Luận án tiến sĩ về virus viêm gan vịt và kháng thể phòng bệnh tại đồng bằng sông Cửu Long

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phân lập và định danh virus viêm gan vịt tại đồng bằng sông Cửu Long, sản xuất kháng thể phòng bệnh hiệu quả.

• Tác giả: Phạm Công Uẩn
• Người hướng dẫn: PGS. Hồ Thị Việt Thu
• Trường học: Trường Đại Học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Virus Viêm Gan Vịt Và Sản Xuất Kháng Thể Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Cần Thơ

Mục lục chi tiết

• Lời cảm tạ
• Lời cam đoan
• Danh sách bảng
• Danh sách hình
• Danh mục từ viết tắt
• 1. Chương 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Những đóng góp mới về khoa học
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
• 2. Chương 2: Lược khảo tài liệu
• 2.1. Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan vịt do virus
• 2.2. Bệnh viêm gan vịt do virus
• 2.2.1. Đặc điểm tác nhân gây bệnh
• 2.2.2. Sự xâm nhập và đường lây lan
• 2.2.3. Cơ chế sinh bệnh
• 2.2.4. Đặc điểm dịch tễ
• 2.2.5. Triệu chứng và bệnh tích
• 2.2.6. Chẩn đoán và phòng bệnh
• 2.2.6.1. Phòng bệnh
• 2.3. Sinh học phân tử virus viêm gan vịt
• 2.3.1. Hình thái và cấu tạo của virus viêm gan vịt type I
• 2.3.2. Thành phần hệ gen của virus viêm gan vịt type I
• 2.3.3. Cấu trúc hệ gen và protein của virus viêm gan vịt type I
• 2.3.4. Đặc tính kháng nguyên và khả năng gây bệnh của virus
• 2.3.5. Xếp loại virus viêm gan vịt
• 2.4. Đặc tính sinh học của virus viêm gan vịt
• 2.4.1. Nuôi cấy trên phôi trứng
• 2.4.2. Nuôi cấy trên môi trường tế bào
• 2.4.3. Nuôi cấy trên động vật cảm thụ
• 2.4.4. Sức đề kháng của virus viêm gan vịt
• 2.5. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt do virus trong nước và trên thế giới trong thời gian gần đây
• 2.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 2.5.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
• 2.6. Kháng thể IgY của gà
• 2.6.1. Tính chất phân tử của kháng thể IgY
• 2.6.2. Đặc tính hóa lý của kháng thể IgY
• 2.6.3. Sự truyền kháng thể IgY từ máu gà mẹ sang lòng đỏ trứng
• 2.7. Phương pháp sản xuất kháng thể từ lòng đỏ trứng gà
• 2.7.1. Gây tối miễn dịch cho gà mái
• 2.7.2. Đường tiêm chủng cho gà mái
• 2.7.3. Tần số và khoảng cách giữa các lần tiêm chủng cho gà mái
• 2.7.4. Chiết xuất kháng thể IgY
• 2.7.5. Các phương pháp tinh sạch kháng thể IgY
• 2.7.5.1. Phương pháp kết tủa bằng muối ammonium sulphat
• 2.7.5.2. Phương pháp thẩm tích
• 2.7.5.3. Sắc ký trao đổi ion
• 2.8. Những ứng dụng kháng thể IgY trong phòng và trị bệnh trên gia cầm
• 2.9. Thành tựu phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus ở Việt Nam
• 3. Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 3.1. Nội dung nghiên cứu
• 3.2. Phương tiện nghiên cứu
• 3.2.1. Thời gian và địa điểm
• 3.2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2.3. Hóa chất và môi trường
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phân lập và định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long
• 3.3.1.1. Phương pháp lấy mẫu
• 3.3.1.2. Phương pháp xử lý mẫu
• 3.3.1.3. Phương pháp phân lập virus viêm gan vịt trên môi trường phôi trứng vịt
• 3.3.1.4. Phương pháp cấy truyền virus viêm gan vịt trên môi trường tế bào xơ phôi vịt sơ cấp
• 3.3.1.5. Định danh virus viêm gan vịt bằng sinh học phân tử
• 3.3.2. Nghiên cứu di truyền virus viêm gan vịt type I genotype 3
• 3.3.2.1. Giải trình tự nucleotide sản phẩm RT-PCR
• 3.3.2.2. Nghiên cứu di truyền của các chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 phân lập được
• 3.3.3. Khảo sát độc lực của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên phôi vịt và trên vịt con
• 3.3.3.1. Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào xơ phôi vịt của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3
• 3.3.3.2. Xác định liều gây chết 50% phôi vịt và khảo sát bệnh tích biểu hiện trên phôi của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3
• 3.3.3.3. Xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm và khảo sát đặc điểm bệnh lý của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3
• 3.3.3.4. Khảo sát bệnh tích vi thể từ mẫu bệnh phẩm của vịt khảo sát LD50
• 3.3.4. Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà mái và ứng dụng trong phòng, trị bệnh
• 3.3.4.1. Tạo miễn dịch cho gà mái
• 3.3.4.2. Tách chiết kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà
• 3.3.4.3. Kiểm tra hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái và lòng đỏ trứng gà
• 3.3.4.4. Xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà đối với tế bào xơ phôi vịt
• 3.3.4.5. Khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ trước khi gây nhiễm
• 3.3.4.6. Khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ sau khi gây nhiễm
• 3.3.4.7. Xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt 12 ngày tuổi của kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà bằng phản ứng trung hòa virus
• 3.3.4.8. Thử nghiệm hiệu quả phòng bệnh do virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên vịt con
• 3.3.4.9. Thử nghiệm hiệu quả trị bệnh do virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên vịt con
• 3.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. Chương 4: Kết quả và thảo luận
• 4.1. Kết quả phân lập và định danh virus gây bệnh viêm gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long
• 4.1.1. Kết quả phân lập virus viêm gan vịt trên môi trường phôi vịt
• 4.1.2. Kết quả cấy truyền virus viêm gan vịt trên môi trường tế bào xơ phôi vịt sơ cấp
• 4.1.3. Kết quả định danh virus viêm gan vịt bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• 4.2. Kết quả khảo sát đặc điểm di truyền phân tử của các chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 đã phân lập
• 4.2.1. Kết quả giải trình tự nucleotide sản phẩm RT-PCR
• 4.2.2. Tìm kiếm sự tương đồng với virus viêm gan vịt type I genotype 3 khác đã đăng ký trong Ngân hàng gen Thế giới
• 4.2.3. So sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide và axít amin giữa các chủng phân lập với các chủng khác trong Ngân hàng gen Thế giới
• 4.3. Kết quả khảo sát độc lực của virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên phôi vịt và trên vịt con
• 4.3.1. Kết quả khảo sát độc lực và tính gây bệnh của virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên phôi vịt
• 4.3.1.1. Kết quả xác định liều gây chết 50% phôi vịt thí nghiệm
• 4.3.1.2. Kết quả khảo sát thời gian chết phôi trung bình theo nồng độ
• 4.3.1.3. Biểu hiện bệnh tích trên phôi vịt thí nghiệm
• 4.3.2. Kết quả khảo sát độc lực và tính gây bệnh của virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên vịt con
• 4.3.2.1. Kết quả xác định liều gây chết 50% trên vịt con
• 4.3.2.2. Khảo sát thời gian vịt chết trung bình theo nồng độ virus khác nhau
• 4.3.2.3. Khảo sát triệu chứng lâm sàng ở vịt thí nghiệm
• 4.3.2.4. Khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thí nghiệm qua mổ khám
• 4.3.2.5. Khảo sát bệnh tích vi thể trên vịt thí nghiệm
• 4.4. Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà mái
• 4.4.1. Kết quả phân tích hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái
• 4.4.2. Mối tương quan giữa hàm lượng kháng thể IgY trong máu gà và trong trứng gà sau khi gây miễn dịch
• 4.4.3. Trích ly kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà bằng phương pháp tủa phân đoạn muối Amonium sulphat 40%
• 4.4.4. Khảo sát độc tính của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà đối với tế bào xơ phôi vịt và tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên tế bào xơ phôi vịt
• 4.4.4.1. Kết quả xác định liều gây nhiễm 50% tế bào xơ phôi vịt của virus viêm gan vịt type I genotype 3
• 4.4.4.2. Kết quả xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY lòng đỏ đối với tế bào xơ phôi vịt
• 4.4.4.3. Hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ trước khi gây nhiễm
• 4.4.4.4. Hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ sau khi gây nhiễm
• 4.4.5. Ứng dụng dịch kháng thể IgY lòng đỏ trong phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus type I genotype 3
• 4.4.5.1. Kết quả xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt 12 ngày tuổi của dịch kháng thể IgY lòng đỏ
• 4.4.5.2. Kết quả phòng bệnh viêm gan vịt do virus viêm gan vịt type I genotype 3 bằng dịch kháng thể IgY lòng đỏ trên vịt con 3 ngày tuổi
• 4.4.5.3. Kết quả trị bệnh viêm gan vịt do virus type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trên vịt con 3 ngày tuổi
• Kết luận và đề nghị
• Tài liệu tham khảo
• Phụ lục

