Nghiên Cứu Tạo Interleukin 6 Tái Tổ Hợp Trên Escherichia Coli

Chuyên khảo phân tích Nghiên cứu tạo interleukin 6 người tái tổ hợp trên escherichia coli, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo.

• Tác giả: Tôn Thảo Vy
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Quốc Thái
• Trường học: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
• Đề tài: Nghiên cứu tạo Interleukin 6 người tái tổ hợp trên Escherichia coli
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về Interleukin
• 2.2. Cấu trúc Interleukin-6
• 2.3. Tương tác giữa IL-6 và thụ thể, cơ chế truyền tín hiệu
• 2.4. Vai trò của IL-6 và các bệnh lí liên quan
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen IL-6
• 3.2.2. coli mang plasmid pET-SUMO-IL-6
• 3.2.3. Khảo sát điều kiện nuôi cấy
• 3.2.4. Tinh chế protein
• 3.2.5. Định lượng IL-6 bằng hIL-6-ELISA-KIT
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên Cứu Tạo Interleukin 6 Tái Tổ Hợp

Nghiên cứu về Interleukin 6 (IL-6) tái tổ hợp trên Escherichia coli đang thu hút sự chú ý lớn trong lĩnh vực sinh học phân tử. IL-6 là một cytokine đa chức năng, có vai trò quan trọng trong việc điều hòa các phản ứng miễn dịch. Việc sản xuất IL-6 tái tổ hợp có thể giúp cung cấp nguồn protein dồi dào cho các nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng. Tuy nhiên, việc chiết xuất IL-6 từ mô người gặp nhiều khó khăn và chi phí cao. Do đó, nghiên cứu này nhằm mục tiêu tạo ra IL-6 với độ tinh khiết cao từ vi khuẩn E. coli.

1.1. Đặc điểm sinh học của Interleukin 6

IL-6 có cấu trúc polypeptid chứa 184 acid amin, tham gia vào nhiều quá trình sinh học như viêm và miễn dịch. Nồng độ IL-6 tăng cao trong nhiều bệnh lý, bao gồm ung thư và viêm khớp dạng thấp.

1.2. Vai trò của Escherichia coli trong sản xuất protein tái tổ hợp

E. coli là một trong những vi khuẩn phổ biến nhất được sử dụng trong công nghệ sinh học để sản xuất protein tái tổ hợp. Việc sử dụng E. coli giúp tăng năng suất và giảm chi phí sản xuất protein như IL-6.

II. Thách thức trong Nghiên Cứu Tạo Interleukin 6 Tái Tổ Hợp

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc tạo ra IL-6 tái tổ hợp trên E. coli vẫn gặp phải nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và biểu hiện protein. Nhiều nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng sản lượng protein thu được thường không đạt yêu cầu. Hơn nữa, việc tinh chế IL-6 cũng là một bước quan trọng để đảm bảo độ tinh khiết và hoạt tính của protein.

2.1. Khó khăn trong việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH và thời gian có thể ảnh hưởng lớn đến năng suất biểu hiện IL-6. Việc tìm ra điều kiện tối ưu là rất cần thiết để đạt được sản lượng cao.

2.2. Thách thức trong quá trình tinh chế protein

Quá trình tinh chế IL-6 thường phức tạp và tốn thời gian. Các phương pháp như sắc ký ái lực cần được tối ưu hóa để thu được IL-6 với độ tinh khiết cao nhất.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tạo Interleukin 6 Tái Tổ Hợp

Nghiên cứu này sử dụng chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) và vector pET-SUMO-IL-6 để tạo ra IL-6 tái tổ hợp. Phương pháp sốc nhiệt được áp dụng để biến nạp plasmid vào tế bào E. coli. Sau đó, IL-6 được biểu hiện trong môi trường ZYP-5052 ở 25 °C. Các điều kiện biểu hiện protein được tối ưu hóa để thu được IL-6 hòa tan và tinh khiết.

