MỞ ĐẦU “Thu hẹp khoảng cách - Kết nối cộng đồng” là thông điệp được đưa ra tại Lễ mít tinh hưởng ứng ngày Hemophilia thế giới (17/4/) diễn ra tại Hà Nội, với mong muốn cải thiện tình hình chăm sóc bệnh nhân bị bệnh Hemophilia (hay còn gọi là bệnh máu khó đông) trên phạm vi toàn cầu, hướng tới mục tiêu tất cả người bệnh máu khó đông đều có cơ hội được điều trị và chăm sóc tốt. Ở Việt Nam, theo thống kê của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương ước tính hiện nay có khoảng 6.000 bệnh nhân bị bệnh Hemophilia, trong đó mới chỉ 20% bệnh nhân được phát hiện và chăm sóc thường xuyên. Hemophilia là một rối loạn chảy máu di truyền do bất thường gen gây nên, bệnh nhân bị chảy máu khó cầm ở khắp các bộ phận trên cơ thể, đặc biệt là cơ và khớp. Bệnh xuất hiện do cơ thể thiếu hụt hoặc không có đủ các yếu tố làm đông máu, thường gặp là yếu tố VIII (hemophilia A) và IX (hemophilia B).
Trên thế giới, việc nghiên cứu và sử dụng các thuốc giúp làm máu đông nhanh để điều trị bệnh Hemophilia bằng công nghệ sinh học đã được bắt đầu từ cuối năm 1980. Cho tới nay, việc áp dụng những kỹ thuật hiện đại của công nghệ gen và protein để phân lập và tách dòng cDNA nhằm sản xuất các chể phẩm protein tái tổ hợp VIII và IX trong các tế bào vi khuẩn và tế bào động vật đã phát triển vượt bậc [59]. Người ta đã sản xuất được các chế phẩm VIII và IX có giá trị trong điều trị với giá thành hạ, sản lượng tăng, độ tinh sạch cao. đáp ứng những nhu cầu cấp bách của thực tiễn [35].
Người bệnh Hemophilia có thể có cuộc sống gần như người bình thường nếu được phát hiện sớm và điều trị đúng cách. Còn nếu người bệnh để bệnh phát triển thì hậu quả sẽ là chảy máu nhiều lần, gây biến dạng cơ và khớp, dẫn đến khó khăn trong việc đi lại, trở thành người tàn tật, thậm chí tử vong sớm. Ở nước ta, quá trình điều trị cho những người mắc bệnh Hemophilia gặp phải rất nhiều khó khăn. Điều trị bằng phương pháp tiếp máu có những khó khăn như rất tốn kém và để có được nguồn máu phù hợp cho người bệnh là rất khó.
Ngoài ra, cách điều trị này còn tiềm 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ẩn lây truyền các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm như virus viêm gan, HIV. cho bệnh nhân Hemophilia. Bên cạnh đó, nếu điều trị bằng cách sử dụng các dược phẩm dưới dạng các yếu tố đông máu VIII/IX thì phải nhập ngoại các dược phẩm này do không có sẵn trên thị trường. Do vậy, giá thành của chúng rất cao.
Theo thông tin từ Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương, chi phí cho một bệnh nhân Hemophilia trung bình khoảng 50 – 100 triệu đồng/năm. Cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có một công bố hay đề tài nào về nghiên cứu sản xuất yế u tố đông máu IX tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn hay tế bào động vật được thực hiện. Do những nhu cầ u cấ p thiế t trong điề u tri ̣bê ̣nh Hemophilia , chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn E. coli”, nhằm tạo ra một bước tiền đề hướng tới việc nghiên cứu và phát triển chế phẩm yếu tố đông máu IX tái tổ hợp, góp phần vào việc chăm sóc sức khỏe bệnh nhân Hemophilia trong tương lai.
Đề tài thực hiện với mục tiêu cụ thể sau: 1. Tách chiết được RNA tổng số từ mô gan sinh thiết của người. Phân lập được đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô người. Thiết kế được vector biểu hiện mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người.