Tóm tắt

I. Giới thiệu về virus viêm gan vịt

Virus viêm gan vịt là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng cho gia cầm, đặc biệt là vịt. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và định danh virus viêm gan vịt tại các tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long. Virus này có khả năng gây ra các triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng, dẫn đến tỷ lệ tử vong cao ở vịt con. Việc hiểu rõ về bệnh viêm gan vịt và các đặc điểm của virus là rất cần thiết để phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.1 Đặc điểm của virus viêm gan vịt

Virus viêm gan vịt thuộc họ virus Picornaviridae, có cấu trúc gen đơn và có khả năng gây bệnh cho vịt. Đặc điểm sinh học của virus này bao gồm khả năng lây lan nhanh chóng qua đường tiêu hóa và hô hấp. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng virus có thể tồn tại trong môi trường và lây lan qua thức ăn, nước uống, và tiếp xúc giữa các cá thể. Việc phân lập virus từ các mẫu bệnh phẩm là bước đầu tiên trong việc xác định loại virus và nghiên cứu tính chất gây bệnh của nó.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua việc thu thập mẫu từ các ổ dịch tại năm tỉnh đồng bằng sông Cửu Long. Các mẫu bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường phôi vịt và tế bào xơ phôi vịt. Kỹ thuật PCR được áp dụng để phát hiện và định danh các chủng virus viêm gan vịt. Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng và chính xác các loại virus viêm gan vịt, từ đó có thể đánh giá tình hình dịch bệnh tại khu vực nghiên cứu.

2.1 Quy trình phân lập virus

Quy trình phân lập virus bao gồm việc lấy mẫu từ các ổ dịch, xử lý mẫu và nuôi cấy trên môi trường phôi vịt. Sau khi nuôi cấy, virus được xác định bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Kết quả cho thấy tỷ lệ dương tính cao với virus viêm gan vịt type I genotype 3, cho thấy sự phổ biến của loại virus này trong khu vực. Việc phân lập thành công virus là cơ sở để nghiên cứu sâu hơn về tính chất sinh học và khả năng gây bệnh của virus.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy có 56/78 mẫu virus được xác định là virus viêm gan vịt type I genotype 3. Tỷ lệ dương tính ở các tỉnh khác nhau cho thấy sự phân bố rộng rãi của virus trong đồng bằng sông Cửu Long. Đặc biệt, virus có độc lực cao, gây ra các triệu chứng nghiêm trọng ở vịt con. Những phát hiện này không chỉ cung cấp thông tin quan trọng về tình hình dịch bệnh mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển vaccine và kháng thể phòng bệnh.

3.1 Tính độc lực của virus

Nghiên cứu đã xác định được tính độc lực của chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên phôi vịt và vịt con. Kết quả cho thấy thời gian gây chết phôi từ 18 - 78 giờ, với các triệu chứng điển hình như xuất huyết và sưng gan. Những triệu chứng này cho thấy virus có khả năng gây bệnh mạnh mẽ, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của gia cầm. Việc hiểu rõ về tính độc lực của virus là rất quan trọng để xây dựng các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

IV. Sản xuất kháng thể IgY

Kháng thể IgY được sản xuất từ lòng đỏ trứng gà là một trong những phương pháp hiệu quả để phòng ngừa bệnh viêm gan vịt. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng kháng thể IgY có khả năng trung hòa virus viêm gan vịt, giúp bảo vệ vịt con khỏi bệnh. Việc sản xuất kháng thể này không chỉ có ý nghĩa trong việc phòng bệnh mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm sinh học phục vụ cho ngành chăn nuôi.

