Nghiên Cứu Xây Dựng Quy Trình Real-time RT-PCR Chẩn Đoán Vi Rút EV71 Gây Bệnh Tay Chân Miệng Ở Trẻ Em

• Tác giả: Trần Văn Thịnh
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hội
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Quy Trình RT-PCR Chẩn Đoán Vi Rút EV71 Gây Bệnh Tay Chân Miệng Ở Trẻ Em
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Khái niệm về bệnh Tay Chân Miệng
• 1.2. Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới và Việt Nam
• 1.2.1. Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới
• 1.2.2. Tình hình bệnh Tay Chân Miệng tại Việt Nam
• 1.3. Cấu trúc phân tử và cơ chế gây bệnh Tay Chân Miệng của vi rút EV71
• 1.3.1. Cấu trúc phân tử của vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng
• 1.3.2. Phương thức truyền bệnh của EV71
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Dụng cụ, trang thiết bị
• 2.4. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu và mẫu dò Taqman probe để khuếch đại gen đặc trưng của Vi rút EV71
• 2.4.1. Các nguyên tắc thiết kế mồi
• 2.4.2. Các nguyên tắc thiết kế Probe
• 2.4.3. Các phần mềm sử dụng
• 2.5. Phương pháp tiến hành
• 2.5.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ chủng vi rút EV71
• 2.5.2. Phản ứng Realtime RT-PCR
• 2.5.3. Phương pháp điện di
• 2.5.4. Tối ưu hóa phản ứng Realtime RT-PCR để chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng
• 2.5.4.1. Phương pháp RT-PCR nhân gen đặc trưng của virus EV71
• 2.5.4.2. Tối ưu nhiệt độ kéo dài
• 2.5.4.3. Tối ưu nồng độ Magie
• 2.5.5. Xác định độ nhạy của phản ứng Realtim RT-PCR
• 2.5.5.1. Phương pháp đo nồng độ xác định số bản sao plasmid
• 2.5.5.2. Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng RT-PCR
• 2.5.6. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng trên các chủng vi rút khác nhau
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Phân tích, so sánh trình tự bằng phần mềm ClustalX
• 3.2. Kết quả thiết kế mồi và mẫu dò
• 3.3. Kết quả khảo sát hoạt động của hệ mồi trên thực nghiệm
• 3.4. Kết quả tối ưu nhiệt độ của phản ứng RT-PCR
• 3.5. Kết quả tối ưu nồng độ Magie của phản ứng RT-PCR
• 3.6. Kết quả khuếch đại và đường chuẩn của phản ứng RT-PCR
• 3.7. Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên plasmid tách dòng
• 3.8. Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên virut EV71 nuôi cấy
• 3.9. Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng Realtimr RT-PCR trên các chủng vi rút khác nhau
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu RT PCR EV71 Gây Bệnh TTM ở Trẻ

Bệnh tay chân miệng (TCM) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, thường gặp ở trẻ em, do các virus EV71 gây ra. Bệnh lây lan qua đường tiêu hóa và tiếp xúc trực tiếp. Các triệu chứng bao gồm sốt, phát ban phỏng nước ở tay, chân và miệng. Mặc dù bệnh thường tự khỏi, nhưng có thể gây ra các biến chứng nghiêm trọng như viêm não, phù phổi cấp, và thậm chí tử vong. Việc chẩn đoán nhanh chóng và chính xác là rất quan trọng để điều trị kịp thời và ngăn ngừa các biến chứng. Kỹ thuật RT-PCR đã nổi lên như một phương pháp hiệu quả để phát hiện virus EV71 trong các mẫu bệnh phẩm. Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng và tối ưu hóa quy trình RT-PCR để chẩn đoán virus EV71 gây bệnh tay chân miệng ở trẻ em.

