Luận văn: Phân lập và thiết kế vector promoter phát triển phôi cây Arabidopsis

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập và thiết kế vector mang promoter liên quan đến quá trình phát triển phôi ở cây arabidopsis, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề

• Tác giả: Nguyễn Hùng Mạnh
• Người hướng dẫn: Lê Hồng Điệp
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Phân lập và thiết kế vector mang promoter liên quan đến quá trình phát triển phôi ở cây Arabidopsis
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm và ý nghĩa của promoter phát triển phôi

Promoter là những vùng ADN nằm phía trước gen, có nhiệm vụ điều khiển sự biểu hiện của gen. Trong quá trình phát triển phôi ở cây Arabidopsis, các promoter đặc hiệu đóng vai trò cực kỳ quan trọng. Chúng hoạt động như những "công tắc" sinh học, quyết định khi nào và ở đâu các gen được "bật" để tạo ra các protein cần thiết. Phân lập promoter phát triển phôi giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về cơ chế điều hòa gene trong giai đoạn quan trọng này. Điều này có ý nghĩa to lớn trong việc cải tiến giống cây, tăng năng suất nông nghiệp và phát triển các ứng dụng công nghệ gene trong thực vật. Cây Arabidopsis với bộ gene đã được giải mã hoàn toàn trở thành mô hình lý tưởng để nghiên cứu các quá trình sinh học phức tạp này.

1.1. Cấu trúc và chức năng của promoter trong sinh vật nhân chuẩn

Promoter ở sinh vật nhân chuẩn gồm các phần tử cis-acting như TATA box, CAAT box và GC box. Những yếu tố này nhận biết các protein điều hòa transcription, dẫn tới sự kết hợp của ARN polymerase II. Ở thực vật, cấu trúc promoter còn phức tạp hơn với các vùng điều hòa mở rộng. Khoảng cách giữa các phần tử này ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện gen. Promoter phát triển phôi có các đặc trưng riêng, cho phép chúng hoạt động chỉ trong các giai đoạn phôi cụ thể.

1.2. Vai trò của promoter ET trong phát triển phôi Arabidopsis

Promoter ET (Effector of Transcription) là loại promoter đặc hiệu được biểu hiện mạnh mẽ trong quá trình phát triển phôi. Gen ET điều khiển sự phát triển của các cấu trúc phôi trong cây Arabidopsis. Phân lập promoter ET cho phép tạo các vector chuyển gen có khả năng biểu hiện gen đích một cách chính xác tại những giai đoạn phôi cụ thể. Điều này rất hữu ích trong việc nghiên cứu chức năng gene và ứng dụng công nghệ gene thực vật.

II. Phương pháp phân lập promoter từ cây Arabidopsis

Phân lập promoter phát triển phôi là quá trình công phu đòi hỏi các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến. Bước đầu tiên là tách chiết ADN tổng số từ mô phôi non của cây Arabidopsis sử dụng phương pháp CTAB. Sau đó, sử dụng PCR với mồi đặc hiệu thiết kế dựa trên trình tự gen ET đã biết để khuếch đại promoter mục tiêu. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose để xác nhận kích thước chính xác. Sau khi có được trình tự promoter, sản phẩm được gắn vào vector tách dòng như pJET1 để tạo ra các klon. Các klon này sau đó được xác nhận bằng phân tích trình tự DNA để đảm bảo độ chính xác. Phương pháp này yêu cầu sự cẩn thận cao độ và kiến thức chuyên sâu về sinh học phân tử.

2.1. Quy trình tách chiết ADN tổng số từ phôi Arabidopsis

Tách chiết ADN tổng số bắt đầu bằng cách lấy mô phôi non tươi từ cây Arabidopsis và nghiền nhuyễn trong dung dịch đệm CTAB. Sau khi ly tâm để loại bỏ tạp chất, ADN được lắng đọng bằng isopropanol và rửa sạch bằng ethanol. ADN tổng số được hòa tan trong nước cất thanh trùng, sau đó định lượng bằng spectrophotometer. Kiểm tra độ tinh sạch bằng tỉ lệ OD260/OD280 (nên từ 1,7-1,9). ADN được bảo quản ở -20°C trước khi sử dụng cho PCR.

