Trần thị minh thu đánh giá khả năng kháng biofilm staphylococcus aureus của cao chiết lá ổi psidium guajava l và cao chiết nhục đậu khấu myristica fragrans houtt

Nghiên cứu khả năng kháng biofilm Staphylococcus aureus của cao chiết lá ổi (Psidium guajava L.) và nhục đậu khấu (Myristica fragrans Houtt.). Tìm hiểu dược tính tự nhiên.

• Tác giả: Trần Thị Minh Thu
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Khắc Tiệp
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Đánh giá khả năng kháng biofilm Staphylococcus aureus của cao chiết lá ổi (Psidium guajava L.) và cao chiết nhục đậu khấu (Myristica fragrans Houtt.)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về biofilm của Staphylococcus aureus
• 1.1.1. Tổng quan về Staphylococcus aureus
• 1.1.2. Biofilm và các thất bại trong điều trị nhiễm khuẩn
• 1.1.3. Một số mô hình biofilm và ứng dụng trong nghiên cứu
• 1.1.4. Cách đánh giá các chỉ tiêu thành phần của biofilm
• 1.2. Tổng quan về một số dược liệu sử dụng trong đề tài
• 1.2.1. Tổng quan về ổi (Psidium guajava L.)
• 1.2.2. Tổng quan về nhục đậu khấu (Myristica fragrans Houtt.)
• 1.3. Một số nghiên cứu về tác dụng kháng biofilm S. aureus của cao chiết dược liệu
• 1.3.1. Nghiên cứu nước ngoài
• 1.3.2. Nghiên cứu trong nước
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.1. Vi sinh vật
• 2.1.2. Hóa chất, thiết bị
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2.1. Đánh giá khả năng kháng biofilm của các phân đoạn cao chiết lá ổi
• 2.2.2. Đánh giá khả năng kháng biofilm của các phân đoạn cao chiết nhục đậu khấu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
• 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm của S. aureus
• 2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng biofilm của cao dược liệu
• 2.3.4. Phương pháp thống kê
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đánh giá khả năng kháng biofilm S. aureus của cao chiết lá ổi các phân đoạn
• 3.1.1. Đánh giá khả năng kháng biofilm S. aureus của cao chiết lá ổi các phân đoạn EtOH, n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, H2O
• 3.1.2. Đánh giá khả năng kháng biofilm S. aureus của các phân đoạn O1.7 của phân đoạn n-hexan
• 3.1.3. Đánh giá khả năng kháng biofilm của đa nồng độ phân đoạn O1.7
• 3.2. Đánh giá khả năng kháng biofilm S. aureus của cao chiết nhục đậu khấu và các phân đoạn
• 3.2.1. Đánh giá khả năng kháng biofilm S. aureus của cao chiết nhục đậu khấu các phân đoạn EtOH, CH2Cl2, EtOAc, H2O
• 3.2.2. Đánh giá khả năng kháng biofilm S. aureus của các phân đoạn NĐK1.7 của phân đoạn CH2Cl2
• 3.2.3. Đánh giá khả năng kháng biofilm S. aureus của các phân đoạn NĐK2.5 của phân đoạn NĐK1.2
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Về việc đánh giá khả năng kháng biofilm S. aureus của cao chiết lá ổi và các phân đoạn
• 4.2. Về việc đánh giá khả năng kháng biofilm S. aureus của cao chiết nhục đậu khấu và các phân đoạn
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Khám phá Biofilm Staphylococcus aureus và thách thức

Staphylococcus aureus là một tác nhân gây bệnh hàng đầu, gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng từ nhẹ đến nghiêm trọng. Việc điều trị nhiễm trùng do S. aureus gặp nhiều khó khăn do khả năng kháng thuốc, các yếu tố độc lực và khả năng hình thành biofilm. Biofilm là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tồn tại dai dẳng của nhiễm trùng. Hầu hết các loại kháng sinh hiện nay đều có hiệu quả hạn chế trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng liên quan đến biofilm. Cần có những chiến lược mới như chế tạo bề mặt chống nhiễm trùng, tìm kiếm các hoạt chất mới có hoạt tính kháng biofilm. Các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên từ thực vật được xem là một lựa chọn thay thế quan trọng cho các kháng sinh truyền thống. Việc sử dụng các chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật, với đặc tính kháng khuẩn, chống biofilm là một phương pháp đầy hứa hẹn để chống lại nhiễm trùng do vi khuẩn. Một nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng cao chiết lá ổi và cao chiết nhục đậu khấu có tiềm năng kháng biofilm S. aureus. Do đó, nghiên cứu này tập trung vào lá ổi và nhục đậu khấu, với hy vọng tìm ra hoạt chất mới có hoạt tính kháng biofilm S. aureus từ thực vật.

