Nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp PCR xác định vi khuẩn Mycoplasma hominis

Nghiên cứu về Mycoplasma hominis ngày càng trở nên quan trọng do vai trò của nó trong nhiều bệnh nhiễm trùng, đặc biệt là… 57 trang · Đại học Y Hà Nội · 2023.

• Tác giả: Phan Thị Phương
• Người hướng dẫn: Th.S. Nguyễn Minh Hoan
• Trường học: Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Kỹ thuật Y học
• Đề tài: Nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp PCR xác định vi khuẩn Mycoplasma hominis
• Loại tài liệu: khóa luận
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Vi khuẩn Mycoplasma hominis
• 1.2. Hình thái và cấu tạo
• 1.3. Đặc điểm nuôi cấy
• 1.4. Đặc điểm bộ gen
• 1.5. Khả năng đề kháng
• 1.6. Đường lây truyền
• 1.7. Khả năng gây bệnh
• 1.8. Đặc điểm dịch tễ
• 1.9. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm
• 1.9.1. Kỹ thuật PCR
• 1.9.2. Huyết thanh học
• 1.9.3. Phương pháp sinh học phân tử
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Thiết kế nghiên cứu
• 2.5. Trang thiết bị
• 2.6. Quy trình thực hiện
• 2.6.1. Tách chiết DNA
• 2.6.2. Kiểm tra DNA sau tách chiết
• 2.6.3. Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi
• 2.6.4. Tối ưu hóa nồng độ DNA khuôn
• 2.6.5. Khảo sát điều kiện tối ưu trên mẫu mô đúc nền
• 2.7. Đạo đức nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả tách chiết DNA
• 3.2. Tách chiết DNA từ mẫu vi khuẩn nuôi cấy
• 3.3. Tách chiết DNA từ mẫu mô đúc nền
• 3.4. Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi
• 3.5. Kết quả tối ưu hóa nồng độ DNA khuôn
• 3.6. Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu trên mẫu mô đúc nền
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA
• 4.2. Đặc điểm môi trường sử dụng
• 4.3. Tối ưu hóa phản ứng PCR
• 4.4. Ưu nhược điểm của mẫu bệnh phẩm đúc nền
• 4.5. Đánh giá kết quả khuếch đại gen vi khuẩn Mycoplasma hominis trên mẫu mô đúc nền
• 4.6. Những nghiên cứu về Mycoplasma hominis trên mẫu mô đúc nền
• KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về PCR Mycoplasma hominis Giới Thiệu Chung

Nghiên cứu về Mycoplasma hominis ngày càng trở nên quan trọng do vai trò của nó trong nhiều bệnh nhiễm trùng, đặc biệt là các bệnh liên quan đến đường sinh dục. Mycoplasma hominis là một loài vi khuẩn không có thành tế bào, gây khó khăn cho việc phát hiện và điều trị. PCR (phản ứng chuỗi polymerase) đã trở thành một phương pháp chẩn đoán phổ biến nhờ vào độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Phương pháp này cho phép phát hiện Mycoplasma hominis một cách nhanh chóng và chính xác, ngay cả khi số lượng vi khuẩn rất thấp. Mục tiêu của việc tối ưu hóa PCR là nâng cao hiệu quả phát hiện, giảm thiểu sai sót và đảm bảo kết quả đáng tin cậy, từ đó hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh hiệu quả hơn. Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc cải tiến các yếu tố như nhiệt độ ủ mồi, nồng độ DNA khuôn và các thành phần khác của phản ứng PCR để đạt được kết quả tối ưu. Theo một nghiên cứu của Bùi Quang Hão (2015), tỷ lệ nhiễm Mycoplasma hominis trên bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương chiếm 3.75%.

1.1. Định danh vi khuẩn và Tầm Quan Trọng của PCR

Việc định danh vi khuẩn Mycoplasma hominis đóng vai trò then chốt trong việc chẩn đoán và điều trị các bệnh nhiễm trùng liên quan. Kỹ thuật PCR nổi bật như một công cụ chẩn đoán hiệu quả, cung cấp khả năng phát hiện Mycoplasma hominis một cách nhanh chóng và chính xác. PCR Mycoplasma hominis vượt trội so với các phương pháp truyền thống nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện vi khuẩn ngay cả khi số lượng mẫu rất nhỏ. Do đó, xét nghiệm PCR Mycoplasma hominis đã trở thành một phần không thể thiếu trong việc quản lý và điều trị các bệnh lý liên quan đến vi khuẩn Mycoplasma.

1.2. Sinh học phân tử và Ứng Dụng trong Chẩn Đoán Nhiễm Khuẩn

Sinh học phân tử đã mở ra một kỷ nguyên mới trong chẩn đoán các bệnh nhiễm khuẩn, đặc biệt là với những tác nhân khó nuôi cấy như Mycoplasma hominis. Kỹ thuật PCR dựa trên nguyên tắc của sinh học phân tử, cho phép khuếch đại và phát hiện DNA của vi khuẩn một cách chính xác. Ứng dụng của PCR trong chẩn đoán Mycoplasma hominis giúp cải thiện đáng kể thời gian và độ chính xác so với các phương pháp truyền thống như nuôi cấy. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các quyết định điều trị kịp thời và hiệu quả, giảm thiểu nguy cơ biến chứng và lây lan.

II. Thách Thức Trong Phát Hiện Mycoplasma hominis Bằng PCR

Mặc dù PCR là một phương pháp mạnh mẽ, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc phát hiện Mycoplasma hominis. Các yếu tố như sự hiện diện của chất ức chế trong mẫu bệnh phẩm, sự biến đổi gen của vi khuẩn và sự khác biệt trong trình tự mồi có thể ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm. Việc tối ưu hóa PCR là cần thiết để khắc phục những hạn chế này và đảm bảo kết quả chính xác và đáng tin cậy. Ngoài ra, việc đảm bảo chất lượng của DNA khuôn và kiểm soát các điều kiện phản ứng cũng rất quan trọng. Các nghiên cứu gần đây đã tập trung vào việc phát triển các phương pháp tiền xử lý mẫu để loại bỏ chất ức chế và thiết kế các mồi đặc hiệu hơn để phát hiện Mycoplasma hominis một cách hiệu quả.

2.1. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Độ Nhạy PCR và Độ Đặc Hiệu PCR

Độ nhạy PCR và độ đặc hiệu PCR là hai yếu tố then chốt quyết định chất lượng của xét nghiệm PCR Mycoplasma hominis. Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hai yếu tố này, bao gồm chất lượng DNA khuôn, thiết kế mồi, chu trình nhiệt và sự hiện diện của các chất ức chế trong mẫu. Việc tối ưu hóa PCR cần tập trung vào việc kiểm soát và cải thiện các yếu tố này để đảm bảo kết quả xét nghiệm chính xác và đáng tin cậy. Điều này bao gồm việc sử dụng các phương pháp tiền xử lý mẫu để loại bỏ chất ức chế, thiết kế mồi đặc hiệu và điều chỉnh chu trình nhiệt PCR để đạt được hiệu quả khuếch đại tối ưu.

