Tổng quan nghiên cứu
Interleukin-6 (IL-6) là một cytokine đa chức năng có vai trò quan trọng trong điều hòa các phản ứng miễn dịch và sinh học của cơ thể người. Nồng độ IL-6 tăng cao liên quan đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng như viêm khớp dạng thấp, ung thư, và các bệnh lý viêm cấp tính, đặc biệt là trong bối cảnh đại dịch COVID-19. Tuy nhiên, việc chiết xuất IL-6 trực tiếp từ mô người gặp nhiều khó khăn do sản lượng thấp và quy trình phức tạp. Tại Việt Nam, nguồn IL-6 tái tổ hợp phục vụ nghiên cứu và thử nghiệm thuốc còn rất hạn chế, đồng thời chi phí cao cũng là rào cản lớn.
Luận văn thạc sĩ này tập trung nghiên cứu tạo IL-6 người tái tổ hợp trên vi khuẩn Escherichia coli nhằm cung cấp nguồn protein có độ tinh khiết cao, phục vụ cho các nghiên cứu sinh học và phát triển thuốc điều trị. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn 2019-2021 tại Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, với mục tiêu thiết kế vector biểu hiện gen IL-6 tối ưu, khảo sát điều kiện nuôi cấy và tinh chế protein tái tổ hợp. Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao năng suất biểu hiện IL-6 hòa tan, giảm chi phí và mở rộng khả năng ứng dụng trong thử nghiệm in vitro và phát triển thuốc.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Khung lý thuyết áp dụng
Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:
Cytokin và Interleukin-6: IL-6 là một cytokine đa chức năng, tham gia điều hòa miễn dịch qua các con đường tín hiệu JAK/STAT, với cấu trúc gồm bốn chuỗi xoắn alpha đặc trưng. IL-6 truyền tín hiệu qua phức hợp thụ thể IL-6R và gp130, có hai dạng thụ thể là màng (mIL-6R) và hòa tan (sIL-6R), tạo ra các hiệu ứng sinh học đa dạng như tín hiệu cổ điển và tín hiệu trans.
Công nghệ biểu hiện protein tái tổ hợp trên Escherichia coli: E. coli BL21(DE3) được lựa chọn làm vật chủ do khả năng tăng trưởng nhanh, dễ nuôi cấy, và có hệ thống biểu hiện T7 promoter hiệu quả. Việc tối ưu hóa codon, sử dụng tag SUMO để tăng hòa tan và biểu hiện protein, cùng với các kỹ thuật tinh chế sắc ký ái lực Ni-Sepharose và sắc ký lọc gel, là nền tảng cho quy trình sản xuất IL-6 tái tổ hợp.
Phương pháp định tính và định lượng protein: SDS-PAGE được sử dụng để phân tích kích thước và độ tinh khiết protein, phương pháp Bradford và ELISA được áp dụng để định lượng chính xác nồng độ IL-6 trong mẫu.
Phương pháp nghiên cứu
Nguồn dữ liệu: Gen IL-6 người được tối ưu hóa codon bằng phần mềm OptimumGeneTM, gắn tag His-SUMO để tăng hòa tan và thuận tiện cho tinh chế. Vector pET24a(+) chứa gen IL-6 được biến nạp vào chủng E. coli BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt.
Phương pháp phân tích: Protein biểu hiện được khảo sát trong môi trường ZYP-5052, LB và TB ở các nhiệt độ 25 °C và 37 °C để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Protein hòa tan được thu nhận qua ly tâm và tán siêu âm, sau đó tinh chế bằng sắc ký ái lực Ni-Sepharose với nồng độ imidazol rửa giải 200 mM. Protein nguyên thể được thu nhận sau thủy phân bằng SUMO protease. Định tính protein bằng SDS-PAGE, định lượng bằng Bradford và ELISA.
Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian 2019-2021, bao gồm các bước thiết kế vector, biến nạp, khảo sát điều kiện nuôi cấy, tinh chế và đánh giá sản phẩm.
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Những phát hiện chính
Thiết kế vector và tối ưu hóa codon: Gen IL-6 được tối ưu hóa với chỉ số Codon Adaptation Index (CAI) đạt 0,97, đảm bảo biểu hiện hiệu quả trên E. coli. Tần số codon tối ưu chiếm 87%, hàm lượng GC trong khoảng 30-70%, phù hợp cho biểu hiện gen.
