Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắc xin cúm AH5N1 trên tế bào thận khỉ tiên ...

Luận văn nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất vắc xin cúm AH5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát, ứng dụng trong quy mô phòng thí nghiệm.

• Tác giả: Nguyễn Thu Vân
• Người hướng dẫn: GS. Hoàng Thủy Nguyên
• Trường học: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Quy trình sản xuất vắc xin cúm AH5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm
• Loại tài liệu: báo cáo khoa học
• Năm xuất bản: 2007
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Quy trình sản xuất vắc xin cúm AH5N1

Quy trình sản xuất vắc xin cúm AH5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát được thực hiện trong phòng thí nghiệm với các bước cụ thể và chặt chẽ. Quy trình này bao gồm việc tạo chủng virus tái tổ hợp giảm độc lực, sử dụng kỹ thuật di truyền ngược để đảm bảo tính kháng nguyên của chủng gốc A/Vietnam/1194/2004. Các phương pháp kiểm tra chất lượng chủng được áp dụng theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), đảm bảo an toàn và hiệu quả của vắc xin.

1.1. Tạo chủng virus tái tổ hợp

Chủng virus tái tổ hợp được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền ngược, kết hợp gen HA và NA từ chủng A/Vietnam/1194/2004 với 6 gen còn lại từ chủng A/PR8/34. Quá trình này được thực hiện trên dòng tế bào PMKc, một dòng tế bào phổ biến trong sản xuất vắc xin. Chủng virus tái tổ hợp được kiểm tra độc lực và tính kháng nguyên trước khi sử dụng làm chủng gốc (MSV) và chủng sản xuất (WSV).

1.2. Sản xuất vắc xin trên tế bào thận khỉ

Quy trình sản xuất vắc xin trên tế bào thận khỉ tiên phát bao gồm các bước: gây nhiễm virus trên tế bào, nuôi cấy, gặt virus, bất hoạt bằng formalin, cô đặc và siêu lọc. Các bước này được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm với các thông số kỹ thuật chính xác, đảm bảo chất lượng và hiệu quả của vắc xin.

II. Công nghệ sản xuất vắc xin

Công nghệ sản xuất vắc xin cúm AH5N1 được phát triển dựa trên các phương pháp hiện đại, bao gồm kỹ thuật di truyền ngược và các phương pháp tinh chế kháng nguyên. Quy trình này đảm bảo tính ổn định và hiệu suất cao trong sản xuất vắc xin ở quy mô phòng thí nghiệm.

2.1. Kỹ thuật di truyền ngược

Kỹ thuật di truyền ngược được sử dụng để tạo ra chủng virus tái tổ hợp giảm độc lực, giữ nguyên tính kháng nguyên của chủng gốc. Phương pháp này cho phép sản xuất vắc xin an toàn và hiệu quả, đáp ứng các yêu cầu của WHO.

2.2. Tinh chế kháng nguyên

Các phương pháp tinh chế kháng nguyên hiện đại như siêu lọc, cô đặc và thẩm tách được áp dụng để sản xuất vắc xin. Các phương pháp này đảm bảo độ tinh khiết và hiệu quả của kháng nguyên, giúp vắc xin đạt chất lượng cao.

III. Đánh giá tính an toàn và hiệu quả

Nghiên cứu vắc xin cúm AH5N1 bao gồm các thử nghiệm đánh giá tính an toàn và hiệu quả trên động vật thực nghiệm. Các kết quả cho thấy vắc xin sản xuất được an toàn và có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh.

3.1. Thử nghiệm an toàn

Các thử nghiệm an toàn được thực hiện trên chuột lang, chuột nhắt và thỏ. Kết quả cho thấy vắc xin không gây tác dụng phụ nghiêm trọng và đáp ứng các tiêu chuẩn an toàn của WHO.

3.2. Đánh giá đáp ứng miễn dịch

Vắc xin được thử nghiệm trên gà và khỉ để đánh giá hiệu quả miễn dịch. Kết quả cho thấy vắc xin kích thích sản xuất kháng thể bảo vệ, đáp ứng yêu cầu về hiệu quả miễn dịch.

IV. Ứng dụng thực tiễn

Phát triển vắc xin cúm AH5N1 có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống đại dịch. Vắc xin sản xuất được có khả năng ứng dụng rộng rãi trong thực tế, giúp giảm thiểu nguy cơ lây lan và tử vong do virus cúm AH5N1.