1.1. Tổng quan về Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus), hay còn gọi là tụ cầu vàng, là một loại vi khuẩn Gram dương không di động. Vi khuẩn này có thể gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng khác nhau, từ nhiễm trùng da và mô mềm đến viêm nội tâm mạc nhiễm khuẩn và nhiễm khuẩn huyết. S. aureus được phân biệt với các loài tụ cầu khác dựa trên sắc tố vàng của khuẩn lạc và kết quả dương tính của các phép thử coagulase. Theo độ nhạy cảm với thuốc kháng sinh, S. aureus có thể được chia thành MSSA và MRSA.

1.2. Tổng quan về Biofilm

Biofilm được định nghĩa là một cộng đồng vi sinh vật (VSV) gồm các tế bào nằm trong chất nền các chất cao phân tử ngoại bào mà chúng đã tạo ra. Chất nền này được cấu tạo từ polysaccharid, ADN ngoại bào (eDNA) và protein. Sự hình thành biofilm của S. aureus có thể được chia thành ba giai đoạn chính: (1) gắn ban đầu, (2) tăng sinh tế bào và sản xuất chất nền ngoại bào, (3) tách tế bào và hình thành biofilm mới.

1.3. Vai trò của Biofilm trong thất bại điều trị

Biofilm không chỉ bảo vệ vi sinh vật (VSV) khỏi sự thay đổi pH, nhiệt độ, sự khan hiếm chất dinh dưỡng mà còn ngăn chặn sự tiếp cận của vi khuẩn trong biofilm khỏi tế bào miễn dịch của vật chủ và thuốc kháng sinh. VSV trong biofilm có thể chịu được nồng độ kháng sinh cao gấp 10-1000 lần so với tế bào ở dạng tự do. Sự kém đáp ứng với kháng sinh của vi khuẩn trong biofilm liên quan đến các yếu tố liên quan đến dược động học (PK) và và dược lực học (PD) của thuốc.

II. Lá ổi và Nhục đậu khấu Bí quyết kháng Biofilm

Các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên từ thực vật đã trở thành một lựa chọn thay thế quan trọng cho các kháng sinh truyền thống. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh tiềm năng của một số loại dược liệu trong việc chống lại sự hình thành biofilm. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá khả năng kháng biofilm của cao chiết lá ổi (Psidium guajava L.) và cao chiết nhục đậu khấu (Myristica fragrans Houtt.) đối với Staphylococcus aureus. Lá ổi và nhục đậu khấu được chọn vì kết quả sàng lọc cho thấy chúng có tiềm năng kháng biofilm S. aureus. Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá khả năng kháng biofilm S. aureus của cao chiết lá ổi và các phân đoạn, cũng như đánh giá khả năng kháng biofilm S. aureus của cao chiết nhục đậu khấu và các phân đoạn.

2.1. Lá ổi Psidium guajava L. Tổng quan và tác dụng

Lá ổi (Psidium guajava L.) là một loại dược liệu được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng lá ổi chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm hợp chất phenolic, flavonoid và tinh dầu. Các hợp chất này có khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa và chống viêm. Lá ổi cũng đã được chứng minh là có khả năng ức chế sự phát triển của một số loại vi khuẩn, bao gồm Staphylococcus aureus.

2.2. Nhục đậu khấu Myristica fragrans Houtt. Tổng quan và tác dụng

Nhục đậu khấu (Myristica fragrans Houtt.) là một loại gia vị và dược liệu có giá trị. Nhục đậu khấu chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm tinh dầu và các hợp chất phenolic. Các hợp chất này có khả năng kháng khuẩn, chống viêm và chống oxy hóa. Nhục đậu khấu cũng đã được chứng minh là có khả năng ức chế sự phát triển của một số loại vi khuẩn, bao gồm Staphylococcus aureus.

2.3. Các nghiên cứu về tác dụng kháng biofilm của dược liệu

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tác dụng kháng biofilm của các cao chiết dược liệu khác nhau đối với Staphylococcus aureus. Các nghiên cứu này đã sử dụng các phương pháp khác nhau để đánh giá khả năng kháng biofilm, bao gồm phương pháp nhuộm tinh thể tím và phương pháp đếm số lượng vi khuẩn trong biofilm. Kết quả của các nghiên cứu này cho thấy rằng một số cao chiết dược liệu có khả năng ức chế sự hình thành biofilm của S. aureus.

III. Phương pháp Chiết xuất và Đánh giá Kháng Biofilm S

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp chuẩn để chiết xuất các hợp chất từ lá ổi và nhục đậu khấu. Các phương pháp này bao gồm sử dụng các dung môi chiết xuất khác nhau để phân tách các hợp chất có hoạt tính sinh học. Sau khi chiết xuất, các cao chiết được đánh giá về khả năng kháng biofilm S. aureus bằng các phương pháp in vitro. Các phương pháp này bao gồm đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC), cũng như đánh giá khả năng ức chế sự hình thành biofilm.

3.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu

Việc chiết xuất dược liệu là một quá trình quan trọng để thu được các hợp chất có hoạt tính sinh học. Nghiên cứu này sử dụng các dung môi chiết xuất khác nhau, bao gồm ethanol, n-hexan, diclorometan, ethyl acetate và nước, để phân tách các hợp chất từ lá ổi và nhục đậu khấu. Quá trình chiết xuất được thực hiện theo quy trình chuẩn để đảm bảo thu được cao chiết có chất lượng tốt.

