NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG Neisseria meningitidis KHU VỰC MIỀN BẮC GIAI ĐOẠN 2017 – 2020

• Tác giả: Hoàng Thị Ngọc Anh
• Người hướng dẫn: Thượng Tá, TS. Võ Viết Cường
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu một số đặc điểm di truyền phân tử của các chủng Neisseria meningitidis khu vực miền Bắc giai đoạn 2017 – 2020
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan não mô cầu
• 1.2. Đặc điểm sinh học Neisseria meningitidis
• 1.3. Dịch tễ học
• 1.4. Dịch tễ học nhiễm não mô cầu
• 1.5. Dịch tễ học phân tử Neisseria meningitidis
• 1.6. Chẩn đoán ca bệnh lâm sàng
• 1.7. Chẩn đoán xác định ca bệnh
• 1.8. Đáp ứng miễn dịch
• 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Hoá chất, sinh phẩm
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Tách chiết DNA
• 2.4.2. Xác định nhóm huyết thanh của Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật multiplex-PCR
• 2.4.3. Phản ứng PCR khuếch đại các đoạn gen MLST
• 2.4.4. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen kháng nguyên mã hoá protein màng ngoài PorA và PorB
• 2.4.5. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
• 2.4.6. Tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.4.7. Giải trình tự gen các sản phẩm PCR
• 2.4.8. Phân tích dữ liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả xác định cơ cấu nhóm huyết thanh N. meningitidis bằng kỹ thuật multiplex-PCR
• 3.2. Xác định trình tự vùng VR1, VR2 và cơ cấu phân týp huyết thanh N. meningitidis dựa trên gen porA
• 3.3. Khuếch đại, xác định trình tự vùng VR1, VR2 gen porA
• 3.4. Xác định cơ cấu phân týp huyết thanh N.
• 3.5. Xác định trình tự vùng VR1 – VR4 và cơ cấu týp huyết thanh N. meningitidis dựa trên gen porB
• 3.6. Kết quả khuếch đại, xác định trình tự vùng VR1 – VR4 của gen porB
• 3.7. Xác định cơ cấu týp huyết thanh N.
• 3.8. Phân tích tính đa hình di truyền thông qua xác định kiểu trình tự (MLST) của các chủng N.
• 3.9. Kết quả khuếch đại 7 đoạn gen quản gia (house keeping)
• 3.10. Xác định kiểu trình tự (MLST) của các chủng N.
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG

I. Tổng quan Nghiên cứu đặc điểm di truyền Neisseria 2017 2020

Bệnh nhiễm khuẩn do não mô cầu Neisseria meningitidis là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, gây dịch với nhiều thể lâm sàng khác nhau, trong đó viêm màng não mủ và nhiễm khuẩn huyết là phổ biến hơn. Não mô cầu cư trú tại vùng hầu họng của người và lây qua đường hô hấp. Bệnh thường để lại di chứng nặng nề, tỷ lệ tử vong cao. Ở Việt Nam, NMC có khả năng gây dịch nhỏ và ca bệnh rải rác. Dựa vào cấu trúc kháng nguyên ngoài màng, đã xác định 13 nhóm huyết thanh, trong đó 5 nhóm (A, B, C, Y, W135) chiếm 90% ca bệnh. Hiện có vaccine tái tổ hợp phòng ngừa nhóm A, C, W135, Y. Vắc xin nhóm B có tính sinh miễn dịch kém. Hiểu rõ cấu trúc gen và protein màng ngoài (PorA, PorB...) giúp nghiên cứu và chế tạo vắc xin hiệu quả hơn. Phương pháp định type bằng trình tự đa locus (MLST) là tiêu chuẩn vàng để giám sát dịch tễ phân tử. Các bệnh viện tuyến Trung ương đã triển khai kỹ thuật sinh học phân tử, nhưng sử dụng sinh phẩm ngoại với giá thành cao là một hạn chế. Các nghiên cứu xác định đặc điểm dịch tễ phân tử của các chủng N. meningitidis ở Việt Nam so với cơ sở dữ liệu thế giới chưa nhiều. Nghiên cứu này cung cấp dữ liệu quan trọng trong việc giám sát NMC, đặc biệt là dòng xâm lấn, tiên lượng nguy cơ dịch và làm cơ sở cho nghiên cứu vaccine dự phòng.

