Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sự gia tăng tình trạng kháng đa thuốc trên phạm vi toàn cầu trong các bệnh lý nhiễm trùng liên quan đến chăm sóc y tế và cộng đồng đang đặt ra thách thức lớn đối với hiệu quả điều trị của các phác đồ kháng sinh thông thường. Bên cạnh việc suy giảm hoạt lực diệt khuẩn, việc sử dụng thuốc kháng sinh tổng hợp hóa học còn đi kèm các tác dụng phụ bất lợi, trong đó có việc thúc đẩy sản sinh các gốc oxy tự do (ROS). Các gốc oxy phản ứng này gây mất cân bằng oxy hóa (stress oxy hóa), dẫn đến tổn thương cấu trúc lipid màng, protein và acid nucleic của tế bào, kích hoạt phản ứng viêm và các bệnh lý mạn tính. Trong bối cảnh đó, hướng nghiên cứu khai thác các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật được đẩy mạnh nhờ ưu thế về tính an toàn, ít tác dụng phụ và cơ chế tác động đa đích lên tế bào vi sinh vật, hạn chế nguy cơ hình thành chủng đề kháng.

Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học của sinh viên Đào Thị Huyền Trang (Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, 2023) được thực hiện nhằm cung cấp dữ liệu khoa học về hoạt tính sinh học của các cây thuốc dân gian Việt Nam. Đề tài xác định 02 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Sàng lọc tác dụng kháng khuẩn của một số dược liệu Việt Nam.
  2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của một số dược liệu Việt Nam bằng phương pháp thử DPPH.
  • Đối tượng nghiên cứu: 05 loài dược liệu gồm Rau má (Centella asiatica Urban), Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb), thân rễ Cam thảo (Glycyrrhiza glabra L. / Glycyrrhiza uralensis), Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) và lá Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata). Đối tượng vi sinh vật thử nghiệm gồm 02 chủng vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis) và 01 chủng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli).
  • Phạm vi nghiên cứu: Các mẫu dược liệu được thu hái tại các địa phương như Tiền Giang, Thanh Hóa, Nghệ An, Vĩnh Phúc và được giám định thực vật học bởi Bộ môn Dược liệu & Dược cổ truyền – Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN. Các chủng vi khuẩn kiểm định được cung cấp bởi Trường Đại học Phenikaa. Nghiên cứu tập trung đánh giá hoạt tính sinh học in vitro của dạng cao chiết toàn phần ethanol 70% trong năm 2023 tại Hà Nội.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và hoạt chất tự nhiên

Khóa luận hệ thống hóa cơ sở lý thuyết về cấu trúc hình thái vi khuẩn, phân loại thành tế bào vi khuẩn Gram dương (lớp peptidoglycan dày, chứa acid teichoic/lipoteichoic) và vi khuẩn Gram âm (lớp peptidoglycan mỏng, màng ngoài giàu lipid). Nghiên cứu định nghĩa hai thông số vi sinh học cơ bản: nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC).

Về mặt hóa học thực vật, khóa luận điểm luận các nhóm hoạt chất chính có hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa:

  • Alkaloid: Hợp chất hữu cơ chứa nitơ dị vòng, có dược lực tính mạnh, tác động lên màng và chuyển hóa vi khuẩn.
  • Coumarin: Dẫn xuất lacton của acid ortho-hydroxy cinnamic, có khả năng tạo phức không thuận nghịch với acid amin ái nhân, làm bất hoạt protein vi khuẩn.
  • Flavonoid: Các hợp chất polyphenolic có khả năng tạo phức với protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn, ức chế sinh tổng hợp prostaglandin và đóng vai trò như chất bẫy gốc tự do.
  • Saponin và Tanin: Có khả năng tạo phức với protein màng hoặc làm thay đổi tính thấm màng tế bào.