4.1 Ứng dụng kháng thể IgY trong phòng bệnh

Kháng thể IgY được thử nghiệm trên vịt con cho thấy hiệu quả phòng bệnh cao. Kết quả cho thấy vịt con được tiêm kháng thể IgY có tỷ lệ sống sót cao hơn so với nhóm đối chứng. Điều này chứng tỏ rằng kháng thể IgY có thể được sử dụng như một biện pháp phòng ngừa hiệu quả cho bệnh viêm gan vịt, góp phần giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Chăn nuôi vịt là ngành sản xuất truyền thống tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), cung cấp lượng lớn thực phẩm phục vụ nhu cầu nội địa và xuất khẩu. Sự gia tăng mật độ đàn đi kèm phương thức chăn thả chạy đồng khiến nguy cơ bùng phát dịch bệnh truyền nhiễm trở nên phức tạp. Trong số các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở thủy cầm, bệnh viêm gan do virus gây thiệt hại nghiêm trọng nhất cho vịt con dưới 28 ngày tuổi với đặc trưng bộc phát cấp tính, lây lan nhanh và tỷ lệ tử vong có thể lên tới 90-100%. Mặc dù bệnh đã được ghi nhận tại Việt Nam từ năm 1978, việc điều trị bằng kháng sinh không mang lại hiệu quả; đồng thời, các loại vaccine lưu hành chủ yếu phát triển dựa trên virus viêm gan vịt type I genotype 1 (DHAV-1), không tạo được sự bảo hộ chéo hoàn toàn với các kiểu gen khác hoặc không kịp kích hoạt miễn dịch trước khi vịt con mắc bệnh.

Trước thời điểm thực hiện đề tài, khu vực ĐBSCL thường xuyên xuất hiện các ổ dịch viêm gan vịt gây chết hàng loạt nhưng chưa có nghiên cứu hệ thống nào về việc phân lập, xác định kiểu gen lưu hành thực tế cũng như mối quan hệ di truyền của tác nhân gây bệnh. Bên cạnh đó, các chế phẩm kháng thể thương mại trên thị trường còn hạn chế và chưa công bố rõ nguồn gốc kháng nguyên của chủng virus sử dụng để gây miễn dịch. Đề tài luận án tiến sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học (mã số: 62 42 01 07) của nghiên cứu sinh Phạm Công Uẩn, thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Hồ Thị Việt Thu tại Trường Đại học Cần Thơ năm 2019, giải quyết trực tiếp khoảng trống dịch tễ học phân tử và công nghệ sinh học phòng bệnh này.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 4 nội dung cụ thể:

1. Phân lập và định danh virus gây bệnh viêm gan vịt tại 5 tỉnh thuộc khu vực ĐBSCL.
2. Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của các chủng virus gây viêm gan vịt phân lập được tại 5 tỉnh ĐBSCL.
3. Khảo sát độc lực và tính gây bệnh của một chủng virus đại diện phân lập được trên phôi trứng vịt và trên vịt con.
4. Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà và ứng dụng trong phòng, trị bệnh.

Đối tượng nghiên cứu bao gồm: các chủng virus viêm gan vịt phân lập từ thực địa; phôi trứng vịt và vịt con nở từ đàn vịt bố mẹ đã kiểm tra âm tính với virus viêm gan vịt; tế bào xơ phôi vịt sơ cấp (DEF); gà mái đẻ phục vụ gây tối miễn dịch; và kháng thể IgY tinh chế từ lòng đỏ trứng gà. Phạm vi không gian của nghiên cứu bao gồm 5 địa bàn chăn nuôi vịt trọng điểm tại ĐBSCL: Kiên Giang, Hậu Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long và Trà Vinh. Phạm vi thời gian nghiên cứu được tiến hành từ ngày 27 tháng 12 năm 2012 đến ngày 27 tháng 12 năm 2016.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Bệnh viêm gan vịt do virus được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1945 tại Mỹ. Đến năm 1950, Levine và Fabricant đã phân lập được virus viêm gan vịt type I (DHV-1) trên phôi gà từ các trang trại nuôi vịt Bắc Kinh ở Long Island. Năm 1965, Asplin phân lập được virus viêm gan vịt type II tại Norfolk (Anh) trên đàn vịt đã tiêm vaccine phòng type I. Năm 1969, Toth phát hiện virus viêm gan vịt type III tại Long Island (Mỹ). Về mặt phân loại học, Ủy ban Quốc tế về Phân loại Virus (ICTV) đã xếp virus viêm gan vịt type I vào một chi mới là Avihepatovirus thuộc họ Picornaviridae, gọi tên là Duck hepatitis A virus (DHAV) gồm ba kiểu gen: DHAV-1, DHAV-2 và DHAV-3 (Kim et al., 2006, 2007; Tseng and Tsai, 2007a; Wang et al., 2008). Trong khi đó, virus viêm gan vịt type II và type III được phân loại thuộc chi Avastrovirus trong họ Astroviridae, lần lượt đổi tên thành Duck Astrovirus type 1 (DAstV-1) và Duck Astrovirus type 2 (DAstV-2) (Gough et al., 1985; Todd et al., 2009).

Tại Việt Nam, sau các ghi nhận dịch bệnh từ 1979-1983, Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng (1985) đã xác định tác nhân gây bệnh tại miền Bắc là virus viêm gan vịt type I và thử nghiệm các chủng vaccine nhược độc TN, VN, E52. Các nghiên cứu tiếp theo của Nguyễn Hữu Vũ và ctv (2001), Nguyễn Văn Cảm và ctv (2001), Trần Thị Liên và ctv (2005), Nguyễn Bá Hiên và ctv (2007) tiếp tục tập trung vào dịch tễ lâm sàng và sản xuất vaccine nhược độc trên phôi gà từ chủng DH-EG-2000. Đến năm 2009, Đoàn Thị Thanh Hương và ctv lần đầu tiên phân lập và định danh chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 (chủng DN2) tại tỉnh Đồng Nai, giải mã toàn bộ hệ gen dài 7.691 nucleotide (Đoàn Thị Thanh Hương và ctv, 2011), sau đó tiếp tục xác định chủng DHAV-3 (chủng NT) tại tỉnh Ninh Thuận vào năm 2014. Năm 2015, Nguyễn Văn Dung và ctv xác định DHAV-3 hiện diện tại tỉnh Long An.

