Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu biểu hiện tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein ha5 1 tái tổ hợp biểu hiệu trong escherichia coli

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nghiên cứu biểu hiện tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein ha5 1 tái, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Trần Thị Nhài
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh Học
• Đề tài: Nghiên cứu Biểu Hiện, Tinh Chế Và Đánh Giá Khả Năng Sinh Đáp Ứng Miễn Dịch Của Protein HA5-1 Tái Tổ Hợp Biểu Hiện Trong Escherichia Coli
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM
• 1.1.1. Sơ lƣợc về cấu trúc và khả năng gây bệnh của virus cúm
• 1.1.2. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ
• 1.1.3. Cấu trúc, chức năng của HA và NA
• 1.1.4. Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A
• 1.1.5. Vaccine phòng cúm A/H5N1
• 1.2. BIỂU HIỆN GEN
• 1.2.1. Hệ biểu hiện E.
• 1.2.2. Chủng biểu hiện E.
• 1.2.3. Vector biểu hiện pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin
• 1.3. Các chủng sinh vật và plasmid
• 1.4. Hóa chất và enzym
• 1.5. Máy móc và thiết bị
• 1.6. Môi trƣờng nuôi cấy
• 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Xử lý cắt DNA plasmid bằng enzym cắt giới hạn
• 2.2. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào plasmid
• 2.3. Biến nạp sản phẩm ghép gen vào tế bào E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
• 2.4. Tách chiết plasmid DNA từ tế bào E.
• 2.5. Điện di DNA trên gel agarose
• 2.6. Thu nhận băng DNA từ gel agarose
• 2.7. Điện di protein trên gel polyacrylamide
• 2.8. Biểu hiện protein tái tổ hợp
• 2.9. Tinh chế sơ bộ protein tái tổ hợp bằng dung dịch đệm urê
• 2.10. Kiểm tra tính kháng nguyên của TrxHA5-1
• 2.11. Kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên gà
• 3. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET22TRXHA5-1
• 3.2. Chuyển gen ha5-1 vào vector biểu hiện pET22trx
• 3.3. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-l bằng enzyme cắt giới hạn
• 3.4. BIỂU HIỆN GEN HA5-1 TRONG CHỦNG VI KHUẨN E.
• 3.5. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1 TRONG E.
• 3.5.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự biểu hiện của gen ha5-l
• 3.5.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG đến sự biểu hiện của gen ha5-l
• 3.5.3. Lựa chọn thời điểm thu mẫu thích hợp
• 3.6. TINH CHẾ SƠ BỘ PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1
• 3.7. KIỂM TRA TÍNH SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP HA5-1
• PHỤ LỤC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu protein HA5 1 tái tổ hợp trong E

Nghiên cứu protein HA5-1 tái tổ hợp trong E. coli là một lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử và công nghệ sinh học. Protein HA5-1, một thành phần chính của virus cúm A, có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ. Việc sản xuất protein này trong E. coli không chỉ giúp tiết kiệm chi phí mà còn tăng hiệu suất sản xuất. Nghiên cứu này nhằm mục đích phát triển vaccine hiệu quả cho gia cầm, đặc biệt là trong bối cảnh dịch cúm gia cầm đang gia tăng.

1.1. Đặc điểm của protein HA5 1 và vai trò trong miễn dịch

Protein HA5-1 là một glycoprotein có vai trò quan trọng trong việc kích thích hệ thống miễn dịch. Nó giúp cơ thể nhận diện và tiêu diệt virus cúm A. Nghiên cứu cho thấy rằng protein này có khả năng tạo ra kháng thể đặc hiệu, từ đó bảo vệ gia cầm khỏi sự xâm nhập của virus.

