Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nghiên cứu gen mã hóa protiease hiv mang đột biến kháng thuốc, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp khả thi cho thực tiễn.

• Tác giả: Nguyễn Văn Dũng
• Người hướng dẫn: PGS. Phan Tuấn Nghĩa
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về HIV
• 1.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS
• 1.3. Phương pháp điều trị HIV/AIDS
• 1.4. Protease của HIV-1 (gọi tắt là protease HIV-1)
• 1.5. Gen mã hóa protease HIV-1
• 1.6. Cấu trúc của protease HIV-1
• 1.7. Chức năng của protease HIV-1
• 1.8. Tạo protease HIV-1 tái tổ hợp
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mẫu huyết thanh
• 2.2. Các hệ vector và chủng vi sinh vật
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Tách chiết RNA hệ gen HIV-1 và tổng hợp cDNA
• 2.5. Tổng hợp cDNA từ RNA virus
• 2.6. Tách chiết và định lượng DNA
• 2.7. Điện di DNA trên gel agarose
• 2.8. Nhân bản các đoạn gen bằng kỹ thuật PCR
• 2.9. Nhân dòng đoạn gen mã hóa protease HIV-1
• 2.10. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng phương pháp Sanger
• 2.11. Biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 ở E. coli
• 2.12. Tinh sạch protease HIV-1 bằng cột sắc ký ái lực His-bind (Novagen)
• 2.13. Điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS-PAGE) theo phương pháp của Laemmli
• 2.14. Nhận dạng protease HIV-1 bằng thẩm tách miễn dịch (Western blotting)
• 2.15. Phân tính hoạt độ của protease HIV-1 theo phương pháp của Richard và tập thể
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1
• 3.2. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1
• 3.3. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1 (Đột biến N83T)
• 3.4. Thiết kế hệ thống biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T trong vector pET32a
• 3.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy và biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α
• 3.6. Cảm ứng biểu hiện protease HIV-1 mang đột biến N83T trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) RIL
• 3.7. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực His-bind
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu đột biến kháng thuốc HIV

Nghiên cứu về đột biến kháng thuốc HIV trong gen mã hóa protease HIV là một lĩnh vực quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh nhân nhiễm HIV. Virus HIV, đặc biệt là HIV-1, có khả năng biến đổi gen rất nhanh chóng, dẫn đến sự xuất hiện của các đột biến kháng thuốc. Điều này gây khó khăn trong việc điều trị và quản lý bệnh. Việc hiểu rõ về cơ chế và loại hình đột biến này sẽ giúp các nhà khoa học phát triển các liệu pháp điều trị mới và hiệu quả hơn.

1.1. Định nghĩa và vai trò của protease HIV

Protease HIV là một enzyme quan trọng trong chu trình sống của virus, có chức năng cắt các polyprotein thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho sự phát triển của virus. Việc ức chế hoạt động của protease có thể ngăn chặn sự nhân lên của virus, do đó, đây là một mục tiêu chính trong nghiên cứu thuốc điều trị HIV.

1.2. Tình hình nhiễm HIV và kháng thuốc tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tình hình nhiễm HIV vẫn còn phức tạp với hàng trăm ngàn người sống chung với virus. Các nghiên cứu cho thấy có sự xuất hiện của nhiều đột biến kháng thuốc trong gen mã hóa protease HIV, điều này đòi hỏi cần có các biện pháp điều trị phù hợp và hiệu quả hơn.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu đột biến kháng thuốc HIV

Một trong những thách thức lớn nhất trong nghiên cứu đột biến kháng thuốc HIV là sự biến đổi nhanh chóng của virus. Các đột biến này không chỉ làm giảm hiệu quả của các loại thuốc hiện có mà còn tạo ra những chủng virus mới có khả năng kháng thuốc. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết cho việc phát triển các phương pháp xét nghiệm và điều trị mới.

2.1. Tình trạng kháng thuốc và nguyên nhân

Kháng thuốc HIV thường xảy ra do sự sao chép sai lệch của virus trong quá trình nhân bản. Tốc độ đột biến cao của virus HIV-1 dẫn đến sự xuất hiện của các chủng kháng thuốc, làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn.

2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển đột biến

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của đột biến kháng thuốc, bao gồm sự sử dụng thuốc không đúng cách, sự thay đổi trong phác đồ điều trị và sự tương tác giữa các loại thuốc. Việc hiểu rõ các yếu tố này là rất quan trọng để phát triển các chiến lược điều trị hiệu quả.

