dõi định kỳ liên tục trong 5 tuần thông qua phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) sử dụng hồng cầu gà 0,5% trên đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U. Phương pháp phân tích thống kê sinh học áp dụng công thức tính giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể Geometric Mean Titer (GMT) chuyển đổi về thang đo log2 trên phần mềm chuyên dụng, cho phép đánh giá định lượng chính xác hiệu lực bảo hộ miễn dịch dịch thể.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình triển khai thực nghiệm đã đem lại các kết quả cốt lõi sau:

Thứ nhất, thiết kế thành công cấu trúc vector biểu hiện pET22trxha5-1 với kích thước 6,9 kb. Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra bằng enzyme hạn chế NcoI và BamHI trên gel agarose 0,8% cho thấy sự xuất hiện rõ nét của hai băng DNA tương ứng với kích thước vector 5,9 kb và đoạn gen ha5-1 xấp xỉ 1,0 kb. Kết quả giải trình tự khẳng định đoạn gen chèn có độ tương đồng 100% với trình tự mã hóa tiểu phần HA1 của virus cúm A/H5N1 công bố trên ngân hàng gen quốc tế (mã số truy cập AJ867074).

Thứ hai, xác định chính xác điều kiện tối ưu để biểu hiện protein TrxHA5-1 trong vi khuẩn Escherichia coli BL21. Quá trình sinh tổng hợp đạt đỉnh cao nhất tại nhiệt độ nuôi cấy 30°C, nồng độ chất cảm ứng IPTG đạt 0,5 mM và thời gian thu hoạch sinh khối tối ưu là 4 giờ sau cảm ứng (tương ứng thời điểm vi khuẩn đạt pha cân bằng sinh trưởng). Ở các điều kiện này, protein tái tổ hợp chiếm tỷ lệ vượt trội trong tổng lượng protein tế bào.

Thứ ba, phân đoạn tinh chế sơ bộ bằng đệm chứa Urea 2 M đã thu hồi thành công protein tái tổ hợp TrxHA5-1 có khối lượng phân tử khoảng 57,5 kDa ở dạng thể vùi với độ tinh sạch cao. Kết quả phân tích Western Blot khẳng định protein tái tổ hợp bắt cặp đặc hiệu hoàn toàn với kháng thể kháng HA5 tự nhiên từ thỏ, đồng thời phát hiện các phân đoạn nhỏ 40-45 kDa là sản phẩm đứt gãy tự nhiên nhưng vẫn bảo tồn nguyên vẹn các epitope kháng nguyên chức năng.

Thứ tư, thử nghiệm in vivo trên gà Lương Phượng chứng minh protein TrxHA5-1 kích thích cơ thể sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Hiệu giá kháng thể HI ở cả hai lô tiêm và nhỏ niêm mạc tăng trưởng liên tục từ tuần thứ 1 đến tuần thứ 4. Tại thời điểm đạt đỉnh (tuần 3 và tuần 4), hiệu giá HI trung bình ở lô tiêm đạt mức tối đa 2,7 log2, trong khi lô nhỏ mắt và mũi đạt mức cực đại 2,2 log2.

Thảo luận kết quả

Khác với các hệ thống biểu hiện protein thông thường luôn hướng tới dạng tan, việc protein TrxHA5-1 biểu hiện ưu thế ở dạng không tan (thể vùi) mang lại lợi thế kép trong nghiên cứu vaccine tái tổ hợp. Dạng thể vùi giúp bảo vệ cấu trúc kháng nguyên không bị phân giải bởi các enzyme protease của vi khuẩn, đơn giản hóa quá trình tinh chế thông qua thao tác ly tâm tách cặn và nồng độ Urea 2 M vừa đủ để hòa tan kháng nguyên mà không làm biến tính hoàn toàn các vùng quyết định kháng nguyên bề mặt.

Khi biểu diễn động thái đáp ứng miễn dịch dưới dạng đồ thị đường theo dõi biến thiên hiệu giá HI qua 5 tuần, sự khác biệt rõ rệt giữa hai phương thức đưa kháng nguyên đã được làm sáng tỏ. Ở lô tiêm dưới da (phối hợp tá chất Freund), hiệu giá kháng thể tăng rất nhanh và đạt đỉnh 2,7 log2 vào tuần thứ 3, nhưng đến tuần thứ 5 lại sụt giảm đột ngột về mức 1,5 log2. Ngược lại, ở lô nhỏ qua đường niêm mạc mắt và mũi (phối hợp tá chất Ctb), mặc dù hiệu giá kháng thể đỉnh chỉ đạt 2,2 log2 nhưng động thái duy trì miễn dịch ở tuần thứ 5 ổn định hơn hẳn, chỉ giảm nhẹ về mức 1,9 log2. Hiện tượng này chứng minh rằng kháng nguyên dung hợp TrxA khi đi qua niêm mạc kết hợp với tá chất Ctb đã kích thích hiệu quả hệ thống miễn dịch niêm mạc (MALT), duy trì thời gian bán hủy của kháng thể lâu hơn trong tuần hoàn.