4.1. Phòng chống đại dịch

Vắc xin cúm AH5N1 là công cụ quan trọng trong phòng chống đại dịch, đặc biệt trong bối cảnh virus có khả năng lây truyền từ gia cầm sang người. Vắc xin giúp giảm thiểu nguy cơ bùng phát dịch và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

4.2. Triển vọng tương lai

Nghiên cứu này mở ra triển vọng phát triển các loại vắc xin khác dựa trên công nghệ tế bào thận khỉ tiên phát. Điều này có ý nghĩa lớn trong việc nâng cao năng lực sản xuất vắc xin trong nước và quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BKHCN-BYT VVSDT T¦ BKHCN-BYT BKHCN-BYT vvsdt t− VVSDT T¦ Bé khoa häc c«ng nghÖ – Bé y tÕ ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ trung −¬ng 1 Yersin, Hµ Néi b¸o c¸o tæng kÕt khoa häc vµ kü thuËt ®Ò tµi nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin cóm a/h5n1 trªn tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t ë quy m« phßng thÝ nghiÖm m∙ sè : §T§L-2006/02G GS.NguyÔn THU V¢N 6374 14/5/2007 Hµ néi – 2007 B¶n quyÒn 2007 thuéc C«ng ty v¾cxin vµ sinh phÈm sè 1,ViÖn VSDTT¦ §¬n xin sao chÐp b¶n toµn bé hoÆc tõng phÇn tµi liÖu nµy ph¶i göi ®Õn Gi¸m ®èc C«ng ty v¾cxin vµ sinh phÈm sè 1 trõ tr−êng hîp sö dông víi môc ®Ých nghiªn cøu Bé khoa häc c«ng nghÖ – Bé y tÕ ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ trung −¬ng 1 Yersin, Hµ Néi b¸o c¸o tæng kÕt khoa häc vµ kü thuËt ®Ò tµi nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin cóm a/h5n1 trªn tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t ë quy m« phßng thÝ nghiÖm m∙ sè : §T§L-2006/02G GS.NguyÔn THU V¢N Hµ néi – 2007 B¶n th¶o viÕt xong th¸ng 3/2007 Tµi liÖu nµy ®−îc chuÈn bÞ trªn c¬ së kÕt qu¶ thùc hiÖn §Ò tµi cÊp Nhµ n−íc, m· sè §T§L-2006/02G ®Ò tµi nghiªn cøu khoa häc c«ng nghÖ nhµ n−íc §T§L-2006/02G nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin cóm a/h5n1 trªn tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t ë quy m« phßng thÝ nghiÖm Cè vÊn khoa häc : GS.Hoµng Thñy Nguyªn Chñ nhiÖm ®Ò tµi : GS.TSKH NguyÔn Thu V©n C¸c c¸n bé tham gia TS.NguyÔn TuyÕt Nga Th¹c sü §inh Thóy V©n KS.TrÞnh TuÊn ViÖt CNSH.NguyÔn Kim Dung Th¹c sü §oµn V¨n L−u TS.§ç Thñy Ng©n Th¹c sü NguyÔn Thu H»ng CNSH.NguyÔn Hoµng Mai Th¹c sü NguyÔn BÝch Thñy TS.NguyÔn QuÕ Anh TS.Lª Quúnh Mai Th¹c sü NguyÔn Lª Kh¸nh H»ng C¬ quan thùc hiÖn : ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng c¸c ch÷ viÕt t¾t ADN Desoxyribonucleic acid (axÝt desoxyribonucleic) ARN Ribonucleic acid (axÝt ribonucleic) BSA Bovine Serum Albumin CCID 50 Cell Culture Infectious Dose 50 (LiÒu g©y nhiÔm 50% tÕ bµo) CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung t©m kiÓm so¸t bÖnh tËt vµ dù phßng- Mü) CPE Cytopathic effect t¸c ®éng g©y hñyho¹i tÕ bµo dpi day post infection