Nghiên cứu xây dựng mô hình xơ gan trên chuột nhắt bằng carbon tetraclorid

Quy trình xây dựng mô hình xơ gan trên chuột bằng CCl4. Đánh giá tổn thương gan qua chỉ số huyết học, hóa sinh và kết quả phân tích mô học.

• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu xây dựng mô hình xơ gan trên chuột nhắt bằng hóa chất
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Cấu trúc cơ bản của tiểu thùy gan
• 1.2. Thực trạng bệnh xơ gan
• 1.3. Tiến trình bệnh lý xơ gan
• 1.4. Nguyên nhân gây xơ gan
• 1.5. Cơ chế bệnh sinh của xơ gan
• 1.6. Tiêu chí đánh giá xơ gan
• 1.6.1. Kiểm tra chức năng gan
• 1.6.2. Sinh thiết gan
• 1.7. Các mô hình gây xơ gan trên động vật
• 1.8. Cơ chế gây bệnh bằng carbon tetrachloride (CCl4)
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp gây dựng mô hình
• 2.3.2. Phương pháp đánh giá hiệu quả gây xơ gan và điều trị xơ gan
• 2.3.2.1. Đánh giá thay đổi trọng lượng, tình trạng toàn thân
• 2.3.2.2. Xác định các chỉ số huyết học
• 2.3.2.3. Xác định hoạt độ các thông số sinh hóa
• 2.3.2.4. Đánh giá cấu trúc mô học gan
• 2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.3.4. Đạo đức nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Thời gian gây xơ gan trên chuột nhắt trắng bằng CCl4
• 3.2. Tình trạng chuột
• 3.3. Kết quả xét nghiệm huyết học
• 3.4. Kết quả xét nghiệm hóa sinh
• 3.5. Kết quả mô học
• 3.5.1. Sự thay đổi hình ảnh đại thể gan
• 3.5.2. Tổn thương vi thể cấu trúc gan
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về mô hình xơ gan CCl4 trên chuột

Mô hình xơ gan bằng carbon tetrachloride (CCl4) là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để xây dựng mô hình bệnh lý gan trên động vật thí nghiệm, đặc biệt là trên chuột. Xơ gan là bệnh lý nguy hiểm đứng thứ 11 nguyên nhân tử vong trên thế giới, làm ảnh hưởng đến chức năng gan và có thể dẫn đến ung thư gan. CCl4 là một hóa chất độc tính cao, khi xâm nhập vào cơ thể được chuyển hóa bởi enzyme tại gan, tạo ra các gốc tự do và các chất trung gian độc hại gây tổn thương tế bào gan. Quy trình xây dựng mô hình này giúp các nhà nghiên cứu hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh, tiến trình phát triển của bệnh lý và tìm kiếm các phương pháp điều trị hiệu quả.

1.1. Định nghĩa và ý nghĩa của mô hình xơ gan CCl4

Mô hình xơ gan CCl4 được sử dụng để mô phỏng quá trình xơ hóa gan ở con người. Mô hình này cho phép nghiên cứu chi tiết về cơ chế bệnh sinh, đánh giá hiệu quả của các loại thuốc mới và phương pháp điều trị. CCl4 gây tổn thương gan nặng thông qua oxidative stress và viêm gan, dẫn đến fibrosis (xơ hóa) lan tỏa. Sử dụng mô hình động vật giúp các nhà khoa học có cái nhìn toàn diện về bệnh lý trước khi thử nghiệm lâm sàng trên người.

1.2. Vai trò của carbon tetrachloride trong gây xơ gan

Carbon tetrachloride (CCl4) là một hóa chất có tính chất hepatotoxic mạnh mẽ. Khi CCl4 được tiêm vào cơ thể chuột, nó được chuyển hóa bởi cytochrome P450 thành các chất trung gian độc hại như CCl3 và CCl3OO. Những chất này gây ra tổn thương tế bào gan, kích hoạt hepatic stellate cells (HSCs), dẫn đến sản sinh collagen quá mức và hình thành xơ hóa gan. CCl4 còn gây necrosis (hoại tử) tế bào gan, steatosis (tích mỡ) và viêm gan mạn tính.

II. Quy trình xây dựng mô hình xơ gan trên chuột

Quy trình xây dựng mô hình xơ gan bằng CCl4 trên chuột được tiến hành một cách có hệ thống và khoa học. Thường sử dụng chuột nhắt trắng BALB/c ở độ tuổi 8-10 tuần, vì ở tuổi này hệ thống miễn dịch và chuyển hóa của chuột đã phát triển hoàn chỉnh. CCl4 được pha loãng trong dầu khoáng với nồng độ thích hợp và tiêm dưới da (subcutaneously) với liều lượng và tần suất nhất định. Thời gian xây dựng mô hình thường kéo dài từ 8-12 tuần để tạo ra xơ gan ở giai đoạn mong muốn. Trong suốt quá trình thí nghiệm, chuột được theo dõi chặt chẽ về trọng lượng, tình trạng toàn thân, ăn uống và các dấu hiệu bệnh lý.

2.1. Lựa chọn động vật thí nghiệm và chuẩn bị

Chọn chuột nhắt trắng BALB/c 8-10 tuần tuổi, khỏe mạnh, không nhiễm bệnh. Chuột được nuôi trong điều kiện môi trường chuẩn: nhiệt độ 20-24°C, độ ẩm 50-70%, chu kỳ sáng tối 12 giờ. Chuột được chia thành các nhóm: nhóm đối chứng không tiêm CCl4 và nhóm tiêm CCl4 với các liều lượng khác nhau. Mỗi chuột được cân trọng lượng ban đầu, đánh dấu nhận diện, và ghi chép dữ liệu cơ bản trước khi bắt đầu thí nghiệm.

2.2. Phương pháp tiêm CCl4 và lịch trình điều trị

CCl4 được pha loãng 1:9 trong dầu khoáng, tạo nồng độ 20%. Tiêm dưới da (subcutaneous injection) vào vùng cơ lưng chuột với liều 3 ml/kg thể trọng, tiêm 2 lần/tuần trong 8-12 tuần. Sau mỗi lần tiêm, chuột được theo dõi hành vi, tình trạng lông, ăn uống, và các dấu hiệu viêm tại vị trí tiêm. Chuột nhóm đối chứng được tiêm dầu khoáng thuần với liều lượng tương tự. Ghi chép chi tiết thời gian, liều lượng và tình trạng chuột sau mỗi lần tiêm.

III. Phương pháp đánh giá hiệu quả tạo xơ gan

Đánh giá hiệu quả của mô hình xơ gan CCl4 được thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau. Đánh giá lâm sàng bao gồm theo dõi sự thay đổi trọng lượng, tình trạng lông, thói quen ăn uống và hành vi của chuột. Xét nghiệm huyết học giúp xác định sự thay đổi về số lượng và chất lượng các tế bào máu. Xét nghiệm hóa sinh đo lường hoạt độ các enzyme gan như ALT, AST, ALP, GGT và nồng độ các chỉ số chuyển hóa. Mô bệnh học là phương pháp quan trọng nhất, sử dụng nhuộm H&E, nhuộm Masson để đánh giá cấu trúc mô gan, mức độ xơ hóa, và giai đoạn fibrosis theo thang điểm METAVIR.

