Luận án tiến sĩ sinh học: Thiết kế vector biểu hiện thụ thể neurokinin-1 người tái tổ hợp trên dòng tế bào - Phạm Thị Hồng Nhung, ĐHQG Hà Nội

Dưới đây là meta tags cho bài viết: { "ai_description": "Thiết kế vector biểu hiện thụ thể neurokinin-1 người tái tổ hợp ứng dụng dược phẩm: nghiên cứu chi

• Tác giả: Phạm Thị Hồng Nhung
• Người hướng dẫn: PGS. Đinh Đoàn Long
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện thụ thể neurokinin-1 người tái tổ hợp trên dòng tế bào cho định hướng ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về thụ thể neurokinin 1 người và vai trò sinh học

Thụ thể neurokinin-1 người (hNK1R) thuộc họ thụ thể kết cặp protein G (GPCR), có cấu trúc bảy miền xuyên màng đặc trưng. Phối tử chính của thụ thể này là chất P (substance P), một neuropeptide thuộc họ tachykinin. Chức năng sinh học của hệ thống chất P/NK1R rất đa dạng. Hệ thống này tham gia vào quá trình truyền tín hiệu đau, viêm nhiễm, co thắt cơ trơn đường hô hấp và tiêu hóa. Ngoài ra, NK1R còn đóng vai trò quan trọng trong điều hòa cảm xúc, hành vi, buồn nôn và nôn. Biểu hiện bất thường của NK1R liên quan đến nhiều bệnh lý. Các rối loạn viêm, đau mạn tính, trầm cảm và một số loại ung thư đều có sự tham gia của con đường tín hiệu này. Do đó, NK1R trở thành mục tiêu hấp dẫn cho nghiên cứu và phát triển dược phẩm. Việc sản xuất protein NK1R tái tổ hợp có hoạt tính là bước nền tảng quan trọng.

1.1. Cấu trúc và cơ chế hoạt hóa thụ thể NK1R

Thụ thể NK1R là protein xuyên màng bảy lần. Phân tử có miền N đầu ngoại bào, bảy xoắn α xuyên màng (TM1-TM7) và miền C đầu nội bào. Chất P liên kết chủ yếu vào vùng khe ngoại bào và các xoắn TM của thụ thể. Khi chất P liên kết, thụ thể thay đổi cấu hình không gian. Sự thay đổi này cho phép tương tác với protein G nội tại. Protein G sau đó hoạt hóa các enzym truyền tin trung gian như phospholipase C. Quá trình này giải phóng IP3 và DAG, huy động Ca2+ nội bào. Chuỗi tín hiệu nội bào này dẫn đến các đáp ứng sinh lý đặc hiệu của tế bào.

1.2. Vai trò của NK1R trong bệnh lý và dược lý học

NK1R tham gia vào nhiều con đường bệnh lý quan trọng. Trong ung thư, tín hiệu NK1R thúc đẩy tăng sinh, di căn và hình thành mạch máu mới. Các khối u như ung thư biểu mô, ung thư hắc tố thường biểu hiện NK1R cao. Trong lĩnh vực thần kinh, NK1R liên quan đến lo âu, trầm cảm và đáp ứng stress. Thuốc đối kháng NK1R như aprepitant đã được phê duyệt điều trị buồn nôn do hóa trị. Nhiều hợp chất đối kháng NK1R khác đang được nghiên cứu.Ứng dụng lâm sàng thành công này thúc đẩy nghiên cứu sâu hơn về thụ thể. Nhu cầu về protein NK1R tái tổ hợp chất lượng cao ngày càng tăng.

II. Thách thức trong biểu hiện tái tổ hợp thụ thể GPCR người

Biểu hiện tái tổ hợp các thụ thể GPCR, bao gồm NK1R, là nhiệm vụ đầy thách thức. GPCR là protein màng có cấu trúc phức tạp. Chúng cần được gấp nếp đúng cách và biến đổi sau dịch mã để có hoạt tính. Hệ thống biểu hiện tế bào nhân sơ như E. coli có ưu điểm chi phí thấp, thời gian ngắn và dễ mở rộng quy mô. Tuy nhiên, tế bào nhân sơ thiếu hệ thống biến đổi sau dịch mã. Protein thường biểu hiện ở dạng thể bao không tan hoặc không có hoạt tính đầy đủ. Một số GPCR đã được biểu hiện trên E. coli như thụ thể adenosine 2A, cannabinoid 2. Tuy nhiên, chất lượng protein thường không đạt yêu cầu cho nghiên cứu chức năng. Hệ thống tế bào nhân thực như nấm men, tế bào côn trùng hoặc tế bào động vật có vú được ưu tiên hơn. Các hệ thống này cung cấp biến đổi sau dịch mã phù hợp. Tuy nhiên, chi phí cao hơn và quy trình phức tạp hơn đáng kể.