3.2. Đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán

Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch được sử dụng để đánh giá khả năng kháng khuẩn của các cao chiết đối với Staphylococcus aureus. Phương pháp này dựa trên việc đo đường kính vòng vô khuẩn hình thành xung quanh đĩa giấy tẩm cao chiết. Đường kính vòng vô khuẩn càng lớn, khả năng kháng khuẩn càng cao.

3.3. Phương pháp nuôi cấy và đánh giá hoạt tính kháng biofilm

Các phương pháp nuôi cấy và đánh giá hoạt tính kháng biofilm in vitro được sử dụng để đánh giá khả năng ức chế sự hình thành biofilm của S. aureus bởi các cao chiết. Các phương pháp này bao gồm đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC), cũng như đánh giá khả năng ức chế sự hình thành biofilm bằng phương pháp nhuộm tinh thể tím và phương pháp đếm số lượng vi khuẩn trong biofilm.

IV. Cao chiết lá ổi và nhục đậu khấu Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết lá ổi và cao chiết nhục đậu khấu có khả năng kháng biofilm Staphylococcus aureus in vitro. Các cao chiết này ức chế sự hình thành biofilm và giảm số lượng vi khuẩn trong biofilm. Phân tích sâu hơn cho thấy một số phân đoạn của cao chiết lá ổi và cao chiết nhục đậu khấu có hoạt tính kháng biofilm mạnh hơn so với cao chiết tổng. Các kết quả này cho thấy lá ổi và nhục đậu khấu có tiềm năng trở thành nguồn cung cấp các hợp chất kháng biofilm mới.

4.1. Khả năng kháng biofilm của cao chiết lá ổi và các phân đoạn

Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng biofilm S. aureus của cao chiết lá ổi và các phân đoạn EtOH, n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, H2O. Kết quả cho thấy các phân đoạn n-hexan từ lá ổi có khả năng kháng biofilm tốt. Đánh giá hoạt tính kháng biofilm của đa nồng độ phân đoạn O1 cho thấy phản ứng ức chế rõ rệt khi tăng nồng độ phân đoạn.

4.2. Khả năng kháng biofilm của cao chiết nhục đậu khấu và các phân đoạn

Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng biofilm S. aureus của cao chiết nhục đậu khấu và các phân đoạn EtOH, CH2Cl2, EtOAc, H2O. Kết quả cho thấy các phân đoạn CH2Cl2 từ nhục đậu khấu có khả năng kháng biofilm tốt. Đánh giá hoạt tính kháng biofilm của các phân đoạn NĐK1.7 và NĐK2.5 cho thấy có tác dụng ức chế.

4.3. So sánh hiệu quả kháng biofilm giữa lá ổi và nhục đậu khấu

Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng cả lá ổi và nhục đậu khấu đều có khả năng kháng biofilm S. aureus. Tuy nhiên, hiệu quả kháng biofilm có thể khác nhau tùy thuộc vào phương pháp chiết xuất, dung môi chiết xuất và các phân đoạn được sử dụng. Cần có thêm nghiên cứu để so sánh trực tiếp hiệu quả kháng biofilm của lá ổi và nhục đậu khấu và xác định các hợp chất hoạt tính sinh học chính.

V. Hướng dẫn Ứng dụng Cao chiết lá ổi và nhục đậu khấu

Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng lá ổi và nhục đậu khấu như một nguồn cung cấp các hợp chất kháng biofilm mới. Các hợp chất này có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm mới để điều trị và phòng ngừa nhiễm trùng Staphylococcus aureus, đặc biệt là các nhiễm trùng liên quan đến biofilm. Tuy nhiên, cần có thêm nghiên cứu để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của các hợp chất này trong các thử nghiệm lâm sàng.

5.1. Tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm

Cao chiết lá ổi và cao chiết nhục đậu khấu có tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm để điều trị các bệnh nhiễm trùng do Staphylococcus aureus. Các hợp chất kháng biofilm từ lá ổi và nhục đậu khấu có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới để điều trị các nhiễm trùng da, nhiễm trùng vết thương và các nhiễm trùng khác do S. aureus.

5.2. Ứng dụng trong sản phẩm tự nhiên và vệ sinh cá nhân

Cao chiết lá ổi và cao chiết nhục đậu khấu có thể được sử dụng trong các sản phẩm tự nhiên và vệ sinh cá nhân, chẳng hạn như kem đánh răng, nước súc miệng và xà phòng, để giúp ngăn ngừa sự hình thành biofilm và giảm nguy cơ nhiễm trùng. Các sản phẩm này có thể giúp cải thiện sức khỏe răng miệng và da.

5.3. Nghiên cứu sâu hơn về độc tính tế bào và an toàn sinh học

Cần có thêm nghiên cứu để đánh giá độc tính tế bào và an toàn sinh học của cao chiết lá ổi và cao chiết nhục đậu khấu. Các nghiên cứu này sẽ giúp xác định liệu các hợp chất này có an toàn để sử dụng trong các sản phẩm dược phẩm và sản phẩm tự nhiên hay không.