Mặc dù hiệu giá HI đạt được (2,2 - 2,7 log2) còn thấp hơn ngưỡng bảo hộ tuyệt đối của vaccine thương phẩm truyền thống (thường yêu cầu từ 4,0 log2 trở lên), kết quả này đã chứng minh tính đúng đắn về mặt nguyên lý sinh học của phân tử kháng nguyên tái tổ hợp sản xuất từ vi khuẩn Escherichia coli, tạo tiền đề vững chắc cho việc nâng cấp nồng độ và cải tiến công thức tá chất trong giai đoạn tiếp theo.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết luận thực nghiệm, bốn nhóm giải pháp kỹ thuật và ứng dụng cần được triển khai đồng bộ:

Thứ nhất, tối ưu hóa liều lượng kháng nguyên tiêm chủng. Cần tiến hành thử nghiệm mở rộng dải liều protein TrxHA5-1 từ mức 100 µg hiện tại lên các mức 200 µg, 300 µg và 500 µg cho mỗi cá thể gà. Mục tiêu hướng tới là nâng hiệu giá kháng thể HI trung bình vượt ngưỡng bảo hộ tiêu chuẩn 4,0 log2 trong khung thời gian 6 tháng tới, do nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ Sinh học chủ trì thực hiện.

Thứ hai, cải tiến hệ thống tá chất bổ trợ và dạng bào chế. Thay thế tá chất Freund truyền thống bằng các hệ tá chất nhũ dầu thế hệ mới như Montanide ISA 70 hoặc các hạt nano chitosan, liposome nhằm kéo dài thời gian giải phóng kháng nguyên chậm. Thời gian triển khai dự kiến trong vòng 9 tháng, phối hợp giữa đơn vị nghiên cứu sinh học và các phòng thí nghiệm công nghệ dược phẩm.

Thứ ba, thực hiện thử thách công cường độc (challenge test) trên động vật. Cơ quan thú y chuyên ngành cần phối hợp tổ chức thử nghiệm đánh giá tỷ lệ sống sót của đàn gà đã được gây miễn dịch sau khi gây nhiễm trực tiếp với chủng virus cúm A/H5N1 thực địa có độc lực cao. Chỉ số mục tiêu cần đạt là tỷ lệ bảo hộ sinh mạng tối thiểu 80% trong vòng 14 ngày sau công độc, hoàn thành trong vòng 12 tháng.

Thứ tư, nâng cấp quy trình công nghệ lên men sinh học quy mô pilot. Chuyển giao quy trình nuôi cấy từ bình tam giác 300 ml sang hệ thống nồi lên men bioreactor tự động kiểm soát dung tích từ 5 lít đến 50 lít. Đơn vị sản xuất sinh phẩm thú y cần kiểm soát chặt chẽ các thông số pH, oxy hòa tan (DO) và nạp cơ chất theo mẻ để nâng cao mật độ tế bào vi khuẩn, bảo đảm sản lượng protein tinh sạch đạt trên 200 mg/l dịch nuôi cấy trong giai đoạn 2024-2026.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang lại giá trị ứng dụng và hàm lượng học thuật cao cho bốn nhóm đối tượng chính:

Nhóm thứ nhất là các nhà khoa học, nghiên cứu viên trong lĩnh vực Công nghệ Sinh học và Miễn dịch học. Luận văn cung cấp toàn bộ quy trình chi tiết từ thiết kế mồi, tách dòng gen, tạo vector biểu hiện dung hợp pET22trx đến các thông số tối ưu hóa lên men thể vùi và tinh chế kháng nguyên virus cúm.

Nhóm thứ hai là các chuyên gia dịch tễ thú y và cán bộ quản lý dịch bệnh tại các Chi cục Chăn nuôi và Thú y. Tài liệu cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm về kỹ thuật chuẩn độ HI, phương pháp gây miễn dịch qua đường niêm mạc và động thái đáp ứng kháng thể trên gia cầm, phục vụ công tác giám sát dịch tễ cúm gia cầm.