III. Phương pháp nghiên cứu đột biến kháng thuốc trong gen mã hóa protease HIV

Nghiên cứu về đột biến kháng thuốc HIV thường sử dụng các phương pháp phân tích gen hiện đại để xác định các đột biến trong gen mã hóa protease HIV. Các phương pháp này bao gồm giải trình tự gen, PCR và các kỹ thuật sinh học phân tử khác. Việc áp dụng các công nghệ này giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các đột biến kháng thuốc.

3.1. Kỹ thuật giải trình tự gen

Giải trình tự gen là một trong những phương pháp chính để xác định các đột biến trong gen mã hóa protease HIV. Kỹ thuật này cho phép các nhà nghiên cứu xác định chính xác trình tự nucleotide và phát hiện các đột biến kháng thuốc.

3.2. Phân tích hoạt tính protease HIV

Phân tích hoạt tính của protease HIV là một bước quan trọng trong việc đánh giá ảnh hưởng của các đột biến đến chức năng của enzyme. Các phương pháp như SDS-PAGE và Western blotting thường được sử dụng để xác định hoạt tính của protease và sự hiện diện của các đột biến.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả từ các nghiên cứu về đột biến kháng thuốc HIV đã chỉ ra rằng có nhiều đột biến khác nhau trong gen mã hóa protease HIV, ảnh hưởng đến hiệu quả của các loại thuốc điều trị. Những phát hiện này không chỉ giúp cải thiện phác đồ điều trị mà còn cung cấp thông tin quý giá cho các nghiên cứu tiếp theo.

4.1. Phát hiện các đột biến kháng thuốc

Nghiên cứu đã phát hiện nhiều đột biến kháng thuốc trong gen mã hóa protease HIV, trong đó có các đột biến N83T và M36I. Những đột biến này có thể làm giảm hiệu quả của các thuốc ức chế protease, từ đó ảnh hưởng đến kết quả điều trị.

4.2. Ứng dụng trong điều trị HIV AIDS

Các kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng để phát triển các phác đồ điều trị mới, giúp tăng cường hiệu quả điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV. Việc phát hiện sớm các đột biến kháng thuốc sẽ giúp các bác sĩ điều chỉnh phác đồ điều trị kịp thời.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu đột biến kháng thuốc HIV

Nghiên cứu về đột biến kháng thuốc HIV trong gen mã hóa protease HIV là một lĩnh vực quan trọng và cần thiết trong cuộc chiến chống lại HIV/AIDS. Những phát hiện từ các nghiên cứu hiện tại sẽ mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn trong tương lai.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát hiện và phân tích các đột biến mới, cũng như phát triển các phương pháp điều trị mới nhằm đối phó với tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng.

5.2. Hướng đi mới trong điều trị HIV AIDS

Việc phát triển các loại thuốc mới và phác đồ điều trị kết hợp sẽ là chìa khóa để cải thiện hiệu quả điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV. Các nghiên cứu trong tương lai cần tiếp tục khai thác tiềm năng của các công nghệ sinh học mới để tìm ra các giải pháp điều trị hiệu quả hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Virus suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency virus - HIV) là nguyên nhân chính gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immunodeficiency Syndrome - AIDS) và là một trong những virus gây bệnh nguy hiểm nhất hiện nay. Theo các tài liệu đã công bố, có ít nhất hai type HIV gây nên AIDS đó là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), nhưng HIV-1 là nguyên nhân chính gây ra AIDS trên toàn thế giới. Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới, tính đến cuối năm 2009 có khoảng 33,3 triệu người đang sống chung với HIV/AIDS, khoảng 1,8 triệu người đã chết vì AIDS và có thêm 2,6 triệu trường hợp mới bị nhiễm virus này. Ở Việt Nam, theo báo cáo Cục phòng chống HIV/AIDS - Bộ Y tế tính đến 31/3/2011, toàn quốc đã phát hiện người nhiễm HIV tại hơn 75,2% xã/phường, gần 97,9% quận/huyện và 63/63 tỉnh/thành phố.

Tổng số trường hợp nhiễm HIV là 235.535 người, số bệnh nhân AIDS là 94.613 người, số trường hợp tử vong đến cuối kỳ báo cáo là 49. Trong chu trình sống của HIV-1, protease là enzyme không thể thiếu. Enzyme này cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định để tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Vì thế protease được xem là một trong các đích tác động quan trọng nhất cho liệu pháp tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS.