2.2. Khuếch đại trình tự promoter bằng PCR đặc hiệu

PCR được thiết kế với các mồi đặc hiệu nhắm tới trình tự promoter ET trong ADN tổng số của Arabidopsis. Chu trình PCR gồm 30-35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có ba bước: khử nhiệt (94-95°C), gắn mồi (55-60°C) và kéo dài (72°C). Sản phẩm PCR promoter được kiểm tra bằng điện di agarose 1% và quan sát dưới ánh sáng UV. Kích thước sản phẩm khuếch đại được xác nhận so với thang chuẩn DNA trước khi tiến hành bước tiếp theo.

III. Xây dựng vector tái tổ hợp mang promoter phát triển phôi

Sau khi phân lập promoter thành công, bước tiếp theo là xây dựng vector tái tổ hợp để đưa promoter này vào cây Arabidopsis. Sản phẩm PCR promoter ET được gắn vào vector tách dòng pJET1 để tạo các klon trung gian. Sau khi xác nhận trình tự bằng phân tích DNA, promoter ET được cắt ra và chèn vào vector biểu hiện pBI121. Vector pBI121 là một vector nhị nguyên thường dùng trong công nghệ gene thực vật, chứa gen marker gus để kiểm tra sự chuyển gen. Các vector tái tổ hợp pBI121-ET được biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens - một vi khuẩn gây bệnh trên thực vật nhưng được biến đổi để trở thành công cụ chuyển gen hiệu quả. Quy trình này yêu cầu kiến thức sâu sắc về kỹ thuật cắt-dán ADN và kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt.

3.1. Gắn promoter vào vector tách dòng pJET1

Sản phẩm PCR promoter ET được cắt bằng restriction enzyme nếu cần và gắn vào vector pJET1 bằng T4 DNA ligase. Hỗn hợp gắn được biến nạp vào E.coli năng lực cao bằng heat shock. Các klon được lựa chọn trên môi trường LB có chứa ampicillin (marker kháng sinh). Những klon nghi ngờ được xác nhận bằng colony-PCR và phân tích trình tự DNA.

3.2. Chèn promoter ET vào vector biểu hiện pBI121

Vector pBI121 được cắt bằng restriction enzyme tương thích với promoter ET được sử dụng. Promoter ET được cắt từ vector pJET1 và gắn vào vector pBI121 bằng T4 DNA ligase. Vector tái tổ hợp pBI121-ET được tạo ra chứa promoter ET ở vị trí phía trước gen gus. Các vector tái tổ hợp được kiểm tra bằng PCR và phân tích hạn chế để xác nhận tính chính xác của cấu trúc.

IV. Ứng dụng promoter phát triển phôi trong cây chuyển gen

Promoter phát triển phôi được phân lập có giá trị ứng dụng lớn trong công nghệ gene thực vật và nghiên cứu sinh học. Việc sử dụng vector tái tổ hợp pBI121-ET để tạo các cây Arabidopsis chuyển gen cho phép kiểm tra cụ thể hoạt động của promoter trong các giai đoạn khác nhau của phát triển phôi. Bằng cách gắn promoter ET với gen báo cáo gus (mã hóa enzyme β-glucuronidase), các nhà nghiên cứu có thể hình dung chính xác nơi và khi nào promoter được kích hoạt. Cây Arabidopsis chuyển gen mang promoter ET được nuôi cấy in vitro rồi chuyển sang điều kiện in vivo để theo dõi. Phân tích biểu hiện gen bằng nhuộm X-gluc cho thấy các vùng mô phôi nhuộm xanh nơi promoter ET hoạt động mạnh. Những phát hiện này giúp hiểu sâu hơn về cơ chế điều hòa gene trong phát triển phôi và mở ra các ứng dụng mới trong cải tiến giống, phát triển thực vật chuyển gen có tính trạng mong muốn.

4.1. Tạo cây Arabidopsis chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens

Vector tái tổ hợp pBI121-ET được biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens bằng phương pháp điện xung hoặc đông-tan. Agrobacterium được nuôi cấy rồi dùng để nhiễm các mô Arabidopsis tại phần kết hợp cay (hypocotyl) hoặc lá. Sau khi nhiễm, mô được chuyển sang môi trường chọn lọc có kanamycin để chọn lọc các cây chuyển gen. Các cây sống sót được xác nhận chứa vector bằng PCR trước khi chuyển sang điều kiện in vivo.