2.2. Vấn Đề Khuẩn Lạc Mycoplasma hominis và Ảnh Hưởng đến Kết Quả PCR

Khuẩn lạc Mycoplasma hominis thường phát triển chậm và có hình dạng đặc trưng, gây khó khăn cho việc phân lập và nuôi cấy. Điều này có thể ảnh hưởng đến chất lượng DNA khuôn sử dụng cho xét nghiệm PCR Mycoplasma hominis và dẫn đến kết quả sai lệch. Việc tối ưu hóa PCR cần xem xét đến các yếu tố liên quan đến khuẩn lạc Mycoplasma hominis, bao gồm phương pháp thu thập mẫu, quá trình ly giải tế bào và tinh sạch DNA. Các phương pháp cải tiến có thể giúp tăng cường độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm, đảm bảo kết quả PCR chính xác và đáng tin cậy.

III. Tối Ưu Hóa PCR Phương Pháp PCR Cải Tiến Xác Định Vi Khuẩn

Tối ưu hóa PCR là quá trình điều chỉnh các thông số phản ứng để đạt được hiệu quả khuếch đại cao nhất và giảm thiểu các phản ứng không đặc hiệu. Các yếu tố quan trọng cần được xem xét bao gồm nhiệt độ ủ mồi, nồng độ Mg2+, nồng độ mồi và thời gian kéo dài. Ngoài ra, việc lựa chọn enzyme polymerase phù hợp cũng rất quan trọng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng các enzyme polymerase có khả năng chịu nhiệt cao và độ chính xác cao có thể cải thiện đáng kể hiệu quả của phản ứng PCR. Việc tối ưu hóa PCR giúp nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm, từ đó cải thiện khả năng phát hiện Mycoplasma hominis.

3.1. Ảnh Hưởng của Nhiệt Độ Gắn Mồi đến Hiệu Quả PCR

Nhiệt độ gắn mồi là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hiệu quả của PCR. Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi có thể gắn vào các vị trí không đặc hiệu trên DNA khuôn, dẫn đến các sản phẩm không mong muốn. Ngược lại, nếu nhiệt độ quá cao, mồi có thể không gắn vào DNA khuôn, dẫn đến giảm hiệu quả khuếch đại. Việc tối ưu hóa PCR cần xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu để đảm bảo mồi gắn đặc hiệu vào DNA khuôn và đạt được hiệu quả khuếch đại cao nhất. Điều này thường được thực hiện bằng cách thử nghiệm một loạt các nhiệt độ khác nhau và đánh giá kết quả bằng điện di.

3.2. Vai Trò của Mồi PCR Mycoplasma hominis và Thiết Kế Mồi

Mồi PCR Mycoplasma hominis đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tính đặc hiệu của xét nghiệm. Thiết kế mồi cần đảm bảo mồi chỉ gắn vào DNA của Mycoplasma hominis và không gắn vào DNA của các vi sinh vật khác. Các yếu tố cần xem xét khi thiết kế mồi bao gồm chiều dài mồi, hàm lượng GC, nhiệt độ nóng chảy và khả năng tạo cấu trúc bậc hai. Việc sử dụng các công cụ thiết kế mồi chuyên dụng có thể giúp lựa chọn các mồi phù hợp và đảm bảo tính đặc hiệu của xét nghiệm. Mồi được thiết kế tốt sẽ góp phần quan trọng vào việc tối ưu hóa PCR.

3.3. Chu Trình Nhiệt PCR và Tối Ưu Hóa Các Giai Đoạn

Chu trình nhiệt PCR bao gồm ba giai đoạn chính: biến tính, gắn mồi và kéo dài. Mỗi giai đoạn cần được tối ưu hóa để đạt được hiệu quả khuếch đại cao nhất. Thời gian và nhiệt độ của mỗi giai đoạn cần được điều chỉnh dựa trên đặc điểm của DNA khuôn, mồi và enzyme polymerase. Việc tối ưu hóa PCR bao gồm việc thử nghiệm các chu trình nhiệt PCR khác nhau và đánh giá kết quả bằng điện di. Mục tiêu là đạt được hiệu quả khuếch đại cao nhất với số lượng sản phẩm không đặc hiệu thấp nhất. Một chu trình nhiệt PCR được tối ưu hóa sẽ góp phần quan trọng vào việc cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm.

IV. Ứng Dụng Nghiên Cứu Đánh Giá Kết Quả PCR Trên Mẫu Lâm Sàng

Việc ứng dụng các phương pháp PCR đã được tối ưu hóa vào các mẫu lâm sàng là bước quan trọng để đánh giá hiệu quả thực tế của phương pháp. Các mẫu lâm sàng có thể bao gồm dịch âm đạo, nước tiểu, tinh dịch và các mẫu mô khác. Việc đánh giá kết quả PCR trên các mẫu này giúp xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp trong điều kiện thực tế. Ngoài ra, việc so sánh kết quả PCR với các phương pháp chẩn đoán khác như nuôi cấy cũng rất quan trọng để đánh giá độ tin cậy của phương pháp. Các nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh rằng PCR là một phương pháp chẩn đoán hiệu quả và đáng tin cậy cho Mycoplasma hominis.

4.1. So Sánh Các Phương Pháp Phát Hiện Mycoplasma hominis

Nghiên cứu về Mycoplasma hominis đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc so sánh các phương pháp phát hiện Mycoplasma hominis hiện có để xác định phương pháp tối ưu. So sánh các phương pháp phát hiện Mycoplasma hominis giúp làm rõ ưu nhược điểm của từng phương pháp, bao gồm nuôi cấy, huyết thanh học và các kỹ thuật PCR. Qua đó, có thể chọn lựa phương pháp phù hợp nhất với từng điều kiện cụ thể, đảm bảo độ nhạy PCR, độ đặc hiệu PCR, và tính khả thi về mặt kinh tế và thời gian.

4.2. Giải Trình Tự Gen Mycoplasma hominis Xác Định Tính Đặc Hiệu

Giải trình tự gen Mycoplasma hominis là một công cụ mạnh mẽ để xác định tính đặc hiệu của PCR. Bằng cách xác định trình tự DNA của sản phẩm PCR, có thể xác nhận rằng sản phẩm khuếch đại là của Mycoplasma hominis và không phải của các vi sinh vật khác. Giải trình tự gen Mycoplasma hominis cũng có thể giúp phát hiện các biến thể gen của vi khuẩn và đánh giá ảnh hưởng của chúng đến kết quả xét nghiệm. Kết quả từ giải trình tự gen Mycoplasma hominis hỗ trợ việc tối ưu hóa PCR và cải thiện độ chính xác của xét nghiệm.

V. Kết Luận Triển Vọng Nghiên Cứu PCR Mycoplasma hominis

Việc tối ưu hóa PCR để phát hiện Mycoplasma hominis là một quá trình liên tục, đòi hỏi sự kết hợp giữa kiến thức lý thuyết và kinh nghiệm thực tế. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp PCR nhanh chóng, chính xác và hiệu quả hơn, cũng như khám phá các ứng dụng mới của PCR trong chẩn đoán và điều trị các bệnh nhiễm trùng do Mycoplasma hominis. Việc sử dụng các công nghệ mới như PCR real-time Mycoplasma hominis và giải trình tự gen thế hệ mới có thể giúp cải thiện đáng kể khả năng phát hiện Mycoplasma hominis và hiểu rõ hơn về vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý khác nhau.