3.1. Quy trình biến nạp plasmid vào E. coli

Quy trình biến nạp plasmid pET-SUMO-IL-6 vào E. coli sử dụng phương pháp sốc nhiệt, giúp tăng cường khả năng tiếp nhận plasmid của tế bào.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện IL 6

Điều kiện biểu hiện IL-6 được khảo sát kỹ lưỡng, bao gồm nhiệt độ, thời gian và nồng độ inducer, nhằm đạt được sản lượng protein cao nhất.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Tạo Interleukin 6 Tái Tổ Hợp

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) chứa vector pET-SUMO-IL-6 có khả năng biểu hiện IL-6 tái tổ hợp với năng suất khoảng 40%. Sau khi tinh chế, lượng IL-6 nguyên thể thu được là 3,924 mg từ 50 mL dịch nuôi cấy, đạt hiệu suất khoảng 18%. Những kết quả này mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất IL-6 với quy mô lớn.

4.1. Đánh giá năng suất biểu hiện IL 6

Năng suất biểu hiện IL-6 được đánh giá thông qua phương pháp SDS-PAGE, cho thấy hiệu quả của quy trình sản xuất.

4.2. Tinh chế IL 6 và đánh giá độ tinh khiết

Quá trình tinh chế IL-6 bằng sắc ký ái lực cho thấy độ tinh khiết cao, đảm bảo hoạt tính sinh học của protein.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn của Interleukin 6 Tái Tổ Hợp

IL-6 tái tổ hợp có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, từ nghiên cứu cơ bản đến phát triển thuốc điều trị. Việc cung cấp nguồn IL-6 dồi dào sẽ hỗ trợ các nghiên cứu về bệnh lý liên quan đến IL-6, như viêm khớp dạng thấp và ung thư. Hơn nữa, IL-6 cũng có thể được sử dụng trong các thử nghiệm in vitro để đánh giá hiệu quả của các liệu pháp mới.

5.1. Ứng dụng trong nghiên cứu bệnh lý

IL-6 tái tổ hợp có thể được sử dụng để nghiên cứu cơ chế bệnh lý và phát triển các phương pháp điều trị mới cho các bệnh liên quan đến IL-6.

5.2. Tiềm năng trong phát triển thuốc

Việc sản xuất IL-6 tái tổ hợp mở ra cơ hội cho việc phát triển các thuốc điều trị nhắm vào IL-6, mang lại hiệu quả cao hơn trong điều trị bệnh.

VI. Kết Luận và Tương Lai của Nghiên Cứu Interleukin 6 Tái Tổ Hợp

Nghiên cứu này đã thành công trong việc tạo ra IL-6 tái tổ hợp với năng suất và độ tinh khiết cao. Kết quả này không chỉ góp phần vào việc cung cấp nguồn IL-6 cho các nghiên cứu mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các liệu pháp điều trị. Tương lai của nghiên cứu này có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và mở rộng quy mô sản xuất IL-6.

6.1. Định hướng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc cải tiến quy trình sản xuất IL-6 và khám phá các ứng dụng mới của cytokine này.

6.2. Tầm quan trọng của IL 6 trong y học

IL-6 sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và điều trị các bệnh lý liên quan, đặc biệt là trong bối cảnh dịch bệnh hiện nay.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Interleukin-6 (IL-6) là một cytokine đa chức năng có vai trò quan trọng trong điều hòa các phản ứng miễn dịch và sinh học của cơ thể người. Nồng độ IL-6 tăng cao liên quan đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng như viêm khớp dạng thấp, ung thư, và các bệnh lý viêm cấp tính, đặc biệt là trong bối cảnh đại dịch COVID-19. Tuy nhiên, việc chiết xuất IL-6 trực tiếp từ mô người gặp nhiều khó khăn do sản lượng thấp và quy trình phức tạp. Tại Việt Nam, nguồn IL-6 tái tổ hợp phục vụ nghiên cứu và thử nghiệm thuốc còn rất hạn chế, đồng thời chi phí cao cũng là rào cản lớn.