1.1. Khái niệm cơ bản về bệnh tay chân miệng ở trẻ em

Bệnh tay chân miệng là một bệnh nhiễm trùng do virus gây ra, chủ yếu ảnh hưởng đến trẻ em dưới 5 tuổi. Bệnh đặc trưng bởi các vết loét trong miệng và phát ban trên bàn tay và bàn chân. Các tác nhân gây bệnh thường gặp là Coxsackievirus A16 (CA16) và Enterovirus 71 (EV71). Bệnh lây lan dễ dàng qua tiếp xúc trực tiếp với nước bọt, phân hoặc dịch tiết từ các vết loét của người bệnh. Việc chẩn đoán sớm và chính xác là rất quan trọng để ngăn ngừa các biến chứng nghiêm trọng, đặc biệt là các biến chứng thần kinh do EV71 gây ra.

1.2. Tầm quan trọng của việc chẩn đoán EV71 kịp thời

Việc chẩn đoán EV71 kịp thời là rất quan trọng vì virus này có thể gây ra các biến chứng nghiêm trọng hơn so với các loại virus gây bệnh tay chân miệng khác. Các biến chứng có thể bao gồm viêm não, viêm màng não, liệt mềm và thậm chí tử vong. Chẩn đoán sớm giúp các bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị phù hợp và theo dõi sát sao tình trạng của bệnh nhân, từ đó giảm thiểu nguy cơ xảy ra các biến chứng nguy hiểm. Kỹ thuật RT-PCR đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện EV71 nhanh chóng và chính xác.

II. Thách Thức Trong Chẩn Đoán Virus EV71 Gây Bệnh TTM

Mặc dù có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh tay chân miệng, nhưng việc chẩn đoán chính xác virus EV71 vẫn còn nhiều thách thức. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy virus thường tốn thời gian và đòi hỏi kỹ thuật cao. Các bộ kit thương mại có thể có giá thành cao và độ chính xác không đảm bảo, đặc biệt là đối với các chủng virus đang lưu hành ở Việt Nam. Do đó, việc phát triển một quy trình RT-PCR hiệu quả, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao là rất cần thiết để cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị bệnh tay chân miệng do EV71 gây ra.

2.1. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán truyền thống

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như nuôi cấy virus và xét nghiệm huyết thanh học có nhiều hạn chế. Nuôi cấy virus tốn nhiều thời gian (vài ngày đến vài tuần) và đòi hỏi phòng thí nghiệm có trang thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên có tay nghề cao. Xét nghiệm huyết thanh học chỉ có thể xác định sự hiện diện của kháng thể, không thể phân biệt được giữa nhiễm trùng hiện tại và nhiễm trùng trước đó. Ngoài ra, độ nhạy và độ đặc hiệu của các xét nghiệm này có thể không cao, dẫn đến kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả.

2.2. Sự cần thiết của kỹ thuật RT PCR trong chẩn đoán EV71

Kỹ thuật RT-PCR là một phương pháp chẩn đoán phân tử nhanh chóng, nhạy bén và đặc hiệu để phát hiện ARN virus EV71. Kỹ thuật này cho phép khuếch đại và phát hiện các đoạn gen đặc trưng của virus EV71 trong thời gian ngắn (vài giờ). RT-PCR có độ nhạy cao hơn nhiều so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống, cho phép phát hiện virus ngay cả khi nồng độ virus trong mẫu bệnh phẩm rất thấp. Ngoài ra, RT-PCR có độ đặc hiệu cao, giúp phân biệt EV71 với các loại virus gây bệnh tay chân miệng khác.

2.3. Vấn đề về giá thành và độ chính xác của bộ kit thương mại

Các bộ kit thương mại để chẩn đoán EV71 thường có giá thành cao, gây khó khăn cho các cơ sở y tế có nguồn lực hạn chế. Ngoài ra, độ chính xác của các bộ kit này có thể không đảm bảo, đặc biệt là khi sử dụng để chẩn đoán các chủng virus đang lưu hành ở Việt Nam. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng các bộ kit thương mại có thể cho kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả, dẫn đến sai sót trong chẩn đoán và điều trị.