5.1. Tiềm Năng của PCR Real time Mycoplasma hominis

PCR real-time Mycoplasma hominis mang lại nhiều lợi ích so với phương pháp PCR truyền thống, bao gồm khả năng định lượng vi khuẩn, giảm thời gian xét nghiệm và giảm nguy cơ ngoại nhiễm. Việc sử dụng PCR real-time Mycoplasma hominis có thể giúp chẩn đoán sớm và theo dõi hiệu quả điều trị các bệnh nhiễm trùng do Mycoplasma hominis. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc tối ưu hóa PCR real-time và mở rộng ứng dụng của phương pháp này trong các phòng thí nghiệm lâm sàng.

5.2. Hướng Nghiên Cứu và Đánh Giá Hiệu Quả PCR Trong Tương Lai

Các hướng nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp PCR đa mồi để phát hiện đồng thời nhiều loài Mycoplasma, cũng như khám phá các ứng dụng mới của PCR trong chẩn đoán và điều trị các bệnh nhiễm trùng do Mycoplasma hominis. Ngoài ra, việc đánh giá hiệu quả PCR trong các nghiên cứu lâm sàng quy mô lớn là cần thiết để xác định giá trị của phương pháp trong thực tế. Điều này giúp cải thiện việc chẩn đoán và điều trị các bệnh nhiễm trùng do Mycoplasma hominis và nâng cao sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Mycoplasma hominis là vi khuẩn thuộc bộ Mycoplasmatales, lần đầu tiên được Dienes và Edsall phân lập từ ổ áp xe tuyến Bartholin ở người. Vi khuẩn này thường ký sinh trong hệ vi sinh vật đường niệu sinh dục ở người trưởng thành có hoạt động tình dục và có thể được tìm thấy ở niêm mạc miệng, hầu họng. Mặc dù có thể tồn tại ở trạng thái hoại sinh ở người khỏe mạnh, M. hominis là tác nhân gây bệnh cơ hội quan trọng. Vi khuẩn hiện diện ở âm đạo của khoảng 2/3 phụ nữ bị viêm âm đạo do vi khuẩn (so với khoảng 10% ở phụ nữ khỏe mạnh), đồng thời liên quan chặt chẽ đến viêm vùng chậu, viêm vòi tử cung, viêm màng ối và sốt hậu sản. Ở phụ nữ mang thai, sự lây truyền từ mẹ sang con có thể dẫn đến thai chết lưu, sinh non, nhiễm trùng huyết và viêm màng não ở trẻ sơ sinh. Ở nam giới, nhiễm M. hominis đường sinh dục gây viêm niệu đạo và tác động tiêu cực đến chất lượng tinh dịch dẫn đến vô sinh.

Về mặt dịch tễ học, các nghiên cứu quốc tế ghi nhận tỷ lệ nhiễm M. hominis trong nhóm bệnh nhân phụ khoa tại Trung Quốc là 11,02%; tại Ý là 8,1% trên mẫu dịch âm đạo; tại Tây Phi là 8% ở phụ nữ nhiễm trùng không triệu chứng và 6,45% ở phụ nữ vô sinh. Tại Việt Nam, nghiên cứu của Bùi Quang Hảo (2015) tại Bệnh viện Da liễu Trung ương ghi nhận tỷ lệ nhiễm M. hominis bằng phương pháp nuôi cấy chiếm 3,75% (trên tổng số 5,71% mẫu dương tính với Mycoplasma sinh dục); nghiên cứu của Lâm Thị Hậu (2013) ghi nhận tỷ lệ 1,7% trên bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo.

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống bộc lộ nhiều hạn chế:

• Phương pháp nuôi cấy: M. hominis phát triển chậm (2–3 ngày), đòi hỏi môi trường giàu chất dinh dưỡng (bổ sung sterol, chiết xuất nấm men), khuẩn lạc có kích thước rất nhỏ (15–300 µm) hình "trứng ốp" khó phân biệt với các loài Mycoplasma khác.
• Phương pháp huyết thanh học: Khó đưa ra kết luận chẩn đoán xác định do tỷ lệ mang vi khuẩn tự nhiên trong quần thể cao và thiếu các chuẩn mực miễn dịch rõ ràng.
• Phương pháp sinh học phân tử (PCR, Real-time PCR, giải trình tự gen): Cho kết quả nhanh (3–5 giờ), độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phát hiện được lượng nhỏ vi khuẩn mà không phụ thuộc vào trạng thái sống của tác nhân hay đáp ứng miễn dịch của cơ thể.

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Phan Thị Phương (ngành Kỹ thuật Y học, Trường Đại học Y Hà Nội) thực hiện đề tài "Khuếch đại gen vi khuẩn Mycoplasma hominis bằng kỹ thuật PCR" nhằm giải quyết 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Tối ưu hóa một số điều kiện của phản ứng PCR để xác định vi khuẩn Mycoplasma hominis.
2. Thực hiện khảo sát điều kiện đã tối ưu trên mẫu bệnh phẩm mô đúc nến.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu bao gồm:

• Đối tượng: Mẫu vi khuẩn Mycoplasma hominis chuẩn được phân lập và định danh tại Bệnh viện Da liễu Trung ương (dùng làm chứng dương) và 32 mẫu mô vòm họng đúc nến (ký hiệu từ KV1 đến KV32).
• Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu mô: Mẫu mô đúc nến đạt từ 5–8 lát cắt chứa bệnh phẩm, độ dày mỗi lát cắt từ 5–10 µm. Tiêu chuẩn loại trừ: Lát cắt không trúng mô bệnh phẩm, không đủ số lượng lát cắt hoặc không đảm bảo độ dày quy định.
• Không gian và thời gian: Nghiên cứu được triển khai tại Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, trong giai đoạn từ tháng 9/2022 đến tháng 4/2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và mục tiêu phân tử

Mycoplasma hominis là vi khuẩn đa hình thái (hình thoi, hình gậy hoặc hình cầu), kích thước nhỏ (đường kính khoảng 0,3 µm), không có vách tế bào peptidoglycan, màng tế bào gồm ba lớp chứa sterol, không có vỏ, không lông và không sinh nha bào. Do thiếu vách tế bào, vi khuẩn có tính đề kháng tự nhiên với nhóm kháng sinh beta-lactam. Chủng mẫu M. hominis PG21 (ATCC 23114) có bộ gen là một nhiễm sắc thể đơn dạng vòng kích thước 665.445 bp, tỷ lệ G+C là 27,1% và A+T là 72,9%, chứa 537 trình tự mã hóa protein giả định (CDS) và 14 gen giả.

Gen đích được lựa chọn để thiết kế mồi khuếch đại là gen mã hóa 16S ribosomal RNA (16S rRNA). Đoạn gen 16S rRNA có chiều dài khoảng 1.500 bp, cấu trúc bao gồm các vùng bảo tồn cao giữa các loài vi khuẩn xen kẽ 9 vùng siêu biến đổi (V1–V9). Cặp mồi được kế thừa từ nghiên cứu của Ma Guadalupe Aguilera-Arreola và cộng sự nhằm khuếch đại vùng đặc hiệu trên gen 16S rRNA của M. hominis, tạo ra sản phẩm khuếch đại có kích thước lý thuyết là 604 bp.