Chuyển và biểu hiện vector mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn E. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về bệnh Hemophilia 1. Giới thiệu chung về bệnh Hemophilia Hemophilia là một bệnh rối loạn đông máu di truyền mà trong dân gian thường hay gọi là “bệnh máu loãng”, “bệnh máu không đông” hoặc “bệnh máu khó cầm”.
Bệnh này đặc trưng bởi sự thiếu hụt hoặc không có một trong các protein cần thiết cho quá trình đông máu. Một số người mắc bệnh Hemophilia do thiếu hụt yếu tố đông máu VIII, được gọi là Hemophilia A. Một số khác do thiếu yếu tố đông máu IX, được gọi là Hemophilia B. Ngoài ra, có tỷ lệ rất hiếm người mắc bệnh Hemophilia C, bệnh do thiếu hụt yếu tố đông máu XI [70], [71].
Quá trình đông máu ở người bình thường và người mắc bệnh Hemophilia (theo Hiệp hội Hemophilia thế giới). Người mắc bệnh Hemophilia không chảy máu nhanh hơn người bình thường. Tuy nhiên, người bệnh lại chảy máu khó cầm hơn những người khác (Hình 1). Biểu hiện của bệnh là xuất hiện các vết thâm tím lớn dưới da, chảy máu khó cầm ở khắp các vị trí trên cơ thể.
Chảy máu xuất hiện một cách tự nhiên và kéo dài sau những tổn thương hoặc phẫu thuật. Vị trí hay gặp nhất là ở cơ và khớp. Chảy máu cơ và 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com khớp nhiều lần sẽ làm teo cơ, cứng khớp, biến dạng khớp, khiến người bệnh gặp nhiều khó khăn trong việc đi lại, trở thành người tàn tật, sống cô lập với cộng đồng và thậm chí dẫn tới tử vong sớm. Theo Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương, hiện nay ở Việt Nam ước tính có khoảng gần 6.000 người mắc Hemophilia, trong đó số được chẩn đoán và quản lý mới chỉ chiếm chưa tới 20% [66].
Do hiểu biết của cộng đồng, của bệnh nhân và gia đình về bệnh còn hạn chế, đa số bệnh nhân còn được chẩn đoán muộn và chưa biết cách tự chăm sóc. Bên cạnh đó, chế phẩm máu điều trị cho bệnh nhân còn chưa được cung cấp đầy đủ vì vậy tỷ lệ bệnh nhân tàn tật còn cao, chiếm 60%. Theo số liệu thống kế của Hiệp hội Hemophilia quốc tế, hiện nay trên thế giới có hơn 400.000 người mắc bệnh Hemophilia. Trong đó, Hoa Kỳ có khoảng 20.000 người mắc bệnh và ước tính mỗi năm có khoảng 400 bé trai mới sinh mắc bệnh.
Hình 2 minh họa mối tương quan tỷ lệ mắc bệnh Hemophilia của Việt Nam so với thế giới [72]. Tỷ lệ người mắc bệnh Hemophilia ở Việt Nam so với thế giới theo đánh giá của Hiệp hội Hemophilia quốc tế vào tháng 3 năm 2012. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Nguyên nhân gây bệnh Hemophilia Hemophilia là bệnh rối loạn chảy máu di truyền, được gây ra bởi đột biến trong các gen mã hóa cho các yếu tố đông máu VIII, IX và XI.
Trong hầu hết các trường hợp, gen đáp ứng cho bệnh Hemophilia được truyền từ cha hoặc/và mẹ sang con cái. Tuy nhiên, có khoảng 30% trường hợp mắc bệnh Hemophilia được sinh ra từ một gia đình không có tiền sử về bệnh Hemophilia trước đó. Trong những trường hợp như vậy, nguyên nhân gây bệnh Hemophilia là do đột biến gen tự phát tại thời điểm thụ tinh [70]. Nguyên nhân do di truyền Gen mã hóa cho hai yếu tố đông máu VIII và IX đều nằm trên nhiễm sắc thể giới tính "X" [Nữ (XX), nam (XY)].