1.1. Lịch sử phát hiện và nghiên cứu về não mô cầu

Viêm màng não do Neisseria meningitidis đã được ghi nhận từ thế kỷ thứ II trước công nguyên. Đến năm 1805, bệnh được Gaspard Vieusseux mô tả từ vụ dịch ở Geneve. Năm 1884, Ettore Marchiafava và Angelo Celli quan sát được vi khuẩn trong tế bào ở dịch não tủy. Năm 1887, Anton Weichselbaum phân lập được vi khuẩn và đặt tên Diplococcus intracellularis meningitidis. Năm 1901, Albrecht và Ghon đổi tên thành Neisseria meningitidis để ghi công Albert Neisser. Các cột mốc này đánh dấu sự khởi đầu của việc nghiên cứu và hiểu biết về căn bệnh nguy hiểm này. Nghiên cứu giúp con người hiểu rõ hơn về Neisseria, từ đó có các biện pháp phòng ngừa hữu hiệu hơn.

1.2. Đặc điểm sinh học cơ bản của Neisseria meningitidis

Neisseria meningitidis là cầu khuẩn Gram âm, hiếu khí, kích thước thay đổi, có thể thấy ở dạng đơn độc hoặc song cầu hình hạt cà phê. Vi khuẩn này có hoạt tính oxidase dương tính, oxi hóa glucose và maltose, không sử dụng sucrose và lactose. Trên tiêu bản nhuộm vi khuẩn thu từ môi trường nuôi cấy, NMC thường có kích thước đa dạng và cách sắp xếp không điển hình. Vi khuẩn ở trong bệnh phẩm dịch não tủy thường có vỏ, không di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram (-). Neisseria cần môi trường giàu chất dinh dưỡng để phát triển, như thạch máu, thạch chocolate, và khí trường có 5-10% CO2, ở 37°C.

1.3. Cấu trúc kháng nguyên của Neisseria meningitidis và phân loại

Cấu trúc của Neisseria meningitidis bao gồm màng ngoài (OM), lớp Peptidoglycan và màng trong và tế bào chất. Cấu trúc kháng nguyên bao gồm lớp polysaccharide, Lipo-oligosaccharide (LOS), protein màng ngoài: PorA, PorB và một số protein khác. Dựa vào tính không đồng nhất về cấu trúc và tính kháng nguyên của lớp PS, người ta chia được 13 nhóm huyết thanh bao gồm: (A, B, C, D, 29-E, H, I, K, L, W135, X, Y và Z). 5 nhóm huyết thanh chủ yếu gây viêm màng não và nhiễm trùng huyết là A, B, C, Y và W-135. Chỉ một sự khác nhau nhỏ trong cấu trúc dẫn đến các đặc tính miễn dịch khác biệt. Việc hiểu rõ cấu trúc kháng nguyên là rất quan trọng để phát triển vaccine hiệu quả.

II. Thách thức Neisseria và gánh nặng viêm màng não tại miền Bắc

Tỷ lệ người mang mầm bệnh NMC không triệu chứng chiếm khoảng 5-10% trong cộng đồng và 20-25% ở lứa tuổi trưởng thành. Ở Việt Nam, NMC có khả năng gây ra các vụ dịch nhỏ và các ca bệnh rải rác khắp các tỉnh trên cả nước, nguy cơ dịch lây lan ra cộng đồng là rất lớn. Ngoài ra, phương pháp định type bằng trình tự đa locus (Multilocus sequence typing – MLST) được xem là tiêu chuẩn vàng để giám sát dịch tễ phân tử não mô cầu trong phạm vi quốc gia và quốc tế. Hiện nay các bệnh viện tuyến Trung ương – Bộ Y tế đã triển khai kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán NMC, tuy nhiên việc sử dụng các sinh phẩm xét nghiệm của nước ngoài với giá thành cao và hạn sử dụng ngắn đang là hạn chế của 1 kỹ thuật này đối với các bệnh viện tuyến dưới.

