Nghiên cứu xây dựng mô hình xơ gan trên chuột nhắt bằng carbon tetraclorid

Quy trình xây dựng mô hình xơ gan trên chuột bằng CCl4. Đánh giá tổn thương gan qua chỉ số huyết học, hóa sinh và kết quả phân tích mô học.

• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu xây dựng mô hình xơ gan trên chuột nhắt bằng hóa chất
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về mô hình xơ gan CCl4 trên chuột

Mô hình xơ gan bằng carbon tetrachloride (CCl4) là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để xây dựng mô hình bệnh lý gan trên động vật thí nghiệm, đặc biệt là trên chuột. Xơ gan là bệnh lý nguy hiểm đứng thứ 11 nguyên nhân tử vong trên thế giới, làm ảnh hưởng đến chức năng gan và có thể dẫn đến ung thư gan. CCl4 là một hóa chất độc tính cao, khi xâm nhập vào cơ thể được chuyển hóa bởi enzyme tại gan, tạo ra các gốc tự do và các chất trung gian độc hại gây tổn thương tế bào gan. Quy trình xây dựng mô hình này giúp các nhà nghiên cứu hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh, tiến trình phát triển của bệnh lý và tìm kiếm các phương pháp điều trị hiệu quả.

1.1. Định nghĩa và ý nghĩa của mô hình xơ gan CCl4

Mô hình xơ gan CCl4 được sử dụng để mô phỏng quá trình xơ hóa gan ở con người. Mô hình này cho phép nghiên cứu chi tiết về cơ chế bệnh sinh, đánh giá hiệu quả của các loại thuốc mới và phương pháp điều trị. CCl4 gây tổn thương gan nặng thông qua oxidative stress và viêm gan, dẫn đến fibrosis (xơ hóa) lan tỏa. Sử dụng mô hình động vật giúp các nhà khoa học có cái nhìn toàn diện về bệnh lý trước khi thử nghiệm lâm sàng trên người.

1.2. Vai trò của carbon tetrachloride trong gây xơ gan

Carbon tetrachloride (CCl4) là một hóa chất có tính chất hepatotoxic mạnh mẽ. Khi CCl4 được tiêm vào cơ thể chuột, nó được chuyển hóa bởi cytochrome P450 thành các chất trung gian độc hại như CCl3 và CCl3OO. Những chất này gây ra tổn thương tế bào gan, kích hoạt hepatic stellate cells (HSCs), dẫn đến sản sinh collagen quá mức và hình thành xơ hóa gan. CCl4 còn gây necrosis (hoại tử) tế bào gan, steatosis (tích mỡ) và viêm gan mạn tính.

II. Quy trình xây dựng mô hình xơ gan trên chuột

Quy trình xây dựng mô hình xơ gan bằng CCl4 trên chuột được tiến hành một cách có hệ thống và khoa học. Thường sử dụng chuột nhắt trắng BALB/c ở độ tuổi 8-10 tuần, vì ở tuổi này hệ thống miễn dịch và chuyển hóa của chuột đã phát triển hoàn chỉnh. CCl4 được pha loãng trong dầu khoáng với nồng độ thích hợp và tiêm dưới da (subcutaneously) với liều lượng và tần suất nhất định. Thời gian xây dựng mô hình thường kéo dài từ 8-12 tuần để tạo ra xơ gan ở giai đoạn mong muốn. Trong suốt quá trình thí nghiệm, chuột được theo dõi chặt chẽ về trọng lượng, tình trạng toàn thân, ăn uống và các dấu hiệu bệnh lý.

2.1. Lựa chọn động vật thí nghiệm và chuẩn bị

Chọn chuột nhắt trắng BALB/c 8-10 tuần tuổi, khỏe mạnh, không nhiễm bệnh. Chuột được nuôi trong điều kiện môi trường chuẩn: nhiệt độ 20-24°C, độ ẩm 50-70%, chu kỳ sáng tối 12 giờ. Chuột được chia thành các nhóm: nhóm đối chứng không tiêm CCl4 và nhóm tiêm CCl4 với các liều lượng khác nhau. Mỗi chuột được cân trọng lượng ban đầu, đánh dấu nhận diện, và ghi chép dữ liệu cơ bản trước khi bắt đầu thí nghiệm.