VI. Kết luận Kháng Biofilm từ Lá ổi và Nhục đậu khấu

Nghiên cứu này đã chứng minh khả năng kháng biofilm Staphylococcus aureus của cao chiết lá ổi và cao chiết nhục đậu khấu in vitro. Các kết quả này cho thấy lá ổi và nhục đậu khấu có tiềm năng trở thành nguồn cung cấp các hợp chất kháng biofilm mới. Cần có thêm nghiên cứu để xác định các hợp chất hoạt tính sinh học chính và đánh giá tính an toàn và hiệu quả của các hợp chất này trong các thử nghiệm lâm sàng. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng biofilm của các hợp chất này cũng rất quan trọng để phát triển các chiến lược điều trị hiệu quả hơn.

6.1. Tóm tắt các kết quả chính

Nghiên cứu đã chứng minh rằng cao chiết lá ổi và cao chiết nhục đậu khấu có khả năng kháng biofilm Staphylococcus aureus in vitro. Các cao chiết này ức chế sự hình thành biofilm và giảm số lượng vi khuẩn trong biofilm.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc xác định các hợp chất hoạt tính sinh học chính trong cao chiết lá ổi và cao chiết nhục đậu khấu, cũng như đánh giá tính an toàn và hiệu quả của các hợp chất này trong các thử nghiệm lâm sàng. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng biofilm của các hợp chất này cũng rất quan trọng.

6.3. Tiềm năng phát triển các kháng sinh tự nhiên mới

Lá ổi và nhục đậu khấu có tiềm năng trở thành nguồn cung cấp các kháng sinh tự nhiên mới để điều trị nhiễm trùng Staphylococcus aureus. Nghiên cứu sâu hơn về các hợp chất kháng biofilm từ lá ổi và nhục đậu khấu có thể dẫn đến sự phát triển của các phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho các nhiễm trùng liên quan đến biofilm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhiễm khuẩn do Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng), đặc biệt là các chủng kháng methicillin (MRSA), đang là thách thức y tế hàng đầu đối với các cơ sở điều trị trên toàn thế giới. Theo thống kê vi sinh học, vi khuẩn khi hình thành màng sinh học (biofilm) có khả năng đề kháng với kháng sinh cao gấp 10 đến 1000 lần so với dạng tế bào tự do, dẫn đến thất bại trong khoảng 65% ca nhiễm trùng mạn tính và hơn 80% trường hợp nhiễm trùng liên quan đến thiết bị cấy ghép y tế. Trước tình trạng kháng thuốc gia tăng và sự khan hiếm của các nhóm kháng sinh mới, việc khai thác các chất chuyển hóa thứ cấp từ nguồn dược liệu tự nhiên mở ra hướng tiếp cận giàu tiềm năng.

Luận văn thạc sĩ Dược học chuyên ngành Hóa sinh Dược của học viên Trần Thị Minh Thu (Trường Đại học Dược Hà Nội, bảo vệ năm 2024), thuộc khuôn khổ đề tài được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) mã số 108, tập trung giải quyết trực tiếp vấn đề này. Đề tài hướng tới hai mục tiêu cụ thể: đánh giá khả năng kháng biofilm Staphylococcus aureus của cao chiết lá ổi (Psidium guajava L.) và cao chiết hạt nhục đậu khấu (Myristica fragrans Houtt.) cùng các phân đoạn chiết xuất theo định hướng hoạt tính dẫn đường. Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm tại Hà Nội trên chủng chuẩn Staphylococcus aureus ATCC 33591, sử dụng nguồn lá ổi thu hái chuẩn hóa tại Thái Bình và hạt nhục đậu khấu đạt tiêu chuẩn Dược điển. Kết quả nghiên cứu xác định được các phân đoạn hoạt tính có khả năng làm giảm mật độ vi khuẩn sống trong màng sinh học tới 2,11 log10 CFU/mL và hạ nồng độ hiệu quả trung bình EC50 xuống còn 36,9 mg/L khi phối hợp cùng kháng sinh moxifloxacin.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết động học phát triển ba giai đoạn của biofilm vi khuẩn: bám dính ban đầu trên bề mặt sinh học hoặc nhân tạo; tăng sinh tế bào gắn liền với sự bài tiết chất nền ngoại bào gồm polysaccharide liên bào (PNAG/PIA) do operon icaADBC điều hòa cùng DNA ngoại bào (eDNA) và protein; cuối cùng là phân tán tế bào vi khuẩn để tái lập ổ nhiễm khuẩn mới.