Nhóm thứ ba là các doanh nghiệp, nhà máy sản xuất vaccine và sinh phẩm y tế - thú y. Đây là tài liệu tham khảo giá trị để đánh giá tính khả thi kinh tế - kỹ thuật của công nghệ sản xuất vaccine dưới đơn vị tái tổ hợp, giúp định hướng đầu tư dây chuyền sản xuất quy mô công nghiệp không phụ thuộc vào nguồn trứng gà sạch SPF.

Nhóm thứ tư là học viên cao học, sinh viên chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, Công nghệ Sinh học, Thú y và Y dược học. Luận văn là hình mẫu chuẩn mực về phương pháp luận nghiên cứu thực nghiệm, thiết kế thí nghiệm đối chứng và kỹ năng xử lý dữ liệu sinh học phân tử phục vụ làm khóa luận, luận văn tốt nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nghiên cứu lại lựa chọn vi khuẩn Escherichia coli làm hệ thống biểu hiện thay vì tế bào nấm men hoặc tế bào động vật? Hệ biểu hiện Escherichia coli sở hữu nhiều ưu điểm vượt trội như tốc độ nhân đôi nhanh, môi trường nuôi cấy đơn giản, chi phí nguyên liệu rẻ và khả năng tổng hợp protein ngoại lai đạt hiệu suất cao từ 50 mg/l đến 500 mg/l sinh khối. Mặc dù vi khuẩn không thực hiện được quá trình glycosyl hóa, việc dung hợp phân tử Thioredoxin đã hỗ trợ kháng nguyên HA5-1 cuộn gập cấu trúc chính xác, duy trì tốt các epitope nhận diện miễn dịch cần thiết.

Vai trò cụ thể của đoạn peptide Thioredoxin dung hợp trong cấu trúc pET22trx là gì? Thioredoxin (TrxA) là một peptide nhỏ gồm 109 acid amin với khối lượng 11,675 kDa. Phân tử này đóng vai trò như một chaperone nội bào giúp tăng độ tan và độ ổn định của protein ngoại lai, hạn chế sự phân hủy bởi các enzyme protease của vật chủ, đồng thời hoạt động như một tá chất tự nhiên kích thích hệ miễn dịch của gia cầm nhận diện kháng nguyên mạnh mẽ hơn.

Tại sao nồng độ Urea 2 M lại được chọn để tinh sạch protein thay vì nồng độ Urea 4 M hay 8 M? Thực nghiệm cho thấy ở nồng độ Urea 4 M hoặc cao hơn, toàn bộ các protein tạp không tan khác của vi khuẩn đều bị hòa tan đồng loạt làm giảm độ tinh sạch. Ngược lại, nồng độ Urea 2 M kết hợp DTT 10 mM chỉ hòa tan chọn lọc protein tái tổ hợp TrxHA5-1 từ thể vùi, đồng thời loại bỏ được phần lớn cặn tạp chất, giúp sản phẩm đạt độ tinh sạch cao nhất trên gel điện di.

Hiệu giá kháng thể HI đạt 2,7 log2 có ý nghĩa như thế nào trong đánh giá hiệu lực vaccine? Hiệu giá 2,7 log2 chứng minh protein tái tổ hợp TrxHA5-1 đã kích thích thành công hệ miễn dịch của gà sinh ra kháng thể đặc hiệu có khả năng ngăn cản virus ngưng kết hồng cầu. Mặc dù chưa đạt ngưỡng bảo hộ hoàn toàn (thường là 4,0 log2), kết quả này xác nhận tính sinh miễn dịch thực tế của protein với liều 100 µg và mở ra cơ sở để nâng cao hiệu lực qua việc tăng liều hoặc cải tiến tá chất.

Ưu điểm nổi bật của đường gây miễn dịch nhỏ mắt và mũi so với đường tiêm dưới da trong nghiên cứu là gì? Mặc dù đường tiêm tạo hiệu giá kháng thể đỉnh cao hơn (2,7 log2 so với 2,2 log2), phương pháp nhỏ niêm mạc mắt và mũi phối hợp tá chất Ctb giúp duy trì hiệu giá kháng thể ổn định hơn ở tuần thứ 5 (đạt 1,9 log2). Phương pháp này kích hoạt miễn dịch niêm mạc tại chỗ, thuận tiện thao tác trên quy mô đàn lớn và giảm thiểu tối đa stress cho gia cầm nuôi.

