Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nghiên cứu gen mã hóa protiease hiv mang đột biến kháng thuốc, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp khả thi cho thực tiễn.

• Tác giả: Nguyễn Văn Dũng
• Người hướng dẫn: PGS. Phan Tuấn Nghĩa
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về HIV
• 1.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS
• 1.3. Phương pháp điều trị HIV/AIDS
• 1.4. Protease của HIV-1 (gọi tắt là protease HIV-1)
• 1.5. Gen mã hóa protease HIV-1
• 1.6. Cấu trúc của protease HIV-1
• 1.7. Chức năng của protease HIV-1
• 1.8. Tạo protease HIV-1 tái tổ hợp
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mẫu huyết thanh
• 2.2. Các hệ vector và chủng vi sinh vật
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Tách chiết RNA hệ gen HIV-1 và tổng hợp cDNA
• 2.5. Tổng hợp cDNA từ RNA virus
• 2.6. Tách chiết và định lượng DNA
• 2.7. Điện di DNA trên gel agarose
• 2.8. Nhân bản các đoạn gen bằng kỹ thuật PCR
• 2.9. Nhân dòng đoạn gen mã hóa protease HIV-1
• 2.10. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng phương pháp Sanger
• 2.11. Biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 ở E. coli
• 2.12. Tinh sạch protease HIV-1 bằng cột sắc ký ái lực His-bind (Novagen)
• 2.13. Điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS-PAGE) theo phương pháp của Laemmli
• 2.14. Nhận dạng protease HIV-1 bằng thẩm tách miễn dịch (Western blotting)
• 2.15. Phân tính hoạt độ của protease HIV-1 theo phương pháp của Richard và tập thể
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1
• 3.2. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1
• 3.3. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1 (Đột biến N83T)
• 3.4. Thiết kế hệ thống biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T trong vector pET32a
• 3.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy và biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α
• 3.6. Cảm ứng biểu hiện protease HIV-1 mang đột biến N83T trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) RIL
• 3.7. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực His-bind
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu đột biến kháng thuốc HIV

Nghiên cứu về đột biến kháng thuốc HIV trong gen mã hóa protease HIV là một lĩnh vực quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh nhân nhiễm HIV. Virus HIV, đặc biệt là HIV-1, có khả năng biến đổi gen rất nhanh chóng, dẫn đến sự xuất hiện của các đột biến kháng thuốc. Điều này gây khó khăn trong việc điều trị và quản lý bệnh. Việc hiểu rõ về cơ chế và loại hình đột biến này sẽ giúp các nhà khoa học phát triển các liệu pháp điều trị mới và hiệu quả hơn.

1.1. Định nghĩa và vai trò của protease HIV

Protease HIV là một enzyme quan trọng trong chu trình sống của virus, có chức năng cắt các polyprotein thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho sự phát triển của virus. Việc ức chế hoạt động của protease có thể ngăn chặn sự nhân lên của virus, do đó, đây là một mục tiêu chính trong nghiên cứu thuốc điều trị HIV.

1.2. Tình hình nhiễm HIV và kháng thuốc tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tình hình nhiễm HIV vẫn còn phức tạp với hàng trăm ngàn người sống chung với virus. Các nghiên cứu cho thấy có sự xuất hiện của nhiều đột biến kháng thuốc trong gen mã hóa protease HIV, điều này đòi hỏi cần có các biện pháp điều trị phù hợp và hiệu quả hơn.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu đột biến kháng thuốc HIV

Một trong những thách thức lớn nhất trong nghiên cứu đột biến kháng thuốc HIV là sự biến đổi nhanh chóng của virus. Các đột biến này không chỉ làm giảm hiệu quả của các loại thuốc hiện có mà còn tạo ra những chủng virus mới có khả năng kháng thuốc. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết cho việc phát triển các phương pháp xét nghiệm và điều trị mới.

2.1. Tình trạng kháng thuốc và nguyên nhân

Kháng thuốc HIV thường xảy ra do sự sao chép sai lệch của virus trong quá trình nhân bản. Tốc độ đột biến cao của virus HIV-1 dẫn đến sự xuất hiện của các chủng kháng thuốc, làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn.