2.1. Hạn chế của hệ thống biểu hiện nhân sơ đối với GPCR

2.2. Đánh giá các hệ thống biểu hiện nhân thực cho NK1R

III. Thiết kế vector biểu hiện NK1R tái tổ hợp trên dòng tế bào

Thiết kế vector biểu hiện là bước then chốt trong nghiên cứu này. Vector cần chứa nhiều thành phần chức năng để đảm bảo biểu hiện hiệu quả. Promoter điều khiển phiên mã phải phù hợp với hệ thống tế bào chủ. Vùng mã hóa NK1R được tối ưu hóa codon cho dòng tế bào biểu hiện. Các tag tịnh hóa như His-tag, FLAG-tag được thêm vào để thuận lợi cho việc tịnh hóa và phát hiện protein. Vector cũng chứa marker chọn lọc như gen kháng kháng sinh. Hệ thống cảm ứng như Tet-On/Off hoặc cảm ứng IPTG được tích hợp. Điều này cho phép kiểm soát mức độ và thời điểm biểu hiện protein. Quá trình thiết kế sử dụng công cụ sinh học tính toán để dự đoán cấu trúc. Phân tích tính ổn định của mRNA và hiệu suất dịch mã được thực hiện kỹ lưỡng. Vector được kiểm tra bằng sequencing trước khi chuyển vào tế bào chủ.

3.1. Chiến lược tối ưu hóa vùng mã hóa và cấu trúc vector

3.2. Phương pháp chuyển vector và chọn dòng biểu hiện ổn định

IV. Ứng dụng và triển vọng trong nghiên cứu phát triển dược phẩm

NK1R tái tổ hợp có nhiều ứng dụng quan trọng trong nghiên cứu dược phẩm. Ứng dụng đầu tiên là sàng lọc thuốc đối kháng mới. Protein NK1R hoạt tính được sử dụng trong phân tích liên kết phối tử. Phương pháp đo lường sự thay đổi Ca2+ nội bào cho phép đánh giá chức năng thụ thể. Phân tích cAMP áp dụng với GPCR kết cặp Gαi/o như NK1R. Phương pháp đo Ca2+ phân biệt tốt chất chủ vận, chất đối kháng và chất điều biến dị lập thể. Ứng dụng thứ hai là nghiên cứu cấu trúc thụ thể. Protein tinh khiết phục vụ tinh thể học tia X và cryo-EM. Kết quả cấu trúc giúp hiểu rõ cơ chế liên kết phối tử. Thông tin này hỗ trợ thiết kế thuốc hợp lý. Ứng dụng thứ ba là phát triển kháng thể đơn dòng. NK1R tái tổ hợp làm kháng nguyên để tạo kháng thể đặc hiệu. Các kháng thể này có tiềm năng ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư.

4.1. Sàng lọc thuốc và đánh giá hoạt tính đối kháng NK1R

4.2. Nghiên cứu cấu trúc và thiết kế thuốc hợp lý

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Thụ thể neurokinin-1 (viết tắt là NK1R) nói riêng và thụ thể kết cặp với G-protein (viết tắt là GPCR) nói chung là đích tác dụng quan trọng của rất nhiều thuốc hiện nay. Khi NK1R tương tác với chất chủ vận nội sinh sẽ dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi về thần kinh trung ương, gây ra trạng thái lo âu và các triệu chứng giống trầm cảm. Ngoài ra, NK1R tham gia kích thích co cơ trơn và điều hòa các phản ứng miễn dịch của cơ thể. Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của NK1R, nhiều loại thuốc giảm đau cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, chống nôn cho các bệnh nhân ung thư… đã và đang được các hãng dược phẩm đầu tư phát triển và thương mại hóa.

Sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học hướng đích GPCR phục vụ nghiên cứu phát triển thuốc là nhu cầu mang tính thời sự trong các nghiên cứu dược lý học phân tử. Có một số lượng lớn các hợp chất mới có nguồn gốc tự nhiên, bán tổng hợp hoặc tổng hợp (được gọi chung là các thuốc thử) cần xác định đích phân tử và cơ chế dược lý tác động lên cơ thể. Hiện nay, việc sử dụng các GPCR tự nhiên thường gặp khó khăn do các dòng tế bào GPCR tự nhiên biểu hiện ở mức độ thấp, việc thu mẫu và phân lập từ tế bào người gặp nhiều hạn chế về mặt đạo đức cũng như kỹ thuật. Ngoài ra, các GPCR có nhiều dạng biến thể (subtype) khác nhau, có thể dẫn đến những nhận định nhầm về khả năng tương tác với các thuốc thử.