2.2. Phương pháp tiêm CCl4 và lịch trình điều trị

CCl4 được pha loãng 1:9 trong dầu khoáng, tạo nồng độ 20%. Tiêm dưới da (subcutaneous injection) vào vùng cơ lưng chuột với liều 3 ml/kg thể trọng, tiêm 2 lần/tuần trong 8-12 tuần. Sau mỗi lần tiêm, chuột được theo dõi hành vi, tình trạng lông, ăn uống, và các dấu hiệu viêm tại vị trí tiêm. Chuột nhóm đối chứng được tiêm dầu khoáng thuần với liều lượng tương tự. Ghi chép chi tiết thời gian, liều lượng và tình trạng chuột sau mỗi lần tiêm.

III. Phương pháp đánh giá hiệu quả tạo xơ gan

Đánh giá hiệu quả của mô hình xơ gan CCl4 được thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau. Đánh giá lâm sàng bao gồm theo dõi sự thay đổi trọng lượng, tình trạng lông, thói quen ăn uống và hành vi của chuột. Xét nghiệm huyết học giúp xác định sự thay đổi về số lượng và chất lượng các tế bào máu. Xét nghiệm hóa sinh đo lường hoạt độ các enzyme gan như ALT, AST, ALP, GGT và nồng độ các chỉ số chuyển hóa. Mô bệnh học là phương pháp quan trọng nhất, sử dụng nhuộm H&E, nhuộm Masson để đánh giá cấu trúc mô gan, mức độ xơ hóa, và giai đoạn fibrosis theo thang điểm METAVIR.

3.1. Đánh giá lâm sàng và huyết học

Theo dõi trọng lượng chuột mỗi tuần để phát hiện sự suy giảm do độc tính CCl4. Quan sát tình trạng lông, phân chuột, tính năng động của chuột. Lấy máu qua mắt chuột định kỳ (tuần thứ 0, 4, 8, 12) để xác định chỉ số huyết học: RBC, WBC, MCV, hemoglobin. Sự giảm hemoglobin và RBC cho thấy thiếu máu do bệnh gan mạn tính. Xét nghiệm huyết học giúp đánh giá chung tình trạng sức khỏe và mức độ suy chức năng gan.

3.2. Đánh giá sinh hóa và mô bệnh học

Đo hoạt độ enzyme gan (ALT, AST, ALP) từ huyết thanh chuột. Tăng cao ALT và AST chỉ tổn thương tế bào gan, nên nồng độ huyết tố tăng cho thấy cholestasis. Sinh thiết gan lấy mô gan để nhuộm H&E (quan sát viêm, thoái hóa) và nhuộm Masson (đánh giá lượng collagen). Giai đoạn xơ hóa được phân loại theo METAVIR: F0-F4, với F4 là xơ gan hoàn toàn. Kính hiển vi điện tử giúp quan sát chi tiết cấu trúc tế bào gan bị tổn thương.

IV. Ý nghĩa khoa học và ứng dụng lâm sàng của mô hình

Mô hình xơ gan CCl4 trên chuột có ý nghĩa khoa học rất lớn trong nghiên cứu bệnh gan mạn tính. Mô hình này cho phép các nhà nghiên cứu tái tạo được quá trình xơ hóa gan diễn ra ở con người, từ đó có thể: (1) Nghiên cứu cơ chế bệnh sinh chi tiết của xơ gan; (2) Đánh giá hiệu quả của các loại thuốc mới trong điều trị xơ gan; (3) Tìm hiểu vai trò của các yếu tố di truyền và môi trường trong phát triển bệnh lý; (4) Phát triển các phương pháp chẩn đoán và theo dõi bệnh tiến bộ. Kết quả từ mô hình động vật này cung cấp dữ liệu tiền lâm sàng quan trọng, là nền tảng để phát triển các liệu pháp điều trị mới, góp phần cải thiện sức khỏe bệnh nhân xơ gan trên thế giới.

4.1. Ứng dụng trong nghiên cứu cơ bản và phát triển thuốc

Mô hình xơ gan cho phép nghiên cứu chi tiết cơ chế hoạt động của hepatic stellate cells (HSCs) và quá trình fibrogenesis. Nhà khoa học có thể kiểm tra hiệu quả của các hợp chất có tiềm năng, từ đó lựa chọn các ứng cử viên thuốc tốt nhất để thử nghiệm trên người. Mô hình này giúp xác định liều lượng an toàn, tác dụng phụ, và cơ chế tác dụng của thuốc. Các phát hiện từ mô hình động vật tạo cơ sở vững chắc cho các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn sau, rút ngắn thời gian và chi phí phát triển thuốc mới.