2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển đột biến

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của đột biến kháng thuốc, bao gồm sự sử dụng thuốc không đúng cách, sự thay đổi trong phác đồ điều trị và sự tương tác giữa các loại thuốc. Việc hiểu rõ các yếu tố này là rất quan trọng để phát triển các chiến lược điều trị hiệu quả.

III. Phương pháp nghiên cứu đột biến kháng thuốc trong gen mã hóa protease HIV

Nghiên cứu về đột biến kháng thuốc HIV thường sử dụng các phương pháp phân tích gen hiện đại để xác định các đột biến trong gen mã hóa protease HIV. Các phương pháp này bao gồm giải trình tự gen, PCR và các kỹ thuật sinh học phân tử khác. Việc áp dụng các công nghệ này giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các đột biến kháng thuốc.

3.1. Kỹ thuật giải trình tự gen

Giải trình tự gen là một trong những phương pháp chính để xác định các đột biến trong gen mã hóa protease HIV. Kỹ thuật này cho phép các nhà nghiên cứu xác định chính xác trình tự nucleotide và phát hiện các đột biến kháng thuốc.

3.2. Phân tích hoạt tính protease HIV

Phân tích hoạt tính của protease HIV là một bước quan trọng trong việc đánh giá ảnh hưởng của các đột biến đến chức năng của enzyme. Các phương pháp như SDS-PAGE và Western blotting thường được sử dụng để xác định hoạt tính của protease và sự hiện diện của các đột biến.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả từ các nghiên cứu về đột biến kháng thuốc HIV đã chỉ ra rằng có nhiều đột biến khác nhau trong gen mã hóa protease HIV, ảnh hưởng đến hiệu quả của các loại thuốc điều trị. Những phát hiện này không chỉ giúp cải thiện phác đồ điều trị mà còn cung cấp thông tin quý giá cho các nghiên cứu tiếp theo.

4.1. Phát hiện các đột biến kháng thuốc

Nghiên cứu đã phát hiện nhiều đột biến kháng thuốc trong gen mã hóa protease HIV, trong đó có các đột biến N83T và M36I. Những đột biến này có thể làm giảm hiệu quả của các thuốc ức chế protease, từ đó ảnh hưởng đến kết quả điều trị.

4.2. Ứng dụng trong điều trị HIV AIDS

Các kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng để phát triển các phác đồ điều trị mới, giúp tăng cường hiệu quả điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV. Việc phát hiện sớm các đột biến kháng thuốc sẽ giúp các bác sĩ điều chỉnh phác đồ điều trị kịp thời.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu đột biến kháng thuốc HIV

Nghiên cứu về đột biến kháng thuốc HIV trong gen mã hóa protease HIV là một lĩnh vực quan trọng và cần thiết trong cuộc chiến chống lại HIV/AIDS. Những phát hiện từ các nghiên cứu hiện tại sẽ mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn trong tương lai.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát hiện và phân tích các đột biến mới, cũng như phát triển các phương pháp điều trị mới nhằm đối phó với tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng.

5.2. Hướng đi mới trong điều trị HIV AIDS

Việc phát triển các loại thuốc mới và phác đồ điều trị kết hợp sẽ là chìa khóa để cải thiện hiệu quả điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV. Các nghiên cứu trong tương lai cần tiếp tục khai thác tiềm năng của các công nghệ sinh học mới để tìm ra các giải pháp điều trị hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Đại dịch HIV/AIDS tiếp tục là thách thức y tế công cộng nghiêm trọng trên toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, tính đến cuối năm 2009, thế giới ghi nhận khoảng 33,3 triệu người sống chung với HIV/AIDS, 1,8 triệu ca tử vong và 2,6 triệu trường hợp nhiễm mới. Tại Việt Nam, theo báo cáo của Cục Phòng chống HIV/AIDS thuộc Bộ Y tế tính đến ngày 31/3/2011, dịch bệnh đã lan rộng đến 63/63 tỉnh thành, chiếm 97,9% số quận huyện và 75,2% số xã phường, với tổng số 235.535 người nhiễm HIV và 49.000 ca tử vong tích lũy.