Luận văn thạc sĩ này tập trung nghiên cứu tạo IL-6 người tái tổ hợp trên vi khuẩn Escherichia coli nhằm cung cấp nguồn protein có độ tinh khiết cao, phục vụ cho các nghiên cứu sinh học và phát triển thuốc điều trị. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn 2019-2021 tại Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, với mục tiêu thiết kế vector biểu hiện gen IL-6 tối ưu, khảo sát điều kiện nuôi cấy và tinh chế protein tái tổ hợp. Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao năng suất biểu hiện IL-6 hòa tan, giảm chi phí và mở rộng khả năng ứng dụng trong thử nghiệm in vitro và phát triển thuốc.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cytokin và Interleukin-6: IL-6 là một cytokine đa chức năng, tham gia điều hòa miễn dịch qua các con đường tín hiệu JAK/STAT, với cấu trúc gồm bốn chuỗi xoắn alpha đặc trưng. IL-6 truyền tín hiệu qua phức hợp thụ thể IL-6R và gp130, có hai dạng thụ thể là màng (mIL-6R) và hòa tan (sIL-6R), tạo ra các hiệu ứng sinh học đa dạng như tín hiệu cổ điển và tín hiệu trans.

• Công nghệ biểu hiện protein tái tổ hợp trên Escherichia coli: E. coli BL21(DE3) được lựa chọn làm vật chủ do khả năng tăng trưởng nhanh, dễ nuôi cấy, và có hệ thống biểu hiện T7 promoter hiệu quả. Việc tối ưu hóa codon, sử dụng tag SUMO để tăng hòa tan và biểu hiện protein, cùng với các kỹ thuật tinh chế sắc ký ái lực Ni-Sepharose và sắc ký lọc gel, là nền tảng cho quy trình sản xuất IL-6 tái tổ hợp.

• Phương pháp định tính và định lượng protein: SDS-PAGE được sử dụng để phân tích kích thước và độ tinh khiết protein, phương pháp Bradford và ELISA được áp dụng để định lượng chính xác nồng độ IL-6 trong mẫu.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Gen IL-6 người được tối ưu hóa codon bằng phần mềm OptimumGeneTM, gắn tag His-SUMO để tăng hòa tan và thuận tiện cho tinh chế. Vector pET24a(+) chứa gen IL-6 được biến nạp vào chủng E. coli BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt.

• Phương pháp phân tích: Protein biểu hiện được khảo sát trong môi trường ZYP-5052, LB và TB ở các nhiệt độ 25 °C và 37 °C để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Protein hòa tan được thu nhận qua ly tâm và tán siêu âm, sau đó tinh chế bằng sắc ký ái lực Ni-Sepharose với nồng độ imidazol rửa giải 200 mM. Protein nguyên thể được thu nhận sau thủy phân bằng SUMO protease. Định tính protein bằng SDS-PAGE, định lượng bằng Bradford và ELISA.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian 2019-2021, bao gồm các bước thiết kế vector, biến nạp, khảo sát điều kiện nuôi cấy, tinh chế và đánh giá sản phẩm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thiết kế vector và tối ưu hóa codon: Gen IL-6 được tối ưu hóa với chỉ số Codon Adaptation Index (CAI) đạt 0,97, đảm bảo biểu hiện hiệu quả trên E. coli. Tần số codon tối ưu chiếm 87%, hàm lượng GC trong khoảng 30-70%, phù hợp cho biểu hiện gen.

2. Biểu hiện protein tái tổ hợp: Chủng E. coli BL21(DE3) mang vector pET-SUMO-IL-6 biểu hiện IL-6 tái tổ hợp trong môi trường ZYP-5052 ở 25 °C với năng suất biểu hiện khoảng 40% theo SDS-PAGE. So sánh với môi trường LB và TB, ZYP-5052 cho sinh khối và biểu hiện protein hòa tan cao hơn khoảng 20-30%.