4.2. Đánh giá hoạt động của promoter ET bằng gen báo cáo gus

Gen gus mã hóa enzyme β-glucuronidase giúp phát hiện hoạt động của promoter qua phản ứng nhuộm. Các cây Arabidopsis chuyển gen được nhuộm X-gluc - một chất nền của gus - tạo ra màu xanh ở các vùng mô có biểu hiện cao. Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy promoter ET hoạt động tập trung ở các vùng phôi non, phôi cuống, và các cấu trúc sinh sản khác. Kết quả nhuộm được ghi lại và phân tích để xác định tính đặc hiệu phôi của promoter ET.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngày nay, khoa học kĩ thuật phát triển vượt bậc gắn liền với đời sống con người, hiện diện trong mọi lĩnh vực với mục đích nâng cao chất lượng cuộc sống. Công nghệ sinh học ra đời đánh dấu bước tiến mới nhất trong nỗ lực lâu dài chinh phục tự nhiên của con người, đặc biệt là sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại trong nhiều năm gần đây. Sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp, các nhà khoa học đang cố gắng tạo ra những cây trồng vật nuôi có năng suất và chất lượng cao, những thực phẩm, dược phẩm phục vụ chữa bệnh cho con người. Hiện nay, công nghệ tế bào và kĩ thuật chuyển gen đang rất phát triển ở Việt Nam.

Việt Nam là một nước nông nghiệp truyền thống, vì vậy việc phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học được tập trung chủ yếu vào nông - lâm - ngư nghiệp, với mục đích đưa nền nông nghiệp nước ta trở thành nền nông nghiệp hiện đại, ứng dụng khoa học kĩ thuật vào sản xuất để tăng chất lượng, năng suất sản phẩm, đồng thời giảm thiểu sức lao động của con người. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, mưa nhiều, khá thuận lợi để nhiều loài động, thực vật tồn tại và phát triển. Theo các nhà khoa học thì Việt Nam là quốc gia đứng thứ 16 trên thế giới về đa dạng sinh học, riêng ngành thực vật bậc cao đã có khoảng 12000 loài thuộc hơn 2500 chi và 300 họ [12]. Trong đó có rất nhiều loài có giá trị, đáp ứng được các nhu cầu khác nhau của con người như lương thực thực phẩm, làm thuốc, cây cảnh,… Trong công nghệ chuyển gen thực vật, việc thiết kế vector biểu hiện là một khâu quan trọng và đóng góp rất lớn cho sự thành công của công nghệ này.

Vì vậy việc tìm kiếm, phân lập các promoter và các gen có giá trị có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong công tác nghiên cứu và chọn lọc giống. Để đạt được hiệu quả cao trong công tác này người ta thường nghiên cứu trên những sinh vật mô hình, trong đó có Arabidopsis. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana L.) mặc dù không có ý nghĩa gì về mặt nông nghiệp, nhưng trong nghiên cứu nó đóng một vai trò rất quan trọng. Arabidopsis đã được chọn như là một cây mô hình trong nghiên cứu thực vật và đã được các nhà khoa học trên thế giới sử dụng từ lâu.

1 Arabidopsis có bộ gen nhỏ chỉ khoảng 125 Mb, đã hoàn toàn được giải trình tự và công bố năm 2000. Chu kỳ sinh trưởng của Arabidopsis ngắn (khoảng 6-8 tuần), cho nhiều hạt và dễ dàng nuôi trồng trong một không gian hẹp và rất hiệu quả trong việc sử dụng phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium. Sự hình thành và phát triển của hạt do nhiều yếu tố quy định trong đó có các hormone thực vật như ABA, GA… những hormone này đều tham gia hoạt hóa nhiều gen liên quan đến sự phát triển của hạt. Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và thiết kế vecter mang promoter liên quan đến quá trình phát triển phôi ở cây Arabidopsis”, với các mục tiêu cụ thể như sau: 1.

Thiết lập được nguồn mẫu cây Arabidopsis in vitro 2. Nhân dòng được trình tự promoter liên quan đến quá trình phát triển phôi hạt của cây Arabidopsis. Đã thiết kế được vector tái tổ hợp pBI121-ET có mang trình tự promoter ET và tiến hành đưa vào cây Arabidopsis giống Columbia. Bước đầu phân tích trình tự của promoter ET.

