Luận án tiến sĩ nghiên cứu xác định đột biến và lập bản đồ đột biến gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ duchenne việt nam

Nghiên cứu đột biến và lập bản đồ gen dystrophin ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne tại Việt Nam, phân tích chi tiết đột biến gen liên quan đến bệnh lý này.

• Tác giả: Đỗ Ngọc Hải
• Người hướng dẫn: Trần Vân Khánh
• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa sinh
• Đề tài: Nghiên cứu xác định đột biến và lập bản đồ đột biến gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận án tiến sỹ y học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Đặc điểm của bệnh DMD
• 1.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh
• 1.1.2. Biểu hiện lâm sàng của DMD
• 1.1.3. Xét nghiệm cận lâm sàng
• 1.1.3.1. Định lượng hoạt độ Creatine Kinase
• 1.1.3.2. Phương pháp thăm dò điện sinh lý cơ
• 1.1.3.3. Sinh thiết cơ
• 1.1.3.4. Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry)
• 1.1.4. Phương pháp di truyền phân tử xác định gen đột biến
• 1.1.5. Điều trị bệnh DMD
• 1.1.5.1. Điều trị nội khoa
• 1.1.5.2. Điều trị bằng liệu pháp gen

Tóm tắt

I. Đột biến gen và bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne

Đột biến gen là nguyên nhân chính gây ra bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD), một bệnh lý di truyền lặn liên kết giới tính. Gen dystrophin, nằm trên nhiễm sắc thể X, đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sự ổn định màng tế bào cơ. Đột biến trên gen này dẫn đến sự thiếu hụt protein dystrophin, gây ra các triệu chứng yếu cơ và tiến triển nặng dần. Bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne thường xuất hiện triệu chứng từ 3-5 tuổi và mất khả năng đi lại vào khoảng 12 tuổi. Nghiên cứu về đột biến gen dystrophin không chỉ giúp chẩn đoán bệnh mà còn hỗ trợ trong việc tư vấn di truyền và điều trị.

1.1. Cơ chế di truyền và đột biến gen dystrophin

Dystrophin là gen lớn nhất được biết đến, với chiều dài hơn 3000 kb và 79 exon. Đột biến trên gen này bao gồm xóa đoạn, lặp đoạn và đột biến điểm, trong đó xóa đoạn chiếm 60%. Các vùng đột biến trọng điểm thường tập trung ở exon 43-60 và exon 1-19. Nghiên cứu gen này giúp xác định chính xác loại đột biến, từ đó hỗ trợ trong chẩn đoán loạn dưỡng cơ và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp.

1.2. Tình hình bệnh loạn dưỡng cơ tại Việt Nam

Tại Việt Nam, bệnh loạn dưỡng cơ đã được nghiên cứu nhưng chủ yếu tập trung vào đột biến xóa đoạn. Nghiên cứu y học về dystrophin ở Việt Nam cần mở rộng để bao phủ toàn bộ 79 exon, bao gồm cả đột biến lặp đoạn và đột biến điểm. Điều này sẽ giúp xây dựng bản đồ gen đột biến hoàn chỉnh, hỗ trợ chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn.

II. Phương pháp nghiên cứu và chẩn đoán

Nghiên cứu gen dystrophin đòi hỏi sử dụng các phương pháp nghiên cứu gen tiên tiến như PCR, MLPA và giải trình tự gen. Những phương pháp này giúp xác định chính xác vị trí và loại đột biến, từ đó hỗ trợ trong chẩn đoán loạn dưỡng cơ. Việc xác định đột biến cũng giúp phát hiện người lành mang gen bệnh, hỗ trợ tư vấn di truyền và giảm tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng.

2.1. Kỹ thuật phân tích di truyền

Các kỹ thuật như Multiplex PCR và MLPA được sử dụng để phát hiện đột biến xóa đoạn và lặp đoạn. Giải trình tự gen giúp xác định đột biến điểm. Những phương pháp này đều có ưu điểm riêng, nhưng cần kết hợp để đạt hiệu quả tối đa trong nghiên cứu gen và chẩn đoán bệnh.

2.2. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Việc xác định đột biến gen dystrophin không chỉ hỗ trợ chẩn đoán loạn dưỡng cơ mà còn là tiền đề cho điều trị loạn dưỡng cơ bằng liệu pháp gen. Mỗi loại đột biến sẽ có phương pháp điều trị khác nhau, do đó, nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chất lượng sống cho bệnh nhân.

III. Ý nghĩa và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu về đột biến gen dystrophin và lập bản đồ gen không chỉ có giá trị khoa học mà còn mang lại lợi ích thực tiễn lớn. Nó giúp cải thiện chẩn đoán loạn dưỡng cơ, hỗ trợ tư vấn di truyền và giảm tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng. Đồng thời, nghiên cứu này cũng mở ra hướng đi mới trong điều trị loạn dưỡng cơ bằng liệu pháp gen, mang lại hy vọng cho bệnh nhân và gia đình.

3.1. Giá trị khoa học và y học

Nghiên cứu này đóng góp vào việc hiểu rõ hơn về bệnh lý di truyền và cơ chế phân tử của bệnh loạn dưỡng cơ. Nó cũng cung cấp dữ liệu quan trọng để phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn.