Về lý thuyết chống oxy hóa, đề tài làm rõ cơ chế stress oxy hóa do các gốc tự do (chứa electron chưa ghép đôi) gây ra và vai trò của các hệ thống chống oxy hóa nội sinh (enzyme SOD, Catalase, Glutathione) cùng các chất chống oxy hóa ngoại sinh tự nhiên từ thực vật.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Quy trình chiết xuất cao dược liệu: 500 g bột thô khô của từng loại dược liệu được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol 70% ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ, lặp lại 3 lần. Dịch chiết gộp lại được lọc qua giấy lọc và loại dung môi bằng máy cô quay chân không để thu được cao chiết toàn phần.
  • Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Sử dụng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (agar well diffusion assay). Chủng vi khuẩn (S. aureus, S. epidermidis, E. coli) được nuôi lắc 18 giờ trong môi trường TSB (Tryptic Soy Broth, pH 7,1) ở 37°C, pha loãng về mật độ quang $\text{OD}_{600} = 1$, sau đó phối trộn 5% dịch vi khuẩn vào môi trường TSB agar. Mẫu cao chiết được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO) ở 4 nồng độ thử nghiệm: 50, 100, 200 và 500 mg/mL. Nhỏ 50 µL dung dịch mẫu vào các giếng thạch (đường kính $\varnothing = 8\text{ mm}$), giữ đĩa ở 4°C trong 4 giờ để mẫu khuếch tán trước khi ủ ấm ở 37°C (theo dõi sau 24 và 48 giờ). Hoạt tính được biểu thị qua đường kính vòng vô khuẩn (mm).
  • Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa: Sử dụng phương pháp quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). Nguyên lý dựa trên sự khử màu tím của DPPH (hấp thụ cực đại tại 517 nm) sang màu vàng khi nhận electron hoặc hydro từ chất chống oxy hóa. Chuẩn bị dung dịch DPPH 2,19 mg/50 mL methanol. Phối trộn 20 µL mẫu thử (hoặc chất chuẩn Quercetin ở các nồng độ 0,5–10 µg/mL) với 180 µL dung dịch DPPH trong giếng, ủ tối 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó đo độ hấp thụ quang (OD) tại bước sóng 517 nm trên máy quang phổ miễn dịch Epoch 2C. Phần trăm ức chế ($I%$) được tính theo công thức chuẩn và giá trị $\text{IC}_{50}$ được xác định bằng phương trình hồi quy.
  • Phương pháp xử lý số liệu: Dữ liệu thực nghiệm được xử lý bằng Microsoft Excel 2016 và GraphPad Prism 9, biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình $\pm$ độ lệch chuẩn ($X \pm \text{SD}$).

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan về tính kháng khuẩn và một số vi khuẩn

Chương I trình bày cơ sở lý luận về đặc tính sinh học của 3 chủng vi sinh vật kiểm định: Staphylococcus aureus (cầu khuẩn Gram dương, kích thước 0,8–1 µm, tụ chùm, gây nhiễm trùng da và đường hô hấp), Staphylococcus epidermidis (cầu khuẩn Gram dương cộng sinh trên da, tác nhân chính gây nhiễm trùng bệnh viện qua thiết bị y tế cấy ghép), và Escherichia coli (trực khuẩn Gram âm, có lông, di động, thường ký sinh đường ruột và gây nhiễm trùng tiết niệu, tiêu hóa, huyết). Chương này phân tích các phương pháp thử nghiệm kháng sinh in vitro (khuếch tán đĩa thạch, Etest, TLC-bioautography, pha loãng) và cơ chế dập tắt gốc tự do. Đồng thời, tác giả tổng thuật các công trình nghiên cứu trước đây về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 5 cây thuốc: hoạt chất andrographolide trong Xuyên tâm liên, sodium houttuyfonate (SH) trong Diếp cá, acid 18β-glycyrrhetinic (GRA) và các dẫn xuất phenylflavonoid (dehydroglyasperin C, D, isoangustone A) trong Cam thảo, tinh dầu giàu 1,8-cineole và β-thujone trong Ngải cứu, cùng các triterpenoid saponin (asiaticosid, madecassosid, acid asiatic) trong Rau má.

Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu thực vật, chủng vi sinh vật và hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích (DPPH từ Nhật Bản, Quercetin, DMSO, methanol, ethanol). Trang thiết bị sử dụng bao gồm máy quang phổ Epoch 2C, cân phân tích Sartorius QUINTIX224-1S, máy đo hàm ẩm Ohaus MB 45, máy siêu âm Elmasonic S100H, màng lọc cellulose acetat 0,2 µm. Nội dung quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa thành 2 quy trình độc lập: quy trình thử nghiệm đục lỗ thạch xác định vòng kháng khuẩn (ký hiệu các mẫu cao chiết từ M1 đến M5) và quy trình đo quang phổ microplate 96 giếng để định lượng khả năng dập tắt gốc tự do DPPH với đối chứng dương Quercetin.