Về công nghệ sản xuất kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY), các công trình của Carlander et al. (2002), Lee et al. (2002), Schade et al. (2005) đã xác định IgY có trọng lượng phân tử khoảng 180 kDa, gồm 2 chuỗi nặng (67-70 kDa) với 4 vùng hằng định (CH1-CH4), không có vùng bản lề, và 2 chuỗi nhẹ (25 kDa). Kháng thể này được vận chuyển có chọn lọc từ huyết thanh gà mẹ tích lũy vào lòng đỏ trứng qua thụ thể bề mặt màng noãn hoàng. Kháng thể IgY không kích hoạt bổ thể động vật có vú, không gắn thụ thể Fc và không phản ứng chéo với yếu tố thấp khớp. Kháng thể IgY đã được nghiên cứu ứng dụng thành công chống lại vi khuẩn và virus trên động vật cũng như con người (Yokoyama, 1992; Ikemori, 1992; Pokorova et al., 2000; Kassaify and Mine, 2004; Hoàng Trung Kiên và ctv, 2010; Trương Quí Kiên và ctv, 2010). Tại Việt Nam, Công ty HANVET (2001) từng sản xuất kháng thể lòng đỏ trứng gà phòng bệnh viêm gan vịt, nhưng thông tin về kiểu gen virus dùng làm kháng nguyên chưa được xác định cụ thể.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là: khảo sát dịch tễ học vi sinh và sinh học phân tử trên quy mô thực địa tại 5 tỉnh trọng điểm nuôi vịt ở ĐBSCL; xác định chính xác kiểu gen virus lưu hành; phân tích đặc điểm trình tự gen của các chủng đại diện; đánh giá độc lực thực nghiệm trên phôi và vịt con; đồng thời xây dựng quy trình công nghệ sử dụng chính chủng virus phân lập tại chỗ để tạo kháng thể IgY tinh chế từ lòng đỏ trứng gà, thử nghiệm hiệu quả bảo hộ phòng và trị bệnh cho đàn vịt con.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Về cơ sở lý thuyết, virus viêm gan vịt type I (DHAV) là virus có hệ gen RNA đơn dương, kích thước khoảng 7,7 kb, không có vỏ bọc ngoài, cấu trúc đối xứng hình khối đa diện 20 mặt tam giác đều với đường kính 27-30 nm. Hệ gen chứa một khung đọc mở duy nhất (ORF) mã hóa một chuỗi polyprotein gồm 2.249 acid amin, sau đó được phân cắt thành các protein cấu trúc (VP4, VP2, VP3, VP1) và protein không cấu trúc (2A1, 2A2, 2A3, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D). Vùng gen VP1 có tính ổn định cao và đặc trưng cho từng kiểu gen (dài 714 bp ở DHAV-1, DHAV-2 và 720 bp ở DHAV-3). Vùng đầu không dịch mã 5' UTR chứa cấu trúc IRES loại II và motif Yn-Xm-AUG, trong khi vùng 3' UTR dài khoảng 315 bp có vai trò trong nhân lên của virus. Virus có ái lực đặc hiệu với mô gan, phá hủy tế bào nhu mô và tế bào Kupffer, gây ứ đọng lipid, giảm glucose và xuất huyết bề mặt gan.

Phương pháp nghiên cứu thực tế của luận án là phương pháp thực nghiệm vi sinh học, sinh học phân tử và miễn dịch học thực nghiệm:

• Thu thập và xử lý bệnh phẩm: Thu thập 460 mẫu gan từ 92 đàn vịt con (1-28 ngày tuổi) có triệu chứng lâm sàng và bệnh tích điển hình của bệnh viêm gan tại 5 tỉnh ĐBSCL. Mẫu bệnh phẩm được nghiền thành huyễn dịch 10% trong dung dịch đệm DPBS, xử lý bằng kháng sinh để ức chế tạp khuẩn trước khi cấy truyền.

Địa phương	Số đàn vịt khảo sát	Số vịt thu mẫu trên mỗi đàn	Tổng số mẫu gan thu thập
Kiên Giang	22	5	110
Hậu Giang	25	5	125
Cần Thơ	15	5	75
Vĩnh Long	12	5	60
Trà Vinh	18	5	90
Tổng cộng	92	5	460

