MỞ ĐẦU Bệnh nhiễm khuẩn gây ra bởi não mô cầu Neisseria meningitidis là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, gây dịch. Bệnh có các thể lâm sàng: viêm màng não mủ, nhiễm khuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn, viêm màng ngoài tim, … trong đó viêm màng não mủ và nhiễm khuẩn huyết là thường gặp hơn. Não mô cầu (NMC) cư trú tại vùng hầu họng của người và lây qua đường hô hấp do hít phải các giọt nhỏ dịch tiết mũi họng bị nhiễm. Bệnh thường để lại nhiều di chứng nặng nề như chậm phát triển tinh thần, điếc, liệt với tỷ lệ từ 10-20%, tỷ lệ tử vong có thể từ 8- 15%.
Tỷ lệ người mang mầm bệnh không triệu chứng chiếm khoảng 5-10% trong cộng đồng và 20-25% ở lứa tuổi trưởng thành [28,29]. Ở Việt Nam, NMC có khả năng gây ra các vụ dịch nhỏ và các ca bệnh rải rác khắp các tỉnh trên cả nước, nguy cơ dịch lây lan ra cộng đồng là rất lớn. Dựa vào cấu trúc kháng nguyên ngoài màng của N. meningitidis, đã xác định được 13 nhóm huyết thanh (serogroup) khác nhau (bao gồm A, B, C, D, 29-E, H, I, K, L, W135, X, Y và Z), trong đó 90% các ca bệnh trên thế giới tập trung vào các nhóm huyết thanh A, B, C, Y và W135 - đây là 5 nhóm chủ yếu gây viêm màng não và nhiễm trùng huyết [29].
Hiện nay đã có vắc xin tái tổ hợp phòng ngừa NMC nhóm huyết thanh A, C, W135 và Y. Vắc xin nhóm B cũng đã được nghiên cứu sản xuất, tuy nhiên vắc xin kháng lại NMC nhóm B có tính sinh miễn dịch kém. Một trong những giả thuyết cho điều này có thể là do cấu trúc của N. meningitidis nhóm B tương đồng với axit polysialic trên tế bào thần kinh của con người.
Chính vì vậy, hiểu rõ về cấu trúc gen và các protein màng ngoài PorA, PorB… giúp cho việc nghiên cứu và chế tạo vắc xin hiệu quả hơn. Ngoài ra, phương pháp định type bằng trình tự đa locus (Multilocus sequence typing – MLST) được xem là tiêu chuẩn vàng để giám sát dịch tễ phân tử não mô cầu trong phạm vi quốc gia và quốc tế. Hiện nay các bệnh viện tuyến Trung ương – Bộ Y tế đã triển khai kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán NMC, tuy nhiên việc sử dụng các sinh phẩm xét nghiệm của nước ngoài với giá thành cao và hạn sử dụng ngắn đang là hạn chế của 1 kỹ thuật này đối với các bệnh viện tuyến dưới. Bên cạnh đó, các nghiên cứu xác định đặc điểm dịch tễ phân tử (genotype (týp huyết thanh); genosubtype (phân týp huyết thanh); dòng; so sánh trình tự gen, trình tự axit amin suy diễn…) của các chủng N.
meningitidis ở Việt Nam với cơ sở dữ liệu trên thế giới chưa được tiến hành nhiều. Việc cung cấp dữ liệu các đặc điểm dịch tễ phân tử có ý nghĩa quan trọng trong việc giám sát NMC, đặc biệt là các dòng xâm lấn; tiên lượng nguy cơ xảy ra dịch và làm cơ sở cho việc nghiên cứu vắc xin dự phòng, góp phần nâng cao chất lượng công tác phòng dịch bệnh não mô cầu, giảm thiểu tử vong và những di chứng nặng nề do bệnh gây ra, đảm bảo sức khoẻ cho cộng đồng. Xuất phát từ cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm di truyền phân tử của các chủng Neisseria meningitidis khu vực miền Bắc giai đoạn 2017 – 2020 ” với mục tiêu: - Xác định týp và phân týp huyết thanh các chủng Neisseria meningitidis được phân lập bằng phương pháp giải trình tự gen. Nhằm: (1) đánh giá độ đa hình của các vùng biến đổi VRs của gen porA và porB; (2) so sánh đa hình gen porA của các chủng Việt Nam với các chủng trên thế giới.