2.1. Dịch tễ học nhiễm não mô cầu Con đường lây lan và tỷ lệ mắc

Neisseria meningitidis cư trú ở đường hô hấp của con người, lây truyền qua các giọt bắn truyền trong không khí của người nhiễm bệnh hoặc thông thường hơn là của người mang mầm bệnh không có triệu chứng. Tỷ lệ gây bệnh chiếm 1/100.000 và tỷ lệ người mang mầm bệnh là 1/10. Khi đã đi vào máu, NMC phá vỡ phản ứng đáp ứng miễn dịch bằng một số yếu tố độc lực: vỏ vi khuẩn, IgA protease, bề mặt chứa Lipopolysaccharide (LPS), hoạt động như một nội độc tố gây viêm và tổn thương nội mô. Bệnh xảy ra chỉ khi NMC vượt qua biểu mô đường hô hấp để vào máu, gây nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não.

2.2. Di chứng và tỷ lệ tử vong do nhiễm Neisseria meningitidis

Tỷ lệ tử vong do nhiễm NMC có thể lên tới 10%, trong khi di chứng vĩnh viễn xảy ra ở 20% số người sống sót, bao gồm tổn thương thần kinh, rối loạn tâm lý, giảm thính lực, giảm thị lực, cắt cụt chi. Khi điều trị bệnh, tỷ lệ tử vong do viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết là 11%, trong đó viêm màng não đơn thuần là 5%. Hầu hết các trường hợp chết do viêm màng não có nguyên nhân từ nhiễm khuẩn huyết. Bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết nhưng không có hội chứng màng não có tỷ lệ tử vong là 20%, nhưng nếu kèm theo sốc thì tỷ lệ tử vong chiếm đến 50%. Trong nhiễm khuẩn NMC, 15% thể viêm màng não tiến triển nhanh từ khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên đến khi tử vong.

III. PCR Phương pháp phân tích di truyền Neisseria hiệu quả

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một kỹ thuật khuếch đại DNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu Neisseria meningitidis. Nó cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra hàng triệu bản sao của một đoạn DNA cụ thể, giúp việc phân tích và phát hiện vi khuẩn trở nên dễ dàng hơn. PCR được sử dụng để xác định nhóm huyết thanh của Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật multiplex- PCR. Đồng thời, PCR khuếch đại các đoạn gen MLST và đoạn gen kháng nguyên mã hoá protein màng ngoài PorA và PorB. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose được thực hiện để kiểm tra kết quả khuếch đại. Cuối cùng, sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự gen để phân tích dữ liệu.

3.1. Xác định nhóm huyết thanh Neisseria bằng multiplex PCR

Kỹ thuật multiplex- PCR được sử dụng để xác định nhóm huyết thanh của Neisseria meningitidis. Kỹ thuật này cho phép phát hiện đồng thời nhiều nhóm huyết thanh khác nhau trong cùng một phản ứng. Các mồi đặc hiệu cho từng nhóm huyết thanh được thiết kế để khuếch đại các đoạn DNA đặc trưng. Kết quả PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose, và nhóm huyết thanh được xác định dựa trên kích thước của các sản phẩm khuếch đại. Đây là phương pháp nhanh chóng và hiệu quả để xác định nhóm huyết thanh, giúp việc giám sát dịch tễ và lựa chọn vaccine trở nên hiệu quả hơn.

3.2. Khuếch đại và giải trình tự gen PorA và PorB bằng PCR

PCR được sử dụng để khuếch đại các đoạn gen mã hóa protein màng ngoài PorA và PorB của Neisseria meningitidis. Các mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại các vùng biến đổi (VRs) của gen porA và porB. Sản phẩm PCR sau đó được giải trình tự để xác định trình tự nucleotide của các vùng VRs. Phân tích trình tự gen cho phép xác định các phân týp huyết thanh và týp huyết thanh của Neisseria meningitidis. Thông tin này rất quan trọng trong việc hiểu rõ sự đa dạng di truyền và tiến hóa của vi khuẩn, cũng như trong việc phát triển vaccine và chẩn đoán.