3. Tinh chế và thu nhận protein: Tinh chế SUMO-IL-6 bằng sắc ký ái lực Ni-Sepharose với nồng độ imidazol rửa giải 200 mM đạt hiệu suất cao. Sau thủy phân bằng SUMO protease và tinh chế, thu được 3,924 mg IL-6 nguyên thể từ 50 mL dịch nuôi cấy, tương đương hiệu suất khoảng 18%.

4. Định lượng và đánh giá hoạt tính: Protein IL-6 tái tổ hợp được định lượng chính xác bằng phương pháp Bradford và ELISA, đảm bảo độ tinh khiết và hoạt tính sinh học phù hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.

Thảo luận kết quả

Việc tối ưu hóa codon và sử dụng tag His-SUMO đã góp phần tăng biểu hiện protein hòa tan, giảm thiểu thể vùi không tan thường gặp trong biểu hiện protein tái tổ hợp trên E. coli. Nhiệt độ nuôi cấy 25 °C giúp giảm stress tế bào, tăng khả năng gấp cuộn đúng cách của protein, từ đó nâng cao tỷ lệ hòa tan lên khoảng 40%, cao hơn so với các nghiên cứu trước đây chỉ đạt khoảng 2,6 mg/L.

Quy trình tinh chế sắc ký ái lực Ni-Sepharose với nồng độ imidazol 200 mM được tối ưu hóa giúp thu nhận protein có độ tinh khiết cao, đồng thời thủy phân bằng SUMO protease cho phép loại bỏ tag His-SUMO, thu được IL-6 nguyên thể với hiệu suất 18%, phù hợp cho ứng dụng nghiên cứu và thử nghiệm thuốc.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả này thể hiện sự tiến bộ trong việc tạo nguồn IL-6 tái tổ hợp tại Việt Nam, góp phần giảm chi phí và tăng khả năng tiếp cận nguồn protein chất lượng cao. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh năng suất biểu hiện ở các môi trường và nhiệt độ, bảng hiệu suất tinh chế và định lượng protein.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Mở rộng quy mô sản xuất IL-6 tái tổ hợp: Áp dụng quy trình biểu hiện và tinh chế đã tối ưu để sản xuất IL-6 ở quy mô lớn hơn, nhằm đáp ứng nhu cầu nghiên cứu và thử nghiệm thuốc trong nước. Thời gian thực hiện dự kiến 12-18 tháng, do các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học đảm nhiệm.

2. Nghiên cứu cải tiến hệ thống biểu hiện: Thử nghiệm các chủng E. coli biến đổi gen khác như BL21trxB hoặc Origami để tăng cường hình thành liên kết disulfid, nâng cao hoạt tính sinh học của IL-6. Thời gian nghiên cứu 6-12 tháng, do các nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học thực hiện.

3. Phát triển các phương pháp tinh chế hiệu quả hơn: Kết hợp sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký lọc gel để nâng cao độ tinh khiết và thu hồi protein, giảm chi phí sản xuất. Thời gian triển khai 6 tháng, do phòng thí nghiệm phân tích protein đảm nhiệm.

4. Ứng dụng IL-6 tái tổ hợp trong thử nghiệm thuốc: Cung cấp nguồn IL-6 chất lượng cao cho các nghiên cứu in vitro về các bệnh lý liên quan đến IL-6 như viêm khớp dạng thấp, ung thư và COVID-19, hỗ trợ phát triển thuốc nhắm mục tiêu IL-6. Thời gian ứng dụng liên tục, do các trung tâm nghiên cứu dược phẩm và y học thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và dược học: Có thể áp dụng quy trình biểu hiện và tinh chế IL-6 tái tổ hợp để phát triển các protein cytokine khác, nâng cao hiệu quả nghiên cứu và sản xuất protein tái tổ hợp.

2. Các phòng thí nghiệm phát triển thuốc: Sử dụng nguồn IL-6 tái tổ hợp chất lượng cao để thử nghiệm in vitro, đánh giá hiệu quả và cơ chế tác động của các thuốc nhắm mục tiêu IL-6 trong điều trị các bệnh viêm và ung thư.

3. Doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế: Tham khảo quy trình sản xuất IL-6 để phát triển các bộ kit chẩn đoán hoặc thuốc sinh học liên quan đến IL-6, giảm chi phí nhập khẩu và tăng tính chủ động trong sản xuất.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành dược học, công nghệ sinh học: Nắm bắt kiến thức về kỹ thuật biểu hiện protein tái tổ hợp, tinh chế và đánh giá protein, phục vụ cho các đề tài nghiên cứu và học tập chuyên sâu.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn Escherichia coli BL21(DE3) làm vật chủ biểu hiện IL-6?
   E. coli BL21(DE3) có tốc độ tăng trưởng nhanh, hệ thống biểu hiện T7 promoter hiệu quả, ít protease nội bào giúp tăng độ ổn định protein, phù hợp cho sản xuất protein tái tổ hợp với năng suất cao.

2. Lợi ích của việc gắn tag His-SUMO vào IL-6 là gì?
   Tag His-SUMO giúp tăng khả năng hòa tan của protein, dễ dàng tinh chế bằng sắc ký ái lực Ni-Sepharose và có thể được loại bỏ bằng SUMO protease để thu IL-6 nguyên thể, giữ hoạt tính sinh học.

3. Tại sao cần tối ưu hóa codon cho gen IL-6?
   Tối ưu hóa codon giúp phù hợp với tần suất sử dụng codon của E. coli, tăng hiệu quả phiên mã và dịch mã, giảm sai lệch acid amin, từ đó nâng cao năng suất biểu hiện protein.

4. Nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng thế nào đến biểu hiện IL-6?
   Nuôi cấy ở 25 °C giúp giảm stress tế bào, tăng khả năng gấp cuộn đúng cách của protein, giảm thể vùi không tan, nâng cao tỷ lệ protein hòa tan và hoạt tính sinh học.

5. Phương pháp định lượng IL-6 bằng ELISA có ưu điểm gì?
   ELISA có độ nhạy cao, đặc hiệu, cho phép định lượng chính xác IL-6 trong mẫu phức tạp mà không cần tinh sạch hoàn toàn, phù hợp cho đánh giá hoạt tính và nồng độ protein tái tổ hợp.

Kết luận

• Thiết kế vector pET-SUMO-IL-6 với gen IL-6 tối ưu hóa codon đạt CAI 0,97, phù hợp biểu hiện trên E. coli BL21(DE3).
• Biểu hiện IL-6 tái tổ hợp hòa tan đạt khoảng 40% trong môi trường ZYP-5052 ở 25 °C, vượt trội so với các điều kiện khác.
• Tinh chế bằng sắc ký ái lực Ni-Sepharose và thủy phân SUMO protease thu được 3,924 mg IL-6 nguyên thể từ 50 mL dịch nuôi cấy, hiệu suất 18%.
• Kết quả nghiên cứu góp phần tạo nguồn IL-6 tái tổ hợp chất lượng cao, phục vụ nghiên cứu và phát triển thuốc tại Việt Nam.
• Đề xuất mở rộng quy mô sản xuất, cải tiến hệ thống biểu hiện và ứng dụng IL-6 trong thử nghiệm thuốc để nâng cao hiệu quả nghiên cứu và điều trị.

Luận văn này là cơ sở quan trọng để phát triển các nghiên cứu tiếp theo về protein cytokine và ứng dụng trong y học, đồng thời kêu gọi các tổ chức nghiên cứu và doanh nghiệp hợp tác phát triển sản phẩm dựa trên IL-6 tái tổ hợp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Interleukin-6 người (IL-6) là một cytokin đa chức năng có tác động sinh học rộng, tham gia điều hòa nhiều quá trình bao gồm các đáp ứng viêm cấp tại gan, nhiễm trùng máu, viêm khớp dạng thấp… Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc điều trị hướng đích nhắm đến tác động trên IL-6 cho hiệu quả tốt hơn so với phương pháp thường quy. Gần đây, IL-6 cũng được chứng minh là một mục tiêu tiềm năng trong điều trị ung thư. Cytokin này giữ vai trò quan trọng trong chức năng sinh học của hệ thống miễn dịch, tủy xương và hệ thần kinh trung ương. Nồng độ IL-6 tăng cao trong bệnh lý tim mạch như xơ vữa động mạch.