Đặc tính mồi	Mồi xuôi (Forward Primer)	Mồi ngược (Reverse Primer)
Trình tự (5’ – 3’)	ACCCATTGGAAACAATGGCTAATGCCGGATACG	ATAGACCCAGTAAGCTGCCTTCGCCT
Chiều dài	33 nucleotide	26 nucleotide
Tỷ lệ %GC	48%	54%
Nhiệt độ nóng chảy ($T_m$)	64,4°C	61,1°C
Kích thước sản phẩm PCR	604 bp	604 bp

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng thiết kế thực nghiệm trong phòng xét nghiệm (in vitro), gồm các bước:

1. Tách chiết DNA:
   • Mẫu vi khuẩn nuôi cấy: Tách chiết bằng bộ kít QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, code 51106) theo nguyên lý màng silica cột ly tâm với các bước ủ ly giải Proteinase K, đệm AL ở 56°C, gắn DNA lên cột, rửa bằng đệm AW1, AW2 và hòa tan thu hồi trong đệm AE.
   • Mẫu mô đúc nến (FFPE): Tách chiết bằng bộ kít QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN, code 56404). Quy trình gồm bước xử lý loại bỏ paraffin bằng dung môi xylene (ủ, vortex, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút), rửa khử xylene bằng cồn ethanol 100%, làm khô ở 40°C, ly giải mô bằng Proteinase K và đệm ATL ở 56°C qua đêm, ủ bất hoạt ở 90°C trong 1 giờ trước khi gắn cột và rửa giải bằng đệm ATE, ủ DNA ở 80°C trong 1 giờ.
2. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA: Đo mật độ quang học (OD) tại các bước sóng 260 nm, 280 nm và 230 nm trên máy quang phổ tử ngoại - khả kiến NanoDrop 2000c (Thermo Scientific). Đánh giá độ tinh sạch dựa trên tỷ số $A_{260}/A_{280}$ (chuẩn từ 1,7–2,0) và $A_{260}/A_{230}$ (chuẩn từ 2,0–2,2).
3. Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi ($T_a$): Sử dụng phương pháp PCR Gradient trên máy luân nhiệt Eppendorf để khảo sát 6 mức nhiệt độ: 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C và 56°C.
4. Tối ưu hóa nồng độ DNA khuôn: Pha loãng nồng độ DNA vi khuẩn ban đầu (18 ng/µL) thành dãy 7 nồng độ giảm dần: 1 ng/µL, 0,5 ng/µL, 0,25 ng/µL, 0,125 ng/µL, 0,06 ng/µL, 0,03 ng/µL và 0,015 ng/µL.
5. Điện di và phân tích sản phẩm PCR: Điện di trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1X ở hiệu điện thế 120V trong 35 phút. Nhuộm gel bằng dung dịch Ethidium bromide (2–3 phút) và đọc kết quả dưới tia tử ngoại trên hệ thống chụp ảnh bản gel Gel Doc™ XR+ (Bio-Rad), so sánh với thang chuẩn kích thước Marker 100 bp.

Thành phần phản ứng PCR	Nồng độ ban đầu / Đặc tính	Thể tích cho 1 phản ứng (Tổng thể tích 10 µL)
MasterMix 2X	Taq polymerase, dNTPs, đệm PCR, $Mg^{2+}$	5,0 µL
Mồi xuôi (Forward)	5 pmol/µL	0,5 µL
Mồi ngược (Reverse)	5 pmol/µL	0,5 µL
Nước cất 2 lần	Vô trùng, không nuclease	2,0 µL
DNA khuôn	DNA mẫu kiểm tra hoặc chuẩn	2,0 µL

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương 1 hệ thống hóa các y văn về đặc tính sinh học, dịch tễ học của Mycoplasma hominis và nguyên lý các kỹ thuật xét nghiệm:

• Sinh học vi khuẩn: Trình bày cấu trúc không vách, màng ba lớp giàu sterol, kích thước bộ gen nhỏ (665 kb) và đặc điểm chuyển hóa (không lên men glucose, thủy phân arginine tạo năng lượng). Phân tích cấu trúc phân tử của gen 16S rRNA vi khuẩn và ý nghĩa của các vùng bảo tồn/siêu biến trong thiết kế cặp mồi chẩn đoán.
• Bệnh học và lây truyền: Tổng hợp cơ chế bám dính qua việc biến đổi biểu hiện protein màng, con đường lây truyền qua đường tình dục và từ mẹ sang con; các bệnh cảnh lâm sàng gồm viêm âm đạo, viêm vùng chậu, viêm màng não sơ sinh, nhiễm trùng máu hậu sản và tác động làm giảm chất lượng tinh trùng ở nam giới.
• Dịch tễ học: Tổng hợp số liệu tỷ lệ nhiễm trên thế giới (Ý, Hàn Quốc, Tây Phi, Iran) và tại Việt Nam qua các nghiên cứu của Bùi Quang Hảo, Lâm Thị Hậu và số liệu tại Bệnh viện Đại học Y Hà Nội (2018–2022).
• Phương pháp chẩn đoán: So sánh ưu - nhược điểm giữa nuôi cấy cổ điển, huyết thanh học, Real-time PCR, giải trình tự gen và PCR thường quy.
• Nguyên lý và các yếu tố ảnh hưởng đến PCR: Trình bày chu trình nhiệt 3 giai đoạn (biến tính 94–95°C, gắn mồi 40–72°C, kéo dài 72°C), vai trò của enzyme Taq polymerase, ion $Mg^{2+}$, dNTPs, chất lượng DNA khuôn và các phương pháp tối ưu hóa phản ứng (Touchdown PCR, Hot Start PCR, Gradient nhiệt độ).

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, phương tiện nghiên cứu và kiểm soát chất lượng:

• Đối tượng: Mẫu vi khuẩn M. hominis (chứng dương) và 32 mẫu mô vòm họng đúc nến (KV1–KV32) kèm tiêu chuẩn chọn/loại trừ rõ ràng.
• Trang thiết bị - hóa chất: Liệt kê đầy đủ các thiết bị phân tích gồm máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5424R, máy lắc nhiệt ThermoMixer C, máy đo quang NanoDrop 2000c, máy PCR Eppendorf, hệ thống điện di và máy chụp ảnh gel Gel Doc™ XR+. Hóa chất sử dụng gồm hai bộ kít tách chiết của QIAGEN (Blood Mini kit và FFPE Tissue kit), hóa chất MasterMix 2X, đệm TBE, bột agarose và marker 100 bp.
• Quy trình kỹ thuật: Chuẩn hóa từng bước tách chiết DNA vi khuẩn (11 bước) và mô đúc nến (12 bước, nhấn mạnh khử paraffin bằng xylene và ủ Proteinase K qua đêm).
• Thiết lập chu trình nhiệt: Khởi đầu biến tính ở 95°C trong 5 phút; tiếp nối 35 chu kỳ gồm biến tính 95°C (30 giây), gắn mồi ở nhiệt độ khảo sát $T_a$ (30 giây), kéo dài 72°C (45 giây); kết thúc kéo dài 72°C trong 5 phút và giữ mẫu ở 4°C.
• Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu tuân thủ các chuẩn mực y sinh học, thực hiện vì mục đích khoa học.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được từ quá trình đo quang, tối ưu hóa và khảo sát mẫu:

• Kết quả tách chiết DNA vi khuẩn: Mẫu DNA vi khuẩn nuôi cấy đạt nồng độ 18 ng/µL, tỷ số $A_{260}/A_{280} = 1,97$, $A_{260}/A_{230} = 2,11$, đường cong hấp thụ quang học có dạng parabol chuẩn với đỉnh hấp thụ cực đại tại 260 nm.
• Kết quả tách chiết DNA 32 mẫu mô đúc nến: Nồng độ DNA dao động từ 5,39 ng/µL đến 53,8 ng/µL. Các mẫu KV16, KV22, KV26, KV27 có nồng độ thấp (< 10 ng/µL). Độ tinh sạch $A_{260}/A_{280}$ đạt trong khoảng chấp nhận [1,7–2,0], tuy nhiên tỷ số $A_{260}/A_{230}$ đều nằm ngoài khoảng tối ưu [2,0–2,2], cho thấy còn tồn dư carbohydrate hoặc hóa chất tách chiết.
• Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi ($T_a$): Ở cả 6 mức nhiệt độ khảo sát (51°C đến 56°C), phản ứng đều cho một vạch sản phẩm PCR duy nhất có kích thước đúng 604 bp, chứng âm không xuất hiện vạch. Độ đậm và độ sắc nét của vạch tăng dần theo nhiệt độ, trong đó nhiệt độ 56°C cho vạch sản phẩm rõ và đậm nhất.
• Kết quả tối ưu hóa nồng độ DNA khuôn: Thực hiện tại $T_a = 56^\circ\text{C}$ với 7 mức nồng độ. Cả 7 giếng đều xuất hiện vạch đặc hiệu 604 bp, độ đậm của vạch giảm dần tuyến tính theo độ pha loãng của DNA khuôn. Giếng số 1 (nồng độ 1 ng/µL) cho vạch đậm nét nhất; giếng số 7 (nồng độ 0,015 ng/µL) vẫn quan sát thấy vạch mờ; chứng âm hoàn toàn sạch.
• Kết quả khảo sát trên 32 mẫu mô đúc nến:
  • Mẫu KV23 cho kết quả dương tính với một vạch đặc hiệu rõ nét kích thước 604 bp, tương đương với vị trí vạch của mẫu chứng dương (PC).
  • Mẫu KV30 xuất hiện dải vệt mờ (smear).
  • 30 mẫu còn lại cho kết quả âm tính, một số mẫu xuất hiện các vạch phụ không đặc hiệu. Chứng âm (NC) không có vạch khuếch đại.

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

Chương 4 phân tích, giải thích các hiện tượng thực nghiệm và so sánh với y văn:

• Đánh giá chất lượng DNA từ mô FFPE: Phân tích nguyên nhân tỷ số $A_{260}/A_{230}$ không đạt chuẩn do ảnh hưởng của quá trình cố định formalin tạo liên kết chéo DNA-protein và làm đứt gãy mạch DNA, cũng như khả năng ức chế phản ứng từ xylene/ethanol tồn dư.
• Phân tích thiết kế cặp mồi: Đánh giá cấu trúc mồi xuôi (33 nt) và mồi ngược (26 nt), sự chênh lệch $T_m$ (3,3°C) và sự hiện diện của các bazơ G/C ở đầu 3'. Dù cấu trúc mồi dài hơn tiêu chuẩn thông thường, thực nghiệm chứng minh cặp mồi bắt cặp rất đặc hiệu vào vùng 16S rRNA. Tác giả cũng chỉ ra nguy cơ tiềm ẩn về dương tính giả do tính bảo tồn của gen 16S rRNA giữa các loài vi khuẩn nếu có nhiễm tạp.
• Biện luận nhiệt độ gắn mồi và độ nhạy của nồng độ khuôn: Giải thích việc lựa chọn $T_a = 56^\circ\text{C}$ giúp cân bằng giữa độ nhạy và độ đặc hiệu đối với mẫu mô lâm sàng (so với mức 58°C của Aguilera-Arreola trên mô tươi). Ngưỡng phát hiện đạt tới 0,015 ng/µL chứng minh phản ứng có độ nhạy rất cao, đáp ứng tốt với các mẫu bệnh phẩm có tải lượng vi khuẩn thấp.
• Đánh giá kết quả trên mô đúc nến và đối chiếu quốc tế: Lý giải vạch dương tính mẫu KV23 có độ sáng mờ hơn chứng dương do tải lượng vi khuẩn thấp hoặc chất lượng DNA suy giảm. Bàn luận về việc xuất hiện vệt smear (KV30) và các băng phụ ở mẫu âm tính do DNA bị phân mảnh. Đối chiếu tỷ lệ phát hiện với các nghiên cứu mô đúc nến trên thế giới: nghiên cứu tại Hàn Quốc trên mô tử cung đúc nến âm tính (0/154), nghiên cứu tại Tunisia trên mô u tuyến tiền liệt âm tính (0/50), nghiên cứu tại Iran trên mô ung thư tuyến tiền liệt phát hiện 8 mẫu dương tính.
• Phân tích hạn chế: Chỉ ra việc nghiên cứu chưa thiết kế chứng nội chuẩn (internal control) để kiểm soát hiện tượng âm tính giả do chất ức chế PCR, cùng hạn chế về cỡ mẫu nhỏ và điều kiện phòng thí nghiệm.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính của khóa luận

1. Thông số tối ưu hóa phản ứng PCR:
   • Nhiệt độ gắn mồi tối ưu: $T_a = 56^\circ\text{C}$ (trong dải khảo sát 51–56°C).
   • Nồng độ DNA khuôn tối ưu: $1\text{ ng/\mu L}$.
   • Giới hạn phát hiện nhỏ nhất (LOD): $0,015\text{ ng/\mu L}$ DNA vi khuẩn vẫn cho vạch khuếch đại 604 bp nhìn thấy được trên gel agarose 1,5%.
2. Khảo sát trên mẫu bệnh phẩm thực tế:
   • Hoàn thiện quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô vòm họng đúc nến (FFPE), thu được nồng độ DNA từ $5,39\text{ ng/\mu L}$ đến $53,8\text{ ng/\mu L}$.
   • Phát hiện thành công $1/32$ mẫu mô đúc nến dương tính với Mycoplasma hominis (mẫu ký hiệu KV23), cho sản phẩm khuếch đại đặc hiệu kích thước 604 bp.