IV. Giải trình tự gen Bí quyết tìm hiểu đặc điểm di truyền Neisseria

Giải trình tự gen là một phương pháp quan trọng để xác định trình tự nucleotide của DNA. Trong nghiên cứu Neisseria meningitidis, giải trình tự gen được sử dụng để xác định trình tự của các gen như porA, porB và các gen MLST. Trình tự gen cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc di truyền của vi khuẩn, giúp các nhà nghiên cứu hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền, tiến hóa và khả năng gây bệnh của Neisseria meningitidis. Ngoài ra, giải trình tự gen cũng được sử dụng để so sánh các chủng Neisseria meningitidis khác nhau và xác định các đột biến gen có thể ảnh hưởng đến khả năng kháng kháng sinh hoặc khả năng gây bệnh.

4.1. Xác định kiểu trình tự MLST để phân tích tính đa hình

Phương pháp định type bằng trình tự đa locus (Multilocus sequence typing – MLST) được xem là tiêu chuẩn vàng để giám sát dịch tễ phân tử não mô cầu trong phạm vi quốc gia và quốc tế. MLST sử dụng trình tự của 7 gen quản gia (house keeping) để xác định kiểu trình tự (sequence type – ST) của Neisseria meningitidis. Phân tích MLST cho phép xác định các dòng (lineage) của vi khuẩn và theo dõi sự lây lan của các dòng này trong cộng đồng. Thông tin MLST rất quan trọng trong việc giám sát dịch tễ học, dự đoán nguy cơ bùng phát dịch và phân vùng dịch tễ học.

4.2. Phân tích phylogenetic so sánh các chủng Neisseria miền Bắc

Phân tích phylogenetic là một phương pháp sử dụng dữ liệu trình tự gen để xây dựng cây phả hệ (phylogenetic tree) thể hiện mối quan hệ tiến hóa giữa các chủng Neisseria meningitidis. Cây phả hệ cho phép các nhà nghiên cứu xác định nguồn gốc và con đường lây lan của các chủng vi khuẩn. Trong nghiên cứu này, phân tích phylogenetic được sử dụng để so sánh các chủng Neisseria meningitidis phân lập được ở miền Bắc Việt Nam với các chủng trên thế giới. Kết quả phân tích giúp hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền của Neisseria meningitidis ở Việt Nam và mối liên hệ với các chủng ở các khu vực khác.

V. Ứng dụng Nghiên cứu Neisseria góp phần phòng ngừa viêm màng não

Nghiên cứu đặc điểm di truyền phân tử của Neisseria meningitidis có nhiều ứng dụng quan trọng trong công tác phòng ngừa và điều trị bệnh viêm màng não. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin về sự đa dạng di truyền của vi khuẩn, giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh và khả năng kháng kháng sinh. Thông tin này rất quan trọng trong việc phát triển vaccine hiệu quả và lựa chọn kháng sinh phù hợp để điều trị bệnh. Ngoài ra, nghiên cứu còn giúp giám sát dịch tễ học, dự đoán nguy cơ bùng phát dịch và phân vùng dịch tễ học.

5.1. Phát triển vaccine dựa trên đặc điểm di truyền PorA và PorB

Protein màng ngoài PorA và PorB là các kháng nguyên quan trọng của Neisseria meningitidis. Nghiên cứu đặc điểm di truyền của gen porA và porB giúp xác định các phân týp huyết thanh và týp huyết thanh của vi khuẩn. Thông tin này rất quan trọng trong việc phát triển vaccine dựa trên các kháng nguyên PorA và PorB. Vaccine chứa các kháng nguyên này có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch bảo vệ chống lại các chủng Neisseria meningitidis khác nhau. Nghiên cứu giúp lựa chọn các kháng nguyên phù hợp để đưa vào vaccine, tăng cường hiệu quả bảo vệ của vaccine.