III. Quy Trình RT PCR Chẩn Đoán Virus EV71 Phương Pháp Tối Ưu

Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng và tối ưu hóa một quy trình RT-PCR để chẩn đoán virus EV71 gây bệnh tay chân miệng ở trẻ em. Quy trình này bao gồm các bước chính: tách chiết ARN virus, thiết kế mồi và probe đặc hiệu, thực hiện phản ứng RT-PCR, và phân tích kết quả. Mục tiêu là tạo ra một quy trình có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đồng thời giảm thiểu chi phí và thời gian thực hiện. Quy trình RT-PCR được thiết kế để có thể phát hiện các chủng virus EV71 đang lưu hành ở Việt Nam.

3.1. Thiết kế mồi và probe đặc hiệu cho virus EV71

Việc thiết kế mồi và probe đặc hiệu là yếu tố quan trọng để đảm bảo độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR. Mồi và probe được thiết kế dựa trên trình tự gen của virus EV71, đặc biệt là vùng gen VP1, là vùng có tính đặc hiệu cao và ít biến đổi. Các phần mềm tin sinh học được sử dụng để phân tích trình tự gen và lựa chọn các vùng thích hợp để thiết kế mồi và probe. Mồi và probe được kiểm tra kỹ lưỡng để đảm bảo không có sự tương đồng với các virus khác, tránh gây ra kết quả dương tính giả.

3.2. Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng RT PCR

Các điều kiện phản ứng RT-PCR cần được tối ưu hóa để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất. Các yếu tố cần được tối ưu hóa bao gồm nhiệt độ ủ, thời gian ủ, nồng độ MgCl2, nồng độ mồi và probe, và nồng độ enzyme polymerase. Các thí nghiệm được thực hiện để xác định các điều kiện phản ứng tối ưu, đảm bảo phản ứng diễn ra hiệu quả và cho kết quả chính xác. Việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng giúp giảm thiểu nguy cơ xảy ra kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả.

3.3. Kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình RT PCR

Sau khi xây dựng và tối ưu hóa quy trình RT-PCR, cần kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình. Độ nhạy được xác định bằng cách sử dụng các mẫu chuẩn chứa nồng độ virus EV71 đã biết. Độ đặc hiệu được xác định bằng cách sử dụng các mẫu chứa các virus khác gây bệnh tay chân miệng, như Coxsackievirus A16. Kết quả kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu cho phép đánh giá hiệu quả của quy trình RT-PCR và xác định khả năng phát hiện chính xác virus EV71.

IV. Ứng Dụng Thực Tế và Kết Quả Nghiên Cứu RT PCR EV71

Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình RT-PCR được xây dựng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc chẩn đoán virus EV71. Quy trình này có thể được ứng dụng trong các bệnh viện và phòng xét nghiệm để chẩn đoán nhanh chóng và chính xác bệnh tay chân miệng do EV71 gây ra. Việc chẩn đoán sớm giúp các bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị phù hợp và theo dõi sát sao tình trạng của bệnh nhân, từ đó giảm thiểu nguy cơ xảy ra các biến chứng nguy hiểm. Quy trình RT-PCR này cũng có thể được sử dụng để giám sát dịch tễ học bệnh tay chân miệng và phát hiện các chủng virus EV71 mới.

4.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình RT PCR

Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình RT-PCR được xây dựng có độ nhạy cao, có thể phát hiện virus EV71 ở nồng độ rất thấp. Độ đặc hiệu của quy trình cũng rất cao, không có phản ứng chéo với các virus khác gây bệnh tay chân miệng. Điều này đảm bảo rằng quy trình RT-PCR có thể chẩn đoán chính xác virus EV71 và tránh gây ra kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh TTM

Quy trình RT-PCR có thể được ứng dụng rộng rãi trong các bệnh viện và phòng xét nghiệm để chẩn đoán bệnh tay chân miệng do EV71 gây ra. Việc chẩn đoán nhanh chóng và chính xác giúp các bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị phù hợp và theo dõi sát sao tình trạng của bệnh nhân. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các trường hợp bệnh nặng, có nguy cơ biến chứng cao. Chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời có thể giúp giảm thiểu nguy cơ tử vong và di chứng.