Mẫu / Thông số thực nghiệm	Nồng độ DNA	Tỷ số $A_{260}/A_{280}$	Tỷ số $A_{260}/A_{230}$	Kết quả PCR (Băng 604 bp)
Mẫu vi khuẩn nuôi cấy (PC)	18,0 ng/µL	1,97	2,11	Dương tính (Vạch đậm, đặc hiệu)
Mẫu mô đúc nến KV23	11,4 ng/µL	1,82	1,45	Dương tính (1 vạch duy nhất 604 bp)
Mẫu mô đúc nến KV30	14,2 ng/µL	1,79	1,38	Âm tính (Xuất hiện vệt smear)
Các mẫu mô đúc nến khác ($n=30$)	5,39–53,8 ng/µL	1,70–2,00	< 2,00	Âm tính (Có vạch phụ không đặc hiệu)
Mẫu nước cất vô trùng (NC)	0 ng/µL	—	—	Âm tính (Không xuất hiện vạch)

Đóng góp của đề tài

• Chuẩn hóa thành công quy trình kỹ thuật PCR đơn mồi (singleplex PCR) in-house để phát hiện đoạn gen 16S rRNA đặc hiệu của Mycoplasma hominis tại Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein.
• Chứng minh khả năng ứng dụng kỹ thuật PCR trên nguồn bệnh phẩm mô lưu trữ đúc khối paraffin (FFPE) — loại vật liệu sinh học sẵn có cho các nghiên cứu hồi cứu nhưng thường gặp khó khăn do DNA bị phân mảnh và chứa hóa chất ức chế.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận trong văn bản

• Chất lượng DNA từ mô đúc nến: Quá trình cố định mô bằng formalin tạo ra các liên kết chéo DNA-protein phức tạp và gây hiện tượng khử purin, đứt gãy chuỗi DNA. Điều này dẫn đến tỷ số $A_{260}/A_{230}$ của toàn bộ 32 mẫu mô đều không đạt mức tối ưu (> 2,0), gây ra hiện tượng tạo vệt smear (mẫu KV30) và các băng phụ không đặc hiệu ở một số mẫu âm tính.
• Thiếu chứng nội chuẩn (Internal Control): Phản ứng PCR chưa tích hợp cặp mồi nội chuẩn (như gen giữ nhà GAPDH hoặc $\beta$-actin) để kiểm soát chất lượng phản ứng khuếch đại ở từng giếng, dẫn đến nguy cơ tiềm ẩn về kết quả âm tính giả do các chất ức chế có trong mô đúc nến.
• Quy mô và điều kiện kỹ thuật: Do thực hiện trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp đại học, nghiên cứu bị giới hạn về cỡ mẫu khảo sát ($n = 32$), nguồn kinh phí hóa chất và chưa thể tiến hành các bước tinh sạch sâu bổ sung hay giải trình tự kiểm chứng đoạn gen khuếch đại ở mẫu dương tính KV23.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Nghiên cứu bổ sung hệ thống mồi nội chuẩn để thiết lập phản ứng Multiplex PCR, đảm bảo kiểm soát chất lượng khuếch đại và loại trừ hoàn toàn hiện tượng âm tính giả.
• Cải tiến quy trình xử lý tách chiết và tinh sạch DNA từ mô FFPE nhằm loại bỏ triệt để hóa chất ức chế và các liên kết chéo formalin.
• Mở rộng quy mô khảo sát trên các nhóm bệnh phẩm lâm sàng tươi (dịch niệu đạo, dịch âm đạo, nước tiểu, tinh dịch) và giải trình tự gen sản phẩm PCR để khẳng định độ chính xác chẩn đoán ở cấp độ phân tử.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên và học viên ngành Kỹ thuật Y học, Vi sinh - Ký sinh trùng lâm sàng, Công nghệ Sinh học: Cung cấp tài liệu thực hành chi tiết về phương pháp thiết lập gradient nhiệt độ tối ưu hóa phản ứng PCR in-house và kỹ thuật đo quang đánh giá chất lượng acid nucleic trên máy NanoDrop.
• Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử: Cung cấp quy trình thao tác chuẩn (SOP) từng bước về tách chiết DNA từ bệnh phẩm mô vùi nến (FFPE Tissue) với các bước khử paraffin bằng xylene/cồn và xử lý phá vỡ liên kết chéo proteinase K.
• Các nhà nghiên cứu về bệnh lây truyền qua đường tình dục (STDs): Tham khảo bộ thông số kỹ thuật của cặp mồi khuếch đại gen 16S rRNA M. hominis (chu trình nhiệt, thành phần mastermix, nồng độ mồi) và dữ liệu so sánh tỷ lệ nhiễm trên mẫu mô đúc nến từ các y văn quốc tế.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu khuếch đại vùng gen nào và kích thước sản phẩm PCR là bao nhiêu?

Cặp mồi được thiết kế để bắt cặp đặc hiệu vào vùng gen 16S ribosomal RNA (16S rRNA) của vi khuẩn Mycoplasma hominis. Kích thước sản phẩm khuếch đại lý thuyết và thực nghiệm thu được là 604 bp.

2. Điều kiện nhiệt độ gắn mồi ($T_a$) và nồng độ DNA khuôn tối ưu được xác định là bao nhiêu?

Qua thực nghiệm khảo sát gradient nhiệt độ từ 51°C đến 56°C và dãy pha loãng nồng độ DNA, tác giả xác định được:

• Nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 56°C (cho vạch sản phẩm 604 bp sắc nét và đậm nhất).
• Nồng độ DNA khuôn tối ưu là 1 ng/µL.

3. Giới hạn phát hiện nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR trong nghiên cứu là mức nào?

Trong thực nghiệm khảo sát nồng độ DNA khuôn giảm dần, phản ứng PCR vẫn phát hiện được vạch sản phẩm đặc hiệu 604 bp ở nồng độ DNA khuôn thấp nhất là 0,015 ng/µL (tại giếng số 7), chứng minh phương pháp có độ nhạy phân tích rất cao.

4. Kết quả khảo sát trên 32 mẫu mô vòm họng đúc nến ghi nhận bao nhiêu mẫu dương tính?

Trong số 32 mẫu mô đúc nến khảo sát (KV1–KV32), nghiên cứu phát hiện 1 mẫu dương tính (mẫu KV23), xuất hiện một vạch khuếch đại duy nhất có kích thước đúng 604 bp trùng khớp với mẫu chứng dương. Mẫu KV30 xuất hiện dải smear và 30 mẫu còn lại cho kết quả âm tính.

5. Tại sao tỷ số $A_{260}/A_{230}$ của các mẫu mô đúc nến sau tách chiết đều không đạt chuẩn tối ưu?

Do đặc thù của mẫu mô đúc nến đã qua xử lý cố định bằng dung dịch formalin, quá trình này tạo ra các liên kết chéo bền vững giữa DNA và protein, đồng thời formalin bị oxy hóa thành acid formic gây khử purin và đứt gãy DNA. Ngoài ra, việc tẩy paraffin bằng xylene và cồn nếu còn tồn dư lượng nhỏ cũng làm giảm tỷ số $A_{260}/A_{230}$ xuống dưới khoảng tối ưu [2,0–2,2].