5.2. Lựa chọn kháng sinh phù hợp dựa trên kết quả kháng sinh đồ

Neisseria meningitidis có thể kháng một số loại kháng sinh. Nghiên cứu đặc điểm di truyền của vi khuẩn giúp xác định các gen kháng kháng sinh. Thông tin này rất quan trọng trong việc lựa chọn kháng sinh phù hợp để điều trị bệnh. Kháng sinh đồ là một xét nghiệm xác định độ nhạy của vi khuẩn với các loại kháng sinh khác nhau. Kết hợp thông tin về đặc điểm di truyền và kết quả kháng sinh đồ giúp bác sĩ lựa chọn kháng sinh hiệu quả nhất để điều trị bệnh, giảm nguy cơ thất bại điều trị và sự lan rộng của vi khuẩn kháng kháng sinh.

VI. Tương lai Giám sát di truyền Neisseria và chiến lược phòng ngừa

Nghiên cứu đặc điểm di truyền phân tử của Neisseria meningitidis là một lĩnh vực đang phát triển mạnh mẽ. Trong tương lai, các kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (next-generation sequencing – NGS) sẽ được sử dụng rộng rãi để phân tích toàn bộ hệ gen của vi khuẩn. Phân tích hệ gen cho phép xác định tất cả các gen và vùng không mã hóa của vi khuẩn, cung cấp thông tin toàn diện về cấu trúc di truyền, cơ chế gây bệnh và khả năng kháng kháng sinh. Thông tin này sẽ giúp phát triển các chiến lược phòng ngừa và điều trị bệnh hiệu quả hơn.

6.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu về đặc điểm di truyền Neisseria ở VN

Việc xây dựng một cơ sở dữ liệu toàn diện về đặc điểm di truyền của Neisseria meningitidis ở Việt Nam là rất cần thiết. Cơ sở dữ liệu này sẽ chứa thông tin về trình tự gen, kiểu trình tự MLST, phân týp huyết thanh, týp huyết thanh và khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được ở Việt Nam. Cơ sở dữ liệu sẽ là một công cụ quan trọng cho việc giám sát dịch tễ học, dự đoán nguy cơ bùng phát dịch và phát triển các chiến lược phòng ngừa và điều trị bệnh phù hợp với tình hình dịch tễ ở Việt Nam.

6.2. Đề xuất chiến lược phòng ngừa bằng vaccine dựa trên di truyền

Dựa trên thông tin về đặc điểm di truyền của Neisseria meningitidis ở Việt Nam, các nhà khoa học có thể đề xuất một chiến lược phòng ngừa bằng vaccine phù hợp. Chiến lược này có thể bao gồm việc sử dụng các loại vaccine hiện có hoặc phát triển các loại vaccine mới chứa các kháng nguyên đặc hiệu cho các chủng vi khuẩn phổ biến ở Việt Nam. Việc tiêm chủng vaccine có thể giúp giảm nguy cơ mắc bệnh và tử vong do Neisseria meningitidis, đặc biệt là ở các nhóm đối tượng có nguy cơ cao như trẻ em và thanh thiếu niên.