3.1. Đánh giá lâm sàng và huyết học

Theo dõi trọng lượng chuột mỗi tuần để phát hiện sự suy giảm do độc tính CCl4. Quan sát tình trạng lông, phân chuột, tính năng động của chuột. Lấy máu qua mắt chuột định kỳ (tuần thứ 0, 4, 8, 12) để xác định chỉ số huyết học: RBC, WBC, MCV, hemoglobin. Sự giảm hemoglobin và RBC cho thấy thiếu máu do bệnh gan mạn tính. Xét nghiệm huyết học giúp đánh giá chung tình trạng sức khỏe và mức độ suy chức năng gan.

3.2. Đánh giá sinh hóa và mô bệnh học

Đo hoạt độ enzyme gan (ALT, AST, ALP) từ huyết thanh chuột. Tăng cao ALT và AST chỉ tổn thương tế bào gan, nên nồng độ huyết tố tăng cho thấy cholestasis. Sinh thiết gan lấy mô gan để nhuộm H&E (quan sát viêm, thoái hóa) và nhuộm Masson (đánh giá lượng collagen). Giai đoạn xơ hóa được phân loại theo METAVIR: F0-F4, với F4 là xơ gan hoàn toàn. Kính hiển vi điện tử giúp quan sát chi tiết cấu trúc tế bào gan bị tổn thương.

IV. Ý nghĩa khoa học và ứng dụng lâm sàng của mô hình

Mô hình xơ gan CCl4 trên chuột có ý nghĩa khoa học rất lớn trong nghiên cứu bệnh gan mạn tính. Mô hình này cho phép các nhà nghiên cứu tái tạo được quá trình xơ hóa gan diễn ra ở con người, từ đó có thể: (1) Nghiên cứu cơ chế bệnh sinh chi tiết của xơ gan; (2) Đánh giá hiệu quả của các loại thuốc mới trong điều trị xơ gan; (3) Tìm hiểu vai trò của các yếu tố di truyền và môi trường trong phát triển bệnh lý; (4) Phát triển các phương pháp chẩn đoán và theo dõi bệnh tiến bộ. Kết quả từ mô hình động vật này cung cấp dữ liệu tiền lâm sàng quan trọng, là nền tảng để phát triển các liệu pháp điều trị mới, góp phần cải thiện sức khỏe bệnh nhân xơ gan trên thế giới.

4.1. Ứng dụng trong nghiên cứu cơ bản và phát triển thuốc

Mô hình xơ gan cho phép nghiên cứu chi tiết cơ chế hoạt động của hepatic stellate cells (HSCs) và quá trình fibrogenesis. Nhà khoa học có thể kiểm tra hiệu quả của các hợp chất có tiềm năng, từ đó lựa chọn các ứng cử viên thuốc tốt nhất để thử nghiệm trên người. Mô hình này giúp xác định liều lượng an toàn, tác dụng phụ, và cơ chế tác dụng của thuốc. Các phát hiện từ mô hình động vật tạo cơ sở vững chắc cho các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn sau, rút ngắn thời gian và chi phí phát triển thuốc mới.

4.2. Đóng góp cho y học lâm sàng và công tác phòng chống bệnh

Kết quả từ mô hình xơ gan CCl4 cung cấp thông tin quý báu về tiên lượng, diễn tiến bệnh, và đáp ứng điều trị của xơ gan. Các phát hiện này giúp bác sĩ lâm sàng hiểu rõ hơn về bệnh lý, từ đó có kế hoạch điều trị cá nhân hóa tốt hơn. Mô hình cũng giúp phát triển các chỉ số sinh học (biomarkers) mới để chẩn đoán sớm xơ gan. Góp phần nâng cao chất lượng chăm sóc bệnh nhân và cải thiện đáp ứng điều trị, từ đó giảm tỉ lệ tử vong do xơ gan trên thế giới.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Xơ gan là giai đoạn cuối của quá trình xơ hóa gan mạn tính, đặc trưng bởi sự biến đổi cấu trúc tiểu thùy gan, hình thành các dải xơ lan tỏa và các nốt tân sinh bất thường. Quá trình này dẫn đến suy giảm chức năng gan, tăng áp lực tĩnh mạch cửa và gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng như xuất huyết do giãn vỡ tĩnh mạch thực quản, bệnh não gan, hội chứng gan thận, suy gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC). Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2015, xơ gan là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 11 trên toàn cầu với hơn 1 triệu ca tử vong; tại Việt Nam, bệnh lý này đứng thứ 10 trong các nguyên nhân tử vong hàng đầu. Hiện nay, các can thiệp y học đối với xơ gan chủ yếu dừng lại ở việc kiểm soát triệu chứng hoặc ghép gan ở giai đoạn cuối, chưa có thuốc điều trị đặc hiệu giúp đảo ngược hoàn toàn xơ hóa. Do đó, việc thiết lập các mô hình động vật thực nghiệm mô phỏng bệnh sinh xơ gan là điều kiện tiên quyết để nghiên cứu cơ chế phân tử và thử nghiệm các tác nhân dược lý mới.

Trong các phương pháp tạo mô hình xơ gan trên động vật gặm nhấm, sử dụng hợp chất carbon tetrachloride ($\text{CCl}_4$) là phương pháp phổ biến nhờ tính lặp lại cao, chi phí hợp lý và cơ chế tổn thương tương đồng với quá trình xơ hóa do nhiễm độc ở người. Tuy nhiên, các nghiên cứu thực nghiệm trước đây tại Việt Nam chủ yếu áp dụng đường uống hoặc tiêm màng bụng với liều lượng và thời gian khác nhau, thường tập trung vào các chỉ tiêu sinh hóa đơn lẻ và tổn thương tế bào cấp tính, chưa tối ưu hóa thời gian gây bệnh cũng như chưa đánh giá toàn diện cấu trúc giải phẫu bệnh từ mức độ vi thể đến siêu cấu trúc tế bào.

Từ bối cảnh thực tiễn trên, khóa luận tốt nghiệp ngành Sinh học (Chương trình đào tạo tài năng) tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã thực hiện đề tài: "Nghiên cứu xây dựng mô hình xơ gan trên chuột nhắt bằng hóa chất".