4.3. Giám sát dịch tễ học và phát hiện chủng virus EV71 mới

Quy trình RT-PCR cũng có thể được sử dụng để giám sát dịch tễ học bệnh tay chân miệng và phát hiện các chủng virus EV71 mới. Việc giám sát dịch tễ học giúp các cơ quan y tế nắm bắt được tình hình dịch bệnh và đưa ra các biện pháp phòng chống hiệu quả. Việc phát hiện các chủng virus EV71 mới giúp các nhà khoa học nghiên cứu về sự tiến hóa của virus và phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị mới.

V. Kết Luận và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu RT PCR EV71

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng và tối ưu hóa một quy trình RT-PCR hiệu quả để chẩn đoán virus EV71 gây bệnh tay chân miệng ở trẻ em. Quy trình này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể được ứng dụng trong các bệnh viện và phòng xét nghiệm. Trong tương lai, nghiên cứu có thể được mở rộng để phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và đơn giản hơn, phù hợp với điều kiện thực tế ở Việt Nam. Ngoài ra, cần tiếp tục nghiên cứu về sự tiến hóa của virus EV71 để phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu và ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu đã xây dựng thành công một quy trình RT-PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để chẩn đoán virus EV71. Quy trình này có thể được ứng dụng rộng rãi trong các bệnh viện và phòng xét nghiệm, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác bệnh tay chân miệng do EV71 gây ra. Việc chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời có thể giúp giảm thiểu nguy cơ tử vong và di chứng.

5.2. Hướng phát triển nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, nghiên cứu có thể được mở rộng để phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và đơn giản hơn, phù hợp với điều kiện thực tế ở Việt Nam. Ví dụ, có thể phát triển các bộ kit RT-PCR sử dụng công nghệ real-time PCR, cho phép phát hiện virus trong thời gian ngắn hơn và không cần thiết bị phức tạp. Ngoài ra, cần tiếp tục nghiên cứu về sự tiến hóa của virus EV71 để phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn.

5.3. Đề xuất các biện pháp phòng ngừa bệnh TTM hiệu quả

Ngoài việc chẩn đoán và điều trị, việc phòng ngừa bệnh tay chân miệng cũng rất quan trọng. Các biện pháp phòng ngừa hiệu quả bao gồm rửa tay thường xuyên bằng xà phòng, vệ sinh sạch sẽ đồ chơi và bề mặt tiếp xúc, tránh tiếp xúc với người bệnh, và tiêm phòng vaccine (nếu có). Các biện pháp này giúp giảm thiểu nguy cơ lây lan bệnh tay chân miệng trong cộng đồng.

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh Tay Chân Miệng (TCM) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút đường ruột gây ra, phổ biến ở trẻ em dưới 6 tuổi và có khả năng gây thành dịch lớn. Theo số liệu của Bộ Y tế Việt Nam, số ca mắc TCM tăng nhanh qua các năm, với gần 62.000 trường hợp được ghi nhận trong 9 tháng đầu năm 2011 và 114 ca tử vong tại 24 tỉnh, thành phố. Tác nhân chủ yếu gây bệnh là Enterovirus 71 (EV71), có khả năng gây biến chứng thần kinh nghiêm trọng như viêm não, phù phổi cấp, thậm chí tử vong. Việc chẩn đoán sớm và chính xác EV71 là yếu tố then chốt trong kiểm soát dịch bệnh và điều trị hiệu quả.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là xây dựng quy trình chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh TCM ở trẻ em bằng kỹ thuật One-Step Realtime RT-PCR với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Nghiên cứu tập trung vào thiết kế cặp mồi đặc hiệu và mẫu dò Taqman Probe để khuếch đại gen đặc trưng của EV71, đồng thời xác định các thông số kỹ thuật tối ưu cho phản ứng. Phạm vi nghiên cứu bao gồm các mẫu bệnh phẩm dịch ngoáy họng thu thập từ bệnh nhân nghi ngờ nhiễm EV71 tại Bệnh viện Đống Đa, Hà Nội trong năm 2016.