Ngµy sau g©y nhiÔm E.coli Escherichia coli ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (thö nghiÖm miÔn dÞch g¾n enzym) EID50 Effective infectious dose 50 (LiÒu g©y nhiÔm hiÖu qu¶ 50%) ED50 Effective dose 50 (LiÒu g©y miÔn dÞch 50%) FDA Food and Drug Administration (C¬ quan qu¶n lý thùc phÈm vµ thuèc) HA Hemagglutination assay Thö nghiÖm ng−ng kÕt hång cÇu HAU HA unit §¬n vÞ HA HI Hemagglutination inhibition øc chÕ ng−ng kÕt hång cÇu IVPI Intravenous Pathogenicity Index ChØ sè ®é lùc tiªm tÜnh m¹ch kD kiloDalton mARN message ARN ARN th«ng tin MDCK Madin-Darby Canine Kidney MDHQ MiÔn dÞch huúnh quang MEM Minimum Essential Medium M«i tr−êng cÇn thiÕt tèi thiÓu ml mililit µg mcg MSV Master seed virus (Chñng gèc gièng) M.tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Trùc khuÈn Lao nm nanomet NMWL Nominal Molecular Weight Limit ( KÝch cì giíi h¹n träng l−îng ph©n tö ) OD Optical Density MËt ®é quang häc PBS Phosphat Buffer Saline pfu Plaque Forming Unit (§¬n vÞ t¹o ®¸m ho¹i tö) PMKc Primary Monkey Kidney cells QC Quality Control KiÓm tra chÊt l−îng RNP Ribonucleoprotein RT- PCR Reverse transcription- Polymerase chain reaction (ph¶n øng chuçi polymeraza phiªn m· ng−îc) rpm round per minute (Vßng/phót) RV Realase Virus Virut gi¶i phãng rg Reverse genetics Di truyÒn ng−îc SIV Simian Immunodefficiency Virus Virut g©y suy gi¶m miÔn dÞch ë khØ SV40 Simian Virus 40 SFV Simian Foamy Virus Virut t¹o bät cña khØ SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (®iÖn di trªn gel polyacrylamid) SRID Single Radial Immuno Diffusion KhuyÕch t¸n miÔn dÞch vßng trßn ®¬n SPF Specific Pathogen Free Kh«ng cã c¸c yÕu tè g©y bÖnh ®Æc biÖt TCYTTG Tæ Chøc Y TÕ ThÕ Giíi TB TÕ bµo VX V¾cxin VABIOTECH C«ng ty v¾cxin vµ sinh phÈm sè 1 WSV Working seed virus ( Chñng s¶n xuÊt) WHO World Health Organization Tæ chøc Y tÕ thÕ giíi môc lôc §Æt vÊn ®Ò 1 PhÇn 1 : tæng quan 3 1. §Æc ®iÓm chung cña virót cóm 3 1.CÊu tróc virion 3 1. CÊu tróc hÖ gen virót Cóm vµ c¸c protein m· hãa 4 1. Sù t¸i tæ hîp cña virót Cóm 8 1. Sù ph¸t triÓn cña virót trªn tÕ bµo 9 1. §Æc ®iÓm dÞch tÔ häc 10 1. Kü thuËt di truyÒn ng−îc 13 1. Dù phßng 15 1. Mét sè quy tr×nh s¶n xuÊt v¾cxin Cóm 19 PhÇn 2: vËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p 21 2.3 Kh¸ng nguyªn chuÈn A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) 22 2. VËt liÖu vµ trang thiÕt bÞ kh¸c 23 2. Ph−¬ng ph¸p 23 2. Ph−¬ng ph¸p t¹o virut t¸i tæ hîp 23 2. S¶n xuÊt chñng gièng g«c vµ chñng s¶n xuÊt v¾cxin H5N1 23 2. Thö nghiÖm kiÓm tra ®éc lùc cña WSV rgA/H5N1 24 2. Quy tr×nh lùa chän khØ s¹ch 24 2. Quy tr×nh s¶n xuÊt v¾c xin Cóm H5N1 trªn quy m« phßng thÝ nghiÖm 25 2. Ph−¬ng ph¸p ®Þnh l−îng HA trong v¾cxin 27 2. Ph−¬ng ph¸p s¶n xuÊt kh¸ng huyÕt thanh