MỞ ĐẦU Virus gây suy giảm miễm dịch ở ngƣời (Human Immuno Deficiency Virus- HIV) là nguyên nhân chính gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngƣời (AIDS). Đây là một trong các bệnh đã làm nhiều ngƣời chết nhất trong lịch sử loài ngƣời [49]. Có hai type HIV gây nên AIDS là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV - 2), nhƣng HIV-1 độc hơn HIV-2 và là nguyên nhân chính của các ca nhiễm HIV trên toàn thế giới từ khi xuất hiện cho tới nay [28]. Để tồn tại và phát triển, HIV-1 cần đến 3 enzym quan trọng không thể thiếu trong sao chép, đóng gói và hình thành virus hoàn chỉnh đó là: enzym phiên mã ngƣợc reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease.
Nếu một trong ba enzym này bị ức chế chu kì sống của HIV sẽ bị ảnh hƣởng, chính vì vậy hƣớng nghiên cứu tìm ra chất ức chế các enzym trên để sản xuất thuốc điều trị cho các bệnh nhân AIDS đã đƣợc rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Các điều trị theo hƣớng sử dụng chất ức chế 3 enzym đó gọi là liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus ART (antiretroviral drug therapy) [28]. Enzym protease của HIV-1 (đƣợc gọi tắt là protease HIV-1) đƣợc mã hoá bởi gen pol của virus có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag – pol) thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus có thể tiếp tục lây nhiễm. Nếu protease bị mất hoạt tính, HIV-1 sẽ không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh [19].
Tuy nhiên, do HIV-1 có tốc độ sinh sản nhanh, có khoảng 10 triệu hạt virus mới đƣợc tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót của enzym reverse transcriptase là 1/10.000 base dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậm chí khi chƣa điều trị. Ngày càng có nhiều chất ức chế protease (PI) chống HIV đƣợc phát triển và thƣơng mại hóa nhƣng vẫn chƣa tìm đƣợc chất ức chế nào thực sự có hiệu quả. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra chất ức chế protease một cách hiệu quả là nhiệm vụ quan trọng góp phần đẩy lùi HIV/AIDS. Quá trình nghiên cứu nhằm tìm ra chất ức chế protease này cần một lƣợng lớn protease nên việc sản xuất, tinh sạch protease HIV-1 là rất cần thiết.
1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 trên toàn thế giới. Trong thực tế nghiên cứu, protease HIV-1 không dễ dàng biểu hiện trong tế bào vật chủ do đặc tính gây độc tế bào, khó tan, lƣợng protease thu đƣợc sau biểu hiện thƣờng thấp, khó phát hiện. Do đó, cần có những nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 có tính tan và hiệu quả hơn. Phần lớn các công trình nghiên cứu sản xuất protease HIV-1 ở Escherichia coli (E.
coli), vì đây là hệ thống biểu hiện đơn giản, dễ nuôi cấy [3; 18; 41]. coli là một sinh vật nhân sơ và thiếu các cơ quan nội bào chẳng hạn nhƣ mạng lƣới nội chất và bộ máy golgi nhƣ trong sinh vật nhân chuẩn (có chức năng cải biến protein sau tổng hợp). Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn khi biểu hiện ở E. coli không tạo thành dạng protein hoàn chỉnh có chức năng bởi những cải biến sau dịch mã không diễn ra.
Hạn chế này đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng các hệ thống biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn nhƣ nấm men và động vật có vú. Nấm men có cấu trúc đơn giản, nhƣng chúng mang đầy đủ các đặc điểm của một cơ thể và là một mô hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào nhân chuẩn. Nhiều protein của tế bào nhân thực đã đƣợc sản xuất thành công bằng hệ thống biểu hiện nấm men Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae, nấm men Pichia pastoris (P.
pastoris) cũng bắt đầu đƣợc quan tâm sử dụng để biểu hiện protein của sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt từ khi promoter alcohol oxidase đƣợc phân lập và tạo dòng. pastoris còn là hệ thống biểu hiện đáng tin cậy và có tiềm năng hơn E. cerevisiae để sản xuất protein ngoại lai dạng hòa tan [27]. Để tạo ra chế phẩm protease HIV-1 nhằm phát triển chất ức chế sự nhân lên của virus HIV-1, làm cơ sở cho việc nghiên cứu tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS, cùng với thuận lợi của hệ thống biểu hiện của nấm men P.
pastoris so với E. coli, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease của HIV-1 trên nấm men P. pastoris” với các nội dung: - Nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện. - Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa protease HIV-1 trên nấm men P.