Nhiệm vụ và mục tiêu nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể:

1. Khảo sát thời gian gây xơ gan trên chuột nhắt trắng bằng hóa chất carbon tetrachloride ($\text{CCl}_4$).
2. Đánh giá các thương tổn cơ bản gây bởi carbon tetrachloride trên gan của động vật thí nghiệm thông qua các chỉ tiêu thể trạng, huyết học, sinh hóa huyết tương, vi thể mô bệnh học và siêu cấu trúc tế bào.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Chuột nhắt trắng dòng BALB/c thuần chủng, giới tính đực, 8–10 tuần tuổi, trọng lượng cơ thể xấp xỉ 20 gram, do Học viện Quân y cung cấp.
• Phạm vi không gian: Thực hiện tại Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự – Học viện Quân y; phân tích siêu cấu trúc tại Khoa Hình thái – Viện 69 (Bộ Tư lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh).
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được triển khai từ tháng 06/2018 đến tháng 04/2019.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và cơ chế bệnh sinh

Cơ chế gây độc gan của carbon tetrachloride ($\text{CCl}_4$) dựa trên quá trình chuyển hóa tại hệ thống enzym cytochrome P450 thuộc microsome gan (hệ enzym mixed-function oxidase - MFOs). Quá trình này biến đổi $\text{CCl}_4$ thành gốc tự do trichloromethyl ($\text{CCl}_3^\bullet$) và tiếp tục phản ứng với oxy tạo ra gốc trichloromethylperoxy ($\text{CCl}_3\text{OO}^\bullet$). Các gốc tự do này tấn công lipid màng tế bào thông qua chuỗi phản ứng peroxy hóa lipid, phá hủy tính toàn vẹn của màng tế bào gan, màng ty thể và lưới nội chất, dẫn đến hoại tử tế bào gan và phản ứng viêm.

Sự tổn thương tế bào gan kích thích giải phóng các gốc oxy hoạt động (ROS) và các cytokine gây viêm, đặc biệt là Transforming Growth Factor – $\beta$ (TGF-$\beta$) và Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) từ tế bào Kupffer, tế bào nội mô xoang mạch và tiểu cầu. Dưới tác động của các yếu tố này, tế bào hình sao gan (Hepatic Stellate Cells - HSC) tại khoang Disse chuyển dạng thành nguyên bào sợi cơ (Myofibroblasts - MFB), gia tăng biểu hiện thụ thể và tổng hợp ồ ạt các thành phần chất nền ngoại bào (Extracellular Matrix - ECM), đặc biệt là collagen typ I, III và IV. Đồng thời, sự mất cân bằng giữa các metalloproteinase phân giải chất nền (MMP-2, MMP-9) và các chất ức chế mô của metalloproteinase (TIMP-1, TIMP-2) làm giảm khả năng thoái biến chất nền, dẫn đến tích tụ chất nền ngoại bào gấp 6 lần bình thường, hình thành các dải xơ liên kết khoảng cửa - trung tâm tiểu thùy và đảo lộn cấu trúc nhu mô.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp thực nghiệm tiến cứu có đối chứng trên động vật (in vivo):

• Quy mô mẫu và phân nhóm: Tổng số 12 chuột nhắt BALB/c được chia đều thành 4 lô thực nghiệm ($n = 3$ chuột/nhóm):
  • Lô Đối chứng (ĐC): Nuôi dưỡng trong điều kiện thức ăn và nước uống tiêu chuẩn, không can thiệp hóa chất.
  • Lô 1T: Tiêm dưới da $\text{CCl}_4$ liều 160 mg/kg trong thời gian 1 tháng.
  • Lô 2T: Tiêm dưới da $\text{CCl}_4$ liều 160 mg/kg trong thời gian 2 tháng.
  • Lô 3T: Tiêm dưới da $\text{CCl}_4$ liều 160 mg/kg trong thời gian 3 tháng.
• Phương pháp gây độc: Dung dịch $\text{CCl}_4$ dạng lỏng (Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ) pha loãng trong dầu olive theo tỷ lệ thể tích 1:18 (tương đương nồng độ thể tích xử lý 2 ml/kg), tiêm dưới da vùng đùi với tần suất 2 lần/tuần. Vị trí tiêm được thay đổi luân phiên để chống loét hoại tử tại chỗ.
• Quy tắc điều chỉnh liều theo thể trọng nhằm hạn chế tỷ lệ tử vong:
  • Cân nặng biến thiên $0 - 2\text{ g}$: Giữ nguyên liều ban đầu.
  • Cân nặng tăng $2 - 4\text{ g}$: Tăng liều thêm $0{,}01\text{ ml}$.
  • Cân nặng tăng $> 5\text{ g}$: Tăng liều thêm $0{,}02\text{ ml}$.
  • Cân nặng giảm $2 - 4\text{ g}$: Giảm liều $0{,}01\text{ ml}$.
  • Cân nặng giảm $> 5\text{ g}$: Giảm liều bằng $50%$ liều ban đầu.

Phương pháp thu thập và phân tích dữ liệu

• Đánh giá thể trạng và huyết học: Chuột được theo dõi hành vi, tình trạng lông, phân và cân trọng lượng 2 lần/tuần bằng cân điện tử Sartorius TE3102S (độ chính xác 0,01 g). Lấy máu qua tĩnh mạch xoang mắt vào ống chống đông để phân tích số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, nồng độ hemoglobin, chỉ số hematocrit và thể tích trung bình hồng cầu (MCV) trên máy đếm tự động theo nguyên lý trở kháng và đo quang.
• Phân tích hóa sinh huyết tương:
  • Hoạt độ ALT và AST: Đo động học quang học ở bước sóng 340 nm dựa trên tốc độ oxy hóa coenzym NADH thành $\text{NAD}^+$.
  • Albumin: Đo độ hấp thụ phức hợp màu xanh với thuốc nhuộm Bromocresol Green (BCG) ở bước sóng 620 nm.
  • Bilirubin toàn phần: Định lượng thông qua phản ứng oxy hóa với Bilirubin Oxidase (BOD).
  • Lipid máu (Cholesterol toàn phần và Triglycerides): Phản ứng tạo phức màu quinone qua xúc tác enzym (CHER, AOD, POD cho cholesterol; Lipase, GK, GPO, POD cho triglycerides).
• Phân tích giải phẫu bệnh và vi cấu trúc gan:
  • Mô bệnh học vi thể (H&E): Cố định mô gan bằng dung dịch Carnoy (60% cồn tuyệt đối, 20% chloroform, 10% acid acetic) trong 3 giờ, đúc khối parafin, cắt lát dày $5\ \mu\text{m}$ trên máy Microtome Reichert, nhuộm Hematoxylin - Eosin để khảo sát hoại tử, thoái hóa mỡ và thâm nhiễm viêm. Quan sát trên kính hiển vi quang học Olympus IX 70 (độ phóng đại tối đa 800 lần).
  • Nhuộm ba màu Masson (Masson's Trichrome): Định vị mạng lưới sợi collagen (bắt màu xanh lam), nhân tế bào (bắt màu đen) và tế bào chất/hồng cầu (bắt màu đỏ). Phân loại mức độ xơ gan theo thang điểm METAVIR (Bảng 1).
  • Siêu cấu trúc (TEM): Cố định mẫu kích thước $1 \times 1 \times 2\text{ mm}$ bằng dung dịch Glutaraldehyde 2% và hậu cố định bằng Acid Osmic 1% trong đệm cacodylate (pH 7,3). Mẫu được khử nước qua chuỗi nồng độ cồn và propylene/Epon 812, cắt siêu mỏng 50 nm trên máy siêu cắt, nhuộm Uranyl Acetate 2% kết hợp Chì Citrate 5% và phân tích trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400 (JEOL, Nhật Bản).
• Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được biểu diễn dưới dạng Trung bình $\pm$ Độ lệch chuẩn ($\bar{X} \pm \text{SD}$). So sánh sự khác biệt giữa các nhóm bằng kiểm định Student's $t$-test với ngưỡng ý nghĩa thống kê xác định tại $p < 0{,}05$.
• Đạo đức nghiên cứu: Chuột được thuần hóa môi trường nuôi 1 tuần trước thí nghiệm, quá trình thao tác đảm bảo giảm thiểu căng thẳng, động vật được hy sinh nhân đạo bằng phương pháp kéo giãn đốt sống cổ tuân thủ quy chế thực nghiệm của Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự.