Kết luận

• Thiết kế và tạo dòng thành công plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-1 kích thước 6,9 kb mang gen ngoại lai ha5-1 kích thước 1,0 kb, có độ tương đồng trình tự 100% với mã số ngân hàng gen AJ867074.
• Xác lập chuẩn xác quy trình biểu hiện protein tái tổ hợp TrxHA5-1 (khối lượng 57,5 kDa) trong Escherichia coli BL21 ở các điều kiện tối ưu: nhiệt độ 30°C, chất cảm ứng IPTG 0,5 mM và thời gian thu sinh khối 4 giờ sau cảm ứng.
• Tinh chế sơ bộ hiệu quả protein tái tổ hợp dạng thể vùi bằng đệm Urea 2 M và DTT 10 mM; xác nhận tính đặc hiệu kháng nguyên qua phản ứng Western Blot với kháng thể kháng HA5 tự nhiên.
• Đánh giá thành công khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên gà Lương Phượng với hiệu giá kháng thể HI cực đại đạt 2,7 log2 qua đường tiêm và 2,2 log2 qua đường nhỏ niêm mạc mắt, mũi.
• Định hướng trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tới cần tập trung nâng liều kháng nguyên lên 200-300 µg, phối hợp tá chất nhũ dầu thế hệ mới và thực hiện thử nghiệm công cường độc để hoàn thiện quy trình sản xuất vaccine tái tổ hợp dưới đơn vị phòng chống dịch cúm A/H5N1 tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào biểu mô và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm (Hình 1.2: Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất) và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme NA. Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới trung bình là khoảng 6 giờ. Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử và rơi vào quá trình chết theo chương trình làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ [35, 38]. Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription).

Phức hợp protein – RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào [4]. Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase. Các sợi này không được Adenine hóa 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào. Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus (Hình 1.

Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi” tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [25, 26].3 Cấu trúc, chức năng của HA và NA Hai protein HA và NA là các protein chính trên bề mặt capsid, đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A [21, 25].

Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA, được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay [6, 17, 21, 24]. Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai dưới đơn vị HA1 (36 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa và gắn vào mặt ngoài capsid là dưới đơn vị HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA1 chứa đựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích [6, 36]. Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm.

Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa sialic acid của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau [36, 38]. Vị trí amino acid 226 (aa226) của dưới đơn vị HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó. Ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A). Protein NA (neuraminidase) Protein neuraminidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.18), là một enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type NA [3, 36].

Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. Mặt khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình cởi áo giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn [36]. Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] khỏi các chất ức chế không đặc hiệu. Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ.

Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế virus không đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzyme này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ thể [8]. Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA [12]. Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A và là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [31, 42].4 Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A Do kháng nguyên HA và NA của virus thường xuyên biến đổi mà bệnh cúm rất khó kiểm soát. Có hai phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A [42].

Hiện tượng lệch kháng nguyên Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các phân đoạn gen/hệ gen của virus do virus cúm A không có cơ chế “đọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích. Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn đến các enzyme sao chép phụ thuộc RNA sẽ có thể “gài” thêm [1], làm mất đi hoặc thay thế một hay nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của virus [25]. Tuỳ thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa mà có thể trực tiếp làm thay đổi các amino acid trong trình tự của protein được mã hóa biểu hiện, dẫn đến thay đổi thuộc tính của protein. Các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một phân type virus mới có những đặc tính kháng nguyên mới có thể bị sai lệch.

11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Hiện tượng trộn kháng nguyên Hiện tượng trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) giữa các gen kháng nguyên của virus cúm với gen khác ở một số rất ít virus RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng rất cao. Hệ gen gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt của virus cúm A được 2 chủng virus cúm A khác nhau khi đồng nhiễm trong một tế bào trao đổi cho nhau. Trong quá trình kết hợp lại RNA hệ gen có thể xảy ra sự hoà trộn hoặc trao đổi các phân đoạn gen của hai chủng virus đó tạo ra các trạng thái khác nhau của RNA hệ gen của các hạt virus mới từ hai RNA hệ gen của những virus ban đầu. Kết quả là đã tạo ra thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh [9, 16, 23].5 Vaccine phòng cúm A/H5N1 Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch [32].

Đối với dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người [17, 29]. Kháng thể đặc hiệu được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine và chủ yếu là các kháng thể kháng HA, NA, MA góp phần vô hiệu hóa virus cúm khi chúng xâm nhập vào cơ thể. Kháng thể kháng HA có vai trò tiên quyết trong việc tạo miễn dịch bảo hộ cho vật chủ bị nhiễm. Hiện nay có 3 loại vaccine được bán và sử dụng rộng rãi tại Việt Nam là: - Vaccine vô hoạt nhũ dầu H5N2 (Trung Quốc): được tạo ra bằng cách vô hoạt virus A/Turkey/England/N-28/73 (H5N2).

Đây là loại vaccine dị chủng (là vaccine sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng) .