Chương III: Kết quả nghiên cứu

Chương III công bố các dữ liệu thực nghiệm định lượng thu được:

  1. Kết quả kháng khuẩn: Đường kính vòng ức chế của 5 mẫu cao chiết biến thiên tùy thuộc vào nồng độ và chủng vi khuẩn. Đối chứng âm DMSO không thể hiện vòng vô khuẩn ($0\text{ mm}$).
  2. Kết quả chống oxy hóa: Giá trị phần trăm ức chế gốc tự do DPPH tăng dần theo nồng độ khảo sát (3–100 µg/mL). Giá trị $\text{IC}{50}$ của 5 mẫu cao chiết dao động trong khoảng từ $13,889 \pm 0,087\text{ µg/mL}$ đến $130,298 \pm 1,075\text{ µg/mL}$. Mẫu chuẩn dương Quercetin đạt giá trị $\text{IC}{50} = 3,163 \pm 0,067\text{ µg/mL}$.

Chương IV: Bàn luận

Chương IV tập trung phân tích và so sánh kết quả thực nghiệm với các công bố quốc tế:

  • Đối với S. aureus, cao chiết Cam thảo thể hiện hoạt tính ức chế mạnh nhất (19 mm ở 500 mg/mL). Tác giả dẫn chứng nghiên cứu của Long DR và cộng sự (2013) giải thích vai trò của acid 18β-glycyrrhetinic (GRA) trong việc làm giảm kích thước tổn thương và ức chế các yếu tố độc lực tụ cầu khuẩn như gen hla và saeRS.
  • Đối với S. epidermidis, chỉ có Diếp cá và Rau má cho tác dụng; Diếp cá có hiệu lực ở cả 4 nồng độ. Kết quả này được đối chiếu với nghiên cứu của Laldinsangi C và cộng sự (2022) về natri houttuyfonate (SH) trong việc điều hòa hệ thống cảm ứng mật độ (quorum sensing), làm tăng phiên mã luxS, giảm biểu hiện agr và RNA III, từ đó ức chế hình thành màng sinh học (biofilm).
  • Đối với E. coli, Rau má thể hiện tác dụng tốt nhất (15 mm ở 500 mg/mL). Hoạt tính của Xuyên tâm liên được bàn luận thông qua cơ chế của andrographolide gây ức chế quá trình tổng hợp DNA, RNA và protein của vi khuẩn.
  • Về hoạt tính chống oxy hóa, Ngải cứu cho giá trị $\text{IC}{50}$ nhỏ nhất ($13,889\text{ µg/mL}$), được giải thích là do hàm lượng polyphenol và flavonoid cao. Tác giả cũng phân tích nguyên nhân dẫn đến sự sai khác về chỉ số $\text{IC}{50}$ của Rau má ($65,048\text{ µg/mL}$) so với các công bố quốc tế trước đây ($31,25\text{ µg/mL}$ ở dịch chiết nước) xuất phát từ sự khác biệt về dung môi, điều kiện chiết xuất và nguồn gốc địa lý thu hái mẫu.

Kết quả và đóng góp

Bảng số liệu tổng hợp kết quả kháng khuẩn

Ký hiệu Tên dược liệu Đường kính vòng kháng khuẩn trên S. aureus (sau 48h) ở nồng độ (mg/mL) Đường kính vòng kháng khuẩn trên S. epidermidis (sau 48h) ở nồng độ (mg/mL) Đường kính vòng kháng khuẩn trên E. coli (sau 24h) ở nồng độ (mg/mL)
50 100 200 500 50 100 200 500 50 100 200 500
M1 Rau má - 11 12 16 - 12 16 19 - 12 15 15
M2 Diếp cá - 10 12 13 12 14 16 19 - - 13 17
M3 Cam thảo 11 14 16 19 - - - - - - - -
M4 Ngải cứu 10 11 13 17 - - - - - - 13 16
M5 Xuyên tâm liên - 11 14 16 - - - - - 11 12 16
DMSO Đối chứng âm - - - - - - - - - - - -

(Ghi chú: Đơn vị tính: mm; dấu (-) thể hiện không phát hiện vòng kháng khuẩn).