Tất cả những phát hiện trên cho thấy IL-6 liên quan mật thiết đến phản ứng miễn dịch bảo vệ chống lại nhiều loại bệnh liên quan [1]. Mục tiêu sản xuất được protein tái tổ hợp IL-6 người có chức năng sinh học với số lượng lớn để phục vụ các nghiên cứu trên protein này là cần thiết, bởi vì chiết xuất từ các mô của con người khó khăn và sản lượng protein đạt được rất thấp [38]. Nhiều nghiên cứu tạo nguồn IL-6 tái tổ hợp trên Escherichia coli được thực hiện nhưng kết quả không như mong đợi. Đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào đưa ra được quy trình tạo nguồn IL-6 hoàn chỉnh, ổn định về năng suất, hoạt tính và giá trị kinh tế.

Bên cạnh đó, hướng thiết kế cấu trúc phân tử nhỏ ức chế hoạt tính IL-6 đang được quan tâm trong những năm gần đây. Điển hình như, nghiên cứu của nhóm tác giả Thái Khắc Minh, Trần Quế Hương, Lê Minh Trí đã tiến hành sàng lọc được các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng ức chế hoạt tính IL-6 trong điều trị viêm khớp dạng thấp. Tuy nhiên, khó khăn của nhóm nghiên cứu gặp phải trong thử nghiệm đánh giá in vitro là nguồn IL-6 có giá thành rất cao và không đủ cung ứng cho thử nghiệm. Tại Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có báo cáo nghiên cứu tạo nguồn IL-6 người được thực hiện.

Với mong muốn tự tạo nguồn IL-6 người tái tổ hợp sẵn có phục vụ cho công tác nghiên cứu và thử nghiệm thuốc, đề tài “Nghiên cứu tạo Interleukin 6 người tái tổ hợp trên Escherichia coli ” được tiến hành với những mục tiêu cụ thể như sau:. 2 - Thiết kế vector biểu hiện gen IL-6 người có gắn His-SUMO tag và sử dụng tối ưu hoá codon để biểu hiện trên E. coli mang vector biểu hiện IL-6 tái tổ hợp. - Khảo sát các điều kiện biểu hiện gen IL-6 để thu protein tái tổ hợp.

- Tinh chế protein IL-6 tái tổ hợp. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về Interleukin Interleukin (IL) là những cytokin phân tử nhỏ có hoạt tính cao và có chức năng khác nhau. Hầu hết IL tác động qua thụ thể cytokin và hoạt hoá lộ trình tín hiệu JAK/STAT [12]. Cytokin đóng một vai trò quan trọng, là chất trung gian giữa các tế bào, chỉ với một lượng picomol cytokin cũng có thể gây ra các biến đổi lớn trong chuyển hóa tế bào, bao gồm: • Monokin là cytokin được sản xuất bởi các tế bào thực bào đơn nhân • Lymphokin là cytokin được sản xuất bởi tế bào lympho được hoạt hóa, đặc biệt là các tế bào T-helper • Interleukin là cytokin có vai trò trung gian giữa các bạch cầu • Chemokin là một phân tử nhỏ chủ yếu chịu trách nhiệm cho việc di chuyển bạch cầu Không giống như hormon, cytokin không được lưu trữ như các protein biểu hiện khác, cytokin được sản xuất nhanh chóng trong phản ứng miễn dịch.