Tuy nhiên, những khó khăn trên có thể khắc phục bằng cách sử dụng các tế bào biểu hiện GPCR tái tổ hợp của người. GPCR tái tổ hợp biểu hiện ở mức độ cao và đầy đủ hoạt tính sẽ cung cấp nguồn nguyên liệu dồi dào cho các thí nghiệm xác định hoạt tính liên kết với phối tử cũng như chức năng liên kết của các G-protein. Chính vì 12 vậy, xây dựng mô hình biểu hiện mạnh GPCR tái tổ hợp của người trên các hệ thống tế bào động vật là nghiên cứu cấp thiết và có giá trị thực tiễn trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Mặc dù nhiều hệ thống biểu hiện đã được phát triển nhằm biểu hiện protein ngoại lai trong tế bào nhân sơ đến nhân chuẩn, đến nay biểu hiện hiệu suất cao và chủ động các protein xuyên màng tế bào vẫn là một thách thức lớn.

Sự biểu hiện GPCR mức độ thấp có liên quan chủ yếu tới yêu cầu biến đổi sau dịch mã, sự cuộn gập protein, vận chuyển nội bào và khả năng gây độc tính tế bào của thụ thể. Có một thuận lợi là các GPCR dù đa dạng về trình tự amino acid song có cấu trúc không gian tương đồng lớn (đều là đơn chuỗi peptide với 7 miền xuyên màng kị nước). Chính vì vậy, mô hình biểu hiện thành công cho một thụ thể có khả năng mở rộng áp dụng cho rất nhiều thụ thể khác, đặc biệt là các thụ thể cùng họ GPCR. Trong các hệ thống biểu hiện, hệ thống biểu hiện của Semliki Forest Virus (viết tắt là SFV) được ghi nhận là một trong những hệ thống biểu hiện protein màng tế bào động vật trong thời gian nhanh nhất.

Theo tài liệu, hệ thống này đã được một số hãng dược phẩm (như Hoffman La Roche) ứng dụng biểu hiện cho hơn 100 GPCR phục vụ cho nghiên cứu và phát triển thuốc, nhưng các dòng tế bào tái tổ hợp không được thương mại hóa trên thị trường. Trong bối cảnh đó, việc ứng dụng và làm chủ được hệ thống biểu hiện SFV hứa hẹn cung cấp một công cụ sinh học hữu ích trong nghiên cứu y sinh dược học ở Việt Nam. Từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, tôi tiến hành thực hiện luận án: “Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện thụ thể neurokinin-1 người tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO định hướng ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2.

Mục tiêu tổng quát Biểu hiện được NK1R tái tổ hợp của người trên dòng tế bào tự nhiên vốn không biểu hiện thụ thể này nhằm sàng lọc hoạt chất và dịch chiết dược liệu hướng đích NK1R. Qua đó, tạo cơ sở xây dựng mô hình biểu hiện cho các GPCR tái tổ hợp khác phục vụ cho các nghiên cứu và phát triển dược phẩm ở Việt Nam. Mục tiêu cụ thể Mục tiêu 1: Xây dựng được quy trình kỹ thuật biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người thông qua hệ thống biểu hiện SFV trên dòng tế bào động vật. Mục tiêu 2: Đánh giá được hoạt động chức năng của NK1R tái tổ hợp biểu hiện trên tế bào động vật.

Mục tiêu 3: Áp dụng được tế bào động vật biểu hiện thụ thể NK1R trong sàng lọc một số dược liệu tiềm năng. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung 1: Phát triển hệ vector SFV biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người. Nội dung 2: Tạo hạt SFV mang trình tự NK1R tái tổ hợp của người. Nội dung 3: Đánh giá biểu hiện NK1R trên một số dòng tế bào động vật.

Nội dung 4: Đánh giá biểu hiện và chức năng của NK1R người tái tổ hợp trên tế bào CHO. Nội dung 5: Tạo ra một lượng lớn tế bào biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người với đầy đủ chức năng, ứng dụng bước đầu trong nghiên 14 cứu dược lý in vitro dịch chiết methanol và tinh chất của 10 loài dược liệu Việt Nam trên NK1R tái tổ hợp. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống biểu hiện GPCR người tái tổ hợp, từ xây dựng vector chuyển gen mã hóa NK1R của người đến biểu hiện thụ thể tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học các hoạt chất hướng đích NK1R in vitro của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn, có tính mới trên thế giới.