2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV 1. Nguyên nhân hình thành AIDS Thuật ngữ AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome - Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) đƣợc đề xuất trong cuộc họp tại Washington của các nhà lãnh đạo cộng đồng ngƣời đồng tính, các quan chức và CDC (trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa kỳ) để thay thế cho GRID (suy giảm miễn dịch liên quan đến đồng tính) vào tháng 7 năm 1982 [11]. Đến tháng 8 năm 1982, AIDS đã trở thành tên gọi về hội chứng suy giảm miễn dịch ở ngƣời do tác nhân HIV gây nên [38].
Virus gây suy giảm miễn dịch đƣợc phát hiện lần đầu vào năm 1959 tại Châu Phi, và phân lập đầu tiên do Luc Montagnier và tập thể ở Viện Pasteur Paris thực hiện năm 1983 với tên gọi ban đầu là virus liên quan tới viêm hạch (LAV). Năm 1986, virus này đƣợc Uỷ ban Quốc tế thống nhất gọi tên là HIV [24]. Montagnier lại phân lập đƣợc một loại virus tƣơng tự ở Tây Phi và đặt tên là HIV type 2 (HIV-2), đây là loại virus gốc của HIV-1. Cả HIV-1 và HIV-2 đều làm suy giảm hệ thống miễn dịch của ngƣời nên đƣợc đặt tên chung là HIV.
Chúng giống nhau về cách thức truyền bệnh, các hình thức nhiễm bệnh cơ hội và phƣơng pháp điều trị nhƣng ngƣời nhiễm HIV-2 ít phát sinh bệnh hơn so với HIV-1 và HIV-2 chủ yếu thấy ở các vùng Châu Phi [28]. Bởi vậy, bệnh AIDS hiện nay đƣợc hình thành do tác nhân chính là virus HIV-1. Theo phân loại, HIV thuộc họ Retrovirus, chi Lentivirus, có hai loại là HIV- 1 và HIV-2. Retrovirus là họ gây ung thƣ cho ngƣời và động vật.
HIV-1 có 4 nhóm chính là M (main), N (new) và O (outlier) và nhóm P [40]. Trong đó, nhóm M xuất hiện tới 90% tổng số các ca lây nhiễm HIV trên toàn thế giới, nhóm này có 9 phân type (subtypes or clades) đƣợc kí hiệu bằng các chữ cái A; B; C; D; E; F; G; H; J; K và 49 dạng tái tổ hợp khác gọi tắt là các phân nhóm CRF (circulating recombinant forms) [6]. Sự khác nhau giữa phân nhóm này và phân nhóm khác là trình tự axit amin của protein vỏ và có thể vƣợt quá 30%. Vị trí địa lý có thể ảnh hƣởng đến sự 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com lây nhiễm các phân nhóm khác nhau nhƣ phân nhóm B phổ biến ở Mỹ, Tây Âu và Austalia, còn ở các nƣớc đang phát triển nhƣ Châu Á và Châu Phi, nơi mà có nhiều ngƣời bị nhiễm HIV-1 đang sinh sống thì lại phổ biến các phân nhóm không thuộc nhóm B.