• Phân lập và cấy truyền virus: Tiêm huyễn dịch gan đã xử lý vào xoang niệu mô của phôi trứng vịt 10-14 ngày tuổi. Theo dõi sự chết của phôi trong 24-72 giờ và thu hoạch dịch phôi chết. Dịch phôi tiếp tục được cấy truyền trên môi trường tế bào xơ phôi vịt sơ cấp (DEF) nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung huyết thanh bào thai bò (FBS). Đánh giá sự hình thành bệnh lý tế bào (CPE).
• Định danh bằng RT-PCR: Tách chiết RNA tổng số bằng bộ kit NA pRNA Extraction Kit (Việt Á), tổng hợp cDNA bằng Tetro cDNA Synthesis Kit (BIOLINE). Thực hiện phản ứng RT-PCR sử dụng 4 cặp mồi chuyên biệt để phát hiện DHAV-1, DHAV-2, DHAV-3 và virus viêm gan vịt type II.
• Giải trình tự và phân tích di truyền: 10 chủng virus đại diện được giải trình tự nucleotide sản phẩm RT-PCR tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Dữ liệu trình tự được đối chiếu bằng công cụ BLAST trên NCBI và phân tích cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA.
• Khảo sát độc lực: Sử dụng chủng đại diện DHAV-3-HG2. Xác định liều gây chết 50% phôi trứng vịt (ELD50) trên phôi 12 ngày tuổi; xác định liều gây chết 50% vịt con (LD50) trên vịt con 3 ngày tuổi theo phương pháp Reed-Muench; xác định liều gây nhiễm 50% tế bào (TCID50) trên tế bào DEF. Theo dõi triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể và cấu trúc vi thể qua nhuộm hematoxylin-eosin (HE x200).
• Sản xuất và tinh sạch kháng thể IgY: Gây tối miễn dịch trên gà mái đẻ bằng chủng DHAV-3-HG2 với 3 mức liều kháng nguyên (10^4, 10^6, 10^8 ELD50/ml), tiêm bắp cơ ức 3 lần, mỗi lần cách nhau 14 ngày. Kiểm tra hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh và lòng đỏ trứng gà bằng phương pháp khuếch tán trên thạch hoặc gián tiếp. Tách chiết và tinh sạch IgY từ lòng đỏ bằng phương pháp kết tủa phân đoạn với muối ammonium sulfate (AS) 40%, sau đó loại muối bằng thẩm tách qua màng bán thấm cellophane trong dung dịch đệm phosphate 0,01 M (pH = 7).
• Thử nghiệm in vitro và in vivo: Xác định liều an toàn của dịch IgY trên tế bào DEF bằng phương pháp nhuộm MTT đo mật độ quang (OD). Đánh giá khả năng trung hòa virus ở các mốc 24 giờ trước và 24 giờ sau gây nhiễm. Xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt (PD50). Thử nghiệm hiệu quả phòng và trị bệnh trên vịt con 3 ngày tuổi qua hai đường cấp: tiêm bắp cơ ức và cho uống, đánh giá tỷ lệ bảo hộ sau khi công cường độc với chủng DHAV-3-HG2.
• Xử lý số liệu: Sử dụng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) và tính toán tỷ lệ phần trăm trên các chỉ tiêu thí nghiệm.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu

Chương này nêu bối cảnh thực tiễn của nghề chăn nuôi vịt tại ĐBSCL, tính chất nguy hiểm của bệnh viêm gan vịt do virus với tỷ lệ chết từ 90-100%, sự bất cập trong phòng chống dịch bệnh do thiếu hụt thông tin dịch tễ phân tử tại địa phương, và sự không phù hợp của vaccine thương phẩm lưu hành. Tác giả xác định 4 mục tiêu nghiên cứu và nêu tóm tắt 3 đóng góp mới của đề tài về mặt định danh tác nhân, dịch tễ di truyền học và sản xuất chế phẩm kháng thể sinh học.

Chương 2: Lược khảo tài liệu

Chương 2 tổng hợp hệ thống các cơ sở lý luận và y văn gồm 9 mục nội dung lớn:

• Lịch sử phát hiện bệnh từ năm 1945 tại Mỹ (Levine and Fabricant, 1950), type II tại Anh (Asplin, 1965), type III (Toth, 1969) và tình hình dịch tễ tại Việt Nam từ năm 1978.
• Đặc điểm sinh học và dịch tễ học của tác nhân gây bệnh: cơ chế xâm nhập qua đường tiêu hóa/hô hấp, rối loạn chuyển hóa lipid và glycogen tại gan, bệnh tích thoái hóa tế bào gan và phản ứng viêm vi thể.
• Sinh học phân tử của virus viêm gan vịt: cấu tạo virion không vỏ, bộ gen RNA đơn dương 7,7 kb, cấu trúc vùng 5' UTR (chứa IRES loại II), 3' UTR và chuỗi ORF mã hóa polyprotein gồm các protein cấu trúc VP0-VP4-VP2-VP3-VP1 cùng các protein phi cấu trúc (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D).
• Hệ thống phân loại của ICTV đổi tên DHV thành DHAV thuộc chi Avihepatovirus, chia làm 3 genotype: DHAV-1, DHAV-2, DHAV-3.
• Đặc tính nuôi cấy trên phôi trứng (gây chết phôi sau 24-72 giờ), nuôi cấy trên môi trường tế bào sơ cấp (tế bào xơ phôi vịt, thận phôi vịt với biểu hiện bệnh lý tế bào CPE co tròn, thoái hóa) và sức đề kháng với hóa chất ngoại cảnh.
• Tình hình nghiên cứu trên thế giới (công bố của Wei et al. năm 2012 về đồng nhiễm DHAV-1 và DHAV-3; Zhang et al. năm 2012 về bệnh lý vi thể trên vịt SPF) và tại Việt Nam (các công trình của Trần Minh Châu, Đoàn Thị Thanh Hương về chủng DN2 năm 2011 và chủng NT năm 2014).
• Cấu trúc, đặc tính hóa sinh của kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà: khối lượng phân tử 180 kDa, thiếu vùng bản lề, điểm đẳng điện pI 5,7-7,6, độ bền nhiệt dưới 70°C và cơ chế vận chuyển thụ động từ máu gà mẹ sang noãn hoàng.
• Quy trình sản xuất IgY (gây tối miễn dịch gà mái, đường tiêm, khoảng cách tiêm, tủa ammonium sulfate, thẩm tách, sắc ký trao đổi ion) và các ứng dụng phòng trị bệnh vi sinh vật trên động vật và người.
• Thành tựu phòng trị bệnh viêm gan vịt tại Việt Nam thông qua các thế hệ vaccine nhược độc (TN, E52, VN, DH-EG-2000) và chế phẩm kháng thể lòng đỏ thương mại của Hanvet.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết bố cục thực nghiệm gồm 4 nội dung lớn:

• Địa điểm lấy mẫu tại 5 tỉnh ĐBSCL; phòng thí nghiệm thực hiện tại Đại học Cần Thơ, phòng xét nghiệm Phương Thúy, và Công ty Macrogen (Hàn Quốc).
• Vật liệu thí nghiệm gồm đàn vịt bố mẹ âm tính, phôi vịt, vịt con 3 ngày tuổi, gà mái đẻ, môi trường nuôi cấy tế bào DMEM, huyết thanh FBS, hóa chất MTT, kit tách chiết RNA và hóa chất tủa protein.
• Bố trí thí nghiệm phân lập virus trên 92 mẫu bệnh phẩm gan; phương pháp cấy truyền trên tế bào DEF sơ cấp; kỹ thuật RT-PCR với 4 cặp mồi chuyên biệt.
• Phương pháp giải trình tự sản phẩm RT-PCR và phân tích cây phả hệ di truyền.
• Phương pháp khảo sát độc lực chủng đại diện DHAV-3-HG2 (xác định ELD50, LD50, TCID50, triệu chứng, giải phẫu bệnh tích đại thể và nhuộm lát cắt mô học HE).
• Quy trình gây tối miễn dịch cho gà mái đẻ, tách chiết kháng thể IgY bằng ammonium sulfate 40%, đo hàm lượng protein, thử độc tính trên tế bào DEF, phản ứng trung hòa in vitro và thử nghiệm hiệu quả bảo hộ phòng, trị in vivo trên vịt con 3 ngày tuổi.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được qua các bảng biểu và hình ảnh phân tích:

1. Kết quả phân lập và định danh: Trong 92 mẫu huyễn dịch gan cấy vào phôi vịt, có 78 mẫu gây chết phôi (đạt tỷ lệ 84,8%). Cả 78 dịch phôi này khi cấy truyền tiếp lên tế bào DEF đều thể hiện bệnh lý tế bào (CPE) điển hình như tế bào co tròn, bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy. Kết quả RT-PCR cho thấy 56/78 chủng (chiếm 71,79%) dương tính với virus viêm gan vịt type I genotype 3 (DHAV-3). Không có mẫu nào dương tính với DHAV-1, DHAV-2 hay virus viêm gan vịt type II.

Tỉnh điều tra	Số đàn nghi bệnh (mẫu gan)	Số mẫu gây chết phôi	Số mẫu dương tính DHAV-3	Tỷ lệ dương tính DHAV-3 (%)
Kiên Giang	22	19	16	84,2
Hậu Giang	25	22	18	81,8
Cần Thơ	15	14	8	57,1
Vĩnh Long	12	10	6	60,0
Trà Vinh	18	14	8	61,5
Tổng cộng	92	78	56	71,79

2. Đặc điểm di truyền phân tử: Giải trình tự 10 chủng đại diện (DHAV-3-CT2, DHAV-3-CT6, DHAV-3-HG2, DHAV-3-HG4, DHAV-3-KG1, DHAV-3-KG12, DHAV-3-TV2, DHAV-3-TV5, DHAV-3-VL3, DHAV-3-VL8) cho thấy độ tương đồng nucleotide đạt từ 98% đến 100%, và tương đồng acid amin đạt từ 97% đến 100%. Phân tích cây phát sinh loài cho thấy các chủng ĐBSCL có quan hệ rất gần gũi với chủng DHAV-NT (Ninh Thuận, Việt Nam) và các chủng DHAV-12-01, DHAV-B-N, DHAV-Du-090905 phân lập tại Trung Quốc, tạo thành một phân nhóm riêng biệt so với các chủng DHAV-3 khác trên thế giới.

3. Độc lực và tính sinh bệnh của chủng DHAV-3-HG2:

   • Trên phôi trứng vịt: Độc lực đạt 10^8,17 ELD50/0,2ml. Thời gian gây chết phôi dao động từ 18 đến 78 giờ, trung bình là 24,8 ± 3,3 giờ. Tần suất bệnh tích trên phôi: da phôi xuất huyết (100%), phôi còi cọc chậm phát triển (87%), gan sưng xuất huyết (78,3%), phù nề tích nước (43,5%), gan vàng nhạt (21,8%), cơ tim nhạt màu (21,7%).
   • Trên vịt con 3 ngày tuổi: Độc lực đạt 10^3,3 LD50/0,5ml. Triệu chứng lâm sàng: ít hoặc không đi lại (77,3%), bỏ ăn và ủ rũ (50,7%), co giật ngửa đầu lên lưng (opisthotonos) trước khi chết (48%), triệu chứng thần kinh co giật (18,7%). Bệnh tích đại thể: gan sưng và xuất huyết điểm/loang lổ (100%), túi mật căng phồng (73,3%), lách sưng (63,3%). Bệnh tích vi thể: xuất huyết nhu mô gan, hoại tử tế bào gan, xâm nhập nhiều bạch cầu; thận có tiểu thể Malpighi teo nhỏ và hoại tử biểu mô ống lượn gần.

4. Sản xuất và ứng dụng kháng thể IgY:

   • Gây tối miễn dịch gà mái: Liều kháng nguyên 10^8 ELD50/ml tiêm 3 lần (cách nhau 14 ngày) cho đáp ứng miễn dịch cao nhất và ổn định, hiệu giá kháng thể IgY trong lòng đỏ đạt trung bình cực đại 8,1 log2. Hàm lượng IgY đạt 27 mg/ml lòng đỏ, tương đương trung bình 63,9 mg IgY/trứng gà.
   • Thử nghiệm trên tế bào DEF: Kháng thể tinh chế an toàn cho tế bào và có khả năng ức chế CPE do DHAV-3 gây ra khi cấp trước hoặc sau gây nhiễm 24 giờ.
   • Hiệu quả bảo hộ in vivo trên vịt con 3 ngày tuổi: Kháng thể cấp qua đường tiêm bắp cơ ức cho hiệu quả cao hơn đường uống (tỷ lệ bảo hộ trong thử nghiệm phòng bệnh đạt 93,3% so với 86,7%). Liều kháng thể 50 PD50 đạt hiệu quả cao nhất ở cả thử nghiệm phòng bệnh và trị bệnh, với tỷ lệ sống sót đạt trên 80% sau khi công cường độc bằng chủng DHAV-3-HG2.

Chương 5: Kết luận và đề nghị

Tóm tắt các kết luận chính về mặt phân lập (tỷ lệ 71,79% dương tính DHAV-3), tương đồng di truyền (98-100%), độc lực chủng DHAV-3-HG2, và hiệu quả sản xuất kháng thể IgY (hiệu giá 8,1 log2, hàm lượng 27 mg/ml, tỷ lệ bảo hộ >80% ở liều 50 PD50). Đề nghị tiếp tục nghiên cứu nâng quy mô sản xuất kháng thể và thử nghiệm đánh giá rộng rãi trên các mô hình chăn nuôi vịt thực tế tại địa phương.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã ghi nhận các đóng góp khoa học và thực tiễn cụ thể:

• Về mặt khoa học: Luận án là công trình đầu tiên xác định virus viêm gan vịt type I genotype 3 (DHAV-3) là tác nhân chính gây ra các ổ dịch viêm gan cấp tính ở vịt con tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long (chiếm 71,79% số chủng phân lập được từ 5 tỉnh nghiên cứu). Đề tài khẳng định không phát hiện sự lưu hành của DHAV-1, DHAV-2 hay virus viêm gan vịt type II trong các mẫu bệnh phẩm khảo sát. Phân tích di truyền chứng minh 10 chủng DHAV-3 đại diện tại ĐBSCL có sự đồng nhất cao về trình tự nucleotide (98-100%) và acid amin (97-100%), đồng thời phân dòng thành một nhánh riêng biệt, có mối quan hệ gần gũi với chủng DHAV-NT ở miền Trung Việt Nam và các chủng phân lập tại Trung Quốc.