Ý nghĩa của nghiên cứu thể hiện qua việc phát triển một phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác, tiết kiệm chi phí so với các bộ kit nhập khẩu và kỹ thuật nuôi cấy truyền thống. Quy trình này góp phần nâng cao năng lực chẩn đoán tại các cơ sở y tế tuyến tỉnh và trung ương, hỗ trợ công tác phòng chống dịch bệnh TCM hiệu quả hơn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc phân tử vi rút EV71: EV71 thuộc họ Picornaviridae, có bộ gen RNA dương sợi dài khoảng 7.4 kb, mã hóa polyprotein gồm các protein cấu trúc VP1-VP4 và protein không cấu trúc. Gen VP1 là vùng gen đặc trưng, chịu áp lực chọn lọc của hệ miễn dịch, được sử dụng làm mục tiêu thiết kế mồi và probe trong kỹ thuật PCR.
• Phương thức truyền bệnh EV71: EV71 lây truyền qua đường miệng-miệng và miệng-phân, với thời gian ủ bệnh kéo dài, đặc biệt dễ lây lan trong môi trường gia đình và cộng đồng trẻ em.
• Kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng Taqman Probe: Đây là kỹ thuật khuếch đại gen với khả năng phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại theo thời gian thực, sử dụng probe gắn chất phát huỳnh quang để tăng độ đặc hiệu và độ nhạy so với PCR truyền thống. Kỹ thuật này cho phép phát hiện sớm vi rút từ các loại mẫu bệnh phẩm khác nhau, rút ngắn thời gian xét nghiệm và giảm thiểu sai số.

Các khái niệm chính bao gồm: cặp mồi (primer), mẫu dò (probe), chu kỳ ngưỡng (Ct), độ nhạy, độ đặc hiệu, và hiệu quả khuếch đại.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nghiên cứu sử dụng 69 mẫu bệnh phẩm dịch ngoáy họng từ bệnh nhân nghi ngờ nhiễm EV71 tại Bệnh viện Đống Đa, Hà Nội (2016). Ngoài ra, 10 chủng vi rút EV71 nuôi cấy từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và các mẫu bệnh phẩm dương tính với các vi rút, vi khuẩn khác được sử dụng để đánh giá độ đặc hiệu.
• Thiết kế cặp mồi và probe: Dựa trên trình tự gen VP1 của EV71 từ ngân hàng dữ liệu NCBI, sử dụng phần mềm ClustalX để sắp xếp trình tự, BioEdit để chọn vùng bảo tồn, Oligo Analyzer để kiểm tra tính chất mồi và probe, và BLAST để xác định độ đặc hiệu.
• Phương pháp phân tích: Thực hiện phản ứng One-Step Realtime RT-PCR với kit SuperScript® III One-Step RT-PCR của Invitrogen, tối ưu nhiệt độ kéo dài (55°C) và nồng độ MgSO4 (5 mM). Đánh giá độ nhạy bằng cách pha loãng plasmid mang gen EV71 và vi rút nuôi cấy, xác định giới hạn phát hiện. Đánh giá độ đặc hiệu bằng thử nghiệm trên các chủng vi rút và vi khuẩn khác.
• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và thực hiện xét nghiệm trong năm 2016, phân tích dữ liệu và hoàn thiện luận văn trong năm 2017.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thiết kế cặp mồi và probe đặc hiệu: Cặp mồi EV71F (18 bp) và EV71R (24 bp) cùng probe Taqman dài 27 bp được thiết kế trên vùng gen VP1, sản phẩm khuếch đại 103 bp. Kết quả BLAST cho thấy độ tương đồng 100% với các trình tự EV71 trên toàn cầu, đảm bảo tính đặc hiệu cao.

2. Tối ưu điều kiện phản ứng: Nhiệt độ kéo dài 55°C và nồng độ MgSO4 5 mM cho kết quả khuếch đại tốt nhất với giá trị Ct thấp hơn khoảng 2 chu kỳ so với các điều kiện khác, biểu đồ khuếch đại rõ ràng và đường curve đẹp.

3. Độ nhạy của phản ứng: Giới hạn phát hiện của phản ứng RT-PCR là 100 copies/ml đối với cả plasmid mang gen EV71 và vi rút nuôi cấy, với giá trị Ct tương ứng khoảng 27-35. Độ nhạy này tương đương hoặc vượt trội so với các nghiên cứu quốc tế.