Cấu trúc cytokin ổn định nhờ cầu nối disulfid nội phân tử và glycosyl hoá tại vị trí N và/hoặc O. Các cytokin có thể truyền tín hiệu nội bào bằng cách gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào với ái lực cao [19]. Cytokin có thể tác động lên các tế bào tiết ra chúng (autocrine), các tế bào lân cận (paracrine) hoặc các tế bào ở xa thông qua việc lưu thông (nội tiết). Các loại tế bào khác nhau sẽ tiết ra cùng một cytokin hoặc một cytokin sẽ có tác động trên nhiều loại tế bào khác nhau [56].

Nhiều tác dụng của cytokin đã được nghiên cứu như tiêu diệt vi khuẩn và hình thành miễn dịch, thu hút thực bào trong giai đoạn sớm của nhiễm trùng (các chemokin điển hình là IL-8), điều hòa quá trình miễn dịch, tham gia vào sự tăng trưởng của các tế bào tạo máu (IL-1 đến IL-38 trừ IL-8), tác động lên sự tăng trưởng và phát triển tế bào gốc, phân chia các tế bào nội môi [11]. Hiện nay, cytokin đang được sử dụng trên lâm sàng như những chất sửa đổi đáp ứng sinh học để điều trị các rối loạn khác nhau. 4 Các liệu pháp dựa trên cytokin đem lại tiềm năng về phương pháp điều trị mới cho bệnh ung thư, bệnh tự miễn và nhiều loại bệnh truyền nhiễm [13].1 Cấu trúc Interleukin-6 Gen IL-6 ở người được tác giả Hirano và cộng sự báo cáo vào năm 1986. IL- 6 là một polypeptid chứa 184 acid amin, nằm trên nhiễm sắc thể 7p21, bao gồm 5 exon và 4 intron, khối lượng phân tử khoảng 21-28 kDa.

Cấu trúc tinh thể của IL-6 có bốn chuỗi xoắn chính tương tự như các cytokin khác trong cùng phân họ. Trong đó chuỗi xoắn A và B chạy song song cùng hướng, chuỗi xoắn C và D chạy song song theo hướng ngược lại. Liên kết các vòng xoắn trong sự sắp xếp này được thực hiện bằng một vòng dài nối các vòng xoắn A và B, một vòng ngắn giữa B và C, cuối cùng là một kết nối dài thứ hai giữa C và chuỗi xoắn D (Hình 1. Cấu trúc Interleukin-6 Nguồn: Somers W và cộng sự (1997) [48] 1.2 Tương tác giữa IL-6 và thụ thể, cơ chế truyền tín hiệu IL-6 truyền tín hiệu thông qua phức hợp thụ thể trên bề mặt tế bào, bao gồm thụ thể IL-6 (IL-6R) và thành phần truyền tín hiệu gp130 [3].

Thụ thể IL-6 (IL-6R) còn được gọi là CD126, IL-6R tồn tại ở hai dạng: dạng xuyên màng (mIL-6R) và dạng hòa tan (sIL-6R). Dạng sIL-6R được tạo ra từ mIL-6R bằng cách phân cắt mIL- 6R bởi ADAM 10/17 hoặc thông qua nối mRNA IL-6R thay thế. IL-6 truyền tín hiệu qua trung gian bằng cách tạo một phức hợp giữa IL-6, mIL-6R hoặc sIL-6R và phân tử truyền tín hiệu gp130. Do đó, tín hiệu IL-6 có thể được truyền theo ba cách, trong đó IL-6 liên kết với mIL-6R (classic signaling), với sIL-6R (trans-signaling), hoặc được kết hợp thông qua IL-6R đến gp130 trên các tế bào gần đó (trans-presentation).

Thực tế là gp130 được dẫn truyền ở khắp mọi nơi, dẫn đến các chức năng đa hướng của IL-6 (Hình 1. Các con đường tín hiệu khác nhau được kích thích bởi IL-6 Nguồn: Uciechowski P và cộng sự (2020) [53] Tín hiệu cổ điển và tín hiệu trans, IL-6 đều liên kết với IL-6R sau đó tạo phức hợp với gp130. Tuy nhiên tín hiệu cổ điển chỉ xảy ra ở những tế bào biểu hiện mIL- 6R đáp ứng với IL-6 như tế bào gan, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân và tế bào T. Phức hợp IL-6/mIL-6R liên kết với gp130 dẫn đến sự đồng phân hóa gp130.