1.2. Lợi ích của việc sử dụng E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp

E. coli là một hệ thống biểu hiện phổ biến nhờ vào tốc độ sinh trưởng nhanh và khả năng sản xuất protein tái tổ hợp hiệu quả. Việc sử dụng E. coli giúp giảm thiểu thời gian và chi phí trong quá trình sản xuất protein HA5-1, đồng thời đảm bảo chất lượng và tính khả dụng của sản phẩm.

II. Thách thức trong nghiên cứu protein HA5 1 tái tổ hợp

Mặc dù có nhiều lợi ích, việc nghiên cứu và sản xuất protein HA5-1 tái tổ hợp trong E. coli cũng gặp phải một số thách thức. Các vấn đề như sự biểu hiện không ổn định, khả năng tái cấu trúc protein và khả năng sinh đáp ứng miễn dịch là những yếu tố cần được xem xét kỹ lưỡng.

2.1. Vấn đề biểu hiện không ổn định của protein

Một trong những thách thức lớn nhất là việc protein HA5-1 có thể không được biểu hiện ổn định trong E. coli. Điều này có thể dẫn đến sự giảm hiệu suất sản xuất và chất lượng protein. Cần có các phương pháp tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để cải thiện tình trạng này.

2.2. Khả năng tái cấu trúc protein và ảnh hưởng đến miễn dịch

Protein tái tổ hợp có thể không đạt được cấu trúc ba chiều đúng như protein tự nhiên, điều này ảnh hưởng đến khả năng sinh đáp ứng miễn dịch. Việc nghiên cứu các phương pháp tinh chế và điều chỉnh cấu trúc protein là cần thiết để đảm bảo tính hiệu quả của vaccine.

III. Phương pháp nghiên cứu protein HA5 1 tái tổ hợp trong E

Để nghiên cứu protein HA5-1, các phương pháp như cắt DNA plasmid, ghép nối gen và biến nạp vào E. coli được áp dụng. Những phương pháp này giúp tạo ra các chủng E. coli có khả năng biểu hiện protein HA5-1 một cách hiệu quả.

3.1. Cắt DNA plasmid và ghép nối gen

Quá trình cắt DNA plasmid bằng enzym cắt giới hạn cho phép tạo ra các đoạn gen cần thiết để ghép nối với gen HA5-1. Sau đó, các đoạn gen này được ghép nối vào plasmid để tạo ra vector biểu hiện.

3.2. Biến nạp sản phẩm ghép gen vào E. coli

Phương pháp sốc nhiệt được sử dụng để biến nạp plasmid chứa gen HA5-1 vào tế bào E. coli. Quá trình này giúp tế bào E. coli tiếp nhận và biểu hiện protein tái tổ hợp một cách hiệu quả.

IV. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5 1

Kết quả nghiên cứu cho thấy protein HA5-1 tái tổ hợp có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ ở gia cầm. Các thí nghiệm cho thấy sự gia tăng nồng độ kháng thể đặc hiệu sau khi tiêm vaccine chứa protein này.

4.1. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên gà

Các thí nghiệm trên gà cho thấy protein HA5-1 tái tổ hợp có khả năng kích thích sản xuất kháng thể cao, từ đó bảo vệ gia cầm khỏi virus cúm A. Kết quả này mở ra triển vọng cho việc phát triển vaccine hiệu quả.

4.2. So sánh hiệu quả giữa vaccine tái tổ hợp và vaccine truyền thống

Nghiên cứu so sánh cho thấy vaccine chứa protein HA5-1 tái tổ hợp có hiệu quả cao hơn so với vaccine truyền thống. Điều này chứng tỏ rằng việc sử dụng protein tái tổ hợp là một hướng đi tiềm năng trong việc phát triển vaccine phòng cúm A.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu protein HA5 1

Nghiên cứu protein HA5-1 tái tổ hợp trong E. coli không chỉ mở ra hướng đi mới trong việc phát triển vaccine phòng cúm A mà còn góp phần nâng cao hiểu biết về cơ chế miễn dịch. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học và nông nghiệp.

