Tổng quan nghiên cứu

Vô sinh là một vấn đề sức khỏe sinh sản ngày càng gia tăng trên toàn cầu, với tỷ lệ hiếm muộn trung bình khoảng 6-12% dân số theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Tại Việt Nam, nghiên cứu trên 13.300 cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ cho thấy tỷ lệ vô sinh là 7,7%, trong đó tỷ lệ vô sinh nam và nữ tương đương nhau. Vô sinh nam chiếm khoảng 20-30% các trường hợp vô sinh, với nhiều nguyên nhân liên quan đến chất lượng và số lượng tinh trùng. Tinh dịch đồ là xét nghiệm thường quy để đánh giá chất lượng tinh trùng, tuy nhiên không phản ánh được tính toàn vẹn của vật chất di truyền trong tinh trùng. Sự phân mảnh DNA tinh trùng được xem là một chỉ số quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của nam giới, nhưng các bộ kít xét nghiệm hiện nay còn hạn chế về độ ổn định và chi phí cao (khoảng 1-2 triệu đồng/xét nghiệm).

Luận văn tập trung nghiên cứu hoàn thiện bộ kít thử và quy trình tạo tiêu bản xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng người nhằm đáp ứng nhu cầu xét nghiệm chính xác, ổn định và chi phí hợp lý. Mục tiêu cụ thể gồm xác định các điều kiện thích hợp để chế tạo kít thử và đánh giá mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với các đặc tính tinh trùng sử dụng bộ kít BK-HaloSperm. Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 10/2020 đến tháng 11/2021 tại Trung tâm Hỗ trợ sinh sản và Nam học - Bệnh viện Sản Nhi tỉnh Phú Thọ và Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán và điều trị vô sinh nam, góp phần nâng cao hiệu quả các phương pháp hỗ trợ sinh sản.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về sinh tinh, cấu trúc chromatin tinh trùng và cơ chế phân mảnh DNA tinh trùng. Hai lý thuyết chính được áp dụng gồm:

  • Lý thuyết cấu trúc chromatin tinh trùng: Chromatin tinh trùng được đóng gói chủ yếu bởi protamine, giúp DNA nén chặt gấp 6 lần so với tế bào sinh dưỡng. Sự thay thế histone bằng protamine trong quá trình sinh tinh là yếu tố quan trọng đảm bảo tính toàn vẹn của DNA. Các tổn thương DNA, đặc biệt ở vùng liên kết với histone, ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển phôi thai.

  • Mô hình cơ chế phân mảnh DNA tinh trùng: Phân mảnh DNA do nhiều nguyên nhân như rối loạn quá trình chết theo chương trình, tái tổ hợp không hoàn chỉnh, tác động của các chất oxy hóa, enzyme nội sinh, tia xạ, hóa chất và các tác nhân môi trường. Mức độ phân mảnh DNA được đánh giá qua chỉ số DFI (DNA Fragmentation Index) với các ngưỡng phân loại thấp (<15%), trung bình (15-30%) và cao (>30%).

Các khái niệm chuyên ngành quan trọng bao gồm: tinh dịch đồ, phân mảnh DNA tinh trùng, kỹ thuật SCD (Sperm Chromatin Dispersion), DTT (Dithiothreitol), agarose, và các phương pháp xét nghiệm phân mảnh DNA như COMET, SCSA, TUNEL, SCD.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thực nghiệm sử dụng kỹ thuật SCD để phát triển bộ kít BK-HaloSperm và quy trình tạo tiêu bản xác định mức độ phân mảnh DNA tinh trùng. Tổng cộng 200 mẫu tinh dịch được thu thập từ nam giới vô sinh tại Trung tâm Hỗ trợ sinh sản và Nam học - Bệnh viện Sản Nhi tỉnh Phú Thọ. Cỡ mẫu 50 được sử dụng để tối ưu các điều kiện kỹ thuật, 150 mẫu dùng để so sánh kết quả với bộ kít thương mại Halosperm Tây Ban Nha.

Phương pháp chọn mẫu là ngẫu nhiên thuận tiện. Các bước nghiên cứu gồm:

  • Xác định điều kiện cố định tinh trùng trên lam kính với các nồng độ agarose khác nhau (0,3% đến 4%).

  • Xác định điều kiện biến tính DNA tinh trùng bằng dung dịch axit HCl với các nồng độ từ 0,05N đến 0,15N.

  • Xác định điều kiện ly giải nhân tinh trùng với dung dịch ly giải chứa DTT ở các nồng độ 10mM, 50mM và 100mM.

  • Thiết lập bộ kít BK-HaloSperm gồm lam kính, lamen, gel agarose, dung dịch axit HCl, dung dịch ly giải, dung dịch cồn và thuốc nhuộm Giemsa.

  • Thực hiện quy trình xét nghiệm và đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học.