Bên cạnh đó, đề tài áp dụng mô hình dược động học và dược lực học (PK/PD) giải thích cơ chế thất bại trong điều trị nhiễm khuẩn màng sinh học. Mô hình này làm rõ sự suy giảm khuếch tán thuốc qua cấu trúc chất nền, tương tác bắt giữ thuốc của DNA ngoại bào và sự chuyển đổi sang kiểu hình tế bào dai dẳng (persister cells) có khả năng dung nạp kháng sinh cao mà không làm thay đổi nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Ba khái niệm trung tâm được vận dụng xuyên suốt gồm: tổng sinh khối màng sinh học, mức độ chuyển hóa của vi khuẩn sống và hiệu lực diệt khuẩn tối đa (Emax) trong môi trường màng bảo vệ.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dược liệu lá ổi bánh tẻ được thu hái từ cây trên 5 năm tuổi tại xã Đông Hải, huyện Quỳnh Phụ, tỉnh Thái Bình vào khung giờ từ 7 đến 9 giờ sáng trong tháng 9 và tháng 10, đảm bảo không sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trong vòng 1 năm trước khi thu mẫu. Hạt nhục đậu khấu nhập khẩu chính ngạch đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn kiểm nghiệm của Dược điển Trung Quốc 2015. Chủng vi khuẩn sử dụng là chủng chuẩn Staphylococcus aureus ATCC 33591 được cung cấp bởi Đại học Công giáo Louvain (Vương quốc Bỉ) và lưu trữ bảo quản ở âm 80 độ C. Nhằm đảm bảo độ tin cậy và tính lặp lại thống kê, mỗi thí nghiệm đều được thiết kế lặp lại tối thiểu 3 lần độc lập.

Quy trình chiết xuất sử dụng phương pháp ngâm nóng với ethanol 96%, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu cao tổng, sau đó chiết phân bố lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexan, diclomethan (CH2Cl2), ethyl acetat (EtOAc) và nước (H2O). Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá thông qua đường kính vòng vô khuẩn trên môi trường thạch Tryptic Soy Agar (TSA) với mật độ vi khuẩn 1,5 nhân 10 mũ 6 CFU/mL. Hoạt tính kháng biofilm 24 giờ được thử nghiệm trên đĩa 96 giếng ở nồng độ chất thử 100 mg/L dưới 3 điều kiện: dùng đơn độc, phối hợp moxifloxacin 1,5 mg/L và phối hợp vancomycin 20 mg/L. Các chỉ tiêu biofilm được định lượng đồng thời bằng phương pháp nhuộm tím tinh thể (Crystal Violet) đo hấp thụ ở bước sóng 570 nm, đo huỳnh quang chuyển hóa resazurin thành resorufin ở bước sóng kích thích/phát xạ 560/590 nm và cấy đếm trực tiếp số lượng khuẩn lạc sống (log10 CFU/mL). Dữ liệu được xử lý thống kê bằng One-way ANOVA và T-test trên phần mềm GraphPad Prism với ngưỡng tin cậy p dưới 0,05.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Sàng lọc sơ bộ các phân đoạn chiết xuất lớn cho thấy phân đoạn n-hexan từ lá ổi và phân đoạn diclomethan từ nhục đậu khấu thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và kháng biofilm vượt trội nhất:

• Đối với lá ổi: Phân đoạn n-hexan ở nồng độ 100 mg/L làm giảm 40,2% mức chuyển hóa huỳnh quang ở dạng đơn, giảm 64,1% khi kết hợp moxifloxacin và giảm 50,4% khi kết hợp vancomycin. Về mật độ vi khuẩn sống, phân đoạn n-hexan tiêu diệt 0,62 log10 CFU/mL khi dùng đơn và đạt mức giảm 1,06 log10 CFU/mL khi phối hợp cùng moxifloxacin so với mẫu chứng có mật độ 8,50 log10 CFU/mL.
• Phân đoạn nhỏ từ lá ổi: Tiếp tục phân tách phân đoạn n-hexan thành 7 phân đoạn nhỏ, phân đoạn O1.7 thể hiện hoạt tính mạnh nhất. Ở dạng đơn, phân đoạn O1.7 làm giảm 0,98 log10 CFU/mL; khi kết hợp với moxifloxacin 1,5 mg/L, lượng vi khuẩn sống giảm mạnh tới 2,11 log10 CFU/mL (tương đương tiêu diệt hơn 99% vi khuẩn trong màng sinh học).
• Động học đa nồng độ của phân đoạn O1.7: Thử nghiệm ở 7 dải nồng độ từ 1 đến 1000 mg/L xác định hiệu lực diệt khuẩn tối đa Emax của O1.7 đạt mức giảm 2,940 log10 CFU/mL dạng đơn và giảm 3,155 log10 CFU/mL dạng kết hợp kháng sinh (tương đương tiêu diệt 99,9% tế bào vi khuẩn). Phối hợp moxifloxacin giúp kéo nồng độ EC50 giảm mạnh từ 95,7 mg/L xuống còn 36,9 mg/L.
• Đối với nhục đậu khấu: Phân đoạn diclomethan tạo đường kính vòng vô khuẩn 10,3 mm tại nồng độ 10 mg/mL, làm giảm 40,0% chuyển hóa vi khuẩn ở dạng đơn và giảm 58,8% khi kết hợp vancomycin 20 mg/L. Lượng vi khuẩn sống giảm 0,75 log10 CFU/mL dạng đơn và giảm 1,32 log10 CFU/mL khi kết hợp vancomycin so với đối chứng 8,19 log10 CFU/mL. Phân đoạn nhỏ NĐK1.6 đạt đường kính kháng khuẩn 11,7 mm tại nồng độ 10 mg/mL.