4.2. Đóng góp cho y học lâm sàng và công tác phòng chống bệnh

Kết quả từ mô hình xơ gan CCl4 cung cấp thông tin quý báu về tiên lượng, diễn tiến bệnh, và đáp ứng điều trị của xơ gan. Các phát hiện này giúp bác sĩ lâm sàng hiểu rõ hơn về bệnh lý, từ đó có kế hoạch điều trị cá nhân hóa tốt hơn. Mô hình cũng giúp phát triển các chỉ số sinh học (biomarkers) mới để chẩn đoán sớm xơ gan. Góp phần nâng cao chất lượng chăm sóc bệnh nhân và cải thiện đáp ứng điều trị, từ đó giảm tỉ lệ tử vong do xơ gan trên thế giới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Cấu trúc cơ bản của tiểu thùy gan Tiểu thùy gan là đơn vị chức năng của gan. Mỗi tiểu thùy có tĩnh mạch trung tâm, đổ vào tĩnh mạch gan và chảy vào tĩnh mạch chủ. Ngoại vi của mỗi tiểu thùy, nơi tập trung ống dẫn mật, các nhánh tĩnh mạch cửa và động mạch gan. Các tế bào gan được phân chia bởi các xoang, từ ngoại vi vào trung tâm tiểu thùy gan.

Các xoang này nhận máu từ tĩnh mạch cửa và động mạch gan. Cấu trúc này cho phép các tế bào gan loại các chất ra khỏi máu hoặc có thể giải phóng các chất vào máu khi nó qua các xoang. Trong tiểu thùy gan cũng chứa các mao quản mật nằm giữa màng tế bào các tế bào gan liền kề. Các tế bào gan sản xuất mật đổ vào mao quản mật, đổ vào ống mật ở ngoại vi thùy gan, góp vào ống mật lớn rồi góp vào ống gan trái và phải, tạo thành cây gan mật[21].

Cấu trúc trên đây cũng là cơ sở để tiến hành đánh giá các tổn thương đối với gan ở mức tế bào, mô thông qua việc đánh giá tổn thương của khoảng cửa, tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy, các bè gan, ống mật….1 Thực trạng bệnh xơ gan Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) (2015) xơ gan là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 11 trên thế giới, gây ra hơn 1 triệu ca tử vong[19]. Tại Mỹ theo thông báo của Trung tâm Thống kê Y tế Quốc gia (NCHS) năm 2015 có 42.443 ca tử vong do xơ gan chiếm tỷ lệ 13,2 ca/100. Tỷ lệ tử vong do xơ gan khá cao ở hầu hết các nước Châu Á và Châu Phi, nơi có tình trạng viên gan B và C mạn tính khá phổ biến, trong đó Ai Cập, Moldova và Mông Cổ có tỷ lệ tử vong do xơ gan cao nhất trên thế giới. Trên thực tế, tỷ lệ bệnh nhân xơ gan có thể cao hơn so với các số liệu đã công bố do bệnh nhân xơ gan ở giai đoạn còn bù thường không có triệu chứng và hầu hết.

Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh học các trường hợp chỉ được phát hiện khi đã xuất hiện các biến chứng, và nhiều nước trên thế giới không có con số thống kê chính xác, đặc biệt là Châu Phi[19]. Tỷ lệ tử vong trong vòng 1 năm của bệnh nhân xơ gan dao động từ 1% đến 57% tùy thuộc vào giai đoạn bệnh[27]. Bên cạnh đó, gần 59% bệnh nhân xơ gan sẽ xuất hiện cổ trướng trong 10 năm và gần một nửa số ca xuất hiện cổ trướng sẽ tử vong trong vòng 2 năm[47]. Tại Việt Nam, xơ gan là nguyên nhân tử vong đứng thứ 10.

Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong 3 quốc gia nằm ở phía Tây Thái Bình Dương có tỷ lệ nhiễm viêm gan virut cao nhất, ước tính khoảng 8,7 triệu người mặc viêm gan B và 1 triệu người mắc viêm gan C mạn tính (2016); trong đó, tỷ lệ bệnh nhân viêm gan mạn tính chuyển thành xơ gan là khá cao[58].2 Tiến trình bệnh lý xơ gan Xơ gan thể hiện cho giai đoạn cuối của quá trình xơ hóa gan, phản ứng chữa lành cho tổn thương gan mạn tính. Xơ gan đặc trưng bởi sự biến dạng các nhu mô gan liên quan đến dải xơ và hình thành các nốt sần cũng như thay đổi lưu lượng máu. Quá trình xơ hóa tự nhiên bắt đầu với một giai đoạn dài không triệu chứng, được gọi là giai đoạn bù lại, sau đó là một giai đoạn tiến triển nhanh được gọi là xơ gan mất bù, có dấu hiện lâm sàng là tăng huyết áp cổng và hoặc sự sai hỏng chức năng gan. Những biến chứng khác có thể phát triển bao gồm tràn dịch màng bụng, hội chứng gan thận, hội chứng gan phổi, viêm phúc mạc do vi khuẩn tự phát có thể làm trầm trọng thêm quá trình bệnh.

Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) có thể phát triển ở bất kỳ giai đoạn nào của xơ gan.Ghép gan thường được sử dụng là biện pháp duy nhất để điều trị xơ gan và có thể cải thiện khả năng sống sót và chất lượng cuộc sống ở những bệnh nhân bệnh gan giai đoạn cuối được lựa chọn[45].3 Nguyên nhân gây xơ gan. Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh học Xơ gan xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau, là kết quả của quá trình tổn thương gan lâu dài. Nguyên nhân phổ biến ở các nước phương Tây là do gan nhiễm mỡ do nghiện rượu, nhiễm virus viêm gan C mạn tính và bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD). Trong khi viêm gan B mạn tính là nguyên nhân chính gây xơ gan ở khu vực châu Á – Thái Bình Dương.

Một số nguyên nhân khác do tổn thương ống mật như xơ mật nguyên phát (PBS – Primary biliary cirrhosis), viêm xơ chai đường mật nguyên phát (PSC – Primary sclerosing cholangitis) và viêm gan tự miễn dịch, hay do các bệnh di truyền (bệnh Wilson, hemochromatosis, thiếu hụt alpha-1 antitrypsin, hyperoxaluria và oxalosis), thuốc, chất độc, ký sinh trùng. Một số trường hợp là tự phát hoặc không rõ nguyên nhân. Trong những thập kỷ gần đây, NAFLD đã trở thành nguyên nhân hàng đầu gây bệnh gan mạn tính ở các nước phương Tây như Hoa Kỳ, với tỷ lệ cao tới 30% trong dân số nói chung[64]. Trong số các nguyên nhân trên, rượu và nhiễm virut viêm gan là 2 nguyên nhân hay gặp nhất.

Theo thống kê của Hiệp hội Nghiên cứu bệnh gan Hoa Kỳ (AASLD) rượu là nguyên nhân hay gặp nhất của bệnh gan trên toàn thế giới được biệt ở các nước phát triển. và cộng sự tổng hợp 43 nghiên cứu trên khắp thế giới về nguyên nhân xơ gan cho thấy 57% căn nguyên xơ gan trên toàn thế giới là do nhiễm virut viêm gan trong đó 30% do HBV và 27% do HCV[9]. Tại Việt Nam, nguyên nhân xơ gan chủ yếu do virut, ngoài ra rượu cũng là nguyên nhân đáng kể và tăng nhiều trong những năm gần đây. Theo nghiên cứu của Vũ Văn Khiên, Bùi Văn Lạc, Mai Hồng Bàng cho thấy trong các nguyên nhân gây xơ gan nguyên nhân do virut viêm gan B chiếm 55%, 20% do rượu, 5% do virut viêm gan C, do rượu và virut viêm gan B chiếm 5% và 15% do các nguyên nhân khác[1].4 Cơ chế bệnh sinh của xơ gan.

Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh học Xơ hóa gan là kết quả đáp ứng làm lành tổn thương gan lặp đi lặp lại. Có 4 thay đổi cơ bản trong mô gan xơ hóa so với mô gan bình thường: (1) tái sắp xếp mô học, (2) thay đổi vi cấu trúc của chất nền ngoại bào (ECM – Extracellular matrix), (3) tăng hàm lượng ECM, (4) thay đổi thành phần của ECM[14]. Sau tổn thương gan cấp tính (như viêm gan viruts), các tế bào như mô tăng sinh và thay thế các tế bào hoại tử hoặc bị chết theo chu trình. Quá trình này liên quan đến phản ứng viêm và tích tụ có giới hạn chất nền ngoại bào.

