Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv., họ Ngũ gia bì - Araliaceae), còn gọi là sâm Ngọc Linh, là loài thảo dược đặc hữu quý hiếm của Việt Nam, được phát hiện lần đầu vào năm 1973 tại vùng núi Ngọc Linh. Về mặt hóa học và dược lý, Sâm Việt Nam được ghi nhận chứa hơn 50 hợp chất saponin khung dammaran, bao gồm các ginsenosid tương tự nhân sâm Triều Tiên, sâm Mỹ và đặc biệt là hàm lượng cao các saponin nhóm ocotillol (tiêu biểu là majonosid-R2). Các hoạt chất này mang lại nhiều tác dụng sinh học giá trị như bồi bổ cơ thể, tăng cường sinh lực, chống oxy hóa, chống trầm cảm, giải lo âu, bảo vệ tế bào gan, tăng cường miễn dịch và phòng chống tạo khối u.

Tuy nhiên, nguồn dược liệu Sâm Việt Nam trong tự nhiên phân bố hẹp ở độ cao từ 1.500 m đến 2.200 m thuộc vùng núi Ngọc Linh (Kon Tum, Quảng Nam), đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt do bị khai thác quá mức. Đồng thời, chu kỳ sinh trưởng của cây sâm trong tự nhiên và trồng trọt truyền thống kéo dài từ 5 đến 7 năm mới có thể thu hoạch thân rễ, gây khó khăn cho việc cung ứng nguyên liệu sản xuất dược phẩm quy mô công nghiệp. Để giải quyết thách thức này, phương pháp nuôi cấy mô thực vật, đặc biệt là công nghệ nuôi cấy rễ tóc (hairy root), được đánh giá là hướng đi tiềm năng nhằm sản xuất sinh khối sạch, ổn định trong thời gian ngắn và không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên.

Nhằm cung cấp dữ liệu thực nghiệm về thành phần hoạt chất của sinh khối nuôi cấy in vitro, đề tài "Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam" được thực hiện với 2 mục tiêu cụ thể:

  1. Phân tích định tính các thành phần saponin chính trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
  2. Định lượng sơ bộ hàm lượng các thành phần saponin chính trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Đối tượng nghiên cứu là mẫu sinh khối rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam do Bộ môn Sinh học Phân tử thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp vào tháng 12 năm 2021. Các thực nghiệm chiết xuất và phân tích sắc ký được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa dược thuộc Trường Đại học PHENIKAA và Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, hoàn thành vào tháng 06 năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên cơ sở lý thuyết về hóa học thực vật và cấu trúc các hợp chất saponin triterpenoid khung dammaran trong chi Panax. Thành phần saponin trong Sâm Việt Nam được chia thành ba nhóm chính:

  • Nhóm dẫn chất 20(S)-protopanaxadiol (PPD): gồm 22 hợp chất đã biết và mới, đại diện tiêu biểu là Ginsenosid-Rb1 (G-Rb1) và Ginsenosid-Rd (G-Rd).
  • Nhóm dẫn chất 20(S)-protopanaxatriol (PPT): gồm 17 hợp chất, đại diện tiêu biểu là Ginsenosid-Rg1 (G-Rg1) và Ginsenosid-Re (G-Re).
  • Nhóm saponin cấu trúc ocotillol (OT): gồm 11 hợp chất, đại diện chính là Majonosid-R2 (M-R2), chiếm tỷ lệ lớn trong sâm tự nhiên.

Quy trình thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu được triển khai theo các bước:

1. Phương pháp xử lý và chiết xuất mẫu:

  • Mẫu rễ tóc khô (khối lượng ban đầu 200 mg) được chiết hồi lưu hỗ trợ siêu âm bằng dung môi methanol (MeOH) kỹ thuật 2 lần (mỗi lần 4 ml trong 30 phút).
  • Gộp dịch chiết methanol, lọc qua giấy lọc và cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 50 °C bằng hệ thống Rotavapor R-100 (BUCHI) để thu cắn cao tổng methanol.
  • Phân tán cắn cao tổng trong nước cất hai lần, tiến hành chiết phân bố lỏng - lỏng với dung môi n-butanol ($n\text{-BuOH}$) bão hòa nước. Gạn tách lớp butanol và cô đuổi dung môi dưới áp suất giảm, thu được 11,4 mg cao phân đoạn butanol.

2. Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử cho HPLC:

  • Các chất chuẩn đối chiếu gồm Ginsenosid-Rg1, Majonosid-R2, Ginsenosid-Rb1 và Ginsenosid-Rd (độ tinh khiết $\ge 95%$ theo HPLC) được cung cấp bởi Viện Dược liệu. Pha dung dịch hỗn hợp chuẩn trong methanol với nồng độ xác định: G-Rg1 (0,325 mg/ml), M-R2 (0,534 mg/ml), G-Rb1 (0,113 mg/ml) và G-Rd (0,110 mg/ml).
  • Pha mẫu thử: Hòa tan chính xác 11,4 mg cao phân đoạn butanol trong 1,0 ml methanol để đạt nồng độ 11,4 mg/ml, xử lý siêu âm 10 phút, ly tâm và lọc dịch qua màng lọc Cellulose Acetate kích thước lỗ lọc 0,45 µm.