Enzyme protease của virus HIV-1 đóng vai trò then chốt trong chu trình sao chép, chịu trách nhiệm cắt các chuỗi polyprotein gag và gag-pol để hình thành nên các hạt virus hoàn chỉnh có khả năng xâm nhiễm. Do đó, protease là đích tác động chủ lực của nhóm thuốc ức chế protease (PI). Tuy nhiên, tốc độ nhân bản cực nhanh với khoảng 10 triệu hạt virus mới mỗi ngày, kết hợp cùng tỷ lệ sai sót lên tới 1/10.000 base của enzyme phiên mã ngược, đã thúc đẩy sự xuất hiện liên tục của các đột biến kháng thuốc.

Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội trong giai đoạn 2009-2011. Đề tài tập trung giải quyết vấn đề cấp bách: phát hiện các đột biến kháng thuốc trên gen mã hóa protease HIV-1 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam và thiết kế hệ thống biểu hiện enzyme tái tổ hợp mang đột biến trong vi khuẩn Escherichia coli. Kết quả nghiên cứu đã cung cấp trình tự gen chuẩn mã số HQ890881 trên Ngân hàng Gen quốc tế với độ tương đồng 96% so với phân nhóm CRF01_AE, tạo nền tảng phân tử quan trọng cho việc theo dõi điều trị và nghiên cứu phát triển thuốc kháng virus thế hệ mới.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng hệ thống lý thuyết sinh học phân tử retrovirus và cơ chế kháng thuốc của các chất ức chế protease. Cấu trúc protease HIV-1 là một homodimer đối xứng gồm 2 tiểu phần giống hệt nhau, mỗi tiểu phần có 99 gốc amino acid với khối lượng phân tử khoảng 11 kDa. Trung tâm xúc tác hoạt động chứa bộ ba amino acid bảo thủ nghiêm ngặt Asp25-Thr26-Gly27, được bảo vệ bởi hai miền mũ linh hoạt từ vị trí amino acid 44 đến 63. Khi enzyme bị ức chế hoặc đột biến làm mất hoạt tính, virus tạo thành sẽ mất khả năng lây nhiễm vào tế bào đích.

Lý thuyết về sự đề kháng thuốc PI phân định rõ hai nhóm đột biến: đột biến tiên phát làm biến đổi trực tiếp cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động và đột biến thứ phát giúp bù trừ khả năng sao chép của virus. Hơn 98% chủng HIV-1 lưu hành tại Việt Nam thuộc phân nhóm CRF01_AE, sở hữu tính đa hình tự nhiên tại nhiều vị trí amino acid. Nghiên cứu tập trung vào 3 khái niệm cốt lõi: đa hình di truyền phân nhóm, cơ chế tự phân cắt của chuỗi polypeptide dung hợp và công nghệ biểu hiện protein dị nguồn gắn protein hỗ trợ hòa tan thioredoxin.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu ban đầu bao gồm 50 mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm HIV-1 được tiếp nhận từ Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm ưu tiên các bệnh nhân đang điều trị phác đồ kháng virus có nguy cơ thất bại điều trị. Đoạn gen protease kích thước 0,34 kb được nhân bản thành công từ 8 mẫu dương tính, trong đó mẫu ký hiệu 02VN.HN27510 từ bệnh nhân thất bại điều trị thuốc PI được lựa chọn để phân tích chi tiết.

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích bắt nguồn từ yêu cầu xác định chính xác cấu trúc gen và kiểm soát độc tính protein:

• Tách chiết RNA virus bằng kit QIAamp UltraSens và tổng hợp cDNA bằng enzyme M-MLV reverse transcriptase trong 90 phút ở 37°C.
• Kỹ thuật PCR lồng với cặp mồi chuyên biệt HIV-Fw1 và HIV-Rv3, tích hợp trình tự tự cắt đặc hiệu gồm 7 amino acid Gly-Thr-Val-Ser-Phe-Asn-Phe và đoạn mã hóa epitope kháng nguyên hemagglutinin gồm 9 amino acid YPYDVPDYA.
• Giải trình tự chuỗi theo phương pháp Sanger trên máy CEQ-8000 của hãng Beckman Coulter, đối sánh đột biến qua cơ sở dữ liệu HIV của Đại học Stanford.
• Hệ vector biểu hiện pET32a được lựa chọn vì mang promoter T7 cực mạnh kết hợp đoạn dung hợp thioredoxin giúp tăng độ tan và đuôi 6xHis hỗ trợ tinh sạch qua sắc ký ái lực kim loại Ni2+.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã xác định trọn vẹn trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 dài 297 base pair từ mẫu bệnh nhân 02VN.HN27510. Trình tự này được đăng ký chính thức trên GenBank với mã số HQ890881, đạt độ tương đồng 96% ở cả cấp độ nucleotide và chuỗi amino acid suy diễn khi so sánh với chủng đối chứng CRF01_AE mã số EU518273.