Biểu hiện protein tái tổ hợp: Chủng E. coli BL21(DE3) mang vector pET-SUMO-IL-6 biểu hiện IL-6 tái tổ hợp trong môi trường ZYP-5052 ở 25 °C với năng suất biểu hiện khoảng 40% theo SDS-PAGE. So sánh với môi trường LB và TB, ZYP-5052 cho sinh khối và biểu hiện protein hòa tan cao hơn khoảng 20-30%.
Tinh chế và thu nhận protein: Tinh chế SUMO-IL-6 bằng sắc ký ái lực Ni-Sepharose với nồng độ imidazol rửa giải 200 mM đạt hiệu suất cao. Sau thủy phân bằng SUMO protease và tinh chế, thu được 3,924 mg IL-6 nguyên thể từ 50 mL dịch nuôi cấy, tương đương hiệu suất khoảng 18%.
Định lượng và đánh giá hoạt tính: Protein IL-6 tái tổ hợp được định lượng chính xác bằng phương pháp Bradford và ELISA, đảm bảo độ tinh khiết và hoạt tính sinh học phù hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.
Thảo luận kết quả
Việc tối ưu hóa codon và sử dụng tag His-SUMO đã góp phần tăng biểu hiện protein hòa tan, giảm thiểu thể vùi không tan thường gặp trong biểu hiện protein tái tổ hợp trên E. coli. Nhiệt độ nuôi cấy 25 °C giúp giảm stress tế bào, tăng khả năng gấp cuộn đúng cách của protein, từ đó nâng cao tỷ lệ hòa tan lên khoảng 40%, cao hơn so với các nghiên cứu trước đây chỉ đạt khoảng 2,6 mg/L.
Quy trình tinh chế sắc ký ái lực Ni-Sepharose với nồng độ imidazol 200 mM được tối ưu hóa giúp thu nhận protein có độ tinh khiết cao, đồng thời thủy phân bằng SUMO protease cho phép loại bỏ tag His-SUMO, thu được IL-6 nguyên thể với hiệu suất 18%, phù hợp cho ứng dụng nghiên cứu và thử nghiệm thuốc.
So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả này thể hiện sự tiến bộ trong việc tạo nguồn IL-6 tái tổ hợp tại Việt Nam, góp phần giảm chi phí và tăng khả năng tiếp cận nguồn protein chất lượng cao. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh năng suất biểu hiện ở các môi trường và nhiệt độ, bảng hiệu suất tinh chế và định lượng protein.
Đề xuất và khuyến nghị
Mở rộng quy mô sản xuất IL-6 tái tổ hợp: Áp dụng quy trình biểu hiện và tinh chế đã tối ưu để sản xuất IL-6 ở quy mô lớn hơn, nhằm đáp ứng nhu cầu nghiên cứu và thử nghiệm thuốc trong nước. Thời gian thực hiện dự kiến 12-18 tháng, do các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học đảm nhiệm.
Nghiên cứu cải tiến hệ thống biểu hiện: Thử nghiệm các chủng E. coli biến đổi gen khác như BL21trxB hoặc Origami để tăng cường hình thành liên kết disulfid, nâng cao hoạt tính sinh học của IL-6. Thời gian nghiên cứu 6-12 tháng, do các nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học thực hiện.
Phát triển các phương pháp tinh chế hiệu quả hơn: Kết hợp sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký lọc gel để nâng cao độ tinh khiết và thu hồi protein, giảm chi phí sản xuất. Thời gian triển khai 6 tháng, do phòng thí nghiệm phân tích protein đảm nhiệm.
Ứng dụng IL-6 tái tổ hợp trong thử nghiệm thuốc: Cung cấp nguồn IL-6 chất lượng cao cho các nghiên cứu in vitro về các bệnh lý liên quan đến IL-6 như viêm khớp dạng thấp, ung thư và COVID-19, hỗ trợ phát triển thuốc nhắm mục tiêu IL-6. Thời gian ứng dụng liên tục, do các trung tâm nghiên cứu dược phẩm và y học thực hiện.