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh nhiễm khuẩn do Neisseria meningitidis (NMC) là một trong những bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, gây viêm màng não mủ và nhiễm khuẩn huyết với tỷ lệ tử vong từ 8-15% và di chứng nặng nề chiếm khoảng 10-20%. Trên thế giới, mỗi năm có khoảng 500.000 ca bệnh và 50.000 ca tử vong do NMC. Ở Việt Nam, NMC gây ra các vụ dịch nhỏ và các ca bệnh rải rác, đặc biệt tại khu vực miền Bắc với tỷ lệ mắc bệnh dao động từ 3,7 đến 11,5/100.000 người, tỷ lệ tử vong lên đến 18,52%. Nghiên cứu tập trung vào các chủng Neisseria meningitidis thu thập từ năm 2017 đến 2020 tại một số tỉnh miền Bắc nhằm xác định đặc điểm di truyền phân tử, bao gồm týp và phân týp huyết thanh, cũng như dòng gen của các chủng này. Mục tiêu chính là đánh giá đa hình của các vùng biến đổi VR1, VR2 của gen porA và các vùng VR1-VR4 của gen porB, đồng thời so sánh với dữ liệu quốc tế để hỗ trợ giám sát dịch tễ học và phát triển vắc xin phòng bệnh. Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc cung cấp dữ liệu dịch tễ phân tử, dự báo nguy cơ bùng phát dịch và đề xuất chiến lược phòng ngừa hiệu quả, góp phần giảm thiểu tử vong và di chứng do NMC gây ra.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về dịch tễ học phân tử của Neisseria meningitidis, tập trung vào:

• Kháng nguyên màng ngoài (Outer Membrane Proteins - OMPs): Bao gồm protein PorA và PorB, là các kháng nguyên chính dùng để xác định týp và phân týp huyết thanh. PorA có hai vùng biến đổi chính VR1 và VR2, PorB có bốn vùng biến đổi VR1-VR4, đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch và phát triển vắc xin.
• Định type đa locus (Multilocus Sequence Typing - MLST): Phương pháp tiêu chuẩn vàng để phân loại các dòng gen dựa trên trình tự 7 gen quản gia (abcZ, adk, aroE, fumC, gdh, pdhC, pgm), giúp phân tích mối quan hệ di truyền và giám sát dịch tễ học dài hạn.
• Dịch tễ học phân tử: Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các chủng NMC, phân biệt các dòng siêu xâm lấn (hyperinvasive lineages) và mối liên hệ với dịch bệnh.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 59 chủng Neisseria meningitidis được phân lập từ người lành mang mầm bệnh tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam (Lạng Sơn, Thái Nguyên, Hà Giang, Hà Nội, Thái Bình, Hòa Bình, Ninh Bình) trong giai đoạn 2017-2020.
• Phương pháp phân tích:
  • Tách chiết DNA sử dụng bộ kit QIAamp DNA mini kit.
  • Xác định nhóm huyết thanh bằng kỹ thuật multiplex-PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho nhóm A, B, C, Y, W135.
  • Khuếch đại và giải trình tự gen porA (vùng VR1, VR2) và porB (vùng VR1-VR4) bằng PCR và phương pháp giải trình tự Sanger.
  • Định type dòng gen bằng MLST qua khuếch đại và giải trình tự 7 gen quản gia.
  • Phân tích dữ liệu bằng phần mềm Sequencher 4, MEGA7 và so sánh với cơ sở dữ liệu quốc tế trên PubMLST.
• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và phân lập chủng trong giai đoạn 2017-2020; phân tích di truyền và giải trình tự gen thực hiện trong năm 2021-2022.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Cơ cấu nhóm huyết thanh:

   • Trong 59 chủng phân lập, nhóm huyết thanh B chiếm ưu thế với 83,05% (49/59 chủng).
   • 16,95% chủng không xác định được nhóm huyết thanh.
   • Không phát hiện nhóm A, C, Y, W135 trong mẫu nghiên cứu.

2. Phân týp huyết thanh dựa trên gen porA:

   • 57/59 chủng có đoạn gen porA được khuếch đại thành công.
   • Phân týp VR1 phổ biến nhất là P1.22-25 chiếm 35,59%, tiếp theo là P1.7-2 với 20,34%.
   • Phân týp VR2 phổ biến nhất là P1.14 chiếm 33,90%, tiếp theo là P1.13-9 với 18,64%.
   • Một số chủng có phân týp không xác định hoặc chỉ xác định một phần.

3. Phân týp huyết thanh dựa trên gen porB:

   • Tất cả 59 chủng mang gen porB lớp 3 (porB3) với kích thước sản phẩm PCR khoảng 810 bp.
   • Không phát hiện gen porB lớp 2 (porB2).
   • Các vùng biến đổi VR1-VR4 của porB thể hiện đa hình di truyền rõ rệt.