Phân tích biến đổi di truyền đã phát hiện 4 đột biến amino acid quan trọng: I13V, I15V, D36E và đặc biệt là N83T. Đột biến N83T xảy ra do sự thay thế nucleotide tạo nên chuyển dịch từ Asparagine sang Threonine tại vị trí 83. Dữ liệu từ Đại học Stanford xác định N83T là một đột biến hiếm gặp, liên quan trực tiếp đến tính kháng mức độ nhẹ đối với nhóm thuốc ức chế protease, và đây là lần đầu tiên biến thể này được ghi nhận tại Việt Nam.

Quá trình tạo dòng và biểu hiện thu được các kết quả thực nghiệm chuẩn xác:

• Đoạn gen chèn được gắn thành công vào vector pGEM-T Easy tạo plasmid pGEM-ProtHA kích thước 0,64 kb sau kiểm tra PCR.
• Vector biểu hiện pET32-ProtHA tái tổ hợp được thiết lập chuẩn xác với sản phẩm PCR kiểm chứng đạt kích thước 1,1 kb.
• Cảm ứng biểu hiện bằng IPTG 0,1 mM trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21(DE3) RIL ở 37°C trong 3-4 giờ cho thấy protein tái tổ hợp tập trung chủ yếu ở phân đoạn kết tủa (thể vùi) với kích thước khoảng 19 kDa.

Thảo luận kết quả

Các dữ liệu phân tích đột biến có thể được trực quan hóa hiệu quả thông qua bảng ma trận so sánh 99 gốc amino acid giữa chủng HQ890881 và các biến thể quốc tế, cùng biểu đồ cột thể hiện mức độ suy giảm độ nhạy cảm của protease đối với từng loại thuốc PI. Vị trí 83 nằm ở vùng cuộn xoắn alpha gần đầu C của protease, sự thay đổi từ Asparagine sang Threonine phân cực làm biến đổi tương tác không gian xung quanh vùng lõi xúc tác.

Về mặt biểu hiện protein, khối lượng phân tử thực nghiệm 19 kDa sai khác so với tính toán lý thuyết: 31 kDa đối với protein dung hợp đầy đủ thioredoxin-protease-HA-His và 12 kDa đối với protease tự cắt. Phân tích thẩm tách miễn dịch Western blot với kháng thể đơn dòng đặc hiệu và phép thử hoạt độ phân cắt cơ chất tổng hợp Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Nph-Glu-Ala-Met tại bước sóng 300 nm cho thấy phân đoạn protein 19 kDa không có hoạt tính enzyme.

Hiện tượng này tương đồng với các công bố quốc tế khi biểu hiện protease HIV trong vi khuẩn E. coli. Hơn 90% protein dị nguồn thường bị kết tụ thành thể vùi do protease có độc tính cao làm suy yếu tế bào chủ, dẫn đến quá trình dịch mã bị phân mảnh hoặc phân cắt nội sinh bất thường. Kết quả khẳng định để thu nhận enzyme N83T có hoạt tính đầy đủ cần áp dụng quy trình biến tính bằng urea 8 M kết hợp hồi tính đa bước.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các phát hiện thực nghiệm, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp mang tính hành động cao:

1. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện và cuộn gập protein: Nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học cần hạ nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng xuống 16-20°C, giảm nồng độ chất cảm ứng IPTG xuống 0,05 mM và thử nghiệm hệ thống dung hợp maltose-binding protein để nâng tỷ lệ protein hòa tan đạt trên 30% trong thời gian 6 tháng.
2. Chuẩn hóa quy trình hòa tan và hồi tính thể vùi: Phòng thí nghiệm chuyên ngành cần triển khai quy trình rửa tủa bằng đệm Triton X-100 1%, hòa tan trong đệm urea 8 M hoặc Guanidine-HCl 6 M, sau đó thẩm tách từng bước với đệm chứa L-arginine 0,4 M để phục hồi hoạt tính enzyme đạt hiệu suất trên 75% trong vòng 9 tháng.
3. Thiết lập hệ thống giám sát dịch tễ đột biến kháng thuốc diện rộng: Cục Phòng chống HIV/AIDS phối hợp cùng các bệnh viện chuyên khoa tuyến đầu triển khai xét nghiệm giải trình tự gen protease định kỳ cho ít nhất 500 bệnh nhân thất bại phác đồ ARV bậc 1 và bậc 2 trong giai đoạn 12-24 tháng.
4. Ứng dụng mô phỏng động lực học phân tử trong thiết kế thuốc: Các viện nghiên cứu hóa dược cần sử dụng tọa độ cấu trúc gen HQ890881 để mô phỏng tương tác kết cặp phân tử, sàng lọc ảo các hợp chất ức chế thế hệ mới có khả năng khắc phục đột biến N83T với độ chọn lọc tăng gấp 2-3 lần trong lộ trình 18 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị thực tiễn và học thuật cho 4 nhóm đối tượng trọng tâm:

1. Bác sĩ lâm sàng và chuyên gia điều trị bệnh truyền nhiễm: Cung cấp cơ sở khoa học về đột biến N83T và các đột biến đi kèm (I13V, I15V, D36E), hỗ trợ đưa ra quyết định thay đổi phác đồ điều trị ARV cá thể hóa khi bệnh nhân có biểu hiện kháng thuốc ức chế protease.
2. Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và công nghệ sinh học: Tiếp cận quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh từ thiết kế mồi PCR lồng, kỹ thuật dòng hóa plasmid tái tổ hợp đến chiến lược xử lý protein độc biểu hiện trong E. coli BL21(DE3) RIL.
3. Chuyên gia nghiên cứu và phát triển dược phẩm: Nắm bắt các đặc tính đột biến đặc trưng của phân nhóm HIV-1 CRF01_AE tại Việt Nam, phục vụ thiết kế các phân tử thuốc ức chế protease thế hệ mới có phổ tác dụng rộng.
4. Học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Y sinh học: Sử dụng như một tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp luận nghiên cứu thực nghiệm, kỹ thuật giải trình tự Sanger và phương pháp đối soát ngân hàng dữ liệu di truyền quốc tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Đột biến N83T trên gen protease HIV-1 có ý nghĩa lâm sàng như thế nào? Đột biến N83T là biến đổi hiếm gặp thay thế Asparagine bằng Threonine tại vị trí 83 của protease. Theo dữ liệu Đại học Stanford, đột biến này làm giảm nhẹ độ nhạy cảm của virus với một số thuốc ức chế protease. Sự xuất hiện của N83T là chỉ dấu cảnh báo sớm về nguy cơ tích lũy thêm các đột biến kháng chéo nghiêm trọng.

2. Tại sao protein tái tổ hợp thu được trong phân đoạn tủa lại có kích thước 19 kDa? Kích thước 19 kDa sai khác so với tính toán lý thuyết 31 kDa của protein dung hợp do enzyme protease có độc tính mạnh đối với tế bào E. coli. Điều này kích hoạt cơ chế tự phân cắt nội bào không hoàn chỉnh hoặc làm dừng sớm quá trình dịch mã, dẫn đến tạo thành thể vùi chứa các đoạn peptide cắt cụt.

3. Vai trò của đoạn peptide HA trong cấu trúc vector pET32-ProtHA là gì? Đoạn peptide HA gồm 9 amino acid YPYDVPDYA đóng vai trò là epitope nhận diện có ái lực rất cao với kháng thể kháng HA. Đoạn tag này giúp tăng độ đặc hiệu khi tinh sạch qua cột ái lực protein G-sepharose và cho phép phát hiện protein tái tổ hợp bằng kỹ thuật Western blot mà không làm biến đổi hoạt tính enzyme đích.

4. Vì sao cần bổ sung trình tự tự cắt của gen gag vào mồi PCR xuôi? Trình tự nhận biết tự cắt gồm 7 amino acid Gly-Thr-Val-Ser-Phe-Asn-Phe được thiết kế để protease HIV-1 tự giải phóng khỏi phần protein dung hợp thioredoxin. Nhờ đó, enzyme sau biểu hiện có thể tạo ra đầu N tự do chuẩn xác với Proline mở đầu, đảm bảo cấu hình không gian tự nhiên cần thiết cho hoạt tính xúc tác.