Nếu tổn thương gan vẫn tiếp diễn, sự tái sinh của gan không đủ để phục hồi, các tế bào gan sẽ bị thay thế bởi lượng lớn chất nền ngoại bào, bao gồm sợi collagen. Khi xơ hóa phát triển, bệnh tiến triển từ các dải collagen thành sự xơ hóa bắc cầu dẫn tới hình thành xơ gan[18]. Ở giai đoạn tiến triển, lượng ECM trong gan tăng khoảng 6 lần so với bình thường bao gồm collagen (typ I, II và IV), fibronectin, undulin, elastin, laminin, hyaluronan và proteoglycan. Tế bào hình sao (HSC) là các tế bào sản xuất ECM chủ yếu trong mô gan tổn thương.

Trong gan bình thường, tế bào hình sao cư trú ở khoang Disse và là nơi dự trữ vitamin A chủ yếu. Sau tổn thương gan mạn tính, các tế bào hình sao được hoạt hóa và chuyển thành các nguyên bào sợi. Các tế bào này sẽ di chuyển và tích tụ ở những vùng mô cần sửa chữa, tiết ra một lượng lớn collagen và chất nền ngoại bào, cuối cùng dẫn đến xơ hóa gan[18]. Ngoài các tế bào hình sao, ECM còn có nguồn gốc từ nhiều loại tếbào khác như các tế bào có nguồn gốc từ tủy xương.

Trong nghiên cứu của Kisscleva và cộng sự năm 2006 cho thấy các tế bào sợi từ tủy xương có thể biệt hóa thành nguyên bào sợi cơ (MFB) sản xuất collagen nhờ TGF – β. Bên cạnh đó, một số bằng chứng cho thấy tế bào trung mô ở khoảng của có liên quan đến quá trình xơ hóa[63]. Ngoài ra, các nguyên bào sợi cơ có nguồn gốc từ quá trình chuyển dạng biểu mô – trung mô đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh xơ hóa liên quan đến các bệnh về ứ mật[56]. Hoạt hóa tế bào hình sao là sự kiện trung tâm trong xơ hóa gan[18].

Quá trình này được khởi phát bởi nhiều yếu tố bao gồm các cytokin (đặc biệt là TGF. Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh học – β, yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu, các gốc oxy hoạt động, các tế bào chết theo chương trình…)[30]. Quá trình hoạt hóa tế bào hình sao trải qua 2 giai đoạn chính: giai đoạn khởi đầu và giai đoạn duy trì. Giai đoạn khởi đầu có liên quan đến những thay đổi sớm về biểu hiện gen và kiểu hình đáp ứng với các cytokin và các kích thích khác, chủ yếu liên quan đến các kích thích cận tiết.

Trong khi đó, giai đoạn duy trì là kết quả của các kích thích này trong việc duy trì kiểu hình.Trong giai đoạn khởi đầu, những thay đổi sớm nhất của các tế bào hình sao có thể là do kích thích cận tiết bởi các tế bào lân cận, bao gồm: tế bào nội mô mao mạch hình sin, tế bào Kupffer, tế bào gan và tiểu cầu. Các tế bào nội mô có thể tham gia vào sự chuyển đổi yếu tố tăng trưởng TGF – β sang dạng hoạt hóa, trở thành tác nhân gây xơ hóa. Tiểu cầu cũng là nguồn kích thích cận tiết quan trọng, bao gồm các yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), TGF – β1, yếu tố tăng trưởng biểu bì. Ngoài ra, các tế bào Kupffer có thể tham gia vào quá trình hoạt hóa tế bào hình sao, chúng kích thích tổng hợp chất nền, tăng sinh tế bào và giải phóng retinoid từ các tế bào hình sao thông qua hoạt động của các cytokin (đặc biệt là TGF – β) và các gốc oxy hoạt động.

Các tế bào gan bị phá hủy giải phóng các gốc oxy hoạt động và các chất trung gian gây xơ, kích thích hoạt hóa HSC và hoạt tính xơ hóa của các nguyên bào sợi cơ.