Cụ thể, theo ghi nhận của Ngân hàng Gen HIV Hoa Kỳ, kiểu gen CRF25_CPX thƣờng chỉ xuất hiện ở Châu Phi [53]. Những nghiên cứu ban đầu về dịch tễ học phân tử của HIV đã xác định đƣợc phân týp chính lƣu hành tại Việt Nam đó là phân týp CRF01_AE (96,7%) và phân týp B (3,3%) [10]. Năm 2013, Phạm Đức Minh và cộng sự đã công bố kết quả phân typ AE và B ở Việt Nam lần lƣợt là 98,53% và 1,33%. Thực trạng nhiễm HIV-1 Sau gần nửa thế kỷ phát hiện ra HIV đến nay, HIV/AIDS vẫn là đại dịch thế kỷ chƣa có vaccine phòng ngừa hay thuốc chữa trị đặc hiệu.
Với tốc độ lây lan nhanh, HIV/AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt là ở khu vực Châu Phi và các nƣớc Châu Á. Theo ƣớc tính của chƣơng trình HIV/AIDS Liên hiệp quốc UNAIDS, trung bình mỗi ngày trên thế giới có thêm khoảng 7000 ngƣời nhiễm HIV. UNAIDS đã công bố báo cáo thống kê trong năm 2012 thế giới có khoảng 2,3 triệu các trƣờng hợp nhiễm mới HIV ở ngƣời lớn và trẻ em, giảm 33% so với năm 2001, các trƣờng hợp tử vong liên quan đến AIDS cũng giảm 30% so với mức đỉnh năm 2005 [49]. Đây là kết quả của sự nỗ lực không ngừng trong công tác truyền thông phòng, chống HIV và việc mở rộng tiếp cận điều trị theo hƣớng kháng virus làm giảm số ngƣời tử vong, kéo dài sự sống cho ngƣời bệnh.
Những con số thống kê này cho thấy hy vọng có thể ngăn chặn và đẩy lùi đại dịch HIV/AIDS trên toàn cầu khi nâng cao hơn nữa tính hiệu quả của các phƣơng pháp điều trị phòng và chống HIV/AIDS. Tuy nhiên, theo công bố của WHO, HIV vẫn tiếp tục là một vấn đề y tế công cộng quan trọng toàn cầu. Đến hết năm 2013 trên toàn thế giới, có khoảng 1,5 triệu ngƣời chết vì các nguyên nhân liên quan đến HIV, 33,2 - 37,2 triệu ngƣời sống chung với HIV với hơn 2,1 triệu ngƣời nhiễm mới. Trong đó, Sahara Châu Phi là khu vực có số ngƣời nhiễm HIV lớn nhất thế giới với trên 24,7 triệu ngƣời sống 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com chung với HIV, số ngƣời nhiễm mới cũng chiếm gần 70% tổng số ngƣời nhiễm trên toàn cầu [56].
Ở Việt Nam, năm 1990 phát hiện bệnh nhân dƣơng tính với HIV đầu tiên. Theo báo cáo của Cục phòng chống AIDS, giữa những năm 2000 đến 2007, số ngƣời nhiễm HIV đã tăng gấp đôi từ 122.000 ngƣời và mỗi năm có khoảng 40.000 ngƣời nhiễm mới. Tính đến 30/9/2010 trên cả nƣớc có 180.631 ngƣời nhiễm HIV, đến ngày 30/9/2013 cả nƣớc có 218.427 ngƣời nhiễm HIV, trong đó có 66.729 ngƣời ở giai đoạn AIDS, 66.116 trƣờng hợp tử vong do HIV/AIDS, và trung bình mỗi ngày cả nƣớc phát hiện thêm 34 ngƣời nhiễm HIV [49]. Theo báo cáo mới nhất của cục phòng chống HIV/AIDS, tính đến ngày 30/4/2014, toàn quốc hiện có 219.163 trƣờng hợp báo cáo hiện nhiễm HIV (trong đó số bệnh nhân chuyển sang giai đoạn AIDS là 67.130 ngƣời nhiễm HIV đƣợc phát hiện.
Đây chỉ là số ngƣời nhiễm HIV đƣợc phát hiện và xác nhận, số ngƣời nhiễm thực tế có thể lớn hơn [49].