Bảng số liệu tổng hợp hoạt tính chống oxy hóa qua thử nghiệm DPPH

Mẫu thử nghiệm Phần trăm ức chế $I%$ ở các nồng độ thử nghiệm Giá trị $\text{IC}_{50}$ ($\mu\text{g/mL}$)
3 $\mu\text{g/mL}$ 10 $\mu\text{g/mL}$ 30 $\mu\text{g/mL}$ 50 $\mu\text{g/mL}$ 100 $\mu\text{g/mL}$
Rau má $5,891 \pm 0,438$ $18,424 \pm 1,320$ $27,446 \pm 0,880$ $42,313 \pm 2,168$ $76,366 \pm 4,396$ $65,048 \pm 3,531$
Diếp cá $10,038 \pm 1,374$ $18,170 \pm 0,794$ $28,081 \pm 2,451$ $40,675 \pm 0,868$ $69,250 \pm 1,339$ $70,026 \pm 2,201$
Cam thảo $10,929 \pm 1,583$ $18,348 \pm 0,666$ $36,850 \pm 0,615$ $71,960 \pm 0,925$ $88,985 \pm 0,976$ $130,298 \pm 1,075$
Ngải cứu $15,883 \pm 2,810$ $38,644 \pm 0,956$ $48,436 \pm 0,521$ $70,689 \pm 1,404$ $90,279 \pm 1,514$ $13,889 \pm 0,087$
Xuyên tâm liên $8,895 \pm 1,144$ $18,043 \pm 0,660$ $35,054 \pm 1,029$ $40,915 \pm 4,999$ $71,792 \pm 2,500$ $35,502 \pm 2,870$
Quercetin (chứng dương) Khảo sát dải 0,5–10 $\mu\text{g/mL}$ ($97,412 \pm 1,240%$ tại 10 $\mu\text{g/mL}$) $3,163 \pm 0,067$

Đóng góp và đề xuất của tác giả

  • Đóng góp khoa học: Cung cấp bộ dữ liệu sàng lọc thực nghiệm so sánh đồng thời giữa 5 mẫu cao chiết dược liệu phổ biến tại Việt Nam trên cả 2 phương diện kháng khuẩn và chống oxy hóa. Nghiên cứu xác định được Ngải cứu có hoạt tính dập tắt gốc tự do mạnh nhất trong 5 mẫu, Cam thảo có hiệu lực ức chế S. aureus nổi bật nhất, và xác nhận Rau má cùng Diếp cá là 2 dược liệu có phổ ức chế trên cả 3 chủng vi khuẩn khảo sát.
  • Đề xuất của tác giả: Tiếp tục mở rộng phạm vi đánh giá phổ kháng khuẩn của các cao chiết trên các chủng vi khuẩn gây bệnh khác; tiến hành phân lập, tinh chế các hợp chất chính trong cao chiết để khảo sát chuyên sâu hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:
    • Nghiên cứu dừng lại ở mức độ sàng lọc in vitro trên dạng cao chiết toàn phần ethanol 70%, chưa đi sâu phân lập các phân đoạn dịch chiết phân cực khác nhau hoặc tinh sạch các hợp chất đơn lẻ.
    • Số lượng chủng vi khuẩn khảo sát còn giới hạn (02 chủng Gram dương và 01 chủng Gram âm), chưa thực hiện xác định chỉ số nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) bằng phương pháp pha loãng.
    • Chưa khảo sát các thử nghiệm hoạt tính sinh học trên mô hình tế bào hoặc mô hình động vật in vivo.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Nghiên cứu tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của quy trình chiết xuất (loại dung môi, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi, nhiệt độ, thời gian chiết).
    • Phân lập, xác định cấu trúc hóa học các chất có hoạt tính sinh học chính trong các phân đoạn cao chiết có tiềm năng cao (Ngải cứu, Cam thảo, Diếp cá).
    • Mở rộng thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc phân lập từ lâm sàng.