Do đó, Hemophilia được gọi là rối loạn chảy máu di truyền liên kết với nhiễm sắc thể giới tính "X". Điều này có nghĩa là bệnh Hemophilia chủ yếu xảy ra ở nam giới, còn nữ giới là người mang gen gây bệnh. Nam giới mắc bệnh có mức độ biểu hiện thấp hoặc không có yếu tố đông máu VIII và IX trong tuần hoàn máu. Trong khi nữ giới mang gen bệnh sẽ có ít nhất một nhiễm sắc thể giới tính “X” mang gen mã hóa cho yếu tố đông máu VIII và IX ở trạng thái bình thường, đáp ứng khoảng 50% mức độ yếu tố đông máu.
Các mô hình di truyền chung cho cả hai bệnh Hemophilia A và B có thể được tóm tắt sau: Bệnh Hemophilia được di truyền trong trường hợp cha mắc bệnh, mẹ không mắc bệnh: Người cha mắc bệnh sẽ di truyền gen gây bệnh nằm trên nhiễm sắc thể “X” cho toàn bộ con gái. Do đó, tất cả con gái được sinh ra từ người cha này trở thành người mang gen bệnh. Mỗi người con trai được sinh ra trong trường hợp này sẽ nhận một nhiễm sắc thể “Y” từ người cha và một nhiễm sắc thể “X” không mang gen bệnh từ người mẹ. Bởi vậy, tất cả các con trai sẽ không mắc bệnh (Hình 3) [69].
5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Sự di truyền bệnh Hemophilia trong trường hợp cha mắc bệnh và Mẹ không mang gen gây bệnh [69]. Bệnh Hemophilia được di truyền trong trường hợp người cha không mắc bệnh, mẹ mang bệnh: Trường hợp này, người mẹ mang gen bệnh có thể di truyền chính chiếc nhiễm sắc thể “X” mang gen bệnh cho cả con gái và con trai của mình. Do đó, cả hai con trai và con gái có 50% nguy cơ nhận được một chiếc nhiễm sắc thể X này từ người mẹ.
Nếu một người con trai nhận được nhiễm sắc thể “X” mang gen bệnh, người con này sẽ mắc bệnh. Còn nếu, người con trai nhận được một chiếc nhiễm sắc thể X không mang gen bệnh, người con này sẽ không mắc bệnh. Đối với con gái, nếu như một người con gái nhận từ nhiễm sắc thể “X” mang bệnh từ người mẹ, người còn gái này sẽ mang gen bệnh. Vì vậy, các con gái được sinh ra từ trường hợp này có 50% nguy cơ cũng trở thành người mang gen bệnh.
Các con trai cũng có 50% nguy cơ mắc bệnh (Hình 4) [69]. Ngoài ra, sự thiếu hụt yếu tố đông máu XI thường là một bệnh di truyền, được gây ra bởi đột biến gen (alteration) của gen mã hóa cho yếu tố đông máu XI. Đây là một rối loạn di truyền gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường, có nghĩa là cả 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com bố và mẹ đều phải mang gen bệnh thì mới có khả năng sinh ra một người con mắc bệnh. Sự ảnh hưởng của gen gây bệnh này đối với cả nam và nữ là như nhau [74].
Sự di truyền bệnh Hemophilia trong trường hợp mẹ mang bệnh và cha không mắc bệnh [69]. Nguyên nhân do đột biến Đột biến xảy ra ở các gen mã hóa cho các yếu tố đông máu (VIII, IX và XI) chủ yếu là các đột biến điểm, đảo đoạn, mất nucleotide và đột biến vô nghĩa. Các dạng đột biến này chiếm tỷ lệ tương ứng 46%, 42%, 8%, 4%.