MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ngày nay, với những mô hình chăn nuôi quy mô công nghiệp ngày càng phát triển thì kéo theo đó dịch bệnh ngày càng trở nên phức tạp. Trong đó, bệnh Dịch tả lợn (DTL) cổ điển (Classical Swine Fever - CSF) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên đàn lợn bởi sự lây lan mạnh, tỷ lệ chết cao (85-100%) cho mọi lứa tuổi và gây ra những thiệt hại nặng nề về kinh tế lớn nhất cho ngành chăn nuôi heo ở nước ta nói riêng và các nước trên thế giới nói chung. Năm 1997, bệnh đã quay trở lại ngay trên các nước thành viên của Liên hiệp châu Âu mà họ nghĩ bệnh đã được thanh toán triệt để trước đó.
Dịch tả lợn là bệnh rất dễ lây, sự lây lan chủ yếu là do sự tiếp xúc giữa những heo sống với nhau hoặc với những sản phẩm của heo bệnh, hoặc những nguyên nhân khác…Tác nhân gây bệnh là một vi rút thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae. Vi rút này có tính kháng nguyên chung với vi rút gây bệnh tiêu chảy ở bò (BVDV- Bovine viral diarrhoea virus) và vi rút bệnh biên giới ở cừu (BDV- border disease virus). Trong công tác chẩn đoán hay phòng và trị bệnh, các phương pháp truyền thống dựa trên dịch tễ lâm sàng hiện ngày càng bộc lộ nhiều khiếm khuyết không thể khắc phục và không thể theo kịp tình hình hiện nay nhất là mầm bệnh càng ngày càng khó kiểm soát. Mặt khác, sinh học phân tử tuy mới đặt nền móng khoảng vài thập kỷ nhưng đã có những bước phát triển vượt bậc với nhiều thành tựu to lớn, đã, đang và sẽ đóng góp vào mọi mặt của đời sống.
Trong thú y, sinh học phân tử với trọng tâm là công nghệ di truyền đã được ứng dụng khá sớm trong chẩn đoán, phòng và trị bệnh trên nhiều đối tượng gây bệnh, trong đó có dịch tả - một trong 4 bệnh “đỏ” của ngành chăn nuôi Việt Nam. Để phân tích chính xác vi rút gây bệnh DTL với những vi rút khác cùng chi Pestivirus như BVDV, BDV., kỹ thuật RT - PCR trở nên hữu ích với những đoạn gene như 5’NTR, E2, NS5B trong việc phân biệt chủng vi rút DTL và tổng kết sự phân biệt chủng vi rút DTL ở nhiều nước trên thế giới kể cả châu Á; kết quả cho thấy mối liên giữa các chủng ở một số nước. Trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng có rất nhiều nghiên cứu về vi rút DTL của các tác giả, tuy nhiên chưa có nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của nhiều đoạn gen khác như NS5B, 5’NTR của những vi rút phân lập được từ các ổ dịch. Protein E2 là một 1 trong những gen của bộ gen vi rút DTL cổ điển được sử dụng nhiều trong những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền vi rút.
Vì vậy việc thực hiện đề tài “ Nghiên cứu biểu hiện protein E2 của vi rút Dịch tả lợn cổ điển bằng hệ thống Baculovirus ” nhằm ứng dụng vào công tác chẩn đoán bệnh và tạo tiền đề cho những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền vi rút Dịch tả lợn sau này. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu biểu hiện protein E2 của vi rút dịch tả lợn cổ điển sử dụng tế bào côn trùng làm sinh phẩm dùng trong chẩn đoán và nguyên liệu tiến tới sản xuất vắc xin phòng bệnh Dịch tả lợn cổ điển tại Việt Nam. PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Protein E2 của vi rút DTL cổ điển phân lập tại Việt Nam. - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 10/2018 tới tháng 2/2019.