4. Độ đặc hiệu của phản ứng: Phản ứng chỉ cho kết quả dương tính với mẫu RNA của EV71 và mẫu bệnh phẩm dương tính, không xảy ra phản ứng chéo với các vi rút và vi khuẩn khác như Cytomegalovirus, Hepes simplex virus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, và E. coli, đạt độ đặc hiệu 100%.

5. Ứng dụng thực tế: Trong 69 bệnh nhân nghi ngờ TCM tại Bệnh viện Đống Đa, 21 trường hợp (30.4%) được xác định dương tính với EV71 bằng quy trình Realtime RT-PCR. Tỷ lệ này phù hợp với các nghiên cứu trong và ngoài nước, phản ánh tính đa dạng của dịch tễ EV71.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình One-Step Realtime RT-PCR được xây dựng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp để chẩn đoán sớm vi rút EV71 trong các mẫu bệnh phẩm dịch ngoáy họng. Việc tối ưu nhiệt độ kéo dài và nồng độ MgSO4 giúp tăng hiệu quả khuếch đại, giảm giá trị Ct, từ đó nâng cao độ nhạy của xét nghiệm.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả tương đồng với các công trình tại Singapore, Hàn Quốc và Trung Quốc, khẳng định tính khả thi và hiệu quả của quy trình trong điều kiện Việt Nam. Đặc biệt, việc sử dụng cặp mồi và probe thiết kế dựa trên trình tự gen VP1 giúp tránh phản ứng chéo với các chủng enterovirus khác, nâng cao độ chính xác.

Việc áp dụng quy trình này tại Bệnh viện Đống Đa đã phát hiện được tỷ lệ nhiễm EV71 phù hợp với đặc điểm dịch tễ trong nước, góp phần hỗ trợ chẩn đoán và điều trị kịp thời, giảm thiểu biến chứng nặng. Dữ liệu cũng cho thấy nhóm tuổi dưới 6 tuổi chiếm đa số, phù hợp với đặc điểm lâm sàng của bệnh.

Biểu đồ khuếch đại, đường chuẩn và điện di sản phẩm PCR là các công cụ trực quan minh chứng cho hiệu quả và độ tin cậy của quy trình. Các bảng số liệu về giá trị Ct, độ nhạy và độ đặc hiệu cung cấp bằng chứng định lượng rõ ràng cho kết quả nghiên cứu.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai rộng rãi quy trình One-Step Realtime RT-PCR tại các bệnh viện tuyến tỉnh và trung ương nhằm nâng cao năng lực chẩn đoán sớm vi rút EV71, giảm thiểu biến chứng và tử vong do TCM. Thời gian thực hiện: 1-2 năm; chủ thể: Bộ Y tế, các bệnh viện chuyên khoa truyền nhiễm.

2. Đào tạo kỹ thuật viên và cán bộ y tế về kỹ thuật Realtime RT-PCR và quy trình tách chiết RNA để đảm bảo chất lượng xét nghiệm và kết quả chính xác. Thời gian: 6-12 tháng; chủ thể: các trung tâm đào tạo, bệnh viện.

3. Phát triển bộ kit chẩn đoán nội địa dựa trên quy trình nghiên cứu nhằm giảm chi phí xét nghiệm, tăng tính chủ động trong phòng chống dịch bệnh. Thời gian: 2-3 năm; chủ thể: các viện nghiên cứu, doanh nghiệp công nghệ sinh học.

4. Tăng cường giám sát dịch tễ và thu thập mẫu bệnh phẩm đa dạng để cập nhật biến đổi di truyền của EV71, từ đó điều chỉnh thiết kế mồi và probe phù hợp với chủng lưu hành mới. Thời gian: liên tục; chủ thể: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, các bệnh viện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành di truyền học, vi sinh y học: Nghiên cứu cung cấp phương pháp thiết kế mồi, probe và tối ưu kỹ thuật Realtime RT-PCR, giúp nâng cao kiến thức và kỹ năng thực nghiệm.