5.1. Tương lai của vaccine phòng cúm A

Vaccine phòng cúm A dựa trên protein HA5-1 tái tổ hợp có tiềm năng lớn trong việc ngăn chặn dịch bệnh. Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và đánh giá hiệu quả lâu dài của vaccine.

5.2. Ứng dụng công nghệ sinh học trong phát triển vaccine

Công nghệ sinh học sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các loại vaccine mới. Việc áp dụng các kỹ thuật hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả và độ an toàn của vaccine, từ đó bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào biểu mô và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm (Hình 1.2: Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất) và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme NA. Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới trung bình là khoảng 6 giờ. Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử và rơi vào quá trình chết theo chương trình làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ [35, 38]. Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription).

Phức hợp protein – RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào [4]. Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase. Các sợi này không được Adenine hóa 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào. Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus (Hình 1.

Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi” tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [25, 26].3 Cấu trúc, chức năng của HA và NA Hai protein HA và NA là các protein chính trên bề mặt capsid, đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A [21, 25].

Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA, được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay [6, 17, 21, 24]. Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai dưới đơn vị HA1 (36 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa và gắn vào mặt ngoài capsid là dưới đơn vị HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA1 chứa đựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích [6, 36]. Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm.

Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa sialic acid của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau [36, 38]. Vị trí amino acid 226 (aa226) của dưới đơn vị HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó. Ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A). Protein NA (neuraminidase) Protein neuraminidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.18), là một enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type NA [3, 36].

Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. Mặt khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình cởi áo giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn [36]. Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] khỏi các chất ức chế không đặc hiệu. Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ.

Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế virus không đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzyme này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ thể [8]. Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA [12]. Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A và là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [31, 42].4 Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A Do kháng nguyên HA và NA của virus thường xuyên biến đổi mà bệnh cúm rất khó kiểm soát. Có hai phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A [42].

Hiện tượng lệch kháng nguyên Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các phân đoạn gen/hệ gen của virus do virus cúm A không có cơ chế “đọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích. Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn đến các enzyme sao chép phụ thuộc RNA sẽ có thể “gài” thêm [1], làm mất đi hoặc thay thế một hay nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của virus [25]. Tuỳ thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa mà có thể trực tiếp làm thay đổi các amino acid trong trình tự của protein được mã hóa biểu hiện, dẫn đến thay đổi thuộc tính của protein. Các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một phân type virus mới có những đặc tính kháng nguyên mới có thể bị sai lệch.

11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Hiện tượng trộn kháng nguyên Hiện tượng trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) giữa các gen kháng nguyên của virus cúm với gen khác ở một số rất ít virus RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng rất cao. Hệ gen gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt của virus cúm A được 2 chủng virus cúm A khác nhau khi đồng nhiễm trong một tế bào trao đổi cho nhau. Trong quá trình kết hợp lại RNA hệ gen có thể xảy ra sự hoà trộn hoặc trao đổi các phân đoạn gen của hai chủng virus đó tạo ra các trạng thái khác nhau của RNA hệ gen của các hạt virus mới từ hai RNA hệ gen của những virus ban đầu. Kết quả là đã tạo ra thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh [9, 16, 23].5 Vaccine phòng cúm A/H5N1 Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch [32].

Đối với dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người [17, 29]. Kháng thể đặc hiệu được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine và chủ yếu là các kháng thể kháng HA, NA, MA góp phần vô hiệu hóa virus cúm khi chúng xâm nhập vào cơ thể. Kháng thể kháng HA có vai trò tiên quyết trong việc tạo miễn dịch bảo hộ cho vật chủ bị nhiễm. Hiện nay có 3 loại vaccine được bán và sử dụng rộng rãi tại Việt Nam là: - Vaccine vô hoạt nhũ dầu H5N2 (Trung Quốc): được tạo ra bằng cách vô hoạt virus A/Turkey/England/N-28/73 (H5N2).

Đây là loại vaccine dị chủng (là vaccine sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng) .