Phân tích số liệu sử dụng phần mềm SPSS phiên bản 20 với các phương pháp thống kê Pearson và T-test để đánh giá tương quan và sự khác biệt giữa các bộ kít. Nghiên cứu tuân thủ các nguyên tắc đạo đức, bảo mật thông tin đối tượng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Điều kiện cố định tinh trùng tối ưu: Nồng độ agarose 1,0% cho kết quả cố định tinh trùng tốt nhất, đảm bảo độ mịn và khả năng quan sát quầng halo rõ ràng. Nồng độ agarose phủ lam kính 0,5% được chọn vì tạo bề mặt mịn, đồng nhất, giúp hỗn hợp tinh dịch - agarose dàn đều và không bị trôi trong quá trình xử lý.

  2. Điều kiện biến tính DNA tinh trùng: Nồng độ axit HCl 0,08N là thích hợp nhất để biến tính DNA, tạo quầng halo sáng, đều và quan sát rõ nhân, đuôi tinh trùng. Nồng độ thấp hơn không đủ biến tính, cao hơn làm quầng halo không đều.

  3. Điều kiện ly giải nhân tinh trùng: Dung dịch ly giải chứa 10mM DTT đủ để phá vỡ cầu nối disulfide trong protamine, tạo quầng halo rõ nét và giữ nguyên hình dạng tinh trùng. Nồng độ DTT này giảm 80 lần so với các bộ kít thương mại, giúp giảm chi phí đáng kể.

  4. Đánh giá tương đương bộ kít BK-HaloSperm và Halosperm Tây Ban Nha: Trên 150 mẫu, hệ số tương quan Pearson giữa hai bộ kít đạt 0,996 (p < 0,001), không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mức độ phân mảnh DNA (p = 0,894). Điều này chứng minh bộ kít BK-HaloSperm có độ chính xác và ổn định tương đương bộ kít thương mại.

  5. Mối tương quan giữa phân mảnh DNA tinh trùng với đặc điểm lâm sàng và tinh dịch đồ: Tỷ lệ phân mảnh DNA trung bình ở nhóm sử dụng thuốc lá là 26,79 ± 20,48%, nhóm không sử dụng là 25,69 ± 17,71%, không có sự khác biệt có ý nghĩa (p = 0,725). Các chỉ số tinh dịch đồ như mật độ, độ di động, tỷ lệ sống và hình dạng tinh trùng có mối tương quan nghịch với mức độ phân mảnh DNA, phù hợp với các nghiên cứu trước đây.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc lựa chọn nồng độ agarose và axit HCl phù hợp là yếu tố quyết định chất lượng tiêu bản và khả năng quan sát phân mảnh DNA tinh trùng. Việc giảm nồng độ DTT trong dung dịch ly giải không làm giảm hiệu quả ly giải nhân tinh trùng, đồng thời giảm chi phí sản xuất bộ kít, tạo điều kiện thuận lợi cho ứng dụng rộng rãi trong thực tế.

Sự tương đồng kết quả giữa bộ kít BK-HaloSperm và bộ kít thương mại Halosperm Tây Ban Nha khẳng định tính khả thi của bộ kít tự sản xuất trong chẩn đoán phân mảnh DNA tinh trùng. Mối tương quan nghịch giữa phân mảnh DNA và các chỉ số tinh dịch đồ phản ánh ảnh hưởng tiêu cực của tổn thương DNA đến chất lượng tinh trùng và khả năng sinh sản.

Việc không tìm thấy sự khác biệt về phân mảnh DNA giữa nhóm sử dụng và không sử dụng thuốc lá có thể do nhiều yếu tố khác nhau như mức độ sử dụng, thời gian tiếp xúc và các yếu tố môi trường khác. Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu trong nước, tuy nhiên vẫn cần nghiên cứu sâu hơn với mẫu lớn hơn và kiểm soát các yếu tố gây nhiễu.

Dữ liệu có thể được trình bày qua các biểu đồ so sánh tỷ lệ phân mảnh DNA giữa các nhóm, biểu đồ tương quan giữa DFI và các chỉ số tinh dịch đồ, giúp minh họa rõ ràng mối quan hệ và hỗ trợ phân tích.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Triển khai sử dụng bộ kít BK-HaloSperm trong các trung tâm hỗ trợ sinh sản nhằm giảm chi phí xét nghiệm phân mảnh DNA tinh trùng, nâng cao khả năng chẩn đoán chính xác nguyên nhân vô sinh nam trong vòng 12 tháng tới.

  2. Đào tạo kỹ thuật viên và bác sĩ chuyên khoa về quy trình xét nghiệm và đọc kết quả phân mảnh DNA tinh trùng để đảm bảo tính chính xác và đồng nhất trong đánh giá, thực hiện trong 6 tháng đầu năm.

  3. Tăng cường nghiên cứu mở rộng về ảnh hưởng của các yếu tố lâm sàng như thuốc lá, rượu bia, tuổi tác đến phân mảnh DNA tinh trùng với cỡ mẫu lớn hơn và đa trung tâm trong 2 năm tới nhằm làm rõ cơ chế và đề xuất biện pháp can thiệp phù hợp.

  4. Phát triển phần mềm hỗ trợ phân tích hình ảnh tiêu bản và tự động hóa quy trình đọc kết quả để giảm sai số chủ quan, nâng cao hiệu quả xét nghiệm, dự kiến hoàn thành trong 3 năm.