Giá trị tham khảo

Khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Dược học, Dược liệu, Dược lý học, Hóa học các hợp chất tự nhiên và Công nghệ sinh học dược phẩm:

  • Tài liệu tham khảo về quy trình: Cung cấp thông số thực nghiệm chuẩn mực cho quy trình chiết xuất ngấm kiệt thu cao toàn phần; phương pháp khuếch tán đục lỗ thạch TSB (thể tích 50 µL, giếng 8 mm, bước ủ lạnh 4°C trước khi nuôi cấy 37°C) và phương pháp đo quang phổ 96 giếng khảo sát gốc tự do DPPH ở bước sóng 517 nm.
  • Dữ liệu đối sánh: Cung cấp số liệu gốc về đường kính vòng kháng khuẩn và giá trị $\text{IC}_{50}$ của 5 cây thuốc phổ biến cùng chất chuẩn Quercetin, làm cơ sở dữ liệu nền tảng cho các nghiên cứu phát triển chế phẩm hoặc thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ nguồn dược liệu trong nước.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu cao chiết nào thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trên chủng Staphylococcus aureus?
Cao chiết Cam thảo (M3) thể hiện tác dụng ức chế mạnh nhất trên S. aureus với đường kính vòng vô khuẩn đạt 19 mm ở nồng độ 500 mg/mL, đồng thời là mẫu có hoạt tính ức chế trên cả 4 dải nồng độ thử nghiệm (đạt 11 mm ở 50 mg/mL; 14 mm ở 100 mg/mL; 16 mm ở 200 mg/mL).

2. Những dược liệu nào có khả năng ức chế được cả 3 chủng vi khuẩn khảo sát (S. aureus, S. epidermidis, E. coli)?
Trong số 5 mẫu dược liệu, chỉ có 02 mẫu cao chiết là Rau má (M1) và Diếp cá (M2) thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên toàn bộ 3 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Cả hai mẫu đều đạt đường kính vòng kháng khuẩn 19 mm trên S. epidermidis ở nồng độ 500 mg/mL.

3. Khả năng dập tắt gốc tự do DPPH của 5 mẫu cao dược liệu được xếp hạng như thế nào theo giá trị $\text{IC}_{50}$?
Khả năng chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự giá trị $\text{IC}{50}$ từ thấp đến cao như sau: Ngải cứu ($13,889 \pm 0,087\text{ µg/mL}$) > Xuyên tâm liên ($35,502 \pm 2,870\text{ µg/mL}$) > Rau má ($65,048 \pm 3,531\text{ µg/mL}$) > Diếp cá ($70,026 \pm 2,201\text{ µg/mL}$) > Cam thảo ($130,298 \pm 1,075\text{ µg/mL}$). Chất đối chứng dương Quercetin đạt $\text{IC}{50} = 3,163 \pm 0,067\text{ µg/mL}$.

4. Thử nghiệm kháng khuẩn sử dụng dung môi nào và nồng độ thử nghiệm của các cao chiết là bao nhiêu?
Các mẫu cao chiết được hòa tan trong dung môi dimethyl sulfoxide (DMSO) và khảo sát ở 4 mức nồng độ: 50, 100, 200 và 500 mg/mL. Mẫu đối chứng âm DMSO không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên cả 3 chủng.

5. Hoạt chất nào trong rễ Cam thảo và Xuyên tâm liên được tác giả dẫn giải để giải thích cơ chế sinh học?
Tác giả dẫn giải hoạt chất acid 18β-glycyrrhetinic (GRA) trong rễ Cam thảo có khả năng ức chế biểu hiện gen độc lực chính của S. aureus (hla, saeRS), và hoạt chất andrographolide trong Xuyên tâm liên có khả năng ức chế tổng hợp DNA, RNA và protein ở vi khuẩn cũng như bẫy gốc tự do bảo vệ tế bào.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Đào Thị Huyền Trang đã hoàn thành việc sàng lọc thực nghiệm tác dụng kháng khuẩn và chống oxy hóa in vitro của 05 mẫu cao chiết ethanol toàn phần từ dược liệu Việt Nam. Kết quả khẳng định cao chiết Ngải cứu có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất ($\text{IC}_{50} = 13,889\text{ µg/mL}$), Cam thảo có hoạt tính kháng S. aureus vượt trội, trong khi Rau má và Diếp cá có phổ tác dụng bao quát trên cả 3 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Công trình cung cấp hệ thống dữ liệu thực nghiệm có độ tin cậy khoa học cao, đóng góp cơ sở dữ liệu định lượng cho các nghiên cứu chiết tách hoạt chất và phát triển sản phẩm trị liệu từ dược liệu trong nước.