4. Định type dòng gen bằng MLST:

   • Các chủng phân lập thuộc nhiều kiểu trình tự (ST) khác nhau, phản ánh sự đa dạng di truyền.
   • Một số dòng siêu xâm lấn được xác định, tương đồng với các chủng lưu hành trên thế giới.
   • MLST cho phép phân biệt rõ ràng các chủng và hỗ trợ giám sát dịch tễ học hiệu quả.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy nhóm huyết thanh B chiếm ưu thế tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2017-2020, phù hợp với các báo cáo trước đây trong nước và quốc tế. Tỷ lệ nhóm B cao (83,05%) phản ánh nguy cơ dịch bệnh do nhóm này gây ra vẫn rất lớn, trong khi nhóm A, C, Y, W135 không được phát hiện, có thể do sự thay đổi dịch tễ học theo thời gian và khu vực.

Phân tích gen porA và porB cho thấy sự đa dạng di truyền cao, đặc biệt ở các vùng biến đổi VR1, VR2 (porA) và VR1-VR4 (porB), điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển vắc xin và giám sát dịch tễ phân tử. Sự hiện diện đồng nhất của gen porB3 cho thấy các chủng lưu hành chủ yếu biểu hiện protein màng ngoài lớp 3, tương tự các nghiên cứu quốc tế.

So sánh với các vắc xin hiện có, như VA-Mengoc-BC® của Cuba và MenB-4C của Mỹ, cho thấy sự không hoàn toàn tương thích giữa các phân týp huyết thanh lưu hành tại Việt Nam và thành phần kháng nguyên vắc xin, đặc biệt với phân týp P1.22-25 chiếm ưu thế nhưng không có trong vắc xin Cuba. Điều này đặt ra yêu cầu cần mở rộng nghiên cứu và cập nhật dữ liệu để phát triển vắc xin phù hợp hơn với đặc điểm chủng tại Việt Nam.

Dữ liệu MLST cung cấp công cụ mạnh mẽ để giám sát dịch tễ học dài hạn, giúp phát hiện các dòng siêu xâm lấn và dự báo nguy cơ bùng phát dịch. Việc sử dụng MLST cũng giúp so sánh các chủng trong nước với quốc tế, hỗ trợ hợp tác nghiên cứu và phòng chống dịch bệnh hiệu quả hơn.

Các kết quả có thể được trình bày qua biểu đồ phân bố nhóm huyết thanh, biểu đồ tần suất các phân týp porA và porB, cũng như bảng phân bố kiểu trình tự MLST, giúp minh họa rõ ràng sự đa dạng và cơ cấu phân bố các chủng.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tăng cường giám sát dịch tễ học phân tử: Áp dụng rộng rãi kỹ thuật MLST và giải trình tự gen porA, porB tại các phòng thí nghiệm tuyến tỉnh và trung ương để theo dõi sự biến đổi của các chủng NMC, từ đó dự báo nguy cơ dịch và có biện pháp can thiệp kịp thời.

2. Nghiên cứu và phát triển vắc xin phù hợp: Cập nhật dữ liệu phân týp huyết thanh và đa hình gen để thiết kế hoặc lựa chọn vắc xin có thành phần kháng nguyên phù hợp với chủng lưu hành tại Việt Nam, đặc biệt nhóm B chiếm ưu thế.

3. Đào tạo và nâng cao năng lực kỹ thuật: Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật sinh học phân tử, giải trình tự gen và phân tích dữ liệu cho cán bộ y tế và nhà nghiên cứu nhằm nâng cao chất lượng giám sát và nghiên cứu.

4. Phối hợp liên ngành và quốc tế: Tăng cường hợp tác giữa các viện nghiên cứu, bệnh viện và tổ chức quốc tế để chia sẻ dữ liệu, kinh nghiệm và công nghệ, góp phần nâng cao hiệu quả phòng chống bệnh não mô cầu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Sinh học phân tử, Vi sinh vật học: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu chi tiết về đặc điểm di truyền phân tử của Neisseria meningitidis, hỗ trợ các nghiên cứu sâu hơn về dịch tễ học và phát triển vắc xin.