  5. Khuyến cáo nam giới trong độ tuổi sinh sản thực hiện lối sống lành mạnh, hạn chế tiếp xúc với các tác nhân gây stress oxy hóa như thuốc lá, rượu bia, môi trường ô nhiễm nhằm giảm thiểu tổn thương DNA tinh trùng, góp phần cải thiện khả năng sinh sản.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Bác sĩ chuyên khoa Nam học và Hỗ trợ sinh sản: Nghiên cứu cung cấp phương pháp xét nghiệm phân mảnh DNA tinh trùng chính xác, giúp chẩn đoán nguyên nhân vô sinh nam và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp.

  2. Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm sinh học phân tử và tinh dịch đồ: Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chi tiết, tiêu chuẩn hóa thao tác và đọc kết quả, nâng cao chất lượng xét nghiệm.

  3. Nhà nghiên cứu trong lĩnh vực Công nghệ sinh học và Y học tái tạo: Cung cấp cơ sở lý thuyết và thực nghiệm về cấu trúc chromatin tinh trùng, cơ chế phân mảnh DNA, mở ra hướng nghiên cứu mới về cải thiện chất lượng tinh trùng.

  4. Các trung tâm hỗ trợ sinh sản và bệnh viện chuyên khoa: Tham khảo để áp dụng bộ kít BK-HaloSperm nhằm giảm chi phí xét nghiệm, tăng khả năng tiếp cận dịch vụ cho bệnh nhân vô sinh nam.

Câu hỏi thường gặp

  1. Phân mảnh DNA tinh trùng là gì và tại sao quan trọng?
    Phân mảnh DNA tinh trùng là sự tổn thương hoặc đứt gãy các sợi DNA trong nhân tinh trùng, ảnh hưởng đến khả năng thụ tinh và phát triển phôi. Mức độ phân mảnh cao làm giảm tỷ lệ thụ thai và tăng nguy cơ sảy thai.

  2. Bộ kít BK-HaloSperm có ưu điểm gì so với bộ kít thương mại?
    BK-HaloSperm có chi phí thấp hơn do giảm nồng độ DTT trong dung dịch ly giải, quy trình đơn giản, kết quả tương đương bộ kít thương mại Halosperm Tây Ban Nha với độ chính xác cao (hệ số tương quan 0,996).

  3. Quy trình xét nghiệm phân mảnh DNA tinh trùng được thực hiện như thế nào?
    Mẫu tinh dịch được pha trộn với agarose, cố định trên lam kính, biến tính DNA bằng axit HCl, ly giải nhân tinh trùng, nhuộm Giemsa và quan sát dưới kính hiển vi để đánh giá quầng halo, từ đó xác định tỷ lệ phân mảnh DNA.

  4. Mối liên quan giữa phân mảnh DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ là gì?
    Phân mảnh DNA tinh trùng có mối tương quan nghịch với mật độ, độ di động, tỷ lệ sống và hình dạng tinh trùng, cho thấy tổn thương DNA ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng tinh trùng.

  5. Việc sử dụng thuốc lá có ảnh hưởng đến phân mảnh DNA tinh trùng không?
    Nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mức độ phân mảnh DNA giữa nhóm sử dụng và không sử dụng thuốc lá, tuy nhiên các yếu tố khác như mức độ sử dụng và thời gian tiếp xúc có thể ảnh hưởng, cần nghiên cứu thêm.

Kết luận

  • Đã xác định được các điều kiện kỹ thuật tối ưu để chế tạo bộ kít BK-HaloSperm với nồng độ agarose 1,0%, phủ lam 0,5%, axit HCl 0,08N và dung dịch ly giải chứa 10mM DTT.
  • Bộ kít BK-HaloSperm cho kết quả phân mảnh DNA tinh trùng tương đương với bộ kít thương mại Halosperm Tây Ban Nha, với hệ số tương quan Pearson đạt 0,996 (p < 0,001).
  • Mức độ phân mảnh DNA tinh trùng có mối tương quan nghịch với các chỉ số tinh dịch đồ như mật độ, độ di động, tỷ lệ sống và hình dạng tinh trùng.
  • Việc sử dụng thuốc lá không làm tăng mức độ phân mảnh DNA tinh trùng một cách có ý nghĩa thống kê trong mẫu nghiên cứu.
  • Nghiên cứu mở ra hướng phát triển bộ kít xét nghiệm phân mảnh DNA tinh trùng chi phí thấp, hiệu quả cao, góp phần nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị vô sinh nam.

Next steps: Triển khai ứng dụng bộ kít BK-HaloSperm tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản, mở rộng nghiên cứu đa trung tâm và phát triển công nghệ tự động hóa phân tích hình ảnh.

Call to action: Các chuyên gia và cơ sở y tế nên cân nhắc áp dụng bộ kít BK-HaloSperm để nâng cao hiệu quả chẩn đoán vô sinh nam, đồng thời khuyến khích nghiên cứu sâu hơn về các yếu tố ảnh hưởng đến phân mảnh DNA tinh trùng.