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Phan Thị Phương đã chuẩn hóa thành công quy trình kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA (kích thước 604 bp) để định danh vi khuẩn Mycoplasma hominis với nhiệt độ gắn mồi tối ưu 56°C và ngưỡng phát hiện nồng độ DNA khuôn đạt tới 0,015 ng/µL. Quy trình đã được ứng dụng thực nghiệm trên 32 mẫu mô vòm họng đúc nến lưu trữ tại Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein Trường Đại học Y Hà Nội và phát hiện 1 mẫu dương tính (KV23). Công trình cung cấp các thông số kỹ thuật chi tiết về tối ưu hóa PCR và quy trình xử lý mô FFPE, đồng thời chỉ ra các thách thức kỹ thuật về chất lượng DNA phân mảnh và sự cần thiết của chứng nội chuẩn trong các xét nghiệm sinh học phân tử hồi cứu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TÔNG QI AN 1. Vi khuẩn Mycoplasma hominis 1. Hình thái và cấu tạo Vi khuẩn Mycoplasmahomims thuộc bộ Mycoplasmatales. hominis là vi khuân đa hình thãi, có thè là hình thoi, hình gậy hay hình cầu.

kích thước nhò với đường kính khoảng 0.3um tuy thuộc vào mỏi trường nuôi cầy. Do không cỏ vách te bào. bộ gen nhô và kha nàng tống hụp hạn chế nên M. hommis phai sống ki sinh và hoại sinh.

Mycoplasma homims không bắt máu với thuốc nhuộm Gram, chi quan sát được trên kinh hiển vi nen đcn hay kinh hiên vi điện tư. homnũs sớ him một màng ba lớp chứa sterol và tế bào chửa cã DNA và RNA. Vi khuân không có võ. không có lõng và không sinh nha bào.

Đặc điểm nuôi cấy Mycoplasma hominis là vi khuân sổng kỷ sinh nhưng có thè được nuôi cấy được trên mòi trường nhân tạo. Nhu cầu khi trưởng: phát trial tốt lum trong khí trường có 5% co?. Nhiệt độ nuôi cấy thích họp lá 36-37°C. Khi nuôi cấy ớ mỏi trường thạch, khuân lạc thường mọc chậm (sau 2-3 ngày) và rất nhò (15-3OOỊU11).

Trên dĩa thạch A7, khuân lạc được quan sát bằng kính hiền vi có đặc diêm: trung tâm khuẩn lạc tối và dày. mọc lấn xuồng thạch, ria khuẩn lạc mong vã dẹt. tròng như dạng “trúng ốp”? «4 ugc V Hl 4 Hình 1. Sựphát triển cùa khuẩn lục.

hoininis hình trúng ổp điển hình sau khi nuôi cấy trên thạch A7. Đặc điểm bộ gen 1. Đặc điểm chung Bộ gen cua chung loại Mycoplasma honmns PG21 (ATCC 23114) đà được bảo cáo lã một nhiễm sắc thê đơn. hình tròn có kích thước 665 445 bp.

Đây lả bộ gen nhô thứ hai trong số cãc sinh vật tự sao chép với hàm lượng G+C tống the lã 27.1% và hãm lượng A*T là 72. Chữa 537 trinh tự DNA mã hóa gia định (CDS), đại diện cho mật độ gen 89.8% và 14 gen gia đã được tim thầy. Chức nâng cỏ thê được dự đoán cho 345 CDS và 106 là protein gia định. Không có trinh tự chẽn, transposon hoặc plasmid nội sinh nào dược tim thấy trong bộ gen? -c «4 ugc V Hl 5 1.

Gen 16S ribosomal RN’A Ribosome cỏ mật trong tầt ca cãc tể bào tự sao chép và cấu thành bộ mây tống họp protein. Ribosome bao gồm hai tiểu dơn vị chinh: tiểu đơn vị nhỏ (30S) vả tiêu đơn vị lón (50S). Ticu đơn vị nhô đọc trinh tự RNA thõng tin (niRNA), trong khi tiêu dơn vị lớn liên kết các amino acid đê tạo thành một chuỗi polypeptide. Mối tiêu dơn vị gồm một hoặc nhiều phân tir RNA ribosome (rRNA) và nhiều phân tư protein Vi khuân có 3 loại rRNA (5S.

16S và 23S rRNA) và thông tin di truyền cũa các phàn từ dược tồ chức trong bộ gen dưới dạng operon rRNA. Trinh tự gen 16S rRNA dài khoáng 1500 bp dú cho mục tiêu sinh học.10 Gen I6S rRNA lã gcn phổ biến trong bộ gen cùa vi khuẩn. Do chức nảng 16S rRNA rất cần thiết cho tế bào vi khuấn trong quả trinh dịch mã. nên hâu như tãt cá các bộ gen cua vi khuân đều dược câu tạo từ gen 16S rRNA.

Kích thước và mức độ bao tồn chức năng cao dần đến tốc độ đột biển diễn ra rắt chậm trong suốt quá trình tiến hóa cua SĨ1111 vật. Và quan trọng nhất, gen 16S rRNA bao gồm vùng dược báo tồn. có thế được sư dụng đề thiết kế các đoạn mồi khuếch dại giữa các dơn vị phân loại, cũng như chín vùng siêu biến dối (V1-V9). có thê cung cấp nhùng trinh tự đặc trưng cho từng loài, diều nảy rất hữu ich de nhận dạng các loại vi khuân.16S ribosomal RNA ữbộgen vi khuẩn fnguồn: htfps://pubììied.

Khã năng đề kháng Mycoplasma hominis có sức để kháng tương dối tốt, sống bển vừng vởi nhiệt độ thấp. homĩnis bi tiên diệt bời dung dịch CO pH acid hoặc kiểm cao. Do không cõ vách te bão nên vi khuẩn có kha nâng đề kháng với cãc kháng sinh nhóm beta-lactam có tác dụng ức chế sinh tòng hợp vách cua vi khuấn? 1. Đường láy truyền Mycoplasma hominis là vi khuẩn lây truyền chu yều qua đường tinh dục.

homnùs còn lầy từ mẹ sang con vì trong quả trinh sinh đè dịch tiết nhiễm vi khuẩn từ dưỡng sinh dục cùa mẹ lây trục tiếp vào niêm mạc mắt. mùi miệng và đường hò hấp cua tre sơ sinh. Khá năng gây bệnh Mycoplasma hominis có thê gãy ra các bệnh VC nhiêm trùng đường sinh dục. tiết niệu như viêm âm đạo do vi khuẩn.

viêm vùng chậu hay nhùng rối loạn về sinh sân. M lìommis đà được chúng mini) có kha nâng da dạng hóa các protein bám dinh bằng cách cẳt bót hoặc thay dồi biền hiện gen mà hóa tạo diều kiện thuận lợi gần với các thụ thê tế bảo khác nhau trong cơ thê vật chu từ dó gây nên cãc bệnh lý nhiêm trùng ngoải cơ quan sinh dục.12 Mcoplasma hominis liên quan mật thiết với viêm âm dạo do vi khuẩn, được tim thấy ờ ám đạo cua 2/3 phụ nừ bị viêm ảm đạo do vi khuẩn so với chi có ờ khoang 10% phụ nữ khoe mạnh? Trong một sổ nghiên cửu. hominis dà được phân lập từ nội mạc tứ cung và ống dần trùng cua khoang 10% phụ nữ bị viêm vòi tứ cung cùng với sự gia tảng kháng the rõ rệt. hominis dã được chứng minh là cân nguyên chịu trách nhiệm cho một số trường họp viêm màng ối và viêm nội mạc tư cung.