Thảo luận kết quả

Dữ liệu thực nghiệm chỉ ra một quy luật quan trọng: cả cao chiết lá ổi và nhục đậu khấu đều không làm biến đổi đáng kể tổng sinh khối chất nền ngoại bào đo qua phương pháp nhuộm tím tinh thể, nhưng lại ức chế hô hấp và tiêu diệt trực tiếp các tế bào vi khuẩn sống nằm sâu bên trong màng. Điều này chứng minh các hợp chất kém phân cực trong phân đoạn n-hexan lá ổi và diclomethan nhục đậu khấu có khả năng thẩm thấu qua chất nền bảo vệ để tác động lên tế bào vi khuẩn mà không cần phải hòa tan toàn bộ cấu trúc polysaccharide ngoại bào.

Hiệu quả hiệp đồng nổi bật giữa phân đoạn O1.7 với kháng sinh fluoroquinolon (moxifloxacin) được giải thích bởi sự hiện diện của các acid triterpenic như acid oleanolic trong lá ổi, giúp làm tăng tính thấm màng tế bào vi khuẩn, tạo điều kiện thuận lợi cho moxifloxacin thâm nhập nội bào ức chế enzyme DNA gyrase. Trong các báo cáo khoa học, dữ liệu này có thể được mô tả trực quan thông qua đồ thị đường cong nồng độ - đáp ứng dạng sigmoid biểu diễn sự suy giảm mật độ vi khuẩn theo logarit nồng độ và bảng so sánh ma trận tỷ lệ huỳnh quang resorufin, làm nổi bật tính ưu việt của liệu pháp phối hợp.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết luận thực nghiệm, nghiên cứu đề xuất 4 nhóm giải pháp cụ thể:

1. Tinh sạch và nhận dạng hoạt chất đích: Thực hiện phân lập hoạt chất tinh khiết từ phân đoạn O1.7 của lá ổi và phân đoạn diclomethan của nhục đậu khấu bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC-MS/NMR). Đặt chỉ tiêu xác định rõ cấu trúc hóa học và tối ưu nồng độ ức chế tối thiểu MIC xuống dưới 10 mg/L trong khung thời gian từ 6 đến 12 tháng, do nhóm nghiên cứu Hóa sinh Dược phối hợp cùng các viện nghiên cứu chuyên ngành thực hiện.
2. Bào chế hệ dẫn thuốc tại chỗ: Ứng dụng công nghệ nano lipid hoặc hydrogel polyme sinh học nhằm mang phân đoạn O1.7 dùng cho các vết thương mạn tính và loét bàn chân đái tháo đường. Đặt mục tiêu duy trì giải phóng dược chất kéo dài từ 24 đến 48 giờ và đạt tỷ lệ diệt vi khuẩn biofilm tại chỗ trên 99,5%, triển khai thực hiện trong vòng 12 đến 18 tháng tại các trung tâm nghiên cứu và phát triển dược phẩm.
3. Tiến hành đánh giá tiền lâm sàng in vivo: Thử nghiệm hiệu quả phá hủy màng sinh học và độc tính bán trường diễn trên mô hình nhiễm trùng ống thông catheter cấy ghép ở chuột hoặc thỏ. Đích đến là làm giảm tối thiểu 2 log10 CFU mật độ vi khuẩn trên bề mặt vật liệu sau 7 ngày điều trị, hoàn thành trong thời gian từ 18 đến 24 tháng bởi các phòng thí nghiệm dược lý thực nghiệm.
4. Chuẩn hóa tiêu chuẩn nguyên liệu đầu vào: Xây dựng quy trình thu hái lá ổi tại Thái Bình theo thực hành tốt trồng trọt và thu hái (GACP) và tiêu chuẩn hóa nguyên liệu hạt nhục đậu khấu theo Dược điển, đảm bảo hàm lượng hoạt chất kháng màng sinh học ổn định trong sản xuất công nghiệp trong vòng 6 tháng tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang lại giá trị tham khảo chuyên môn sâu sắc cho 4 nhóm đối tượng:

• Các nhà nghiên cứu và học viên sau đại học chuyên ngành Dược học, Hóa sinh và Vi sinh y học: Tiếp cận phương pháp luận chuẩn xác về chiết xuất phân đoạn dẫn đường hoạt tính sinh học, cùng kỹ thuật đánh giá kép đồng thời giữa chuyển hóa resazurin và cấy đếm khuẩn lạc sống trên vi đĩa 96 giếng.
• Bác sĩ chuyên khoa truyền nhiễm và dược sĩ lâm sàng: Thu nhận thêm cơ sở khoa học thực nghiệm về chiến lược phối hợp hiệp đồng giữa các kháng sinh kinh điển như moxifloxacin, vancomycin với các hợp chất thiên nhiên để cải thiện hiệu quả điều trị nhiễm trùng tụ cầu dai dẳng.
• Chuyên gia nghiên cứu và phát triển sản phẩm tại các doanh nghiệp dược phẩm: Khai thác tiềm năng của cao chiết n-hexan lá ổi và diclomethan nhục đậu khấu để phát triển các dạng thuốc xịt, kem bôi da, nước súc miệng hoặc băng gạc sinh học phòng chống nhiễm trùng màng sinh học.
• Các nhà quản lý y tế và cơ quan hoạch định chính sách: Có thêm dữ liệu khoa học tin cậy để định hướng các chương trình khai thác nguồn dược liệu tự nhiên trong nước phục vụ chiến lược quốc gia về phòng chống kháng thuốc kháng sinh.