Điểm METAVIR	Giai đoạn xơ hóa	Đặc điểm mô bệnh học
F0	Không xơ hóa	Cấu trúc tiểu thùy gan bình thường.
F1	Xơ khoảng cửa	Xơ hóa mở rộng ở các khoảng cửa, không hình thành vách ngăn.
F2	Xơ hóa có vách ngăn	Xơ khoảng cửa và xuất hiện dải xơ nối khoảng cửa với khoảng cửa.
F3	Xơ hóa bắc cầu	Dải xơ liên kết rộng khắp giữa khoảng cửa và tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy.
F4	Xơ gan thực thụ	Xơ hóa lan tỏa, đảo lộn cấu trúc tiểu thùy, xuất hiện các nốt tân sinh bất thường.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các kiến thức nền tảng về giải phẫu chức năng tiểu thùy gan, dịch tễ học bệnh xơ gan trên thế giới và tại Việt Nam. Chương này tập trung phân tích sâu cơ chế bệnh sinh ở mức độ tế bào và phân tử:

• Sự biến đổi vi cấu trúc của chất nền ngoại bào (ECM) và vai trò trung tâm của tế bào hình sao gan (HSC) trong khoang Disse khi bị hoạt hóa bởi các cytokin tiền xơ hóa (TGF-$\beta$, PDGF) từ tế bào Kupffer và tế bào nội mô xoang mạch.
• Mất cân bằng động học giữa các enzym thoái biến chất nền (MMP-2, MMP-9) và các chất ức chế mô TIMP (TIMP-1, TIMP-2), dẫn đến sự lắng đọng collagen không hồi phục.
• Tổng quan so sánh các mô hình gây xơ gan thực nghiệm trên động vật: mô hình thắt ống mật chủ (BDL), mô hình miễn dịch (dùng huyết thanh dị chủng hoặc ấu trùng sán máng Schistosoma mansoni), mô hình chế độ ăn kiêng (thiếu hụt methionine - choline MCD, chế độ ăn giàu chất béo), mô hình biến đổi gen ($Mdr2^{-/-}$, $Alms1$) và mô hình hóa chất (ethanol, Thioacetamide - TAA, Dimethylnitrosamine - DMN, Diethylnitrosamine - DEN, $\text{CCl}_4$).
• Luận giải cơ chế gây độc gan chuyên biệt của $\text{CCl}_4$ qua chuyển hóa Cytochrome P450 tạo gốc tự do peroxy hóa màng tế bào, khẳng định tính khả thi của việc thiết lập mô hình xơ gan mạn tính trên chuột nhắt.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình tổ chức thực nghiệm trên 12 chuột nhắt trắng BALB/c tại Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự – Học viện Quân y trong thời gian từ tháng 06/2018 đến tháng 04/2019:

• Chi tiết hóa chất $\text{CCl}_4$ (Sigma), tá dược dầu olive, hệ thống thiết bị đo quang, kính hiển vi quang học Olympus IX 70 và kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400 (JEOL).
• Thiết lập quy trình tiêm dưới da $\text{CCl}_4$ nồng độ 160 mg/kg (pha tỉ lệ 1:18 trong dầu olive, tương ứng liều 2 ml/kg) với tần suất 2 lần/tuần.
• Trình bày công thức và thuật toán điều chỉnh liều thích ứng theo sự biến động trọng lượng cơ thể nhằm ngăn ngừa ngộ độc cấp tính và giảm thiểu tỷ lệ chuột chết trong quá trình can thiệp dài ngày.
• Chuẩn hóa các quy trình kỹ thuật: lấy máu xoang mắt, đo chỉ số huyết học tự động, định lượng hóa sinh (ALT, AST, Albumin, Bilirubin, Cholesterol, Triglycerides), quy trình cố định Carnoy cho nhuộm H&E, kỹ thuật nhuộm ba màu Masson đánh giá xơ hóa theo thang METAVIR, và quy trình xử lý mô siêu mỏng (50 nm) cho hiển vi điện tử truyền qua TEM.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thu thập được sau 1, 2 và 3 tháng can thiệp, tiến hành phân tích đối chiếu với các công bố khoa học trong và ngoài nước:

1. Tình trạng thể trạng và tăng trưởng trọng lượng:

• Trước can thiệp, trọng lượng giữa các nhóm đồng đều (~20 g). Sau quá trình tiêm $\text{CCl}_4$, tốc độ tăng trọng lượng ở nhóm gây bệnh giảm đáng kể so với nhóm đối chứng. Sau 12 tuần, chuột nhóm đối chứng tăng trung bình $13{,}75\text{ g}$, trong khi chuột nhóm tiêm $\text{CCl}_4$ chỉ tăng $3{,}31\text{ g}$.
• Trọng lượng chuột nhóm can thiệp thấp hơn có ý nghĩa thống kê ($p < 0{,}05$) so với đối chứng tại các thời điểm: sau 1 tháng chênh lệch $7{,}5 \pm 1{,}14\text{ g}$; sau 2 tháng chênh lệch $17{,}23 \pm 0{,}55\text{ g}$; sau 3 tháng chênh lệch $10{,}14 \pm 5{,}89\text{ g}$.
• Chuột tiêm $\text{CCl}_4$ xuất hiện tình trạng lừ đừ, ăn ít trong 24–48 giờ đầu sau tiêm, lông xù, giảm hoạt động vận động; ở mốc 3 tháng chuột có biểu hiện ủ rũ rõ rệt và phân chuyển sang màu bạc/vàng nhạt tương tự màu thức ăn (dấu hiệu suy giảm bài tiết mật).