Tuy nhiên, do HIV sao chép nhanh, enzyme phiên mã ngược có tỷ lệ sai sót cao tạo ra sự biến đổi liên tục trong cấu trúc hệ gen của các nhóm HIV dẫn đến tình trạng kháng thuốc. Mặc dù ngày càng nhiều chất ức chế protease chống HIV được sản xuất và thương mại hóa nhưng việc tìm các chất ức chế mới của protease vẫn luôn được quan tâm. Bên cạnh đó, các đột biến kháng PI tương đối đặc hiệu cho từng loại thuốc riêng biệt, do đó thay thế một loại thuốc khác trước khi có sự tích lũy đột biến thì các phác đồ sau vẫn thành công (Hoffmann và tập thể, 2007). Vì vậy, xét nghiệm kháng thuốc thường theo hướng phát hiện đột biến trong gen mã hóa protease HIV có vai trò rất quan trọng trong việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/AIDS.

Lớp Cao học K18 1 Khóa 2009-2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng Ở Việt Nam, gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc là vấn đề còn ít được nghiên cứu. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ở người Việt Nam và tìm ra một số đột biến liên quan kháng thuốc. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào về biểu hiện gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc phân lập từ các bệnh nhân người Việt Nam. Đề tài nghiên cứu của chúng tôi được đặt ra là nhằm phát hiện một số đột biến kháng thuốc trong gen mã hóa của protease của HIV, đồng thời bước đầu biểu hiện gen này trong vi khuẩn E.

coli để làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. Các nghiên cứu của luận văn được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Lớp Cao học K18 2 Khóa 2009-2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về HIV 1.

HIV/AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải được gọi tắt là AIDS, do virus HIV gây ra sự suy giảm miễn dịch ở người được phát hiện ở Mỹ năm 1981, đến nay đã trở thành “căn bệnh thế kỷ” trên toàn thế giới. Về phân loại, HIV là các Retrovirus có bộ máy di truyền thuộc họ Retroviridae với hai type chính là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), trong đó HIV-1 gây ra 98% sự lan truyền còn HIV-2 chỉ chiếm ưu thế ở vùng tây châu Phi, ít lan truyền trên thế giới [1, 15]. Vì vậy, HIV-1 được xem như là nguyên nhân chính gây nên AIDS. HIV-1 được chia thành 3 nhóm là M (main), O (outlier), nhóm N (new) trong đó hơn 90% sự lây nhiễm của HIV thuộc nhóm M.

Trong nhóm M gồm các phân nhóm A, B, C, D, F, G, H, J, K và nhiều dạng tái tổ hợp khác (circulating recombinant form-CRF). Các phân nhóm khác nhau chủ yếu ở cấu trúc của các protein vỏ và đặc trưng cho sự truyền nhiễm theo khu vực địa lý. Đây là một đặc điểm đáng lưu ý trong các nghiên cứu để tìm ra thuốc điều trị cho các bệnh nhân HIV/AIDS theo từng khu vực [14]. Về cấu trúc, HIV có dạng hình cầu với kích thước khoảng 120 nm, được mô tả ở hình 1.

Lớp vỏ ngoài cùng của virus HIV bao gồm một lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào chủ, trên lớp vỏ này có chứa khoảng 72 bản sao protein env của virus, mỗi protein env lại chứa một mũ được tạo thành từ 3 phân tử gp120 còn thân được tạo thành từ 3 phân tử gp41 có chức năng neo giữ lõi virus với vỏ bao ngoài. Lõi virus có dạng như hạt đậu tạo thành từ 2.000 bản sao của protein p24. Trong lõi bao gồm hệ gen của HIV là hai sợi RNA (+) đơn, mỗi sợi có kích thước khoảng 10 kb gồm 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau. Cuối mỗi chuỗi RNA là các trình tự được gọi là trình tự lặp lại tận cùng dài (LTRs) đóng vai trò trong việc kiểm soát sự nhân lên cũng như điều hòa quá trình tổng hợp protein của virus.

Giống như các retrovirus khác, HIV có 3 gen chính gag, pol và env mã hóa cho các protein tham Lớp Cao học K18 3 Khóa 2009-2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng gia vào quá trình sao chép và trưởng thành của virus. Sản phẩm ban đầu của gen gag là một protein 56 kDa, sau đó được chế biến thành ít nhất 3 sản phẩm p17, p24 và p15 là các protein cấu trúc của virus. Gen pol mã hóa cho các enzyme reverse transcriptase (RT), intergrase và protease trong đó enzyme RT có chức năng phiên mã ngược RNA của virus thành cDNA; enzyme intergrase chèn cDNA vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ còn protease tham gia vào quá trình cắt các phân tử protein tiền thân dưới dạng polypeptide thành các protein cấu trúc và chức năng cần cho sự hình thành của thể virus. Gen env mã hóa cho các glycoprotein capsid của virus; sản phẩm của gen env (gp160) được cắt bởi protease của tế bào chủ thành gp120 và gp41 sau đó lắp ráp lại thành cấu trúc tam phân trong lớp vỏ virus.