Giới thiệu về cây Arabidopsis 1. Nguồn gốc và vị trí phân loại Arabidopsis (tên Latin Arabidopsis thaliana) là một loài thực vật có hoa nhỏ thuộc họ Cải (Brassicaceae), bộ Brassicales [38]. Arabidopsis có nguồn gốc từ Châu Âu, Châu Á và Tây Bắc Châu Phi. Arabidopsis lần đầu tiên được phát hiện năm 1577 ở dãy núi Harz bởi một bác sỹ người Đức Johannes Thal (1542-1583) và đã được gọi là Pilosella siliquosa.

Đến năm 1841, danh pháp đã được đổi thành Arabidopsis thaliana bởi một nhà thực vật học người Đức Gustav Heynhold để vinh danh Thal. Các loài Arabidopsis có thể được tìm thấy trong tự nhiên hầu như ở khắp mọi nơi ở Bắc bán cầu. Arabidopsis đã được tìm thấy ở mọi độ cao từ mực nước biển cho đến dãy núi cao Himalayas, từ phía bắc Scandinavia đến Bắc Phi, bao gồm cả Cape Verde Islands tại vĩ độ 16. Nó cũng được tìm thấy ở Bắc Mỹ, có thể là bắt nguồn từ Châu Âu [38].

Sinh trưởng và phát triển Arabidopsis có chu kì sống tương đối ngắn khi so sánh với các loài thực vật khác. Toàn bộ chu trình sống bao gồm sự nảy mầm của hạt, tạo thành cây hình hoa thị, mọc thân chính, ra hoa và thời sinh trưởng đến khi hình thành hạt là khoảng 6 đến 8 tuần. Arabidopsis có kích thước rất nhỏ, cây phát triển thành cụm hình hoa thị đường kính 2-10 cm, hoa dài 2 mm, hạt khi trưởng thành đạt kích thước 0.5 mm về chiều dài. Lá được bao phủ bởi lông đơn bào nhỏ gọi là trichomes thuận tiện cho nghiên cứu hình thái và sự khác biệt của tế bào.

Lá thật thứ nhất có trichomes chỉ ở bề mặt trên của lá, trong khi các lá còn lại thì có ở cả mặt dưới. Số lượng lá hình hoa thị được hình thành phụ thuộc vào kiểu gen và điều kiện môi trường cùng với sự tương quan mạnh với thời gian từ lúc nảy mầm đến lúc bắt đầu ra hoa [38]. Hạt giống Arabidopsis nhỏ, có hình bầu dục. Hạt giống có thể nảy mầm một cách dễ dàng, mặc dù hạt sau thu hoạch thì cần được xử lý lạnh một vài ngày và lưu trữ bảo quản một thời gian để hạt có sức nảy mầm tốt nhất.

Hạt thường yêu cầu ánh sáng để nảy mầm. 3 Hạt cây Arabidopsis được gieo trên đĩa petri hoặc trong chậu đặt trong nhà kính hoặc dưới ánh đèn huỳnh quang trong phòng thí nghiệm. Khoảng 3 tuần sau khi gieo hạt, thân chính sẽ bắt đầu phát triển, tạo ra cụm hoa và sau đó là quả. Hoa cấu tạo phía ngoài là bốn đài hoa, vòng xoắn bên trong có bốn cánh hoa màu trắng, sáu nhị hoa mang phấn hoa và một nhụy trung tâm có hai lá noãn hình thành nên quả.

Arabidopsis là loài thực vật tự thụ phấn, cây trưởng thành đạt chiều cao 15-20 cm. Rễ có cấu trúc đơn giản, không cộng sinh với các vi khuẩn cố định đạm, tạo điều kiện dễ dàng cho việc nghiên cứu môi trường tối ưu cho sinh trưởng [38,47]. Đặc điểm về di truyền Arabidopsis là loài thực vật đầu tiên, và là sinh vật đa bào thứ ba sau Caenorhabditis elegans và Drosophila melanogaster hoàn toàn được giải trình tự gen [15,55,56]. Hệ gen của Arabidopsis có kích thước 125 Mb mã hóa cho khoảng 26000 gen trên 5 nhiễm sắc thể [2].

Theo một báo cáo khác của Hall và cộng sự [31] hệ gen của Arabidopsis có kích thước khoảng 146 Mb mã hóa cho khoảng 25000 gen. Kể từ khi hệ thống giải trình tự gen Arabidopsis được hoàn thành và công bố năm 2000 thì trình tự các gen ngày càng được nghiên cứu mở rộng, được bổ sung và hoàn thiện. Các vùng gen của hệ gen đã được giải trình tự và phân tích khoảng 119 Mb. Trình tự hệ gen được phân tích bởi TIGR (The Institute for Genome Research) v5 analysis (http:// www.