Câu hỏi thường gặp

Vì sao Staphylococcus aureus trong màng sinh học có thể kháng kháng sinh gấp 10 đến 1000 lần so với vi khuẩn tự do? Vi khuẩn trong biofilm được bao bọc bởi lớp chất nền ngoại bào chứa polysaccharide liên bào (PNAG), DNA ngoại bào và protein, ngăn cản sự khuếch tán của thuốc. Bên cạnh đó, môi trường yếm khí và thiếu dinh dưỡng bên trong màng thúc đẩy vi khuẩn chuyển sang kiểu hình tế bào dai dẳng với hoạt động trao đổi chất suy giảm, vô hiệu hóa cơ chế tác động của kháng sinh.

Phân đoạn chiết xuất nào của lá ổi thể hiện hoạt tính tiêu diệt vi khuẩn trong màng sinh học mạnh nhất? Phân đoạn n-hexan và phân đoạn nhỏ O1.7 cho hiệu quả cao nhất. Tại nồng độ 100 mg/L, phân đoạn O1.7 khi kết hợp với moxifloxacin 1,5 mg/L làm giảm 2,11 log10 CFU/mL mật độ vi khuẩn, đạt hiệu lực diệt khuẩn tối đa Emax lên đến mức giảm 3,155 log10 CFU/mL (tương đương tiêu diệt 99,9% tế bào Staphylococcus aureus trong màng sinh học).

Vì sao cao chiết dược liệu tiêu diệt vi khuẩn sống nhưng không làm giảm tổng sinh khối biofilm khi đo bằng tím tinh thể? Thuốc nhuộm tím tinh thể bắt màu không chọn lọc trên cả tế bào sống, tế bào chết và toàn bộ khung chất nền ngoại bào. Cao chiết lá ổi và nhục đậu khấu tác động trực tiếp gây tổn thương màng và ức chế chuyển hóa nội bào của vi khuẩn sống chứ không chứa các enzyme ly giải khung polysaccharide hay phân cắt DNA ngoại bào.

Hiệu quả hiệp đồng giữa phân đoạn O1.7 của lá ổi và kháng sinh moxifloxacin có ý nghĩa gì? Sự phối hợp này giúp hạ nồng độ hiệu quả trung bình EC50 của phân đoạn O1.7 từ 95,7 mg/L xuống 36,9 mg/L (giảm hơn 61%). Điều này cho phép giảm liều dùng của cả kháng sinh và dược liệu, nâng cao hiệu quả diệt khuẩn trên 99%, đồng thời hạn chế tối đa nguy cơ chọn lọc chủng vi khuẩn đột biến kháng thuốc.

Tiềm năng ứng dụng điều trị của cao chiết hạt nhục đậu khấu được ghi nhận như thế nào? Phân đoạn diclomethan của nhục đậu khấu làm giảm 58,8% mức chuyển hóa huỳnh quang và tiêu diệt 1,32 log10 CFU/mL vi khuẩn sống khi phối hợp cùng vancomycin 20 mg/L. Đây là cơ sở thực nghiệm quan trọng để nghiên cứu các phác đồ phối hợp mới nhằm hỗ trợ điều trị các chủng tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) giảm nhạy cảm với glycopeptid.

Kết luận

• Luận văn đã chứng minh phân đoạn n-hexan từ lá ổi và phân đoạn diclomethan từ hạt nhục đậu khấu sở hữu hoạt tính kháng màng sinh học Staphylococcus aureus mạnh nhất trong các phân đoạn chiết xuất.
• Phân lập thành công phân đoạn nhỏ O1.7 từ lá ổi với hiệu lực tiêu diệt vi khuẩn tối đa Emax đạt mức giảm 3,155 log10 CFU/mL khi phối hợp cùng kháng sinh moxifloxacin.
• Khẳng định phối hợp giữa cao chiết dược liệu và kháng sinh chuẩn (moxifloxacin, vancomycin) giúp hạ thấp nồng độ hiệu quả EC50 hơn 61% và tăng cường vượt trội khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn sống trong màng sinh học.
• Xác định cơ chế tác động cốt lõi là ức chế chuyển hóa tế bào và tiêu diệt trực tiếp vi khuẩn sống mà không làm thay đổi tổng sinh khối khung chất nền ngoại bào.
• Đóng góp luận cứ khoa học thực nghiệm quan trọng, mở ra lộ trình từ 12 đến 24 tháng tới để tinh sạch hoạt chất và phát triển các chế phẩm y tế điều trị nhiễm trùng mạn tính từ nguồn dược liệu Việt Nam.