khØ kh¸ng H5N1 sö dông trong thö nghiÖm SRID 28 2. C¸c thö nghiÖm huyÕt thanh häc 28 2. C¸c thö nghiÖm x¸c ®Þnh hiÖu gi¸ virót 28 2. C¸c thö nghiÖm kiÓm tra chÊt l−îng 29 2. §¸nh gi¸ sù nh©n lªn cña virót trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy 34 2. §¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ ®¸p øng miÔn dÞch trong thö nghiÖm tiÒn l©m sµng 34 2. Ph−¬ng ph¸p thÝch øng chñng NIBRG-14 trªn tÕ bµo PMKc vµ Vero 35 2. Ph−¬ng ph¸p thÝch øng chñng rgA/H5N1 trªn tÕ bµo Vero 35 PhÇn 3: KÕt qu¶ 35 3. ThiÕt lËp hÖ chñng gèc vµ chñng s¶n xuÊt v¾c xin Cóm rgA/ H5N1 víi ®Çy ®ñ c¸c chØ tiªu kü thuËt theo quy ®Þnh 36 3. X©y dùng quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾c xin Cóm rgA/H5N1 trªn tÕ bµo PMKc 43 3. KÕt qu¶ s¶n xuÊt thö nghiÖm v¾c xin Cóm ë quy m« phßng thÝ nghiÖm 48 3. KiÓm tra chÊt l−îng vµ ®¸nh gi¸ ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾cxin Cóm rgA/H5N1 trªn ®éng vËt thùc nghiÖm 50 3. KÕt qu¶ nghiªn cøu thÝch øng chñng NIBRG-14 trªn dßng tÕ bµo PMKc, Vero vµ rgA/H5N1 trªn Vero 59 3. X©y dùng tiªu chuÈn c¬ së cho v¾cxin cóm A/H5N1 vÒ c¸c mÆt 64 KÕt luËn 70 KiÕn nghÞ 72 Tµi liÖu tham kh¶o 73 Danh môc c¸c b¶ng trong b¸o c¸o B¶ng Tªn b¶ng Trang B¶ng 1 C¸c ®o¹n ARN trong hÖ gen virót Cóm A vµ c¸c protein m· hãa 5 B¶ng 2 C¸c v¾cxin Cóm ®· ®−îc ®¨ng ký sö dông trªn thÕ giíi 16 B¶ng 3 HiÖu gi¸ virót rg 15T qua c¸c lÇn cÊy truyÒn 37 B¶ng 4 KÕt qu¶ thö nghiÖm kiÓm tra ®éc tÝnh cña c¸c chñng virót 39 A/VN/1203,PR8 vµ rgA/H5N1 trªn chån s−¬ng B¶ng 5 KÕt qu¶ ph©n tÝch tÝnh kh¸ng nguyªn b»ng ph−¬ng ph¸p HI cña c¸c 39 chñng v¾cxin vµ chñng “bè mÑ” B¶ng 6 KÕt qu¶ so s¸nh chñng rgA/H5N1 víi chñng NIBRG -14 (WHO) 40 B¶ng 7 C¸c ph−¬ng ph¸p kiÓm tra khØ s¹ch 44 B¶ng 8 Quy tr×nh kiÓm tra khØ s¹ch 45 B¶ng 9 KÕt qu¶ nghiªn cøu x¸c ®Þnh quy tr×nh g©y nhiÔm 45 B¶ng KÕt qu¶ nghiªn cøu x¸c ®Þnh hµm l−îng nh«m hÊp phô tèi −u 48 10 B¶ng KÕt qu¶ kiÓm tra trong qu¸ tr×nh s¶n xuÊt 49 11 B¶ng KÕt qu¶ hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ HI cña khØ sau khi tiªm 50 12 B¶ng T−¬ng quan gi÷a nång ®é huyÕt thanh khØ vµ hµm l−îng HA trong 51 13 v¾cxin Cóm b»ng thö nghiÖm SRID B¶ng Hµm l−îng HA trong c¸c lo¹t v¾cxin ®−îc ®Þnh l−îng theo ph−¬ng ph¸p 52 14 SRID B¶ng KÕt qu¶ c¸c thö nghiÖm kiÓm tra vÒ mÆt sinh häc 53 15 B¶ng KÕt qu¶ thö nghiÖm hãa – lý cña c¸c lo¹t v¾cxin 54 16 B¶ng KÕt qu¶ kiÓm tra tÝnh g©y miÔn dÞch trªn gµ 56 17 B¶ng KÕt qu¶ thö nghiÖm c«ng hiÖu (ED50) trªn chuét 56 18 B¶ng KÕt qu¶ hiÖu gi¸ HI sau khi g©y miÔn dÞch trªn khØ 56 19 B¶ng KÕt qu¶ hiÖu gi¸ HI sau khi tiªm cho khØ c¸c liÒu kh¸c nhau 58 20 B¶ng HiÖu gi¸ virut c¸c lÇn cÊy truyÒn chñng NIBRG -14 trªn tÕ bµo Vero vµ 61 21 PMKc B¶ng KÕt qu¶ cÊy truyÒn rgA/H5N1 trªn dßng tÕ bµo Vero 64 22 Danh môc c¸c h×nh trong b¸o c¸o H×nh Tªn h×nh Trang H×nh 1 Quy tr×nh s¶n xuÊt v¾c xin Cóm A/H5N1 25 H×nh 2 Tr×nh tù nucleotit ë vÞ trÝ c¾t liªn quan ®Õn ®éc tÝnh cña virót 36 trªn ®o¹n gen HA cña virót rgA/H5N1 trong mçi lo¹t v¾cxin so víi tr×nh tù ®ã trªn gen HA cña chñng virut hoang d¹i A/VN/1194 H×nh 3 Th©n nhiÖt cña chån sau khi g©y nhiÔm víi c¸c chñng virót 38 rgA/H5N1 H×nh 4 H×nh ¶nh g©y nhiÔm chñng v¾cxin rgA/H5N1 trªn PMKc sau 41 72h H×nh 5 H×nh ¶nh tÕ bµo PMKc sau g©y nhiÔm 72h chñng v¾cxin 41 rgA/H5N1 H×nh 6 H×nh ¶nh tÕ bµo PMKc sau khi g©y nhiÔm 72h víi chñng 42 v¾cxin rgH5N1 H×nh 7 H×nh ¶nh tÕ bµo PMKc sau khi g©y nhiÔm 72h víi chñng 42 v¾cxin rgA/H5N1 H×nh 8 H×nh ¶nh tÕ bµo PMKc sau khi g©y nhiÔm 72h víi chñng 43 v¾cxin rgA/H5N1 H×nh 9 KÕt qu¶ HA vµ OD280nm cña c¸c ph©n ®o¹n sau khi siªu ly 47 t©m H×nh 10 H×nh ¶nh SRID sö dông 1,2µl huyÕt thanh khØ /ml agarose ®Þnh 51 l−îng HA trong v¾cxin Cóm H×nh 11 H×nh ¶nh SRID ®Þnh l−îng HA trong v¾cxin Cóm H5N1 55 H×nh 12 H×nh ¶nh tÕ bµo PMKc vµ Vero sau khi g©y nhiÔm chñng 60 NIBRG-14 sau 48h H×nh 13 KÕt qu¶ PCR nhËn d¹ng NIBRG -14 sau khi cÊy truyÒn 62 H×nh 14 ChØ sè pH trong 15 lo¹t v¾c xin Cóm 66 H×nh 15 Hµm l−îng Protein toµn phÇn trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 67 H×nh 16 Hµm l−îng Formaldehyt (g%) trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 67 H×nh 17 Hµm l−îng Thimerosal (g%) trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 68 H×nh 18 hµm l−îng Al+++ (g%) trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 68 Bµi tãm t¾t §Ò tµi: Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin Cóm A/H5N1 trªn tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t ë quy m« phßng thÝ nghiÖm 1. Môc tiªu chÝnh cña ®Ò tµi: 1. X©y dùng quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin Cóm A/H5N1 trªn tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t ë quy m« phßng thÝ nghiÖm 1. §¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾cxin s¶n xuÊt ®−îc trªn ®éng vËt thùc nghiÖm. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu : §Ò tµi ®· sö dông ph−¬ng ph¸p di truyÒn ng−îc (revese genetics) ®Ó t¹o ra chñng virut t¸i tæ hîp gi¶m ®éc lùc mµ vÉn gi÷ nguyªn tÝnh kh¸ng nguyªn cña chñng gèc A/VN/1194/2004, cã hiÖu gi¸ cao. C¸c ph−¬ng ph¸p kiÓm tra chÊt l−îng chñng lµ c¸c ph−¬ng ph¸p chuÈn thøc do TCYTTG quy ®Þnh, ®¶m b¶o yªu cÇu cña chñng s¶n xuÊt v¾cxin. C¸c ph−¬ng ph¸p tinh chÕ kh¸ng nguyªn hiÖn ®¹i nh−: gÆt virut, c« ®Æc, thÈm tÝch, tinh khiÕt, siªu läc…. còng ®−îc ¸p dông ®Ó s¶n xuÊt c¸c lo¹t v¾cxin ë quy m« phßng thÝ nghiÖm. C¸c ph−¬ng ph¸p kiÓm tra chÊt l−îng v¾cxin chuÈn thøc theo quy ®Þnh cña TCYTTG còng ®−îc ¸p dông ®Ó ®¶m b¶o chÊt l−îng cña v¾cxin xuÊt x−ëng.