5. Luận văn đã sử dụng phương pháp nào để kiểm tra hoạt tính phân cắt của protease? Nghiên cứu sử dụng phương pháp đo quang phổ phân giải cơ chất tổng hợp Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Nph-Glu-Ala-Met. Khi liên kết peptide chứa 4-NO2-phenylalanine bị protease phân cắt, độ hấp thụ quang học tại bước sóng 300 nm sẽ suy giảm theo thời gian thực, cho phép định lượng chính xác động học phản ứng của enzyme.

Kết luận

• Xác định thành công trình tự gen mã hóa protease dài 297 bp từ mẫu bệnh nhân HIV-1 Việt Nam, đăng ký chính thức trên GenBank với mã số HQ890881.
• Phát hiện lần đầu tiên tại Việt Nam đột biến kháng thuốc hiếm gặp N83T cùng 3 biến đổi amino acid I13V, I15V và D36E trên phân nhóm CRF01_AE.
• Thiết kế và tạo dòng thành công hệ vector biểu hiện pET32-ProtHA mang đoạn gen dung hợp thioredoxin, đoạn tự cắt gag và epitope HA.
• Khảo sát toàn diện đặc tính biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli BL21(DE3) RIL, làm rõ nguyên nhân tạo thể vùi và phân đoạn peptide 19 kDa.
• Đặt nền móng kỹ thuật cho các nghiên cứu tối ưu hóa quy trình hồi tính enzyme và ứng dụng giám sát kháng thuốc phân tử trong lộ trình 6-12 tháng tới.

Công trình là tài liệu khoa học giá trị cao trong lĩnh vực Sinh học thực nghiệm và Y học phân tử. Quý độc giả, các chuyên gia y tế và nhóm nghiên cứu quan tâm có thể khai thác chi tiết các quy trình thực nghiệm và dữ liệu trình tự gen phục vụ công tác điều trị, giảng dạy và phát triển dược phẩm mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Virus suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency virus - HIV) là nguyên nhân chính gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immunodeficiency Syndrome - AIDS) và là một trong những virus gây bệnh nguy hiểm nhất hiện nay. Theo các tài liệu đã công bố, có ít nhất hai type HIV gây nên AIDS đó là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), nhưng HIV-1 là nguyên nhân chính gây ra AIDS trên toàn thế giới. Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới, tính đến cuối năm 2009 có khoảng 33,3 triệu người đang sống chung với HIV/AIDS, khoảng 1,8 triệu người đã chết vì AIDS và có thêm 2,6 triệu trường hợp mới bị nhiễm virus này. Ở Việt Nam, theo báo cáo Cục phòng chống HIV/AIDS - Bộ Y tế tính đến 31/3/2011, toàn quốc đã phát hiện người nhiễm HIV tại hơn 75,2% xã/phường, gần 97,9% quận/huyện và 63/63 tỉnh/thành phố.

Tổng số trường hợp nhiễm HIV là 235.535 người, số bệnh nhân AIDS là 94.613 người, số trường hợp tử vong đến cuối kỳ báo cáo là 49. Trong chu trình sống của HIV-1, protease là enzyme không thể thiếu. Enzyme này cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định để tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Vì thế protease được xem là một trong các đích tác động quan trọng nhất cho liệu pháp tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS.

Tuy nhiên, do HIV sao chép nhanh, enzyme phiên mã ngược có tỷ lệ sai sót cao tạo ra sự biến đổi liên tục trong cấu trúc hệ gen của các nhóm HIV dẫn đến tình trạng kháng thuốc. Mặc dù ngày càng nhiều chất ức chế protease chống HIV được sản xuất và thương mại hóa nhưng việc tìm các chất ức chế mới của protease vẫn luôn được quan tâm. Bên cạnh đó, các đột biến kháng PI tương đối đặc hiệu cho từng loại thuốc riêng biệt, do đó thay thế một loại thuốc khác trước khi có sự tích lũy đột biến thì các phác đồ sau vẫn thành công (Hoffmann và tập thể, 2007). Vì vậy, xét nghiệm kháng thuốc thường theo hướng phát hiện đột biến trong gen mã hóa protease HIV có vai trò rất quan trọng trong việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/AIDS.