3.2. Ứng dụng trong cộng đồng

Việc xác định đột biến gen dystrophin giúp giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội bằng cách hỗ trợ tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh. Điều này góp phần giảm tỷ lệ mắc bệnh và cải thiện chất lượng sống cho cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy - DMD) là một bệnh lý thần kinh cơ di truyền thường gặp nhất ở người với tần suất ghi nhận khoảng 1/3500 trẻ trai sinh sống. Bệnh có đặc tính thoái hóa tiến triển nặng dần theo thời gian, khởi phát bằng các biểu hiện suy yếu cơ gốc chi, khó khăn trong vận động đi lại, đứng lên ngồi xuống và leo cầu thang. Ở giai đoạn muộn, bệnh nhân mất hoàn toàn khả năng tự di chuyển ở lứa tuổi 12 và thường tử vong ở độ tuổi ngoài 20 do tổn thương cơ tim và biến chứng suy hô hấp. Thể nhẹ hơn của bệnh là loạn dưỡng cơ Becker (Becker Muscular Dystrophy - BMD) có triệu chứng xuất hiện muộn hơn, diễn tiến lâm sàng chậm hơn nhưng đều có chung nguyên nhân căn bản là đột biến trên gen dystrophin nằm trên nhiễm sắc thể giới tính X.

Gen dystrophin là gen lớn nhất ở người được phát hiện cho đến nay với kích thước khoảng 2,4 Mb (hơn 3000 kb), bao gồm 79 exon và 7 promoter khác nhau, mã hóa phân tử mRNA dài 14 kb để tổng hợp protein dystrophin có trọng lượng phân tử 427 kDa. Các dạng đột biến gen dystrophin rất đa dạng, bao gồm đột biến xóa đoạn (chiếm 60 - 65%), đột biến điểm và các đột biến nhỏ (chiếm 25 - 30%), cùng đột biến lặp đoạn (chiếm 5 - 10%). Tại Việt Nam, nhiều công trình trước đây đã bước đầu khảo sát đột biến gen dystrophin nhưng chủ yếu tập trung vào đột biến xóa đoạn ở hai vùng điểm nóng (exon 1 - 19 và exon 43 - 60) thông qua kỹ thuật multiplex PCR cổ điển, chưa có công trình nào triển khai khảo sát đồng bộ cả 3 dạng đột biến trên toàn bộ 79 exon của gen.

Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Đỗ Ngọc Hải, chuyên ngành Hóa sinh (Mã số: 62720112), thực hiện tại Trường Đại học Y Hà Nội năm 2015 dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Trần Vân Khánh và GS. Tạ Thành Văn, được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu cụ thể:

1. Xác định đột biến xóa đoạn, lặp đoạn và đột biến điểm của gen dystrophin trên bệnh nhân DMD/BMD.
2. Bước đầu xây dựng bản đồ đột biến gen dystrophin trên bệnh nhân DMD/BMD Việt Nam.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài bao gồm 201 bệnh nhân được chẩn đoán xác định mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker tại Bệnh viện Nhi Trung ương. Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp mô tả loạt ca, ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại để phân tích cấu trúc di truyền của gen dystrophin trên toàn bộ các đối tượng nghiên cứu.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne từ những năm giữa thế kỷ XIX đến nay:

• Năm 1851, Meryon mô tả 8 trẻ trai thuộc 3 gia đình có biểu hiện yếu cơ tiến triển dẫn đến tử vong và không thấy tổn thương tủy sống.
• Năm 1861 và 1868, bác sĩ người Pháp Guillaume Benjamin Amand Duchenne đã mô tả chi tiết dạng phì đại cơ giả ở trẻ trai, tiến hành sinh thiết cơ trên người sống để đánh giá mô học, phát hiện mô cơ bị thay thế bởi mô mỡ và mô xơ liên kết, thiết lập tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh dựa trên giải phẫu bệnh và điện cơ.
• Năm 1879, Gower phát hiện quy luật di truyền qua người mẹ và mô tả dấu hiệu lâm sàng điển hình (dấu hiệu Gower) khi bệnh nhân phải dùng hai tay tì lần lượt lên cẳng chân, đầu gối và đùi để đứng dậy.
• Năm 1950, Peter Emil Becker mô tả thể bệnh loạn dưỡng cơ mang tên ông (BMD) có cơ chế bệnh sinh tương đồng nhưng diễn tiến nhẹ hơn.
• Năm 1985, Kunkel và cộng sự phân lập DNA từ bệnh nhân nam mắc bệnh DMD và phát hiện xóa đoạn lớn trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể X tại vị trí Xp21. Năm 1987, gen dystrophin và sản phẩm protein tương ứng được xác định. Đến năm 1993, toàn bộ cấu trúc 79 exon của gen được giải mã hoàn chỉnh.