Ngoài 3 gen chính, HIV còn có 6 gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr và vpu) chứa thông tin mã hóa cho các protein có khả năng kiểm soát sự tái bản, các cách lây nhiễm khác nhau hoặc nguy cơ nhiễm các loại bệnh khác nhau [5, 17, 22]. Hình 1: Cấu tạo của HIV [40] HIV truyền nhiễm theo 4 con đường, bao gồm con đường tiêm truyền do dùng chung kim tiêm, lây nhiễm do truyền máu và các sản phẩm của máu, từ mẹ bị nhiễm bệnh sang thai nhi và qua quan hệ tình dục không an toàn [1, 15]. Quá trình tiến triển của bệnh được chia thành 3 thời kì. Sự lây nhiễm HIV ban đầu gọi là quá trình nhiễm sơ cấp, thường kéo dài từ 3-6 tuần, sau đó virus đi khắp cơ thể, nhân bản mạnh trong khi không có bất cứ đáp ứng miễn dịch thích hợp Lớp Cao học K18 4 Khóa 2009-2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng nào được phát hiện [1, 7, 15].

Người bệnh sốt nhẹ, có triệu chứng như cảm cúm, hạch lympho sưng to, cũng có khi không thấy triệu chứng gì. Tiếp theo là giai đoạn tiềm ẩn kéo dài từ 1 đến 12 năm (tùy theo từng người nhiễm). Trong giai đoạn này, quá trình sao chép của virus giảm và số lượng tế bào lympho T CD4+ tăng lên, virus HIV có thể được phát hiện bằng PCR hoặc RT-PCR trong các lympho của máu và trong các mô bạch huyết [1]. Khoảng vài năm sau, mật độ các virus trong máu tăng nhanh và giữ ở mức đó cho tới lúc chết, các kháng thể kháng virus giảm dần.

Giai đoạn này gọi là giai đoạn toàn phát hay giai đoạn cuối. Lúc này hội chứng lâm sàng của bệnh suy giảm miễn dịch xuất hiện, các vi sinh vật cơ hội có điều kiện tấn công, người bệnh chết dần [7, 16, 28]. Chính những đặc trưng phân tử trong cách tấn công hệ thống miễn dịch của HIV mà AIDS trở thành một trong những bệnh nguy hiểm nhất trong lịch sử loài người. Tình hình nhiễm HIV/AIDS Đại dịch HIV/AIDS đã và đang là một thách thức to lớn đối với tiến trình phát triển xã hội.

Sau gần 3 thập kỷ phát hiện, bắt đầu ở các nước phát triển, HIV/ AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt phát triển ở khu vực châu Phi và các nước châu Á. Đến nay vẫn chưa có vaccine phòng ngừa HIV và thuốc chữa trị đặc hiệu. Theo thông báo của Tổ chức y tế thế giới (WHO) và Chương trình phối hợp phòng chống AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS) đến cuối năm 2009 ước tính khoảng 33,3 triệu người đang mang căn bệnh HIV/AIDS, trong đó số đối tượng mới là 2,6 triệu người và có khoảng 1,8 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS. Tại khu vực châu Á, có khoảng 4,87 triệu người đang sống cùng với HIV/AIDS ở các khu vực Đông Nam và Nam Á; tình hình phát triển của bệnh này ngày càng tăng với những diễn biến phức tạp.

Theo dự đoán, khu vực này sẽ trở thành trung tâm của đại dịch HIV/AIDS trong vài thập kỉ tới [37]. Ở Việt Nam, theo UNAIDS [36], tính đến ngày 30/9/2010 trên cả nước có 180.631 trường hợp nhiễm HIV/AIDS, trong đó có 42.339 bệnh nhân AIDS và tổng số người chết vì AIDS được báo cáo là 48. Cho đến nay, đã có trên 74% xã, Lớp Cao học K18 5 Khóa 2009-2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng phường và 97,8% quận, huyện trên toàn quốc báo cáo có người nhiễm HIV/AIDS. Thành phố Hồ Chí Minh vẫn là địa phương có tỷ lệ bệnh nhân HIV/AIDS cao nhất với 23% tổng số bệnh nhân trong cả nước.

Phân tích hình thái lây nhiễm cho thấy, trong số những người mới được phát hiện nhiễm HIV trong 3 quí đầu năm 2010 có 49% bị nhiễm qua đường máu, 38% qua đường tình dục, 3% qua đường mẹ - con và 10% không rõ đường lây. Tỷ lệ nam giới nhiễm HIV chiếm 70,8% và nữ giới chiếm 29,2%.