Dòng tế bào động vật biểu hiện thụ thể tái tổ hợp của người là công cụ hiện đại và hiệu quả phục vụ cho các nghiên cứu y sinh học. Hệ thống biểu hiện SFV đã được thiết lập để tạo được dòng tế bào CHO biểu hiện mạnh NK1R người lần đầu tiên ở Việt Nam. Đây là cơ sở biểu hiện thụ thể có khả năng mở rộng áp dụng cho nhiều GPCR khác. Xây dựng được mô hình sàng lọc in vitro các hoạt chất hướng đích NK1R phục vụ các các nghiên cứu sàng lọc dược phẩm.

Đây là một công cụ mới và hiện đại phục vụ cho các nghiên cứu dược lý, phù hợp với định hướng phát triển các thuốc dược liệu của Việt Nam hiện nay. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ GIÁ TRỊ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN Về mặt khoa học Trình tự NK1R của hai bệnh nhân Việt Nam đã được biểu hiện thành công trên dòng tế bào CHO, mở ra hướng nghiên cứu kỹ thuật biểu hiện ổn định các thụ thể tái tổ hợp phục vụ cho các nghiên cứu về cấu trúc phân tử, dược lý in vitro, góp phần định hướng cho các nghiên cứu phát triển thuốc ở các giai đoạn sau (nghiên cứu dược lý in vivo, nghiên cứu lâm sàng, nghiên cứu dược động học,. 15 Cơ sở khoa học và hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen, biểu hiện protein tái tổ hợp với hệ thống biểu hiện SFV đã được khẳng định thông qua việc phát triển thành công vector SFV mang trình tự NK1R của người và biểu hiện hiệu quả cao trên dòng tế bào CHO. Luận án, các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học công nghệ trong nước và quốc tế là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy.

Về mặt thực tiễn Tế bào biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người với đầy đủ hoạt tính có thể ứng dụng để sàng lọc các các hoạt chất hướng đích NK1R thu từ các cây dược liệu Việt Nam. Nghiên cứu mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn phát triển thuốc dược liệu, tiêu chuẩn hoá và hiện đại hoá các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, góp phần phát huy thế mạnh về nguồn tài nguyên dược liệu phong phú của Việt Nam. Không chỉ biểu hiện hiệu quả protein thụ thể, hệ thống SFV được xây dựng trong nghiên cứu này còn là công cụ hữu ích để chuyển gen và biểu hiện các loại protein khác nhau trên các dòng tế bào động vật. Nhiều nghiên cứu khác nhau trên thế giới đã cho thấy đây cũng là công cụ có tiềm năng ứng dụng trong liệu pháp gen trị liệu ung thư hay công nghệ sản xuất vắc-xin.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. THỤ THỂ KẾT CẶP G - PROTEIN 1. Các dạng thụ thể và phối tử Trong quá trình tồn tại và phát triển, tế bào liên tục tiếp nhận các tín hiệu ngoại bào là các kích thích vật lý (ánh sáng, nhiệt độ hay áp lực) hay các kích thích hóa học (các peptide, chất dẫn truyền thần kinh, các pheromone, các nucleotide và các hợp chất phân tử nhỏ khác). Thụ thể là một lớp lớn các protein có chức năng tiếp nhận các tín hiệu ngoại bào được gọi là phối tử (ligand), truyền hóa và thúc đẩy quá trình truyền tín hiệu nội bào dẫn đến đáp ứng tế bào giúp cơ thể phản ứng kịp thời với sự thay đổi của môi trường [9].

Chính vì vậy, thụ thể có vai trò rất quan trọng, tham gia vào nhiều cơ chế sinh lý trong các tế bào cũng như giữa các tế bào với nhau. Dựa vào tác động lên tế bào mà phối tử có thể chia thành 2 nhóm chính là chất chủ vận (agonist) và chất đối kháng (antagonist) [7, 144]. Chất chủ vận là những chất khi gắn vào thụ thể sẽ hoạt hóa thụ thể gây ra đáp ứng tế bào. Các chất chủ vận được chia thành sáu nhóm như sau: Nhóm 1: Chất chủ vận nội sinh (endogenous agonist): Xuất hiện tự nhiên trong cơ thể, có khả năng liên kết và kích hoạt thụ thể.

Nhóm 2: Chất siêu chủ vận (super agonist): Có khả năng gắn kết với thụ thể và tạo ra phản ứng tối đa, lớn hơn so với các chất chủ vận nội sinh khác. Nhóm 3: Chất chủ vận toàn phần (full agonist): Kích hoạt thụ thể và tạo ra hiệu quả đầy đủ tương đương với phối tử nội sinh. 17 Nhóm 4: Chất chủ vận một phần (partial agonist): Liên kết và kích hoạt thụ thể, nhưng chỉ gây ra đáp ứng một phần so với các chất chủ vận nội sinh. Nhóm 5: Chất chủ vận ngược (inverse agonist): Liên kết với thụ thể và gây ra đáp ứng tế bào đối ngược với chất chủ vận.