Tãc nhân này cùng dược phân lập từ mầu ơ một sổ trường hợp có cơn sốt hậu sán và sốt sau phá thai.14 Các báo cảo trường hợp dà .^H «4 ugc V Hl 7 chi ra rang M. homims CÓ the gày viêm màng não ờ tre sơ sinh hoặc nhiêm trùng san phần thuật thần kinh, mặc dù nhùng biến chúng nãy không phô biến?5 Ngoài ra. homũns có liên quan den vỏ sinh ờ nam giới, nhiễm vi khuẩn nãy ờ đường sinh dục nam có the anh hưởng tiêu cực đến chất lượng tinh dịch.4 Một số nghiên cứu đà phái hiện Mycoplasma hoimms ờ niêm mạc họng, miệng cua bệnh nhân bị các bệnh về dường hò hấp. Trong một nghiên cửu thực hiện trên 1125 bệnh nhân mầc bệnh hô hấp Cap linh dà phái hiện được 49 người (4.4%) nhiễm Mycoplasma homiỉìis bằng phương pháp nuôi cấy.16 Một nghiên cứu khác tại Nga cùng dà xác định được khảng nguyên Mycoplasma hommis trong niêm mạc hầu họng va kháng thề trong huyết thanh ớ máu ngoại vi cua bệnh nhản mác các dạng bệnh hen phế quản.

Đặc diêm dịch tễ • Trên thế giới: Trên thế giới có nhiều nghiên cứu dược tiến hành trên mầu bệnh phàm dịch âm dạo. nước tiêu, tinh dịch. đê kháo sát ty lộ nhiễm Mycoplasma homims. Antonella Mencacci và cộng sự dà nghiên cứu ở bốn phòng till nghiệm làm sàng ớ Ỷ trên 1761 mầu dịch âm đạo cua phụ nừ từ tháng 2/2013 đến 10/2014 bang PCR kết qua có 151 người (8.1* Một nghiên cứu trẽn mầu bệnh phàm 1035 miếng gạc âm dạo cua phụ nừ mang thai ớ độ tuổi 15-47 đến khoa san tại Bệnh viện Đại học Kyung Hee ờ Gangdong (Seoul-Hàn Quổc) được thực hiện bàng phương pháp nuôi cấy dè dành giá ty lệ nhiem Mycoplasma sinh dục trong khoảng thời gian lừ tháng 6 nảm 2009 đến tháng 5 nàm 2014.

Kết qua trong số 1035 mầu bệnh phàm cua phụ nừ mang thai, lông tỳ lộ dương tính với nhiễm Mycoplasma sinh dục lá 55. trong dô ty lệ nhiễm Mycoplasma homims chiếm 0.^H «4 ugc V Hl 8 Một nghiên cứu cầl ngang ở Tây Phi xác dinh sự có mặt cua Mycoplasma hoimnís trong đường sinh dục cua 100 phụ nừ nhiêm trùng không triệu chứng và 31 phụ nừ dược chấn đoán vỏ sinh bảng phương pháp giãi trinh tự gen I6S rRNA (2017-2018). Kct qua cho thấy ở phụ nừ nhiễm trũng không triệu chửng, tý lệ nhiễm M. hommis là 8% trong khi dổi với phụ nừ vó sinh tý lệ nhiêm là 6,45%?’ Theo nghiên cứu dịch lề nhiễm trùng dường sinh dục tại Iran cua Khadijch Moridi và cộng sự tồng hợp các dừ liệu từ tháng I năm 2000 den tháng 6 năm 2019 cho thấy tý lệ nhiễm M.:| • ớ Việt Nam: Tại Việt Nam cùng có một sổ tác gia nghiên cứu về tý lệ nhiem M.

cãc nghiên cứu này tập trung chú yểu trên câc đối tượng có biểu hiện các bệnh về đường sinh dục. Nghiên cứu dược Lâm Thị Hậu (2013) thực hiện trẽn 176 bệnh nhãn có hội chửng tiết dịch niệu dạo. ảm dạo được lãm xẽt nghiệm nuôi cấy vi khuân tại bộiili viện Da lieu Trung ương có tý lộ nhiem Mycoplasma lìomims là 1." Bùi Quang Hão (2015) nghiên cứu ty lộ bệnh nhãn nhiễm Mycoplasma sinh dục bang phương pháp nuôi cấy. kết qua tý lệ nliiềm Mycoplasma là 5.71% (80/1401), trong dỏ ty lệ nhiễm My coplasma homims chiếm 3,75%.’ Một nghiên cứu khác dược thực hiện trên 349 nam giới có biêu hiện viêm niệu dạo cỏ triệu chúng cua các bệnh lây truyền qua đường tình dục (xác định bằng xét nghiệm Real lime PCR) lại Khoa Nam học và Y học tinh dục-Bệnh viện Dại học Y Hà Nội từ nàm 2018 đến nám 2022.

phát hiện ty lệ nhiềm M. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm. Nuôi cầy Mycoplasma homúìis cô lượng gen ít. klia nâng tống họp hạn che nên môi trường nuôi cấy phái giàu dinh dường vá cần khoang 2-3 ngày de có the quan sát được khuân lạc mọc trẽn mỏi trường.

hommis không lên men đường glucose, lấy năng lượng từ thuy phân arginine.24 Trong môi trường long vi khuân không làm đục môi trường nên khỏ phân biệt vi khuân có mục hay không. Trên đĩa thạch A7, khuẩn lạc có hình dạng “trứng ổp" dien hình? Tuy nlũẻn hình dạng khuẩn lạc cùa Mycoplasma giống nhau nên không the dựa vào khuẩn lạc đê phân biệt cãc loài Mycoplasma. ớ môi tnrờng nuôi cầy nhân tạo Mycoplasma homrnis đòi hoi nhùng chất dinh dường độc biệt như các tiền chất acid nucleic (chiết suất nẩm men), acid amin. acid béo và cholesterol (có trong huyết thanh).25 Một sổ mỏi trường đùng dè nuôi cấy M.

Huyết thanh học Có nhiều kỹ thuật dã dược de xuất de phát hiện khảng thê trong các nhỉềm trùng do .Ví ỉìominis nhưng rầt khỏ dế dưa ra kết luận cho chân đoán. homitìis thường tồn tại ơ người và không có cơ sơ về mức độ miền dịch trong quằn thê. Vi vậy phương pháp huyết thanh học không dược khuyến cáo cho chân đoán thường quy. Phương pháp sinh học phán tữ Các kỳ thuật sinh học phân tư cho phép phát hiện nhanh chóng các vi sinh vật khó nuôi cấy.

Các kỳ thuật sinh hục phân tư thường dùng đê phát hiện Mycoplasma homims gồm: PCR. Real lime PCR, giãi trinh tự gen.^H «4 ugc V Hl 10 Real time PCR là kỹ thuật mà kết qua khuếch đại DNA đích được hiên thị sau mồi chu trinh nhiệt cua phan ứng PCR.