2. Biến đổi chỉ số huyết học:

• Lượng bạch cầu giảm từ $10{,}9 \pm 0{,}22\text{ g/L}$ (ở lô ĐC) xuống còn $3{,}93 \pm 2{,}61\ (\times 10^3/\mu\text{L})$ sau tiêm, tương ứng mức giảm $63{,}9%$ ($p < 0{,}05$).
• Số lượng tiểu cầu giảm $26{,}09%$ ($p < 0{,}05$) so với đối chứng, phản ánh tình trạng tổn thương gan làm suy giảm tổng hợp thrombopoietin.
• Số lượng hồng cầu tăng $38{,}1%$ từ $6{,}87 \pm 0{,}1\ (\times 10^3/\mu\text{L})$ ở lô ĐC lên $9{,}11 \pm 0{,}52\ (\times 10^3/\mu\text{L})$ ở nhóm can thiệp ($p < 0{,}05$); chỉ số Hematocrit tăng từ $30{,}86 \pm 0{,}47%$ lên mức $39{,}49 - 42{,}00%$ ($p < 0{,}05$). Không ghi nhận sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về nồng độ hemoglobin và thể tích trung bình hồng cầu (MCV).

Chỉ số huyết học	Lô ĐC ($n=3$)	Lô 1T ($n=3$)	Lô 2T ($n=3$)	Lô 3T ($n=3$)
Bạch cầu (g/L)	$10{,}90 \pm 0{,}22$	$3{,}33 \pm 10{,}07$	$122{,}75 \pm 25{,}18$	$135{,}00 \pm 4{,}00^*$
Hematocrit (%)	$30{,}86 \pm 0{,}47$	$39{,}49 \pm 2{,}53^*$	$42{,}00 \pm 2{,}28^*$	$41{,}65 \pm 0{,}56^*$
MCV (fl)	$44{,}67 \pm 0{,}58$	$44{,}00 \pm 1{,}00$	$45{,}75 \pm 1{,}71$	$45{,}00 \pm 1{,}73$

*(Ghi chú: $^p < 0{,}05$ so với nhóm đối chứng).

3. Biến đổi thông số sinh hóa huyết tương:

• Hoạt độ các enzym gan tăng tiến triển theo thời gian gây độc:
  • ALT: Tăng từ $76{,}33 \pm 4{,}16\text{ U/L}$ (ĐC) lên $103{,}33 \pm 28{,}70\text{ U/L}$ (1T, tăng $35%$), $129{,}33 \pm 33{,}00\text{ U/L}$ (2T, tăng $69{,}4%$) và đạt đỉnh $232{,}33 \pm 145{,}70\text{ U/L}$ (3T, tăng $205%$) ($p < 0{,}05$).
  • AST: Tăng từ $176{,}00 \pm 24{,}68\text{ U/L}$ (ĐC) lên $197{,}00 \pm 47{,}00\text{ U/L}$ (2T, tăng $11{,}9%$) và đạt $359{,}00 \pm 219{,}00\text{ U/L}$ (3T, tăng $103{,}9%$) ($p < 0{,}05$). Tỷ số AST/ALT luôn $> 1$, phản ánh hoại tử tế bào gan sâu sắc và tổn thương cấu trúc ty thể.
• Các chỉ số Albumin ($23{,}33 - 27{,}67\text{ g/L}$), Bilirubin toàn phần ($6 - 14\ \mu\text{mol/L}$), Cholesterol ($2{,}00 - 3{,}20\text{ mmol/L}$) và Triglycerides ($1{,}07 - 1{,}71\text{ mmol/L}$) không có sự sai khác mang ý nghĩa thống kê giữa các nhóm ($p > 0{,}05$), do dung lượng mẫu nhỏ hoặc thời gian tác động chưa đủ làm suy sụp hoàn toàn chức năng tổng hợp và chuyển hóa cơ bản của gan.

Thông số sinh hóa	Lô ĐC ($n=3$)	Lô 1T ($n=3$)	Lô 2T ($n=3$)	Lô 3T ($n=3$)
ALT (U/L)	$76{,}33 \pm 4{,}16$	$103{,}33 \pm 28{,}70^*$	$129{,}33 \pm 33{,}00^*$	$232{,}33 \pm 145{,}70^*$
AST (U/L)	$176{,}00 \pm 24{,}68$	$155{,}67 \pm 15{,}00^*$	$197{,}00 \pm 47{,}00^*$	$359{,}00 \pm 219{,}00^*$
Albumin (g/L)	$23{,}33 \pm 1{,}53$	$25{,}00 \pm 2{,}00$	$27{,}67 \pm 1{,}50$	$25{,}33 \pm 1{,}50$
Bilirubin ($\mu$mol/L)	$6{,}00 \pm 2{,}00$	$13{,}00 \pm 6{,}10$	$14{,}00 \pm 7{,}00$	$9{,}00 \pm 1{,}00$
Cholesterol (mmol/L)	$2{,}73 \pm 0{,}25$	$2{,}00 \pm 0{,}60$	$3{,}20 \pm 0{,}70$	$2{,}13 \pm 0{,}58$
Triglyceride (mmol/L)	$1{,}71 \pm 0{,}28$	$1{,}24 \pm 0{,}20$	$1{,}27 \pm 0{,}20$	$1{,}07 \pm 0{,}12$

*(Ghi chú: $^p < 0{,}05$ so với nhóm đối chứng).

4. Đánh giá giải phẫu bệnh và vi cấu trúc gan:

• Đại thể: Gan nhóm đối chứng có bề mặt trơn nhẵn, màu đỏ nâu đồng nhất, bờ sắc. Gan chuột tiêm $\text{CCl}_4$ xuất hiện tình trạng thô ráp, nhạt màu, xuất hiện các nốt sần nhỏ rải rác trên bề mặt sau 2 và 3 tháng.
• Vi thể nhuộm H&E: Ghi nhận hiện tượng thoái hóa mỡ dạng bóng nước, sưng phồng tế bào gan, hoại tử khu vực quanh tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy và thâm nhiễm dày đặc tế bào viêm đơn nhân ở khoảng cửa.
• Nhuộm ba màu Masson và phân loại METAVIR: Lô 1T xuất hiện xơ hóa nhẹ quanh khoảng cửa (giai đoạn F1); Lô 2T phát triển các dải xơ liên kết khoảng cửa - khoảng cửa (giai đoạn F2); Lô 3T xuất hiện hiện tượng xơ hóa bắc cầu lan rộng liên kết khoảng cửa - trung tâm tiểu thùy, chia cắt nhu mô thành các nốt bất thường (giai đoạn F3–F4).
• Siêu cấu trúc (TEM): Dưới kính hiển vi điện tử truyền qua, tế bào gan chuột tiêm $\text{CCl}_4$ bộc lộ màng nhân nhăn nheo, chất nhiễm sắc kết cụm ngoại vi, ty thể phình to biến dạng thoái hóa gãy mào, lưới nội chất hạt giãn rộng mất hạt ribosome, và khoang Disse tích tụ dày đặc các bó sợi collagen.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