Các đơn vị nghiên cứu, cơ sở đào tạo và doanh nghiệp dược phẩm quan tâm đến việc nhận chuyển giao quy trình chiết xuất và cùng phát triển thử nghiệm tiền lâm sàng có thể liên hệ trực tiếp với nhóm tác giả tại Trường Đại học Dược Hà Nội để cùng mở rộng các hợp tác chuyên sâu!

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Staphylococcus aureus (S. aureus) hay tụ cầu vàng, là một trong những tác nhân hàng đầu gây ra các bệnh nhiễm khuẩn từ đơn giản đến phức tạp [1]. Điều trị nhiễm khuẩn do S. aureus gặp rất nhiều khó khăn, không chỉ do sự đa dạng của các yếu tố độc lực, vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh, mà còn do khả năng bám dính, hình thành biofilm trên các bề mặt khác nhau của vi khuẩn [2].

Khả năng hình thành biofilm là yếu tố quan trọng quyết định sự tồn tại dai dẳng của nhiễm trùng S. Hầu hết các loại kháng sinh cho thấy hiệu quả hạn chế trong điều trị các bệnh nhiễm trùng liên quan đến biofilm. Các chiến lược mới như chế tạo bề mặt chống nhiễm trùng, tìm ra các hoạt chất mới có hoạt tính kháng biofilm mang lại nhiều tiềm năng trong việc điều trị nhiễm trùng liên quan đến biofilm [4]. Các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên từ thực vật đã trở thành lựa chọn thay thế quan trọng cho các kháng sinh truyền thống.

Sử dụng các chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật, với đặc tính kháng khuẩn, chống biofilm là phương pháp đầy hứa hẹn để chống lại nhiễm trùng do vi khuẩn [5]. Kết quả sàng lọc của nhóm nghiên cứu cho thấy cao chiết lá ổi và cao chiết nhục đậu khấu có tiềm năng kháng biofilm S. Do đó, đề tài lựa chọn lá ổi và nhục đậu khấu làm đối tượng nghiên cứu, với mong muốn tạo tiền đề cho việc tìm ra hoạt chất mới có hoạt tính kháng biofilm S. aureus có nguồn gốc từ thực vật.

Chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá khả năng kháng biofilm Staphylococcus aureus của cao chiết lá ổi (Psidium guajava L.) và cao chiết nhục đậu khấu (Myristica fragrans Houtt.)” với 2 mục tiêu: 1. Đánh giá khả năng kháng biofilm S. aureus của cao chiết lá ổi (Psidium guajava L.) và các phân đoạn. Đánh giá khả năng kháng biofilm S.

aureus của cao chiết nhục đậu khấu (Myristica fragrans Houtt.) và các phân đoạn. Trong đó các phân đoạn được lựa chọn để chiết xuất dựa trên cơ sở hoạt tính dẫn đường. Tổng quan về biofilm của Staphylococcus aureus 1. Tổng quan về Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus được xác định lần đầu tiên vào năm 1884 bởi Anton Rosenbach [7, 8].

Theo Từ khóa phân loại Bergey (2001), S. aureus được xếp vào: Giới: Procaryotae; Ngành: Firmicutes; Lớp: Firmibacteria; Họ: Microccocaceae; Chi: Staphylococcus; Loài: Staphylococcus aureus [9].1 Hình ảnh vi khuẩn Staphylococcus aureus Trái: hình ảnh trên kính hiển vi; Phải: hình ảnh trên kính hiển vi điện tử S. aureus là vi khuẩn Gram dương không di động, được đặc trưng bởi các cầu khuẩn riêng lẻ có đường kính từ 0,5 đến 1,5 µm, là vi khuẩn kỵ khí đa dạng [9]. Tụ cầu vàng phát triển tối ưu ở 37°C và pH7,4 [10].

aureus có thể chịu được nhiệt độ cao tới 60ºC trong vòng 30 phút [11]. aureus được phân biệt với các loài tụ cầu khác trên cơ sở sắc tố vàng của khuẩn lạc, kết quả dương tính của các phép thử coagulase, lên men đường mannitol và deoxyribonuclease [12]. Tụ cầu vàng là một trong những mầm bệnh chính gây nhiễm trùng bệnh viện và cộng đồng. aureus có thể gây ra nhiều bệnh như nhiễm trùng da và mô mềm, viêm nội tâm mạc nhiễm khuẩn, viêm tủy xương, viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết,.

[10] 2 Theo độ nhạy cảm với thuốc kháng sinh, S. aureus có thể được chia thành Staphylococcus aureus nhạy cảm với methicillin (MSSA) và Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA). Tính kháng này được tạo ra bởi một gen mã hóa protein gắn với penicillin 2a hoặc 2′ (PBP2a hoặc PBP2′) (mecA) được tích hợp vào thành phần nhiễm sắc thể của S. aureus nhạy cảm với methicillin.