• Về mặt thực tiễn: Luận án đã xác lập đầy đủ dữ liệu về độc lực và bệnh lý thực nghiệm của chủng đại diện DHAV-3-HG2 (độc lực cao với 10^8,17 ELD50/0,2ml trên phôi và 10^3,3 LD50/0,5ml trên vịt con). Luận án xây dựng thành công quy trình công nghệ gây tối miễn dịch cho gà mái đẻ bằng chính chủng virus DHAV-3 thực địa (3 mũi tiêm liều 10^8 ELD50/ml, cách nhau 14 ngày) để sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà đạt hiệu giá cao (8,1 log2) và hàm lượng 27 mg/ml. Chế phẩm IgY tinh chế bằng phương pháp tủa ammonium sulfate 40% chứng minh được hiệu quả bảo vệ tế bào in vitro và mang lại tỷ lệ bảo hộ trên 80% khi phòng và trị bệnh thực nghiệm trên vịt con ở liều 50 PD50 qua đường tiêm bắp cơ ức.

• Khuyến nghị đề xuất: Cần ứng dụng chủng DHAV-3 phân lập tại địa phương để định hướng lại công tác kiểm soát dịch bệnh, thay vì phụ thuộc vào các chế phẩm chỉ chứa kháng nguyên DHAV-1. Đề xuất quy trình tiêm phòng kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà bằng đường tiêm bắp cơ ức với liều lượng tối thiểu 50 PD50 để can thiệp khẩn cấp vào các ổ dịch viêm gan vịt ở giai đoạn vịt con dưới 28 ngày tuổi.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của luận án: Địa bàn thu thập mẫu giới hạn tại 5 tỉnh thuộc ĐBSCL trong giai đoạn 2012-2016, chưa bao phủ toàn bộ 13 tỉnh thành trong vùng. Việc phân tích trình tự di truyền mới chỉ tập trung vào đoạn gen đặc trưng khuếch đại từ sản phẩm RT-PCR mà chưa thực hiện giải trình tự toàn bộ hệ gen (full-length genome) của toàn bộ 56 chủng phân lập. Các thử nghiệm đánh giá hiệu quả phòng và trị bệnh của kháng thể IgY mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm và đàn vịt thực nghiệm trong điều kiện kiểm soát nghiêm ngặt, chưa triển khai khảo nghiệm trên diện rộng tại các trang trại chăn nuôi nông hộ ngoài thực địa.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng giải mã toàn bộ hệ gen của các chủng DHAV-3 đại diện nhằm phân tích sâu hơn các đột biến liên quan đến tính sinh độc lực; hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm kháng thể IgY ở quy mô công nghiệp; khảo nghiệm hiệu lực bảo hộ thực địa trên diện rộng đối với các phương thức chăn nuôi vịt khác nhau tại ĐBSCL.

Giá trị tham khảo

Luận án cung cấp nguồn tư liệu học thuật và giá trị thực tiễn cho nhiều nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Thú y, Bệnh học Thủy cầm: Bản mô tả cung cấp quy trình chuẩn về kỹ thuật phân lập virus viêm gan vịt trên phôi trứng và tế bào sơ cấp DEF, phương pháp thiết kế primer và thực hiện multiplex RT-PCR, cũng như quy trình sản xuất, tinh sạch và định lượng kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gia cầm.
• Cơ quan quản lý thú y và cán bộ dịch tễ động vật tại ĐBSCL: Cung cấp căn cứ dịch tễ học phân tử xác nhận DHAV-3 là tác nhân chủ đạo, giúp điều chỉnh các chương trình giám sát dịch tễ và lựa chọn loại vaccine phòng bệnh phù hợp với thực địa.
• Các doanh nghiệp sản xuất thuốc thú y và chế phẩm sinh học: Phần quy trình công nghệ tạo kháng thể IgY bằng phương pháp tủa ammonium sulfate 40% và các thông số liều bảo hộ 50 PD50 là cơ sở thực nghiệm rõ ràng để nghiên cứu phát triển các chế phẩm kháng thể sinh học thay thế kháng sinh trong kiểm soát bệnh viêm gan vịt.

Câu hỏi thường gặp

1. Tác nhân chủ yếu gây bệnh viêm gan vịt tại 5 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long trong nghiên cứu này là gì?
Kết quả định danh bằng kỹ thuật RT-PCR từ 78 mẫu bệnh phẩm phân lập được xác định có 56 mẫu (chiếm 71,79%) dương tính với virus viêm gan vịt type I genotype 3 (DHAV-3). Tỷ lệ dương tính theo từng tỉnh lần lượt là: Kiên Giang 84,2% (16/19), Hậu Giang 81,8% (18/22), Trà Vinh 61,5% (8/14), Vĩnh Long 60,0% (6/10) và Cần Thơ 57,1% (8/14). Hoàn toàn không phát hiện DHAV-1, DHAV-2 hay virus viêm gan vịt type II trong các mẫu nghiên cứu.

2. Độc lực của chủng đại diện DHAV-3-HG2 được xác định ở mức độ nào?
Chủng đại diện DHAV-3-HG2 có độc lực cao: trên phôi trứng vịt đạt 10^8,17 ELD50/0,2ml với thời gian gây chết phôi trung bình là 24,8 ± 3,3 giờ (từ 18 đến 78 giờ); trên vịt con 3 ngày tuổi đạt 10^3,3 LD50/0,5ml, gây chết nhanh với các triệu chứng co giật ngửa đầu (48%) và 100% vịt chết xuất hiện bệnh tích gan sưng xuất huyết.