- Xác định dòng Neisseria meningitidis sử dụng phương pháp định type bằng trình tự đa locus (MLST), trên cơ sở đó so sánh dòng NMC phân lập được ở Việt Nam với các chủng trên thế giới. Việc thực hiện đề tài là cơ sở giúp cung cấp một công cụ giám sát dịch tễ học NMC, tiên lượng dự báo nguy cơ bùng phát dịch, phân vùng dịch tễ học theo khu vực và mục tiêu xa hơn trong tương lai là đề xuất một chiến lược dự phòng bằng vắc xin. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan não mô cầu 1.
Lịch sử Viêm màng não do Neisseria meningitidis đã được ghi nhận lần đầu tiên từ thế kỳ thứ II trước công nguyên. Nhưng đến tận năm 1805, bệnh mới được Gaspard Vieusseux mô tả từ vụ dịch viêm màng não ở Geneve. Đến năm 1884, Ettore Marchiafava và Angelo Celli lần đầu tiên quan sát được vi khuẩn trong tế bào ở dịch não tuỷ. Sau đó, năm 1887 Anton Weichselbaum phân lập được vi khuẩn gây bệnh từ dịch não tủy của bệnh nhân và mô tả với tên: Diplococcus intracellularis meningitidis.
Năm 1901 Albrecht và Ghon đã đổi thành Neisseria meningitidis để ghi công Albert Neisser [40,36]. Đặc điểm sinh học Neisseria meningitidis 1. meningitidis là cầu khuẩn Gram âm, hiếu khí, kích thước thay đổi, có thể thấy ở dạng đơn độc hoặc song cầu hình hạt cà phê với hai mặt dẹt đối diện nhau, kích thước khoảng 0,8 - 1µm, đứng riêng rẽ từng đôi một hoặc nhiều đôi tụ thành đám và có thể nằm trong hoặc ngoài bạch cầu đa nhân, hoạt tính oxidase dương tính, oxi hóa glucose và maltose, không sử dụng sucrose và lactose. Trên tiêu bản nhuộm vi khuẩn thu từ môi trường nuôi cấy, NMC thường có kích thước đa dạng, to nhỏ khác nhau và cách sắp xếp không điển hình.
Vi khuẩn ở trong bệnh phẩm dịch não tủy thường có vỏ, không di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram (-) [46,55]. Tính chất nuôi cấy N. meningitidis là loại vi khuẩn khó nuôi cấy, chỉ phát triển tốt ở môi trường giàu chất dinh dưỡng như thạch máu, thạch chocolate và khí trường có bổ sung 5 - 10% CO2, với nhiệt độ 37°C. Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc tròn, nhẵn, lồi, óng ánh và có màu hơi xám.
Sau 24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc có đường kính khoảng 1 mm, không tan máu, khuẩn lạc có màu xám đục nếu để trong thời gian dài. Trên 3 môi trường thạch chocolate, khuẩn lạc có dạng S, xám đục và óng ánh [47,56]. meningitidis dưới kính hiển vi điện tử, (B) Khuẩn lạc trên môi trường thạch máu, (C) Khuẩn lạc trên môi trường thạch Chocolate [38] 1. Sức đề kháng Tế bào vi khuẩn N.
meningitidis có sức đề kháng yếu: chỉ sống được trong bệnh phẩm dịch não tuỷ 3 - 4 giờ sau khi ra khỏi cơ thể. Bị tiêu diệt ngay dưới tia cực tím, dung dịch chloramin 0,5 - 1% hoặc cồn 70°, ở nhiệt độ 55°C trong 30 phút hoặc 60°C trong 10 phút, vi khuẩn không chịu được điều kiện khô và ánh sáng. Các thuốc sát trùng thông thường dễ tiêu diệt NMC, ngoài ra vi khuẩn dễ bị chết do men tự ly giải [59]. Cấu trúc kháng nguyên Neisseria meningitidis Ở N.
meningitidis cấu trúc bao gồm màng ngoài (OM), lớp Peptidoglycan và màng trong và tế bào chất. Trong đó, cấu trúc kháng nguyên của N. meningitidis bao gồm: Lớp polysaccharide, Lipo-oligosaccharide (LOS), protein màng ngoài: PorA, PorB và một số protein khác (Hình 1. meningitidis được phân chia thành các týp huyết thanh trên cơ sở cấu trúc hóa học và dạng liên kết của các đơn vị saccharide cấu thành nên vỏ polysaccharide trên bề mặt vi khuẩn.