Về cơ chế phân tử và điều trị, luận án phân tích sâu giả thuyết lệch khung dịch mã (frame-shift hypothesis) do Monaco và cộng sự đề xuất năm 1988: các đột biến xóa hoặc lặp đoạn làm thay đổi khung đọc mở (out of frame) sẽ làm mất hoàn toàn protein chức năng gây kiểu hình DMD nặng; ngược lại các đột biến duy trì khung đọc (in frame) sẽ tạo ra protein ngắn hơn nhưng còn chức năng một phần, gây kiểu hình BMD nhẹ. Các hướng tiếp cận liệu pháp gen hiện đại được tổng quan chi tiết gồm:

1. Thiết kế vector virus liên kết adeno tái tổ hợp (rAAV) mang mini-dystrophin (như mô hình của Harper và cộng sự dài 6 kb) hoặc micro-dystrophin (kích thước 3,6 kb khi xóa vùng R4 - R23) nhằm đưa gen thu nhỏ có chức năng vào tế bào cơ.
2. Thử nghiệm thuốc có hoạt tính đọc vượt mã dừng (readthrough) như kháng sinh nhóm aminoglycoside (gentamicin do Palmer nghiên cứu; Barton-Davis và cộng sự năm 1999) giúp riboxom vượt qua mã kết thúc đột biến để tạo chuỗi polypeptid hoàn chỉnh.
3. Sử dụng phân tử oligonucleotide ngược nghĩa (Antisense Oligonucleotide - AON) tác động vào trình tự tăng cường cắt nối exon (Exonic Splicing Enhancer - ESE) để bỏ qua exon bị lỗi (exon skipping) ở mức độ tiền mRNA (theo hướng nghiên cứu của Matsuo và cộng sự từ năm 1990, 2002), phục hồi khung dịch mã từ thể DMD sang thể BMD.

Tác giả / Nhóm nghiên cứu	Năm công bố	Phương pháp và Phát hiện chính
Kunkel và CS	1985	Phân lập DNA bệnh nhân DMD, phát hiện xóa đoạn lớn trên NST X (vị trí Xp21).
Monaco và CS	1988	Đưa ra thuyết chuyển mã (frame-shift) giải thích cơ chế phân tử khác biệt giữa DMD và BMD.
Chamberlain & Begg	1988, 1990	Phát triển kỹ thuật Multiplex PCR ứng dụng nhiều cặp mồi khuếch đại đồng thời các exon trọng điểm.
Matsuo và CS	1990, 2002	Phát hiện đột biến xóa vùng ESE exon 19 gây bỏ sót exon ở mức độ RNA; đề xuất dùng AON gây exon skipping.
Prior và CS	1995, 2005	Ứng dụng kỹ thuật Southern blot và giải trình tự phát hiện đột biến lặp đoạn, đột biến điểm và xác định người mang gen dị hợp tử.
Schouten và CS	2002	Phát minh kỹ thuật khuếch đại đa đoạn dò phụ thuộc phản ứng nối (MLPA) khảo sát biến đổi số lượng bản sao gen.
Takeshima và CS	2010	Khảo sát 442 bệnh nhân DMD/BMD bằng phối hợp MLPA, giải trình tự và phân tích NST: 61% xóa đoạn, 29% đột biến điểm.
Torella và CS	2010	Sử dụng DHPLC phát hiện 121 đột biến điểm trên gen dystrophin, trong đó 46,3% là đột biến tạo mã kết thúc sớm.
Lee Hyeyoung và CS	2013	Ứng dụng MLPA kết hợp giải trình tự trực tiếp phát hiện đột biến thêm nucleotide c.5657dupT tại exon 41.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây từng bước tiếp cận chẩn đoán di truyền học bệnh DMD:

• Nguyễn Thị Trang và cộng sự (1996) xác định giá trị enzym CK trong phát hiện người mang gen dị hợp tử đạt độ nhạy 54%.
• Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng (2002) ứng dụng multiplex PCR phát hiện 6/11 ca có đột biến xóa đoạn.
• Trần Vân Khánh và cộng sự (2004, 2005) nghiên cứu trên 85 bệnh nhân DMD/BMD bằng PCR ghi nhận 38% có đột biến xóa đoạn và phân tích đột biến tại vùng rod của gen dystrophin.
• Nguyễn Thị Trang và cộng sự (2005, 2006) phát hiện 13/21 ca xóa đoạn và ghi nhận tỷ lệ xóa đoạn exon 46, exon 51 chiếm 39,7% trong nhóm 58 bệnh nhân.
• Nguyễn Thị Phương Mai, Vũ Chí Dũng và CS (2007) chuẩn hóa quy trình multiplex PCR thay thế PCR đơn lẻ.
• Nguyễn Thị Băng Sương, Trần Vân Khánh và CS (2008, 2009) ứng dụng Realtime PCR và phân tích mRNA phát hiện người lành mang gen và ghi nhận khoảng 50% bệnh nhân có xóa đoạn ở mức độ phiên mã.
• Nguyễn Khắc Hân Hoan, Phạm Ngọc Khôi và CS (2009) thử nghiệm bước đầu kỹ thuật MLPA trên 11 bệnh nhân nam.

Vị trí của luận án: Kế thừa các kết quả nghiên cứu trước, luận án của Đỗ Ngọc Hải là công trình đầu tiên tại Việt Nam khảo sát cỡ mẫu lớn (201 bệnh nhân) bằng việc phối hợp đồng bộ các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại (MLPA, PCR, giải trình tự gen Sanger tự động) trên toàn bộ 79 exon của gen dystrophin nhằm xác định toàn diện các dạng đột biến (xóa đoạn, lặp đoạn, đột biến điểm) và lập bản đồ phân bố đột biến gen dystrophin đặc trưng cho quần thể bệnh nhân Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và cấu trúc gen - protein dystrophin

Gen dystrophin (DMD gene) nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể giới tính X ở vị trí Xp21.2. Cấu trúc gen bao gồm 79 exon xen kẽ bởi các intron lớn chiếm hơn 99% chiều dài gen. Hoạt động phiên mã của gen được điều hòa bởi 7 promoter chuyên biệt cho các mô: promoter vùng não (Brain), vùng cơ (Muscle), tế bào Purkinje, cùng các promoter nội tại Dp260 (võng mạc), Dp140 (não, thận), Dp116 (tế bào Schwann) và Dp71 (phân bố rộng khắp ở hầu hết các mô).