Org/tdb/e2k1/ath1/ath1. Arabidopsis là loài thực vật có bộ gen nhỏ nhất, với ít trình tự lặp lại nhất so với bất kỳ loài thực vật bậc cao nào được biết đến, tạo điều kiện cho rất nhiều nghiên cứu phân tử dựa trên bản đồ tách dòng. Ngoài ra, Arabidopsis có thể dễ dàng được chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, đó là điều kiện tiên quyết cho nhiều thí nghiệm di truyền phân tử [51]. Arabidopsis được đề xuất làm thực vật mô hình lần đầu tiên bởi Friedrich Laibach năm 1943.

Mặc dù thực tế Arabidopsis có rất nhiều đặc điểm thuận lợi cho phân tích di truyền học nhưng đã không lập tức được sử dụng phổ biến. Giá trị của cây Arabidopsis Arabidopsis là thực vật mô hình rất hữu ích cho nghiên cứu di truyền học và sinh học phân tử thực vật, bao gồm nghiên cứu bệnh lý học và sinh lý học, với nhiều hiểu biết từ đó có thể áp dụng trực tiếp cho cây trồng. Trong tất cả các loài thực vật có hoa, cây Arabidopsis được sử dụng nhiều nhất làm đối tượng cho các nghiên cứu, hơn hẳn tất cả các loài khác từng được coi là ứng cử viên đầy hứa hẹn để định hướng nghiên cứu thực vật trong tương lai. Chỉ riêng năm 2008, đã có hơn 3500 tài liệu có liên quan đến Arabidopsis được thêm vào cơ sở dữ liệu Pubmed.

So với năm 1979, chỉ có 7 công bố về Arabidopsis và 65 công bố cho tất cả các năm trước cộng lại. Sự phát triển của việc nghiên cứu Arabidopsis trong vòng 30 năm qua rất đáng chú ý, bổ ích, có tác dụng tạo nên một bước tiến mới trong công nghệ sinh học thực vật [37]. Việc nâng cao vai trò của di truyền học trong thời kỳ hội nhập cùng với sự sẵn có của các công cụ sinh học phân tử đã dẫn đến việc các nhà thực vật học tập trung vào một sinh vật để phân tích chi tiết. Arabidopsis mã hóa cho các gen cùng nguồn gốc của hầu hết các protein được các sinh vật nhân thật sử dụng để duy trì tính toàn vẹn của bộ gen [55].

Sự lựa chọn nghiên cứu Arabidopsis đã mang lại và hứa hẹn sẽ mang đến những hiểu biết mới thú vị. Arabidopsis có một số lượng đáng kể các đột biến đặc trưng, tuy nhiên việc nghiên cứu tìm kiếm các đột biến mới cũng rất quan trọng. Hạt giống Arabidopsis rất nhỏ là tương đối nhạy cảm với các chất gây đột biến hóa học, do đó, việc tìm kiếm các đột biến thường xuyên được bắt đầu bằng cách gieo hàng ngàn hạt giống xử lý với ethyl methane sulfonate (EMS). Đối với nhiều mục đích khác, hạt giống đơn giản là có thể trồng trên đất, 16 hạt với mỗi chậu 9 cm, hoặc 250 với mỗi mặt phẳng 25 cm x 50 cm, làm giảm nhu cầu về phương tiện vô trùng.

Để lựa chọn giống kháng thuốc hoặc thuốc diệt cỏ, hoặc để tạo thuận lợi cho sự hấp thu các hợp chất hóa sinh, hạt giống được trồng trên môi trường thạch vô trùng trong đĩa petri hoặc trong hộp nhựa cho phép sự phát triển nhiều hơn. Lá mầm xuất hiện sau 3 ngày, và lá thật đầu tiên sau 6 ngày. Tại thời điểm này, cây giống kháng thuốc cao 5mm, mọc lên từ khoảng 2000 hạt giống gieo trên mỗi đĩa 10 cm, có thể được xác 5 định và chuyển vào đất, hoặc tiếp tục xử lý với ánh sáng UV hoặc các tác nhân gây độc khác.