- Địa điểm nghiên cứu: + Bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch, Viện Thú y quốc gia (Việt Nam). Ý NGHĨA KHOA HỌC Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong giảng dạy và nghiên cứu về bệnh dịch tả ở lợn trong các trường, viện nghiên cứu chuyên ngành thú y; là tư liệu khoa học quý báu và cần thiết cho những người làm công tác thú y cơ sở về bệnh dịch tả lợn. Ý NGHĨA THỰC TIỄN Nghiên cứu sử dụng phương pháp tái tổ hợp protein sử dụng hệ thống biểu hiện Baculovirus của hãng Invitrogen. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp bằng phương pháp IPMA trên tế bào côn trùng TN5 và phương pháp lai Western Blot.
Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho xác định kháng nguyên tái tổ hợp bằng hệ thống biểu hiện Baculovirus vẫn giữ được những đặc tính kháng nguyên trong tự nhiên mang hoạt tính sinh học và khả năng tạo đáp ứng miễn dịch cao cho vật chủ. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. HIỂU BIẾT VỀ VI RÚT DỊCH TẢ LỢN (DTL) 2. Lịch sử căn bệnh DTL ở thế giới Bệnh Dịch tả lợn (DTL) được đưa vào danh sách loại A của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) như 1 bệnh truyền lây mạnh và gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn của thế giới (Moennig Floegel-Niesmann et al.
Những nghiên cứu trước đây cho thấy bệnh lây lan chủ yếu qua đường mũi và miệng. Ngoài ra, vi rút dịch tả lợn cũng bị truyền lây qua tinh dịch hay thức ăn tạp nhiễm (Floegel Wehrend et al. Quá trình phát triển của bệnh DTL khá phức tạp và diễn biến dưới nhiều thể bệnh khác nhau, tùy thuộc vào độc lực của vi rút, sự tương tác giữa vi rút và cơ thể vật chủ (Paton and Greiser-Wilke 2003). Nhìn chung, các thể bệnh có thể được phân loại như sau: Nhiễm sau khi sinh (post-natal infections): bao gồm thể quá cấp, cấp tính và á cấp tính; Nhiễm qua nhau thai (trans-placental infections); Nhiễm mạn tính (persistent infections) (Koenen Van Caenegem et al.
Năm 1810 bệnh DTL được (Hanson 1957) mô tả lần đầu ở Tennessce. Đến năm 1833, bệnh DTL được thông báo đầu tiên ở Ohio (Bắc Mỹ), bệnh lan ra cả nước Mỹ nhất là vùng Cornbert, dịch bệnh diễn ra ở Pháp năm 1862, ở Đức 1893 (Dahle and Liess 1992) và sau đó bệnh lan ra khắp Châu Mỹ, Châu Âu và Châu Á (Dũng 1999; Paton and Greiser-Wilke 2003). Theo (Fuchs 1968) bệnh xuất hiện đầu tiên ở Anh vào năm 1862, sau đó lây lan sang các nước châu Âu khác là Đan Mạch, Thụy Điển vào năm 1887. Các nhà khoa học Mỹ cho rằng bệnh xuất phát từ châu Âu và lan sang khắp các nước trên thế giới, ở Nam Mỹ năm 1899, Nam Phi năm 1900.
Năm 1978 bệnh hoàn toàn bị khống chế ở Bắc Mỹ và sau đó cũng đã được thanh toán ở Úc và toàn bộ các nước ở Tây Âu (Paton and Greiser-Wilke 2003; Singh and Rajak 2017). Mặc dù đã có nhiều nỗ lực trong công tác kiểm soát dịch bệnh, song bệnh DTL vẫn còn xuất hiện ở một số nước thành viên Châu Âu và gây thiệt hại nặng về kinh tế. Cụ thể: ở Hà Lan, chi phí trực tiếp để khống chế bệnh DTL lên tới 93 triệu USD năm 1983 - 1985. Nhiều ổ dịch nghiêm trọng đã xảy ra ở Bỉ, Đức năm 1994, và Pháp năm 1997 (Moennig 2000).