Tín hiệu trans diễn ra rộng hơn do thụ thể sIL-6 liên kết với IL-6 tạo phức hợp IL- 6/sIL-6R sau đó liên kết và kích hoạt gp130 cả trên tế bào không mang mIL-6R làm mở rộng các tế bào đích của IL-6 [53]. Tùy thuộc vào dạng IL-6R, hai con đường tín. 6 hiệu này sẽ tạo ra các hiệu ứng sinh học khác nhau. Tín hiệu cổ điển thúc đẩy các phản ứng chống viêm trong khi tín hiệu trans dẫn đến các phản ứng tiền viêm [25].

Trình diện trans được phát hiện gần đây trong thí nghiệm mô hình chuột cho bệnh đa xơ cứng ở người. Sau khi tương tác đặc hiệu với kháng nguyên của các tế bào tua (DC), IL-6 có vẻ đã liên kết nội bào với IL-6R trong DC và được vận chuyển đến màng sinh chất. Phức hợp IL-6/mIL-6R liên kết màng trên DC sau đó tương tác với gp130 trên tế bào T dẫn đến các tế bào Th17 kết hợp với yếu tố tăng trưởng biến đổi β2 (TGF-β2) tạo ra tế bào Th17 gây viêm (mạn tính) và ức chế tế bào Treg bởi IL- 27 [53].3 Vai trò của IL-6 và các bệnh lí liên quan Interleukin 6 được sản xuất bởi đại thực bào, tế bào B, tế bào T, bạch cầu mono và nhiều loại tế bào khác, là một cytokine đa chức năng có tác động sinh học trên nhiều loại tế bào đích khác nhau và đặc biệt gây ảnh hưởng trên hệ miễn dịch, sự tạo máu, phản ứng viêm và bệnh lý ung thư (Hình 1. IL6 và các bệnh lý liên quan Nguồn: Mauer J và cộng sự (2015) [33].

7 Việc sản xuất quá mức IL-6 và rối loạn điều hòa các con đường tín hiệu IL-6 có thể dẫn đến các bệnh lí liên quan. Covid 19 Các nghiên cứu cho thấy nồng độ IL-6 trong huyết thanh tăng lên đáng kể ở những bệnh nhân bị COVID-19 nặng. IL-6 kết hợp với IL-6Rα và gp130 để kích hoạt chuỗi tín hiệu xuôi dòng JAK/STAT3 [8], [53], [58]. Kết quả của quá trình này có thể dẫn đến vô số hiệu ứng sinh học: tác động lên nhiều tế bào mục tiêu khác nhau như tế bào T, tế bào B, tế bào nội mô mạch máu, bạch cầu đơn nhân và tế bào gan gây kích thích quá trình viêm [9], tăng tiểu cầu do sự biệt hóa megakaryocytes thành tiểu cầu, bất thường về quá trình đông máu do tăng sản xuất thrombin từ prothrombin [22], kích thích tế bào nội mô mạch máu sản xuất VEGF, điều hòa sự biểu hiện của thụ thể C5a trên tế bào nội mô mạch máu để tăng tính thấm thành mạch, dẫn đến hạ huyết áp, giảm oxy máu và phù ngoại vi [52].

Bệnh lí viêm Khi có sự tấn công của vi sinh vật lạ, quá trình viêm cấp tính diễn ra trong cơ thể đặc trưng như sốt, tăng bạch cầu hay những thay đổi trong việc sản xuất các loại protein [15]. IL-6 được xem là một trong các tín hiệu tiền viêm chính, nồng độ tăng rõ rệt và tương quan với mức độ nghiêm trọng cũng như tỷ lệ tử vong trong các bệnh nhiễm trùng nặng (nhiễm trùng huyết) [37]. Đồng thời, nồng độ IL-6 huyết thanh cũng tăng cao trong các bệnh lý viêm mạn tính.