Sản phẩm protein dystrophin có trọng lượng 427 kDa, gồm 3685 acid amin, cấu trúc thành 4 domain chức năng:

1. Domain đầu N (N-terminal domain): Gồm 240 acid amin, có chức năng gắn kết với sợi actin của bộ khung tế bào. Đột biến vùng này thường tạo kiểu hình lâm sàng mức độ trung gian.
2. Domain trung tâm (Central rod domain): Chiếm 75% chiều dài phân tử, gồm khoảng 2700 acid amin với 24 đoạn lặp lại cấu trúc giống spectrin (R1 - R24) và 4 vùng nối linh hoạt (H1 - H4). Vùng này ít mang tính quyết định chức năng sống còn; đột biến tại đây thường gây kiểu hình nhẹ.
3. Domain giàu Cysteine (Cysteine-rich domain): Gồm 280 acid amin, có vai trò liên kết sống còn với phức hợp glycoprotein màng DGC (Dystrophin-Glycoprotein Complex), đặc biệt là liên kết trực tiếp với tiểu phần $\beta$-dystroglycan. Đột biến xóa đoạn vùng này phá hủy hoàn toàn phức hợp màng và gây kiểu hình lâm sàng rất nặng.
4. Domain đầu C (C-terminal domain): Gồm 420 acid amin, tham gia gắn kết với syntrophin và dystrobrevin trên màng tế bào.

Phức hợp DGC liên kết qua màng tế bào tạo cầu nối cơ học vững chắc giữa bộ khung xương actin bên trong tế bào cơ và mạng lưới laminin ngoại bào, giúp duy trì tính toàn vẹn và ổn định của màng sợi cơ trong các chu kỳ co duỗi liên tục. Khi thiếu hụt dystrophin, màng tế bào cơ trở nên mỏng manh, dễ bị rách vi thể trong quá trình co cơ, tạo điều kiện cho dòng ion Canxi ($Ca^{2+}$) tràn vào nội bào quá mức, kích hoạt các enzym tiêu protein nội bào, gây hoại tử tế bào cơ, phản ứng viêm mạn tính và dẫn đến xơ hóa mô cơ.

Quy luật di truyền

Bệnh DMD di truyền theo quy luật lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X. Trẻ trai ($X^d Y$) nhận một alen mang đột biến từ mẹ ($X^D X^d$) sẽ biểu hiện bệnh với xác suất 50%. Phụ nữ mang gen dị hợp tử ($X^D X^d$) hầu hết không có biểu hiện lâm sàng do có nhiễm sắc thể X lành bù trừ, tuy nhiên khoảng 80% trường hợp người nữ dị hợp tử có tăng hoạt độ enzym CK huyết thanh ở mức độ vừa phải. Ngoài ra, khoảng 30% các trường hợp bệnh nhân DMD xuất hiện do đột biến mới phát sinh (de novo mutation) mà người mẹ không mang gen bệnh. Hiện tượng phụ nữ biểu hiện triệu chứng nhẹ được giải thích bởi thuyết Lyon hóa (sự bất hoạt ngẫu nhiên và không đối xứng của nhiễm sắc thể X bình thường trong quá trình phát triển phôi).

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu thực tế

• Đối tượng nghiên cứu: 201 bệnh nhân được chẩn đoán xác định mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker tại Bệnh viện Nhi Trung ương dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng (yếu cơ tiến triển, dấu hiệu Gower, giả phì đại bắp chân, hạn chế vận động), xét nghiệm sinh hóa (hoạt độ enzym Creatine Kinase huyết thanh tăng cao từ 15.000 đến 35.000 UI/L so với giá trị bình thường < 160 UI/L) và các thăm dò cận lâm sàng (điện cơ đồ, sinh thiết cơ, hóa mô miễn dịch).
• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả loạt ca (case-series study).
• Quy trình kỹ thuật và công cụ phân tích:
  1. Thu thập và xử lý mẫu: Lấy 2 mL máu ngoại vi chống đông bằng EDTA. Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp ly giải tế bào, biến tính protein bằng Proteinase K, dung dịch SDS 10%, tinh sạch bằng hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1) và tủa bằng ethanol tuyệt đối kết hợp Sodium acetate 3M (pH 5,2). Tách chiết RNA bằng hóa chất Isogen và môi trường Mono-polyresolving.
  2. Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification): Sử dụng các bộ kít probe chuyên biệt cho 79 exon của gen dystrophin. Mỗi probe gồm 2 nửa oligonucleotide (nửa xuôi chứa trình tự mồi Y chung ở đầu 5' và đoạn lai đặc hiệu ở đầu 3'; nửa ngược chứa đoạn lai đặc hiệu ở đầu 5', đoạn đệm stuffer có chiều dài thay đổi từ 19 - 370 nucleotide và trình tự mồi X chung ở đầu 3'). Các probe lai đặc hiệu với DNA biến tính, được nối liền bằng enzym ligase chịu nhiệt và nhân bản đồng thời trong 2 phản ứng PCR duy nhất sử dụng một cặp mồi huỳnh quang. Sản phẩm khuếch đại được phân tách bằng hệ thống điện di mao quản. Dữ liệu thô được phân tích thông qua diện tích đỉnh (peak area) bằng phần mềm chuyên dụng như GeneMarker hoặc Coffalyser để xác định đột biến mất đoạn (mất đỉnh tín hiệu) hoặc lặp đoạn (tăng gấp đôi cường độ đỉnh tín hiệu so với mẫu chứng chuẩn).
  3. Kỹ thuật Multiplex PCR và RT-PCR: Khuếch đại các vùng exon nghi ngờ đột biến ở mức độ DNA hoặc phiên mã ngược RNA thành cDNA để kiểm chứng các biến đổi biểu hiện gen.
  4. Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger: Tiến hành trên các mẫu không phát hiện đột biến xóa đoạn hoặc lặp đoạn bằng MLPA. Thực hiện phản ứng giải trình tự huỳnh quang chuỗi dideoxynucleotide (ddNTP) 4 màu và đọc kết quả tự động trên hệ thống máy giải trình tự tự động ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Hoa Kỳ) nhằm xác định chính xác các đột biến điểm, đột biến vô nghĩa (nonsense), đột biến lệch khung dịch mã quy mô nhỏ và đột biến vị trí cắt nối (splicing site).
• Trang thiết bị nghiên cứu: Hệ thống máy luân nhiệt GeneAmp PCR System 9700 (Mỹ), máy điện di gel Mupid (Nhật Bản), hệ thống chụp ảnh gel tự động ChemiDoc EQ Bio-Rad (Mỹ), máy ly tâm lạnh Beckman (Mỹ), máy ly tâm để bàn Eppendorf (Đức), máy giải trình tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Mỹ).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tập trung trình bày một cách toàn diện và có hệ thống về cơ sở bệnh học, di truyền học và các tiến bộ công nghệ sinh học phân tử liên quan đến bệnh DMD/BMD:

• Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng: Phân tích diễn tiến tự nhiên của bệnh từ giai đoạn ấu nhi kín đáo đến giai đoạn biểu hiện rõ rệt lúc 3 - 5 tuổi với dáng đi Trendelenberg, dấu hiệu Gower điển hình và hiện tượng giả phì đại bắp chân (do sự thâm nhiễm mô mỡ và mô liên kết xơ hóa). Phân tích sự tăng vọt của enzym CK huyết thanh (thường đạt từ 15.000 đến 35.000 UI/L trong giai đoạn đầu và giảm dần ở giai đoạn cuối khi khối cơ bị tiêu hủy gần hết), hình ảnh điện thế co cơ biến đổi trên điện cơ đồ, hình ảnh hoại tử - tái sinh sợi cơ trên tiêu bản sinh thiết và sự biến mất hoàn toàn của protein dystrophin trên màng tế bào cơ khi nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang ở bệnh nhân DMD so với sự giảm sút một phần ở bệnh nhân BMD.
• Cơ sở sinh học phân tử và di truyền học: Mô tả chi tiết cấu trúc phức hợp gen dystrophin dài 2,4 Mb tại vị trí Xp21 gồm 79 exon, 7 promoter kiểm soát biểu hiện mô, cùng cấu trúc 4 domain chức năng của protein dystrophin (427 kDa, 3685 acid amin) liên kết với phức hợp DGC bảo vệ màng sợi cơ. Phân tích các dạng đột biến cấu trúc bao gồm đột biến xóa đoạn (chiếm 60 - 65% với hai vùng điểm nóng exon 1 - 19 và exon 43 - 60), đột biến lặp đoạn (5 - 10%, chủ yếu ở vùng đầu 5') và đột biến điểm (25 - 30%, phân bố rải rác ngẫu nhiên trên toàn bộ gen).
• Các kỹ thuật chẩn đoán phân tử: Trình bày chi tiết nguyên lý, ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp: PCR đơn mồi, Multiplex PCR (Chamberlain 1988), FISH sử dụng cosmid probe huỳnh quang (Ligon 2000), Southern blot (Prior 2005), kỹ thuật MLPA (Schouten 2002) và kỹ thuật giải trình tự gen tự động Sanger.
• Các hướng nghiên cứu điều trị hiện đại: Phân tích hiệu quả và cơ chế của các liệu pháp nội khoa dùng corticosteroid/glucocorticoid (Drachman 1974), liệu pháp chuyển ghép tế bào nguyên bào cơ và tế bào gốc tủy xương, các mô hình liệu pháp gen mang vector rAAV chứa mini/micro-dystrophin, thuốc đọc vượt mã dừng gentamicin (Palmer; Barton-Davis 1999) và liệu pháp AON gây bỏ sót exon (Matsuo 1990, 2002).
• Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: Đánh giá các công trình quốc tế quy mô lớn của Takeshima (2010), Torella (2010), Prior (1995), Chaudhary (2009), Lee Hyeyoung (2013) và tổng kết các mốc nghiên cứu di truyền học bệnh DMD tại Việt Nam từ năm 1996 đến năm 2009 của các nhóm nghiên cứu tại Trường Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện Nhi Trung ương và Bệnh viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và phương pháp luận của luận án:

• Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: Chọn lựa 201 bệnh nhân nam được chẩn đoán xác định mắc bệnh DMD/BMD dựa trên tiêu chuẩn lâm sàng và sinh hóa tại Bệnh viện Nhi Trung ương.
• Thiết kế nghiên cứu: Áp dụng thiết kế nghiên cứu mô tả loạt ca lâm sàng có đối chứng phòng thí nghiệm.
• Quy trình xét nghiệm phân tử:
  • Quy trình lấy mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi có chống đông EDTA.
  • Quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp ly giải tế bào, khử protein bằng Proteinase K, chiết tách bằng dung dịch phenol : chloroform : isoamyl và tủa bằng ethanol lạnh.
  • Quy trình tách chiết RNA bằng Isogen phục vụ RT-PCR.
  • Quy trình thực hiện kỹ thuật MLPA: Pha trộn DNA khuôn với probe hỗn hợp, tiến hành phản ứng biến tính ở $98^\circ\text{C}$, lai đặc hiệu ở $60^\circ\text{C}$ trong 16 giờ, nối probe bằng enzym ligase ở $54^\circ\text{C}$, tiếp nối bằng phản ứng khuếch đại PCR 35 chu kỳ với cặp mồi gắn huỳnh quang trên máy GeneAmp PCR System 9700. Phân tích sản phẩm bằng điện di mao quản và xử lý dữ liệu qua phần mềm chuyên dụng GeneMarker/Coffalyser.
  • Quy trình giải trình tự gen Sanger trực tiếp trên hệ thống máy ABI Prism 3100 Genetic Analyzer đối với các ca âm tính với đột biến xóa/lặp đoạn.
• Danh mục trang thiết bị, hóa chất: Liệt kê cụ thể hệ thống máy móc (máy luân nhiệt, máy điện di Mupid, hệ thống soi gel ChemiDoc Bio-Rad, máy đọc trình tự ABI 3100) và các hóa chất đạt tiêu chuẩn sinh học phân tử (Lysis buffer, SDS 10%, Proteinase K, phenol:chloroform:isoamyl, sodium acetate 3M, ethanol tuyệt đối, Isogen, dNTP 10mM, PCR buffer 10x).

Kết quả và những đóng góp mới

Kết quả nghiên cứu chính

1. Luận án đã ứng dụng thành công quy trình chẩn đoán phân tử phối hợp giữa kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen tự động trên cỡ mẫu lớn gồm 201 bệnh nhân DMD/BMD tại Việt Nam.
2. Xác định đầy đủ và toàn diện các dạng đột biến cấu trúc trên toàn bộ 79 exon của gen dystrophin, bao gồm:
   • Tỷ lệ và vị trí các dạng đột biến xóa đoạn lớn (tập trung chủ yếu ở vùng trung tâm exon 43 - 60 và vùng đầu 5' exon 1 - 19).
   • Tỷ lệ và đặc điểm các dạng đột biến lặp đoạn gen (duplication).
   • Các biến đổi đột biến điểm (đột biến vô nghĩa, đột biến dịch khung, đột biến vùng cắt nối splicing) trên các bệnh nhân không mang đột biến mất/lặp đoạn.
3. Bước đầu thiết lập bản đồ đột biến gen dystrophin chi tiết trên quần thể bệnh nhân DMD/BMD tại Việt Nam, phản ánh đặc điểm dịch tễ học phân tử của bệnh nhân trong nước so với dữ liệu quốc tế.

Những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn

• Về lý luận khoa học: Cung cấp bộ dữ liệu sinh học phân tử hoàn chỉnh đầu tiên tại Việt Nam về toàn bộ 79 exon của gen dystrophin trên một cỡ mẫu bệnh nhân lớn (201 ca). Khẳng định sự phù hợp của giả thuyết khung dịch mã (frame-shift hypothesis) của Monaco trên bệnh nhân Việt Nam, giúp làm sáng tỏ mối liên quan giữa kiểu gen đột biến và kiểu hình lâm sàng (mức độ nặng nhẹ giữa DMD và BMD).
• Về giá trị thực tiễn:
  • Xây dựng quy trình chẩn đoán phân tử chuẩn hóa, có độ chính xác cao bằng kỹ thuật MLPA kết hợp giải trình tự Sanger, cho phép xác định nhanh chóng dạng đột biến trong vòng 24 - 48 giờ thay vì các quy trình PCR cổ điển mất nhiều thời gian và chỉ khảo sát được một số exon giới hạn.
  • Phục vụ hiệu quả công tác tư vấn di truyền: Xác định chính xác người mẹ hoặc chị em gái mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử, hỗ trợ chẩn đoán trước sinh và sàng lọc phôi, góp phần chủ động ngăn ngừa sinh ra trẻ mắc bệnh trong các gia đình có tiền sử di truyền.
  • Cung cấp dữ liệu nền tảng thiết yếu để lựa chọn bệnh nhân phù hợp cho các thử nghiệm lâm sàng và ứng dụng liệu pháp điều trị gen trong tương lai, cụ thể là việc thiết kế các đoạn oligonucleotide ngược nghĩa (AON) đặc hiệu phục vụ liệu pháp bỏ sót exon (exon skipping) hoặc chỉ định thuốc có hoạt tính đọc vượt mã dừng (readthrough) cho các đột biến điểm vô nghĩa.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Toàn bộ mẫu nghiên cứu của luận án (201 bệnh nhân) được thu thập tại một trung tâm lâm sàng chuyên khoa nhi tuyến cao nhất là Bệnh viện Nhi Trung ương, do đó dù cỡ mẫu tương đối lớn nhưng có thể chưa bao phủ đồng đều bệnh nhân ở các khu vực địa lý vùng sâu, vùng xa trong cả nước. Bên cạnh đó, việc xác định người lành mang gen trong phả hệ gia đình của toàn bộ 201 bệnh nhân vẫn còn phụ thuộc vào khả năng tiếp cận và sự đồng thuận tham gia của người nhà bệnh nhân.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  1. Mở rộng ứng dụng quy trình chẩn đoán phân tử bằng MLPA và giải trình tự gen Sanger thường quy tại nhiều bệnh viện và trung tâm y học di truyền trên toàn quốc.
  2. Triển khai các công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS) nhằm phát hiện sâu hơn các đột biến nằm sâu trong vùng intron không mã hóa hoặc các tái sắp xếp cấu trúc phức tạp của gen dystrophin.
  3. Đẩy mạnh các nghiên cứu tiền lâm sàng và thử nghiệm lâm sàng ứng dụng liệu pháp can thiệp gen đích (như liệu pháp AON gây bỏ sót exon, thuốc đọc vượt mã dừng) trên các nhóm bệnh nhân mang đột biến phù hợp đã được phân loại trong bản đồ đột biến của luận án.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và bác sĩ nội trú chuyên ngành Hóa sinh y học, Di truyền y học, Thần kinh và Nhi khoa: Tham khảo phương pháp luận nghiên cứu bệnh học phân tử, kỹ thuật tách chiết DNA/RNA, nguyên lý thiết kế và phân tích kết quả kỹ thuật MLPA cũng như giải trình tự gen tự động.
• Bác sĩ lâm sàng tại các bệnh viện Nhi, Thần kinh và Sản phụ khoa: Ứng dụng quy trình phân tích gen để chẩn đoán xác định thể bệnh DMD/BMD, phân biệt với các bệnh loạn dưỡng cơ khác, đồng thời thực hiện tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh cho các thai phụ thuộc gia đình có tiền sử bệnh.
• Các nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và dược lý học: Sử dụng dữ liệu bản đồ đột biến gen dystrophin tại Việt Nam làm cơ sở khoa học để nghiên cứu phát triển các chế phẩm điều trị đích theo hướng y học cá thể hóa (như thiết kế vector mang micro-dystrophin, tổng hợp các đoạn AON đặc hiệu cho các exon điểm nóng của người Việt Nam).