2. Bác sĩ và kỹ thuật viên xét nghiệm tại các bệnh viện truyền nhiễm: Áp dụng quy trình chẩn đoán nhanh, chính xác EV71 để hỗ trợ điều trị và phòng ngừa biến chứng cho bệnh nhân TCM.

3. Cơ quan quản lý y tế và phòng chống dịch bệnh: Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chính sách giám sát, phòng chống dịch TCM hiệu quả, đồng thời phát triển bộ kit chẩn đoán nội địa.

4. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và sản xuất kit xét nghiệm: Tham khảo quy trình và kết quả nghiên cứu để phát triển sản phẩm chẩn đoán phù hợp với điều kiện Việt Nam, giảm chi phí và tăng tính cạnh tranh.

Câu hỏi thường gặp

1. Realtime RT-PCR khác gì so với PCR truyền thống trong chẩn đoán EV71?
   Realtime RT-PCR cho phép phát hiện sản phẩm khuếch đại ngay trong quá trình phản ứng, giúp rút ngắn thời gian xét nghiệm và tăng độ nhạy, đặc hiệu nhờ sử dụng probe huỳnh quang, trong khi PCR truyền thống chỉ phát hiện sau khi kết thúc phản ứng.

2. Độ nhạy 100 copies/ml có ý nghĩa gì trong thực tế?
   Độ nhạy này cho phép phát hiện rất sớm lượng vi rút thấp trong mẫu bệnh phẩm, giúp chẩn đoán kịp thời ngay cả khi tải lượng vi rút chưa cao, từ đó hỗ trợ điều trị hiệu quả và ngăn ngừa biến chứng.

3. Tại sao chọn gen VP1 làm mục tiêu thiết kế mồi và probe?
   Gen VP1 chứa vùng bảo tồn đặc trưng của EV71, chịu áp lực chọn lọc của hệ miễn dịch, giúp phân biệt chính xác EV71 với các enterovirus khác, đảm bảo độ đặc hiệu cao cho xét nghiệm.

4. Quy trình này có thể áp dụng cho các loại mẫu bệnh phẩm khác ngoài dịch ngoáy họng không?
   Có, quy trình đã được tối ưu để áp dụng trên nhiều loại mẫu như dịch não tủy, phân, giúp linh hoạt trong chẩn đoán các trường hợp nghi ngờ khác nhau.

5. Làm thế nào để đảm bảo không xảy ra phản ứng chéo với các vi rút hoặc vi khuẩn khác?
   Việc sử dụng phần mềm BLAST kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và probe, cùng với thử nghiệm thực nghiệm trên các chủng vi rút, vi khuẩn khác đã chứng minh phản ứng không xảy ra phản ứng chéo, đảm bảo kết quả chính xác.

Kết luận

• Đã thiết kế thành công cặp mồi và mẫu dò Taqman Probe đặc hiệu cho gen VP1 của vi rút EV71, sản phẩm khuếch đại 103 bp.
• Quy trình One-Step Realtime RT-PCR được tối ưu với nhiệt độ kéo dài 55°C và nồng độ MgSO4 5 mM, đạt độ nhạy 100 copies/ml và độ đặc hiệu 100%.
• Ứng dụng quy trình trên 69 mẫu bệnh phẩm dịch ngoáy họng tại Bệnh viện Đống Đa cho kết quả dương tính EV71 chiếm 30.4%, phù hợp với đặc điểm dịch tễ trong nước.
• Quy trình có thể áp dụng rộng rãi tại các cơ sở y tế để chẩn đoán sớm, hỗ trợ điều trị và phòng chống dịch bệnh Tay Chân Miệng hiệu quả.
• Đề xuất triển khai đào tạo, phát triển bộ kit nội địa và tăng cường giám sát dịch tễ để nâng cao hiệu quả phòng chống EV71 trong tương lai.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các bệnh viện và trung tâm xét nghiệm áp dụng quy trình này, đồng thời phối hợp nghiên cứu mở rộng để cập nhật và hoàn thiện kỹ thuật.