1. Xác lập thành công thông số mô hình thực nghiệm: Chứng minh phác đồ tiêm dưới da $\text{CCl}_4$ liều 160 mg/kg (pha tỉ lệ 1:18 trong dầu olive, tương đương 2 ml/kg), 2 lần/tuần duy trì liên tục trong 3 tháng gây ra tổn thương xơ gan mạn tính ổn định trên chuột nhắt trắng BALB/c với tỷ lệ sống sót cao nhờ cơ chế điều chỉnh liều theo thể trọng.
2. Xác định động học tổn thương theo thời gian:
   • Sau 1 tháng: Tổn thương viêm cấp và thoái hóa mỡ tế bào gan, hoạt độ ALT tăng $35%$, mô học đạt mức xơ hóa nhẹ khoảng cửa (METAVIR F1).
   • Sau 2 tháng: Hoạt độ ALT tăng $69{,}4%$, AST tăng $11{,}9%$, hình thành dải xơ vách ngăn khoảng cửa - khoảng cửa (METAVIR F2).
   • Sau 3 tháng: Hoạt độ ALT tăng $205%$ ($232{,}33\text{ U/L}$), AST tăng $103{,}9%$ ($359\text{ U/L}$), tỷ số AST/ALT $> 1$, mô học hình thành xơ hóa bắc cầu và nốt tân sinh hoàn chỉnh (METAVIR F3–F4).
3. Minh chứng tổn thương đa tầng: Kết hợp đồng bộ dữ liệu huyết học (giảm $63{,}9%$ bạch cầu, giảm $26{,}09%$ tiểu cầu, tăng Hematocrit), hóa sinh enzym hoại tử tế bào, hình ảnh mô bệnh học quang học (nhuộm H&E, Masson) và biến đổi siêu vi cấu trúc bào quan qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).

Đóng góp so với các nghiên cứu trước

• Khắc phục nhược điểm của các nghiên cứu trong nước trước đó vốn chủ yếu dùng đường uống hoặc tiêm màng bụng dễ gây viêm phúc mạc cục bộ hoặc tỷ lệ tử vong cao ở giai đoạn đầu (như mô hình của Trần Hồng Diễm 2010 dùng đường uống trong 8 tuần; Phan Kim Định 2018 dùng đường uống 4 tuần; Nguyễn Thùy Dương 2019 tiêm màng bụng chỉ theo dõi sinh hóa).
• Nghiên cứu đã xây dựng quy trình tiêm dưới da kèm thuật toán điều chỉnh liều định lượng giúp bảo tồn thể trạng chuột, đồng thời là công trình thực nghiệm theo dõi diễn tiến xơ hóa kéo dài 3 tháng và áp dụng phương pháp phân tích siêu cấu trúc (TEM) để khẳng định sự tích tụ sợi collagen tại khoang Disse và tổn thương ty thể ở cấp độ bào quan.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Quy mô mẫu nghiên cứu còn nhỏ: Mỗi nhóm thực nghiệm chỉ có $n = 3$ chuột, do đó độ lệch chuẩn ở một số chỉ tiêu sinh hóa và huyết học còn lớn, làm cho sự biến thiên của các chỉ số chức năng gan như Albumin, Bilirubin, Cholesterol và Triglycerides chưa đạt mức sai khác có ý nghĩa thống kê ($p > 0{,}05$).
• Chưa khảo sát giai đoạn hồi phục: Đề tài chỉ tập trung vào chiều hướng gây bệnh tiến triển trong 3 tháng, chưa thiết lập lô dừng hóa chất để theo dõi khả năng tự thoái lui hoặc duy trì của dải xơ gan.
• Chưa định lượng hóa sinh mô và biểu hiện gen: Chưa thực hiện định lượng hàm lượng hydroxyproline trong mô gan cũng như phân tích mức độ biểu hiện gen mã hóa procollagen, $\alpha$-SMA, TGF-$\beta$ và các enzym MMP/TIMP bằng kỹ thuật Real-time PCR hoặc Western blot.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng cỡ mẫu thực nghiệm ($n \ge 8 - 10$ chuột/nhóm) nhằm tăng độ tin cậy và lực thống kê cho các chỉ tiêu sinh hóa và huyết học.
• Ứng dụng mô hình đã chuẩn hóa này vào các thử nghiệm tiền lâm sàng đánh giá tác dụng bảo vệ gan, kháng viêm và ức chế/đảo ngược xơ hóa của các hợp chất tự nhiên hoặc dược chất mới.
• Bổ sung các kỹ thuật sinh học phân tử định lượng nồng độ collagen mô học (hydroxyproline) và biểu hiện các dấu ấn xơ hóa ở mức độ phiên mã và dịch mã.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Sinh học, Dược lý học, Công nghệ Sinh học Y - Dược, Bác sĩ nội trú và các nhóm nghiên cứu bệnh học thực nghiệm.
• Nội dung có giá trị ứng dụng cao:
  • Quy trình chi tiết pha chế $\text{CCl}_4$ trong dầu olive (tỉ lệ 1:18) và kỹ thuật tiêm dưới da luân chuyển vị trí để hạn chế viêm hoại tử mô.
  • Thuật toán điều chỉnh liều can thiệp theo biến thiên trọng lượng chuột giúp giảm tỷ lệ tử vong trong các nghiên cứu mạn tính dài ngày.
  • Bảng đối chiếu tiêu chuẩn mô bệnh học METAVIR trên động vật gặm nhấm và quy trình xử lý tiêu bản nhuộm ba màu Masson, tiêu bản siêu mỏng phân tích TEM.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lựa chọn đường tiêm dưới da thay vì tiêm màng bụng hay cho uống $\text{CCl}_4$?
Trả lời: Tiêm màng bụng thường gây kích ứng mạnh, dẫn đến viêm phúc mạc dính mạn tính ảnh hưởng nghiêm trọng đến thể trạng động vật, trong khi đường uống có tỷ lệ tử vong rất cao trong các tuần đầu do ngộ độc tiêu hóa cấp tính. Đường tiêm dưới da cho phép thuốc hấp thu từ từ, kết hợp với việc thay đổi vị trí tiêm giúp chuột dung nạp tốt, giảm thiểu tỷ lệ tử vong và duy trì mô hình ổn định suốt 3 tháng.

2. Tỷ số AST/ALT ở nhóm chuột sau 3 tháng tiêm $\text{CCl}_4$ phản ánh điều gì?
Trả lời: Sau 3 tháng, nồng độ AST ($359\text{ U/L}$) tăng vượt trội so với ALT ($232{,}33\text{ U/L}$), thiết lập tỷ số AST/ALT $> 1$. Hiện tượng này phản ánh tình trạng hoại tử tế bào gan tiến triển nặng nề, làm tổn thương cấu trúc màng ty thể và giải phóng lượng lớn enzym AST nội ty thể vào tuần hoàn huyết tương, đồng thời gợi ý tình trạng ứ mật và xơ gan tiến triển.

3. Vì sao các chỉ số Albumin và Bilirubin không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa nhóm mô hình và đối chứng?
Trả lời: Sự sai khác chưa đạt ý nghĩa thống kê ($p > 0{,}05$) chủ yếu do dung lượng mẫu còn nhỏ ($n = 3$ chuột/nhóm) và sự dao động sinh lý giữa các cá thể. Ngoài ra, mức liều $\text{CCl}_4$ 160 mg/kg gây tổn thương xơ hóa cấu trúc tiến triển nhưng các tế bào gan còn lại vẫn duy trì khả năng bù trừ chức năng tổng hợp albumin và liên hợp bilirubin cơ bản.

4. Dấu hiệu tổn thương gan nào được phát hiện dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)?
Trả lời: Dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), tế bào gan chuột can thiệp $\text{CCl}_4$ bộc lộ rõ tình trạng màng nhân co kéo nhăn nheo, chất nhiễm sắc phân bố vón cục, ty thể sưng phồng biến dạng thoái hóa gãy mào, mạng lưới nội chất hạt giãn rộng bong tróc ribosome, và đặc biệt là sự tăng sinh, tích tụ dày đặc các bó sợi collagen ngoại bào bên trong khoang Disse.

---

Kết luận

Khóa luận đã xây dựng thành công mô hình xơ gan mạn tính trên chuột nhắt trắng BALB/c bằng phương pháp tiêm dưới da carbon tetrachloride ($\text{CCl}_4$) liều 160 mg/kg (2 lần/tuần) trong thời gian 3 tháng. Nghiên cứu đã chứng minh tiến trình tổn thương tiến triển rõ rệt theo thời gian từ mức độ xơ hóa khoảng cửa (1 tháng) đến xơ hóa bắc cầu hình thành nốt sần bất thường (3 tháng), đi kèm với sự tăng vọt hoạt độ các men gan ALT, AST và biến đổi siêu cấu trúc tế bào. Quy trình thực nghiệm và thuật toán điều chỉnh liều được xác lập trong đề tài cung cấp một mô hình động vật chuẩn hóa, có độ tin cậy và tính lặp lại cao phục vụ các nghiên cứu sàng lọc thuốc chống xơ hóa gan trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Cấu trúc cơ bản của tiểu thùy gan Tiểu thùy gan là đơn vị chức năng của gan. Mỗi tiểu thùy có tĩnh mạch trung tâm, đổ vào tĩnh mạch gan và chảy vào tĩnh mạch chủ. Ngoại vi của mỗi tiểu thùy, nơi tập trung ống dẫn mật, các nhánh tĩnh mạch cửa và động mạch gan. Các tế bào gan được phân chia bởi các xoang, từ ngoại vi vào trung tâm tiểu thùy gan.

Các xoang này nhận máu từ tĩnh mạch cửa và động mạch gan. Cấu trúc này cho phép các tế bào gan loại các chất ra khỏi máu hoặc có thể giải phóng các chất vào máu khi nó qua các xoang. Trong tiểu thùy gan cũng chứa các mao quản mật nằm giữa màng tế bào các tế bào gan liền kề. Các tế bào gan sản xuất mật đổ vào mao quản mật, đổ vào ống mật ở ngoại vi thùy gan, góp vào ống mật lớn rồi góp vào ống gan trái và phải, tạo thành cây gan mật[21].

Cấu trúc trên đây cũng là cơ sở để tiến hành đánh giá các tổn thương đối với gan ở mức tế bào, mô thông qua việc đánh giá tổn thương của khoảng cửa, tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy, các bè gan, ống mật….1 Thực trạng bệnh xơ gan Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) (2015) xơ gan là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 11 trên thế giới, gây ra hơn 1 triệu ca tử vong[19]. Tại Mỹ theo thông báo của Trung tâm Thống kê Y tế Quốc gia (NCHS) năm 2015 có 42.443 ca tử vong do xơ gan chiếm tỷ lệ 13,2 ca/100. Tỷ lệ tử vong do xơ gan khá cao ở hầu hết các nước Châu Á và Châu Phi, nơi có tình trạng viên gan B và C mạn tính khá phổ biến, trong đó Ai Cập, Moldova và Mông Cổ có tỷ lệ tử vong do xơ gan cao nhất trên thế giới. Trên thực tế, tỷ lệ bệnh nhân xơ gan có thể cao hơn so với các số liệu đã công bố do bệnh nhân xơ gan ở giai đoạn còn bù thường không có triệu chứng và hầu hết.

Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh học các trường hợp chỉ được phát hiện khi đã xuất hiện các biến chứng, và nhiều nước trên thế giới không có con số thống kê chính xác, đặc biệt là Châu Phi[19]. Tỷ lệ tử vong trong vòng 1 năm của bệnh nhân xơ gan dao động từ 1% đến 57% tùy thuộc vào giai đoạn bệnh[27]. Bên cạnh đó, gần 59% bệnh nhân xơ gan sẽ xuất hiện cổ trướng trong 10 năm và gần một nửa số ca xuất hiện cổ trướng sẽ tử vong trong vòng 2 năm[47]. Tại Việt Nam, xơ gan là nguyên nhân tử vong đứng thứ 10.

Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong 3 quốc gia nằm ở phía Tây Thái Bình Dương có tỷ lệ nhiễm viêm gan virut cao nhất, ước tính khoảng 8,7 triệu người mặc viêm gan B và 1 triệu người mắc viêm gan C mạn tính (2016); trong đó, tỷ lệ bệnh nhân viêm gan mạn tính chuyển thành xơ gan là khá cao[58].2 Tiến trình bệnh lý xơ gan Xơ gan thể hiện cho giai đoạn cuối của quá trình xơ hóa gan, phản ứng chữa lành cho tổn thương gan mạn tính. Xơ gan đặc trưng bởi sự biến dạng các nhu mô gan liên quan đến dải xơ và hình thành các nốt sần cũng như thay đổi lưu lượng máu. Quá trình xơ hóa tự nhiên bắt đầu với một giai đoạn dài không triệu chứng, được gọi là giai đoạn bù lại, sau đó là một giai đoạn tiến triển nhanh được gọi là xơ gan mất bù, có dấu hiện lâm sàng là tăng huyết áp cổng và hoặc sự sai hỏng chức năng gan. Những biến chứng khác có thể phát triển bao gồm tràn dịch màng bụng, hội chứng gan thận, hội chứng gan phổi, viêm phúc mạc do vi khuẩn tự phát có thể làm trầm trọng thêm quá trình bệnh.

Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) có thể phát triển ở bất kỳ giai đoạn nào của xơ gan.Ghép gan thường được sử dụng là biện pháp duy nhất để điều trị xơ gan và có thể cải thiện khả năng sống sót và chất lượng cuộc sống ở những bệnh nhân bệnh gan giai đoạn cuối được lựa chọn[45].3 Nguyên nhân gây xơ gan. Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh học Xơ gan xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau, là kết quả của quá trình tổn thương gan lâu dài. Nguyên nhân phổ biến ở các nước phương Tây là do gan nhiễm mỡ do nghiện rượu, nhiễm virus viêm gan C mạn tính và bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD). Trong khi viêm gan B mạn tính là nguyên nhân chính gây xơ gan ở khu vực châu Á – Thái Bình Dương.