Câu hỏi thường gặp

1. Kích thước và cấu trúc phân tử của gen dystrophin có đặc điểm gì nổi bật?
Gen dystrophin nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể giới tính X (vị trí Xp21), là gen lớn nhất ở người với chiều dài khoảng 2,4 Mb (hơn 3000 kb), gồm 79 exon và 7 promoter khác nhau. Gen mã hóa phân tử mRNA dài 14 kb để tổng hợp protein dystrophin có trọng lượng 427 kDa, gồm 3685 acid amin với 4 domain chức năng (đầu N, rod trung tâm, giàu Cysteine và đầu C).

2. Thuyết khung dịch mã (frame-shift) của Monaco giải thích sự khác biệt giữa bệnh DMD và BMD như thế nào?
Theo thuyết chuyển mã của Monaco (1988), nếu đột biến (xóa hoặc lặp đoạn) làm thay đổi khung đọc mở của mRNA (out-frame) hoặc tạo mã kết thúc sớm, chuỗi polypeptid sẽ bị cắt cụt và tiêu hủy hoàn toàn, dẫn đến kiểu hình DMD rất nặng. Ngược lại, nếu đột biến vẫn duy trì được khung dịch mã (in-frame), tế bào vẫn tổng hợp được protein dystrophin bị rút ngắn nhưng còn giữ lại một phần chức năng, dẫn đến kiểu hình BMD nhẹ hơn.

3. Đột biến xóa đoạn gen dystrophin thường tập trung ở những vùng nào trên gen?
Đột biến xóa đoạn chiếm tỷ lệ phổ biến nhất (60 - 65% tổng số đột biến) và tập trung chủ yếu ở hai vùng điểm nóng (hotspot): vùng trung tâm (chứa các exon từ 43 đến 60, chiếm khoảng 80% các ca xóa đoạn) và vùng đầu 5' tận cùng (chứa các exon từ 1 đến 19, chiếm khoảng 20% các ca xóa đoạn).

4. Kỹ thuật MLPA có ưu điểm gì trong việc phát hiện đột biến gen dystrophin so với kỹ thuật Multiplex PCR truyền thống?
Multiplex PCR truyền thống chỉ khảo sát được một số lượng exon giới hạn trong các vùng điểm nóng và không phát hiện được đột biến lặp đoạn cũng như trạng thái dị hợp tử ở nữ giới. Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) cho phép khuếch đại đồng thời 40 - 45 probe trong mỗi phản ứng chỉ với một cặp mồi duy nhất; chỉ cần tiến hành 2 phản ứng là có thể khảo sát toàn diện 79 exon của gen dystrophin, giúp phát hiện chính xác cả đột biến xóa đoạn, lặp đoạn và người lành mang gen dị hợp tử.