Căn cứ vào tính không đồng nhất về cấu trúc và tính kháng nguyên của lớp PS người ta đã chia được 13 nhóm huyết thanh bao gồm: (A, B, C, D, 29-E, H, I, K, L, W135, X, Y và Z), trong đó 5 nhóm huyết thanh chủ yếu gây viêm màng não và nhiễm trùng huyết là A, B, C, Y 4 và W-135. Chỉ một sự khác nhau nhỏ trong cấu trúc nhưng sẽ dẫn đến các đặc tính miễn dịch có sự khác biệt một cách rõ ràng. Nhóm huyết thanh A chứa N-acetyl- mannosamine-1-phosphate, trong khi đó nhóm huyết thanh B, C, Y, W-135 được cấu tạo từ các dẫn xuất của axit sialic - chất đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại và độc tính. Lớp PS vỏ của NMC nhóm huyết thanh B và C bao gồm homopolymer của axit N-acetylneuraminic (Neu5C) liên kết với axit α-2,8 và α-2,9.
Cấu trúc α- 2,9 là kháng nguyên mạnh đối với cơ thể và sinh ra kháng thể bảo vệ còn α-2,8 có tính kháng nguyên rất yếu [8,33]. Cấu trúc màng ngoài tế bào của N. Nhóm miễn dịch L1 - L8 liên quan đến sự chi phối đầu tiên tới NMC nhóm huyết thanh B và C, trong khi đó nhóm miễn dịch L9 - L12 liên quan đến các chủng NMC nhóm huyết thanh A. Màng ngoài chứa hơn 50% LOS, nó tương tự như PS của vi khuẩn Gram âm và chứa lipid A [48].
Lớp Protein của màng ngoài (OMP) của N. meningitidis: Đặc hiệu cho týp huyết thanh và phân týp huyết thanh. Màng ngoài NMC bao gồ m: protein lớp 1 (PorA), lớp 2 hoă ̣c lớp 3 (PorB) với chức năng cho phép các chất dinh dưỡng đi vào và mô ̣t số protein khác như: protein gắn yếu tố H (factor H binding protein - fHbp), protein A vận chuyển sắt (Ferric enterobactin transport protein A - FetA), protein kết dính A (Neisserial adhesin A - NadA). Gần như toàn bộ các chủng NMC (> 80%) đểu biểu hiện protein bề mặt thuộc nhóm OMP1, mã hoá bởi gen porA và một trong hai protein bề mặt nhóm 2 hoặc 3 lần lượt được mã hoá bởi gen porB2 hoặc porB3.
Týp huyết thanh được xác định bởi sự thay đổi của protein PorB; phân týp huyế t thanh xác định bởi sự thay đổi của protein PorA [42]. Hầu hết độ lớn các kháng nguyên bộc lộ trên bề mặt tế bào NMC và độ lớn kháng nguyên giữa các chủng là khác nhau, nên N. meningitidis được phân chia trên 20 týp và phân týp khác nhau, chủ yếu ở nhóm B, C. Nhiều chủng phân lập không thể phân loại được týp hay phân týp nào bằng kháng thể đơn dòng hiện tại.
Protein PorA có kích thước khoảng 1179 bp mã hoá cho protein màng ngoài lớp 1 với trọng lượng phân tử khoảng 44 kDa. Gen porA biểu hiện ở hầu hết các chủng N. Về cấu trúc PorA, có 8 vùng tiếp xúc trên bề mặt (exposed surface loop), đánh số thứ tự vùng I đến VIII, hai trong số vùng này (vùng I và vùng IV) có trình tự axit amin biến đổi mạnh (ký hiệu VR1, VR2). Vùng V có trình tự axit amin ít biến đổi hơn (ký hiệu là VR3).
Các phản ứng huyết thanh đặc hiệu với PorA chủ yếu xảy ra với epitop ở vùng VR1 và VR2 [21]. Dựa vào phản ứng huyết thanh học của kháng thể đơn dòng với vùng VR1, VR2 để xác định phân týp huyết thanh.