Hơn nữa bệnh DTL vẫn còn là vấn nạn và lây lan mạnh mẽ ở Nam và Trung Mỹ, vùng Caribbean, Châu Á và Đông Âu (Moennig 2000, Moennig, Floegel-Niesmann et al. Hiện nay, tuy dịch đã 3 được khống chế, nhưng bệnh vẫn xảy ra lẻ tẻ như ở Hà Lan năm 1997–1998 (Crauwels et al., 2003), và vi rút DTL vẫn lưu hành tại một số nước ở châu Âu (Blome et al., 2010; Bhaskar et al. Bản đồ tình trạng bệnh DTL của các nước thành viên của tổ chức Thú y thế giới cập nhật lần cuối vào tháng 9 năm 2018 Nguồn http://www.int/en/animal-health-in-the-world/official-disease-status/ 2. Lịch sử căn bệnh DTL tại Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh DTL được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1923 - 1924 bởi Houdener.
Từ đó đến nay vẫn còn tồn tại phổ biến và luôn là mối đe doạ nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợn nước ta (Dat et al. Năm 1960 bệnh xảy ra ở Nghệ An, Phú Thọ. Năm 1968 có 481 ổ dịch được phát hiện ở miền bắc, tiếp đó năm 1971 bệnh DTL đã xảy ra ở 11 trại lợn xung quanh Sài Gòn. Năm 1974 xảy ra ở 17 tỉnh thành phía bắc làm thiệt hại hơn 4 vạn con lợn.
Bệnh đã lây lan sang các tỉnh ở Nam Bộ năm 1981, Thừa Thiên Huế năm 1990 (Dũng 1999; Duyên Khuyên và cs. Các tỉnh thuộc Trung Trung Bộ dịch xảy ra tương đối rộng vào các năm 1976 - 1978: năm 1976 có 17 ổ dịch, năm 1977 có 36 ổ dịch, năm 1978 có 18 ổ dịch. 4 Từ những năm 1980 trở lại đây, theo chương trình quốc gia phòng chống các bệnh truyền nhiễm quan trọng nói chung và bệnh DTL nói riêng trên đàn lợn bằng việc sử dụng vắc xin đã thu được những thành quả nhất định, do đó đã phần nào khống chế được dịch bệnh. Mặc dù vậy bệnh DTL vẫn xem là một trong những bệnh nguy hiểm, là mối đe dọa tiềm ẩn đối với ngành chăn nuôi ở nước ta.
Bệnh DTL ở nước ta xảy ra quanh năm, tuy nhiên do thời tiết thay đổi (thể hiện rõ ở miền Bắc) và do biến động số lượng của đàn lợn trong năm nên bệnh có lúc tăng lúc giảm (Bùi, 2001). Việc tiêm phòng theo mùa vụ và tiêm phòng bổ sung thường xuyên góp phần ổn định và hạn chế sự lây lan của dịch, nhưng trong sản xuất thực tế vì nhiều lý do nên việc tiêm phòng chưa thực hiện đúng quy định, do đó bệnh DTL vẫn xảy ra vào các tháng trong năm. Lợn bệnh thường thể hiện ở thể mạn tính và các trường hợp khác là do nhiễm vi rút khi sơ sinh, bệnh có thể kéo dài và là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn con (Nguyễn Hồ và cs. 2002; Nguyễn Trần, 2005; Phạm 2005).
Cấu trúc của vi rút DTL Những mô tả đầu tiên về vi rút gây bệnh DTL đã chỉ ra rằng vi rút DTL thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae. vi rút DTL có quan hệ mật thiết và có chung tính kháng nguyên với vi rút gây bệnh tiêu chảy ở bò (BVDV) và vi rút gây bệnh biên giới ở cừu (BDV), cả hai loại vi rút này đều có khả năng gây bệnh tiêu chảy trên lợn. Vi rút gây bệnh DTL là thuộc loại RNA vi rút nhỏ một sợi và có vỏ bọc ngoài là lipoprotein, đường kính 40 - 50nm, khác hẳn với DNA vi rút lớn gây bệnh DTL châu phi (African swine fever - ASF), mặc dù cả hai loại vi rút này đều gây những triệu chứng lâm sàng và bệnh tích tương tự nhau (Meyers, Rümenapf et al., 1989; Hoffmann Beer et al., 2005; Leifer, Everett et al.