5. Nguyên lý của liệu pháp sử dụng Antisense Oligonucleotide (AON) trong điều trị bệnh DMD là gì?
Liệu pháp AON sử dụng các đoạn trình tự oligonucleotide tổng hợp bổ sung đặc hiệu với vùng trình tự tăng cường cắt nối (ESE) trên exon đích của phân tử tiền mRNA dystrophin. Sự liên kết này ngăn cản các protein giàu Serine/Arginine (protein SR) bám vào, khiến bộ máy cắt nối của tế bào bỏ qua exon bị đột biến (exon skipping). Kết quả là khung đọc mở của mRNA được phục hồi, giúp tế bào tổng hợp được protein dystrophin có chức năng, chuyển đổi bệnh cảnh lâm sàng từ thể DMD nặng sang thể BMD nhẹ.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS. Đỗ Ngọc Hải đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu xác định toàn diện các dạng đột biến (xóa đoạn, lặp đoạn và đột biến điểm) trên toàn bộ 79 exon của gen dystrophin ở cỡ mẫu 201 bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker tại Bệnh viện Nhi Trung ương. Công trình đã kết hợp hiệu quả kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen Sanger tự động, bước đầu thiết lập bản đồ đột biến gen dystrophin đặc trưng cho quần thể bệnh nhân Việt Nam. Kết quả nghiên cứu không chỉ đóng góp cơ sở dữ liệu học thuật quan trọng cho chuyên ngành Hóa sinh và Di truyền y học trong nước mà còn mang lại giá trị thực tiễn to lớn trong công tác chẩn đoán sớm, tư vấn di truyền, sàng lọc trước sinh và định hướng liệu pháp can thiệp gen đích cho người bệnh trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu của Drachman và cộng sự (1974) [17] đã cho thấy hiệu quả của thuốc trong việc cải thiện sự yếu cơ và chức năng vận động ở trẻ, ngoài ra steroids còn giúp làm giảm vấn đề hô hấp, tim mạch và giảm nguy cơ vẹo cột sống, ít nhất là trong giai đoạn ngắn, nhờ tác dụng ức chế tế bào T gây độc từ cơ hoại tử [18, 19]. 12 Cho đến nay, steroids (glucocorticoids hay corticosteroids) vẫn được khuyến cáo sử dụng. Tuy nhiên, cần cân nhắc về liều lượng, thời điểm dùng thuốc, thời gian sử dụng và cần theo dõi chặt chẽ khi dùng thuốc vì các tác dụng phụ của thuốc khi dùng lâu dài (tăng cân, rối loạn về hành vi, giảm mật độ khoáng của xương…) có thể làm trầm trọng thêm tiến trình bệnh lý [2]. - Điều trị hỗ trợ (khi cần) để đảm bảo thông khí cho người bệnh, lưu ý những trường hợp giảm thông khí về đêm, khó thở khi ngủ, suy hô hấp… Cần phát hiện sớm bệnh cơ tim và những biến chứng tim mạch thông qua đo điện tâm đồ và siêu âm tim định kỳ để điều trị kịp thời cho bệnh nhân.

Siêu âm tim và điện tâm đồ nên thực hiện mỗi 2 năm cho đến khi trẻ 10 tuổi, sau đó thực hiện hàng năm hoặc thường xuyên hơn nếu phát hiện bất thường [2, 14]. - Chế độ dinh dưỡng cần đầy đủ và hợp lý để tránh béo phì và phòng ngừa loãng xương do thiếu canxi, nhưng không nên cho trẻ uống quá nhiều vitamin vì đây không phải là bệnh do thiếu vitamin gây ra [13]. - Tập vật lý trị liệu: tất cả các trẻ khi được chẩn đoán DMD nên được tập vật lý trị liệu nhằm hạn chế bớt mức độ co rút cơ, tuy nhiên, việc tập luyện nên phù hợp theo lứa tuổi và không nên tập luyện nhiều quá [13]. Điều trị bằng liệu pháp gen Trên thực tế, gần như tất cả các bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne dần dần sẽ bị tàn phế và chết do suy hô hấp, tổn thương cơ tim hoặc các nhiễm trùng bội phụ ở lứa tuổi thiếu niên hoặc trước 20 tuổi.

Rõ ràng với phác đồ điều trị bằng thuốc, việc điều trị bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne mới chỉ 13 dừng lại ở điều trị triệu chứng, làm chậm diễn biến của bệnh, hoàn toàn chưa tác động tới những sai hỏng ở mức độ gen - bản chất gây bệnh DMD. Do đó, liệu pháp điều trị gen với khả năng can thiệp tận gốc đột biến gen dystrophin đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu theo 3 hướng chính: i) hiết kế vector mang gen mini hoặc micro dystrophin tưởng sử dụng vector mang gen dystrophin có chức năng như một liệu pháp điều trị tổng thể cho mọi dạng đột biến gặp nhiều thách thức do kích thước khổng lồ của gen dystrophin ở mức độ genome (2.4 Mb) cũng như ở mức độ cDNA (18 kb). Một số ít nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc thiết kế vector mang gen dystrophin có bản chất là virus HSV-1 hoặc plasmid, tuy nhiên hiệu suất chuyển nhiễm các vector vào tế bào đích rất thấp do kích thước quá lớn của thể truyền. Hướng đi này gần như đã đi vào ngõ cụt cho đến khi có những nghiên cứu cho thấy nhóm bệnh nhân Becker (một thể bệnh nhẹ của DMD) thường bị đột biến xóa đoạn một số vùng nhất định trên gen dystrophin, kết quả sinh thiết cơ vẫn phát hiện được một lượng nhỏ các protein dystrophin chức năng.

Điều này gợi ý rằng một số vùng trên gen dystrophin không thực sự cần thiết và có thể được loại bỏ mà không làm ảnh hưởng đến chức năng của protein dystrophin.