2. Cán bộ y tế và chuyên gia dịch tễ học: Thông tin về cơ cấu nhóm huyết thanh và dòng gen giúp cải thiện công tác giám sát, chẩn đoán và phòng chống dịch bệnh não mô cầu tại Việt Nam.

3. Các nhà sản xuất và phát triển vắc xin: Dữ liệu phân tích đa hình gen và phân týp huyết thanh là cơ sở khoa học để thiết kế vắc xin phù hợp với đặc điểm chủng lưu hành trong nước.

4. Quản lý y tế và chính sách công: Luận văn cung cấp bằng chứng khoa học để xây dựng chính sách phòng chống dịch bệnh, đầu tư trang thiết bị và đào tạo nhân lực trong lĩnh vực y tế dự phòng.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nhóm huyết thanh B chiếm ưu thế ở miền Bắc Việt Nam?
   Nhóm B có khả năng tồn tại lâu dài trong cộng đồng và gây bệnh rải rác, phù hợp với điều kiện dịch tễ và miễn dịch của người dân địa phương. Ngoài ra, nhóm B có cấu trúc vỏ polysaccharide tương đồng với mô người, làm giảm hiệu quả miễn dịch tự nhiên.

2. Phương pháp MLST có ưu điểm gì so với các phương pháp khác?
   MLST cho phép phân loại chính xác các dòng gen dựa trên trình tự 7 gen quản gia, có tính tái lập cao, so sánh được giữa các phòng thí nghiệm và hỗ trợ giám sát dịch tễ học dài hạn hiệu quả.

3. Tại sao một số chủng không xác định được nhóm huyết thanh?
   Nguyên nhân có thể do sự đa dạng di truyền cao, biến đổi gen hoặc chủng mới chưa có trong cơ sở dữ liệu, cũng như hạn chế của bộ mồi PCR trong việc phát hiện tất cả các nhóm huyết thanh.

4. Việc xác định phân týp huyết thanh dựa trên gen porA và porB có ý nghĩa gì?
   Giúp phân biệt các chủng NMC chi tiết hơn, hỗ trợ giám sát dịch tễ học phân tử, đánh giá hiệu quả vắc xin và phát triển các loại vắc xin mới phù hợp với đặc điểm chủng lưu hành.

5. Làm thế nào để nâng cao hiệu quả phòng chống bệnh não mô cầu tại Việt Nam?
   Cần tăng cường giám sát dịch tễ học phân tử, cập nhật dữ liệu chủng lưu hành, phát triển vắc xin phù hợp, đào tạo nhân lực kỹ thuật và phối hợp liên ngành trong công tác phòng chống dịch.

Kết luận

• Nhóm huyết thanh B chiếm ưu thế với 83,05% trong các chủng Neisseria meningitidis phân lập tại miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2017-2020.
• Phân tích gen porA và porB cho thấy sự đa dạng di truyền cao, đặc biệt ở các vùng biến đổi VR1, VR2 (porA) và VR1-VR4 (porB).
• Tất cả chủng mang gen porB3, không phát hiện porB2, phản ánh đặc điểm protein màng ngoài của chủng lưu hành.
• Phương pháp MLST giúp phân loại chính xác các dòng gen, hỗ trợ giám sát dịch tễ học và so sánh với dữ liệu quốc tế.
• Cần tiếp tục nghiên cứu mở rộng, cập nhật dữ liệu và phát triển vắc xin phù hợp để nâng cao hiệu quả phòng chống bệnh não mô cầu tại Việt Nam.

Hành động tiếp theo: Đẩy mạnh ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong giám sát, phối hợp nghiên cứu đa ngành và phát triển vắc xin phù hợp với đặc điểm chủng lưu hành trong nước nhằm giảm thiểu tác động của bệnh não mô cầu đối với cộng đồng.