Lớp Cao học K18 1 Khóa 2009-2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng Ở Việt Nam, gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc là vấn đề còn ít được nghiên cứu. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ở người Việt Nam và tìm ra một số đột biến liên quan kháng thuốc. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào về biểu hiện gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc phân lập từ các bệnh nhân người Việt Nam. Đề tài nghiên cứu của chúng tôi được đặt ra là nhằm phát hiện một số đột biến kháng thuốc trong gen mã hóa của protease của HIV, đồng thời bước đầu biểu hiện gen này trong vi khuẩn E.

coli để làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. Các nghiên cứu của luận văn được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Lớp Cao học K18 2 Khóa 2009-2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về HIV 1.

HIV/AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải được gọi tắt là AIDS, do virus HIV gây ra sự suy giảm miễn dịch ở người được phát hiện ở Mỹ năm 1981, đến nay đã trở thành “căn bệnh thế kỷ” trên toàn thế giới. Về phân loại, HIV là các Retrovirus có bộ máy di truyền thuộc họ Retroviridae với hai type chính là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), trong đó HIV-1 gây ra 98% sự lan truyền còn HIV-2 chỉ chiếm ưu thế ở vùng tây châu Phi, ít lan truyền trên thế giới [1, 15]. Vì vậy, HIV-1 được xem như là nguyên nhân chính gây nên AIDS. HIV-1 được chia thành 3 nhóm là M (main), O (outlier), nhóm N (new) trong đó hơn 90% sự lây nhiễm của HIV thuộc nhóm M.

Trong nhóm M gồm các phân nhóm A, B, C, D, F, G, H, J, K và nhiều dạng tái tổ hợp khác (circulating recombinant form-CRF). Các phân nhóm khác nhau chủ yếu ở cấu trúc của các protein vỏ và đặc trưng cho sự truyền nhiễm theo khu vực địa lý. Đây là một đặc điểm đáng lưu ý trong các nghiên cứu để tìm ra thuốc điều trị cho các bệnh nhân HIV/AIDS theo từng khu vực [14]. Về cấu trúc, HIV có dạng hình cầu với kích thước khoảng 120 nm, được mô tả ở hình 1.

Lớp vỏ ngoài cùng của virus HIV bao gồm một lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào chủ, trên lớp vỏ này có chứa khoảng 72 bản sao protein env của virus, mỗi protein env lại chứa một mũ được tạo thành từ 3 phân tử gp120 còn thân được tạo thành từ 3 phân tử gp41 có chức năng neo giữ lõi virus với vỏ bao ngoài. Lõi virus có dạng như hạt đậu tạo thành từ 2.000 bản sao của protein p24. Trong lõi bao gồm hệ gen của HIV là hai sợi RNA (+) đơn, mỗi sợi có kích thước khoảng 10 kb gồm 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau. Cuối mỗi chuỗi RNA là các trình tự được gọi là trình tự lặp lại tận cùng dài (LTRs) đóng vai trò trong việc kiểm soát sự nhân lên cũng như điều hòa quá trình tổng hợp protein của virus.

Giống như các retrovirus khác, HIV có 3 gen chính gag, pol và env mã hóa cho các protein tham Lớp Cao học K18 3 Khóa 2009-2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng gia vào quá trình sao chép và trưởng thành của virus. Sản phẩm ban đầu của gen gag là một protein 56 kDa, sau đó được chế biến thành ít nhất 3 sản phẩm p17, p24 và p15 là các protein cấu trúc của virus. Gen pol mã hóa cho các enzyme reverse transcriptase (RT), intergrase và protease trong đó enzyme RT có chức năng phiên mã ngược RNA của virus thành cDNA; enzyme intergrase chèn cDNA vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ còn protease tham gia vào quá trình cắt các phân tử protein tiền thân dưới dạng polypeptide thành các protein cấu trúc và chức năng cần cho sự hình thành của thể virus. Gen env mã hóa cho các glycoprotein capsid của virus; sản phẩm của gen env (gp160) được cắt bởi protease của tế bào chủ thành gp120 và gp41 sau đó lắp ráp lại thành cấu trúc tam phân trong lớp vỏ virus.