3. Quy trình gây tối miễn dịch cho gà mái để sản xuất kháng thể IgY đạt hiệu quả cao nhất cần điều kiện gì?
Quy trình tối ưu được xác định là sử dụng kháng nguyên chủng DHAV-3-HG2 ở nồng độ 10^8 ELD50/ml, tiêm bắp cơ ức cho gà mái 3 lần với khoảng cách giữa các lần tiêm là 14 ngày. Quy trình này cho hiệu giá kháng thể IgY trong lòng đỏ trứng đạt cao nhất là 8,1 log2, hàm lượng IgY đạt 27 mg/ml lòng đỏ (trung bình 63,9 mg IgY trên mỗi quả trứng).

4. Hiệu quả phòng và trị bệnh của kháng thể IgY lòng đỏ trứng trên vịt con 3 ngày tuổi đạt mức độ nào?
Kháng thể IgY lòng đỏ tiêm bắp cơ ức đạt hiệu quả bảo hộ cao hơn so với đường uống (phòng bệnh đạt 93,3% so với 86,7%). Liều kháng thể 50 PD50 mang lại hiệu quả cao nhất trong cả thử nghiệm phòng bệnh và trị bệnh, giúp tỷ lệ vịt con sống sót sau khi công cường độc bằng chủng DHAV-3 đạt trên 80%.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Phạm Công Uẩn đã phân lập và xác định virus viêm gan vịt type I genotype 3 (DHAV-3) là căn nguyên chính gây các ổ dịch viêm gan trên vịt con tại 5 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, với mức độ đồng nhất di truyền cao (98-100%) và độc lực mạnh. Công trình đã xây dựng thành công quy trình sản xuất kháng thể IgY tinh sạch từ lòng đỏ trứng gà bằng phương pháp tủa phân đoạn ammonium sulfate 40% đạt hiệu giá kháng thể cao (8,1 log2). Thử nghiệm thực nghiệm chứng minh chế phẩm kháng thể IgY ở liều 50 PD50 tiêm bắp cơ ức bảo hộ trên 80% vịt con trước sự công cường độc của virus, cung cấp giải pháp sinh học có giá trị ứng dụng cao cho công tác phòng và trị bệnh viêm gan vịt tại địa phương.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Chăn nuôi vịt là một nghề chăn nuôi truyền thống, lâu đời của người dân ở một số tỉnh thuộc khu vực đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Hàng năm, nghề nuôi vịt đã cung cấp một lượng thực phẩm đáng kể cho nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu. Những năm gần đây, số lượng đàn vịt gia tăng nhanh chóng và đã trở thành nguồn thu nhập chính của nhiều nông hộ. Tuy nhiên, trong những năm qua tình hình dịch bệnh xảy ra trên vịt diễn biến ngày càng phức tạp và gây chết nhiều vịt của người chăn nuôi.

Những căn nguyên gây bệnh trên vịt có thể do vi khuẩn, virus như bệnh tụ huyết trùng gia cầm, bệnh dịch tả vịt, bệnh cúm gia cầm. tương tự như những bệnh truyền nhiễm này thì bệnh viêm gan vịt do virus là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, gây thiệt hại rất lớn cho nền chăn nuôi vịt đặc biệt là vịt con. Bệnh viêm gan vịt do virus thường bộc phát cấp tính, lây lan nhanh, do nhiều type virus khác nhau gây bệnh như virus viêm gan vịt type I, virus viêm gan vịt type II và virus viêm gan vịt type III; phổ biến nhất là virus viêm gan vịt type I (Kim et al, 2006; Tseng et al, 2007). Bệnh xảy ra chủ yếu ở vịt con từ 1 đến 28 ngày tuổi, với bệnh tích đặc trưng là gan sưng và xuất huyết lốm đốm trên bề mặt gan, lách và thận sưng (Woolcock, 2004), khi vịt nhiễm bệnh thì tỷ lệ chết cao từ 90-100% và gây thành dịch trên diện rộng (Shane, 2005).

Bệnh viêm gan vịt do virus gây thiệt hại nặng nề cho nền chăn nuôi vịt ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam (Woolcock, 2003). Ở Việt Nam, bệnh viêm gan vịt do virus được ghi nhận vào năm 1978 nhưng chưa phân lập được mầm bệnh. Giai đoạn 1979 – 1983, bệnh xảy ra ở nhiều địa phương và làm chết nhiều vịt con (Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng, 1985). Theo thống kê của Tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) thì bệnh viêm gan vịt do virus gây thiệt hại nặng nề cho nền chăn nuôi vịt ở Việt Nam (OIE, 2006).

Hiện nay, bệnh viêm gan vịt do virus thường xuyên xuất hiện và đã xảy ra rất nhiều ổ dịch trên vịt con ở các tỉnh ĐBSCL với những triệu chứng thần kinh co giật hoặc chết rất nhanh không kịp thể hiện các triệu chứng. Khi chúng tôi mổ khám đã quan sát được bệnh tích rất đặc trưng của bệnh viêm gan do virus như gan nhạt màu và có nhiều điểm, đốm xuất huyết trên bề mặt gan, nhưng điều trị bằng kháng sinh không hiệu quả. Bệnh viêm gan vịt do virus có tính chất nguy hiểm như tỷ lệ chết cao và diễn biến phức tạp nhưng đến nay chưa có nghiên cứu nào về bệnh này được thực hiện ở ĐBSCL. Cho nên, bệnh vẫn còn là mối đe dọa lớn đến sức khỏe đàn vịt cũng như ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của những người chăn 1 luan an nuôi vịt trong vùng.

Ngày nay, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật gen, nên việc xác định được chủng virus gây bệnh, nghiên cứu đặc điểm di truyền và mối quan hệ về nguồn gốc của chúng là cơ sở quan trọng xây dựng qui trình phòng và trị bệnh cho đàn vịt hiệu quả, là yêu cầu cấp thiết để có biện pháp phòng chống bệnh hữu hiệu nhằm bảo vệ sức khỏe đàn vịt ở địa phương, để đáp ứng những yêu cầu cấp thiết đó, đề tài: “Phân lập, định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và sản xuất kháng thể phòng bệnh” được thực hiện.