Một số nguyên nhân khác do tổn thương ống mật như xơ mật nguyên phát (PBS – Primary biliary cirrhosis), viêm xơ chai đường mật nguyên phát (PSC – Primary sclerosing cholangitis) và viêm gan tự miễn dịch, hay do các bệnh di truyền (bệnh Wilson, hemochromatosis, thiếu hụt alpha-1 antitrypsin, hyperoxaluria và oxalosis), thuốc, chất độc, ký sinh trùng. Một số trường hợp là tự phát hoặc không rõ nguyên nhân. Trong những thập kỷ gần đây, NAFLD đã trở thành nguyên nhân hàng đầu gây bệnh gan mạn tính ở các nước phương Tây như Hoa Kỳ, với tỷ lệ cao tới 30% trong dân số nói chung[64]. Trong số các nguyên nhân trên, rượu và nhiễm virut viêm gan là 2 nguyên nhân hay gặp nhất.

Theo thống kê của Hiệp hội Nghiên cứu bệnh gan Hoa Kỳ (AASLD) rượu là nguyên nhân hay gặp nhất của bệnh gan trên toàn thế giới được biệt ở các nước phát triển. và cộng sự tổng hợp 43 nghiên cứu trên khắp thế giới về nguyên nhân xơ gan cho thấy 57% căn nguyên xơ gan trên toàn thế giới là do nhiễm virut viêm gan trong đó 30% do HBV và 27% do HCV[9]. Tại Việt Nam, nguyên nhân xơ gan chủ yếu do virut, ngoài ra rượu cũng là nguyên nhân đáng kể và tăng nhiều trong những năm gần đây. Theo nghiên cứu của Vũ Văn Khiên, Bùi Văn Lạc, Mai Hồng Bàng cho thấy trong các nguyên nhân gây xơ gan nguyên nhân do virut viêm gan B chiếm 55%, 20% do rượu, 5% do virut viêm gan C, do rượu và virut viêm gan B chiếm 5% và 15% do các nguyên nhân khác[1].4 Cơ chế bệnh sinh của xơ gan.

Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh học Xơ hóa gan là kết quả đáp ứng làm lành tổn thương gan lặp đi lặp lại. Có 4 thay đổi cơ bản trong mô gan xơ hóa so với mô gan bình thường: (1) tái sắp xếp mô học, (2) thay đổi vi cấu trúc của chất nền ngoại bào (ECM – Extracellular matrix), (3) tăng hàm lượng ECM, (4) thay đổi thành phần của ECM[14]. Sau tổn thương gan cấp tính (như viêm gan viruts), các tế bào như mô tăng sinh và thay thế các tế bào hoại tử hoặc bị chết theo chu trình. Quá trình này liên quan đến phản ứng viêm và tích tụ có giới hạn chất nền ngoại bào.

Nếu tổn thương gan vẫn tiếp diễn, sự tái sinh của gan không đủ để phục hồi, các tế bào gan sẽ bị thay thế bởi lượng lớn chất nền ngoại bào, bao gồm sợi collagen. Khi xơ hóa phát triển, bệnh tiến triển từ các dải collagen thành sự xơ hóa bắc cầu dẫn tới hình thành xơ gan[18]. Ở giai đoạn tiến triển, lượng ECM trong gan tăng khoảng 6 lần so với bình thường bao gồm collagen (typ I, II và IV), fibronectin, undulin, elastin, laminin, hyaluronan và proteoglycan. Tế bào hình sao (HSC) là các tế bào sản xuất ECM chủ yếu trong mô gan tổn thương.

Trong gan bình thường, tế bào hình sao cư trú ở khoang Disse và là nơi dự trữ vitamin A chủ yếu. Sau tổn thương gan mạn tính, các tế bào hình sao được hoạt hóa và chuyển thành các nguyên bào sợi. Các tế bào này sẽ di chuyển và tích tụ ở những vùng mô cần sửa chữa, tiết ra một lượng lớn collagen và chất nền ngoại bào, cuối cùng dẫn đến xơ hóa gan[18]. Ngoài các tế bào hình sao, ECM còn có nguồn gốc từ nhiều loại tếbào khác như các tế bào có nguồn gốc từ tủy xương.

Trong nghiên cứu của Kisscleva và cộng sự năm 2006 cho thấy các tế bào sợi từ tủy xương có thể biệt hóa thành nguyên bào sợi cơ (MFB) sản xuất collagen nhờ TGF – β. Bên cạnh đó, một số bằng chứng cho thấy tế bào trung mô ở khoảng của có liên quan đến quá trình xơ hóa[63]. Ngoài ra, các nguyên bào sợi cơ có nguồn gốc từ quá trình chuyển dạng biểu mô – trung mô đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh xơ hóa liên quan đến các bệnh về ứ mật[56]. Hoạt hóa tế bào hình sao là sự kiện trung tâm trong xơ hóa gan[18].

Quá trình này được khởi phát bởi nhiều yếu tố bao gồm các cytokin (đặc biệt là TGF. Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh học – β, yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu, các gốc oxy hoạt động, các tế bào chết theo chương trình…)[30]. Quá trình hoạt hóa tế bào hình sao trải qua 2 giai đoạn chính: giai đoạn khởi đầu và giai đoạn duy trì. Giai đoạn khởi đầu có liên quan đến những thay đổi sớm về biểu hiện gen và kiểu hình đáp ứng với các cytokin và các kích thích khác, chủ yếu liên quan đến các kích thích cận tiết.

Trong khi đó, giai đoạn duy trì là kết quả của các kích thích này trong việc duy trì kiểu hình.Trong giai đoạn khởi đầu, những thay đổi sớm nhất của các tế bào hình sao có thể là do kích thích cận tiết bởi các tế bào lân cận, bao gồm: tế bào nội mô mao mạch hình sin, tế bào Kupffer, tế bào gan và tiểu cầu. Các tế bào nội mô có thể tham gia vào sự chuyển đổi yếu tố tăng trưởng TGF – β sang dạng hoạt hóa, trở thành tác nhân gây xơ hóa. Tiểu cầu cũng là nguồn kích thích cận tiết quan trọng, bao gồm các yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), TGF – β1, yếu tố tăng trưởng biểu bì. Ngoài ra, các tế bào Kupffer có thể tham gia vào quá trình hoạt hóa tế bào hình sao, chúng kích thích tổng hợp chất nền, tăng sinh tế bào và giải phóng retinoid từ các tế bào hình sao thông qua hoạt động của các cytokin (đặc biệt là TGF – β) và các gốc oxy hoạt động.

Các tế bào gan bị phá hủy giải phóng các gốc oxy hoạt động và các chất trung gian gây xơ, kích thích hoạt hóa HSC và hoạt tính xơ hóa của các nguyên bào sợi cơ.