Ngoài 3 gen chính, HIV còn có 6 gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr và vpu) chứa thông tin mã hóa cho các protein có khả năng kiểm soát sự tái bản, các cách lây nhiễm khác nhau hoặc nguy cơ nhiễm các loại bệnh khác nhau [5, 17, 22]. Hình 1: Cấu tạo của HIV [40] HIV truyền nhiễm theo 4 con đường, bao gồm con đường tiêm truyền do dùng chung kim tiêm, lây nhiễm do truyền máu và các sản phẩm của máu, từ mẹ bị nhiễm bệnh sang thai nhi và qua quan hệ tình dục không an toàn [1, 15]. Quá trình tiến triển của bệnh được chia thành 3 thời kì. Sự lây nhiễm HIV ban đầu gọi là quá trình nhiễm sơ cấp, thường kéo dài từ 3-6 tuần, sau đó virus đi khắp cơ thể, nhân bản mạnh trong khi không có bất cứ đáp ứng miễn dịch thích hợp Lớp Cao học K18 4 Khóa 2009-2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng nào được phát hiện [1, 7, 15].

Người bệnh sốt nhẹ, có triệu chứng như cảm cúm, hạch lympho sưng to, cũng có khi không thấy triệu chứng gì. Tiếp theo là giai đoạn tiềm ẩn kéo dài từ 1 đến 12 năm (tùy theo từng người nhiễm). Trong giai đoạn này, quá trình sao chép của virus giảm và số lượng tế bào lympho T CD4+ tăng lên, virus HIV có thể được phát hiện bằng PCR hoặc RT-PCR trong các lympho của máu và trong các mô bạch huyết [1]. Khoảng vài năm sau, mật độ các virus trong máu tăng nhanh và giữ ở mức đó cho tới lúc chết, các kháng thể kháng virus giảm dần.

Giai đoạn này gọi là giai đoạn toàn phát hay giai đoạn cuối. Lúc này hội chứng lâm sàng của bệnh suy giảm miễn dịch xuất hiện, các vi sinh vật cơ hội có điều kiện tấn công, người bệnh chết dần [7, 16, 28]. Chính những đặc trưng phân tử trong cách tấn công hệ thống miễn dịch của HIV mà AIDS trở thành một trong những bệnh nguy hiểm nhất trong lịch sử loài người. Tình hình nhiễm HIV/AIDS Đại dịch HIV/AIDS đã và đang là một thách thức to lớn đối với tiến trình phát triển xã hội.

Sau gần 3 thập kỷ phát hiện, bắt đầu ở các nước phát triển, HIV/ AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt phát triển ở khu vực châu Phi và các nước châu Á. Đến nay vẫn chưa có vaccine phòng ngừa HIV và thuốc chữa trị đặc hiệu. Theo thông báo của Tổ chức y tế thế giới (WHO) và Chương trình phối hợp phòng chống AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS) đến cuối năm 2009 ước tính khoảng 33,3 triệu người đang mang căn bệnh HIV/AIDS, trong đó số đối tượng mới là 2,6 triệu người và có khoảng 1,8 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS. Tại khu vực châu Á, có khoảng 4,87 triệu người đang sống cùng với HIV/AIDS ở các khu vực Đông Nam và Nam Á; tình hình phát triển của bệnh này ngày càng tăng với những diễn biến phức tạp.

Theo dự đoán, khu vực này sẽ trở thành trung tâm của đại dịch HIV/AIDS trong vài thập kỉ tới [37]. Ở Việt Nam, theo UNAIDS [36], tính đến ngày 30/9/2010 trên cả nước có 180.631 trường hợp nhiễm HIV/AIDS, trong đó có 42.339 bệnh nhân AIDS và tổng số người chết vì AIDS được báo cáo là 48. Cho đến nay, đã có trên 74% xã, Lớp Cao học K18 5 Khóa 2009-2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng phường và 97,8% quận, huyện trên toàn quốc báo cáo có người nhiễm HIV/AIDS. Thành phố Hồ Chí Minh vẫn là địa phương có tỷ lệ bệnh nhân HIV/AIDS cao nhất với 23% tổng số bệnh nhân trong cả nước.

Phân tích hình thái lây nhiễm cho thấy, trong số những người mới được phát hiện nhiễm HIV trong 3 quí đầu năm 2010 có 49% bị nhiễm qua đường máu, 38% qua đường tình dục, 3% qua đường mẹ - con và 10% không rõ đường lây. Tỷ lệ nam giới nhiễm HIV chiếm 70,8% và nữ giới chiếm 29,2%.