Đối tượng nên tham khảo luận văn
Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và dược học: Có thể áp dụng quy trình biểu hiện và tinh chế IL-6 tái tổ hợp để phát triển các protein cytokine khác, nâng cao hiệu quả nghiên cứu và sản xuất protein tái tổ hợp.
Các phòng thí nghiệm phát triển thuốc: Sử dụng nguồn IL-6 tái tổ hợp chất lượng cao để thử nghiệm in vitro, đánh giá hiệu quả và cơ chế tác động của các thuốc nhắm mục tiêu IL-6 trong điều trị các bệnh viêm và ung thư.
Doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế: Tham khảo quy trình sản xuất IL-6 để phát triển các bộ kit chẩn đoán hoặc thuốc sinh học liên quan đến IL-6, giảm chi phí nhập khẩu và tăng tính chủ động trong sản xuất.
Sinh viên và học viên cao học ngành dược học, công nghệ sinh học: Nắm bắt kiến thức về kỹ thuật biểu hiện protein tái tổ hợp, tinh chế và đánh giá protein, phục vụ cho các đề tài nghiên cứu và học tập chuyên sâu.
Câu hỏi thường gặp
Tại sao chọn Escherichia coli BL21(DE3) làm vật chủ biểu hiện IL-6?
E. coli BL21(DE3) có tốc độ tăng trưởng nhanh, hệ thống biểu hiện T7 promoter hiệu quả, ít protease nội bào giúp tăng độ ổn định protein, phù hợp cho sản xuất protein tái tổ hợp với năng suất cao.Lợi ích của việc gắn tag His-SUMO vào IL-6 là gì?
Tag His-SUMO giúp tăng khả năng hòa tan của protein, dễ dàng tinh chế bằng sắc ký ái lực Ni-Sepharose và có thể được loại bỏ bằng SUMO protease để thu IL-6 nguyên thể, giữ hoạt tính sinh học.Tại sao cần tối ưu hóa codon cho gen IL-6?
Tối ưu hóa codon giúp phù hợp với tần suất sử dụng codon của E. coli, tăng hiệu quả phiên mã và dịch mã, giảm sai lệch acid amin, từ đó nâng cao năng suất biểu hiện protein.Nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng thế nào đến biểu hiện IL-6?
Nuôi cấy ở 25 °C giúp giảm stress tế bào, tăng khả năng gấp cuộn đúng cách của protein, giảm thể vùi không tan, nâng cao tỷ lệ protein hòa tan và hoạt tính sinh học.Phương pháp định lượng IL-6 bằng ELISA có ưu điểm gì?
ELISA có độ nhạy cao, đặc hiệu, cho phép định lượng chính xác IL-6 trong mẫu phức tạp mà không cần tinh sạch hoàn toàn, phù hợp cho đánh giá hoạt tính và nồng độ protein tái tổ hợp.
Kết luận
- Thiết kế vector pET-SUMO-IL-6 với gen IL-6 tối ưu hóa codon đạt CAI 0,97, phù hợp biểu hiện trên E. coli BL21(DE3).
- Biểu hiện IL-6 tái tổ hợp hòa tan đạt khoảng 40% trong môi trường ZYP-5052 ở 25 °C, vượt trội so với các điều kiện khác.
- Tinh chế bằng sắc ký ái lực Ni-Sepharose và thủy phân SUMO protease thu được 3,924 mg IL-6 nguyên thể từ 50 mL dịch nuôi cấy, hiệu suất 18%.
- Kết quả nghiên cứu góp phần tạo nguồn IL-6 tái tổ hợp chất lượng cao, phục vụ nghiên cứu và phát triển thuốc tại Việt Nam.
- Đề xuất mở rộng quy mô sản xuất, cải tiến hệ thống biểu hiện và ứng dụng IL-6 trong thử nghiệm thuốc để nâng cao hiệu quả nghiên cứu và điều trị.
Luận văn này là cơ sở quan trọng để phát triển các nghiên cứu tiếp theo về protein cytokine và ứng dụng trong y học, đồng thời kêu gọi các tổ chức nghiên cứu và doanh nghiệp hợp tác phát triển sản phẩm dựa trên IL-6 tái tổ hợp.