3. Điều kiện phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):

  • Hệ thống thiết bị: Agilent 1260 Infinity LC trang bị đầu dò mảng đi-ốt (UV-DAD) và hệ thống tiêm mẫu tự động.
  • Cột phân tích: Cột pha đảo ZORBAX Eclipse XDB-C18 (kích thước 4,6 × 250 mm; kích thước hạt 5 µm).
  • Pha động: Acetonitril (kênh A) và Nước cất hai lần (kênh B), rửa giải gradient theo chương trình: 0–11 phút (21% A), 11–25 phút (21–32% A), 25–35 phút (32–40% A), 35–40 phút (40–95% A), 40–60 phút (95% A), 60–61 phút (95–21% A), 61–71 phút (21% A).
  • Thông số vận hành: Tốc độ dòng 1,2 ml/phút; nhiệt độ buồng cột 30 °C; thể tích tiêm mẫu 20 µL; bước sóng phát hiện UV 196 nm.

4. Phương pháp tính toán định lượng: Nồng độ từng saponin trong dung dịch thử nghiệm ($C_{\text{thử}}$) được tính theo phương pháp chuẩn ngoại: $$C_{\text{thử}} = \frac{S_{\text{thử}}}{S_{\text{chuẩn}}} \times C_{\text{chuẩn}}$$ Trong đó $S_{\text{thử}}$ và $S_{\text{chuẩn}}$ lần lượt là diện tích pic của chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn.

Hàm lượng phần trăm của từng saponin trong mẫu dược liệu rễ tóc khô ban đầu ($% m_{\text{chất}}$) được xác định bằng công thức: $$% m_{\text{chất}} = \frac{C_{\text{chất thử}}}{C_{\text{cao } n\text{-BuOH}}} \times \frac{m_{\text{cao } n\text{-BuOH}}}{m_{\text{dược liệu}}} \times 100%$$ (với $C_{\text{cao } n\text{-BuOH}} = 11,4\text{ mg/ml}$, $m_{\text{cao } n\text{-BuOH}} = 11,4\text{ mg}$, $m_{\text{dược liệu}} = 200\text{ mg}$).

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương 1 tổng hợp các tài liệu khoa học về loài Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật:

  • Lịch sử và thực vật học: Ghi nhận sự kiện phát hiện sâm tự nhiên tại sườn Đông Nam núi Ngọc Linh ngày 19/03/1973 bởi đoàn khảo sát do Dược sĩ Đào Kim Long chủ trì và công bố quốc tế năm 1985 bởi Hà Thị Dung và I. Grushvitsky tại Viện Thực vật Komarov. Mô tả chi tiết đặc điểm hình thái thân rễ có sẹo đốt hàng năm, thân khí sinh cao 40–80 cm, lá kép chân vịt gồm 5 lá chét mép khía răng cưa có lông gai, hoa tán đơn 50–120 hoa và quả mọng màu đỏ có chấm đen khi chín.
  • Thành phần hóa học sâm tự nhiên: Phân tích dữ liệu 52 hợp chất saponin (26 saponin đã biết và 26 saponin mới phân lập đặt tên vina-ginsenosid-R1 đến R25), trong đó Majonosid-R2 chiếm tỷ lệ cao nhất (khoảng 5,29%), Ginsenosid-Rb1 (khoảng 2,01%), Ginsenosid-Rg1 (khoảng 1,02–1,37%) và Ginsenosid-Rd (khoảng 0,87%). Ngoài ra, chương này liệt kê 7 dẫn chất polyacetylen (tiêu biểu là panaxynol), 17 acid béo (acid linoleic chiếm 40,04%, acid palmitic chiếm 29,62%), 18 acid amin (arginin 46,66%, lysin 17,90%, tryptophan 10,20%), 20 nguyên tố khoáng đa vi lượng (K, Na, Mg, Mn, Cu, Fe, Zn, Se), phytosterol (β-sitosterol, daucosterin), glucid (đường tự do 6,19%, đường toàn phần 26,77%), tinh dầu (0,05–0,10%) và vitamin C (0,059%).
  • Dược lý học và công dụng: Tổng hợp các thử nghiệm thực nghiệm chứng minh tác dụng kích thích thần kinh trung ương, chống trầm cảm và giải tỏa căng thẳng tâm lý trên mô hình chuột; tác dụng ức chế kháng nguyên sớm virus Epstein-Barr (EBV-EA) và ức chế quá trình sinh khối u gan/da hai giai đoạn; bảo vệ tế bào gan trước độc tính của $\text{CCl}_4$ và D-galactosamine/TNF-α; chống viêm qua ức chế COX-2, NO và NF-κB; tăng cường hoạt động vận động và tổng hợp ATP cơ; chống tạo hắc tố melanin trên tế bào khối u ác tính.
  • Nguồn dược liệu thay thế: Đánh giá các hệ thống nuôi cấy in vitro gồm nuôi cấy mô phôi vô tính (somatic embryo), nuôi cấy rễ bất định (adventitious root) và nuôi cấy rễ tóc (hairy root). Rễ tóc được xác định là hệ thống có tốc độ tăng trưởng nhanh, khả năng tích lũy sinh khối cao trong môi trường không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp, đáp ứng tiêu chuẩn dược liệu sạch.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị và quy trình thao tác thực nghiệm:

  • Trình bày thông tin nguồn gốc mẫu rễ tóc nuôi cấy (Viện Di truyền Nông nghiệp) và mẫu tiêu bản lưu giữ tại Khoa Dược – Trường Đại học PHENIKAA; các chất chuẩn hóa học đối chiếu M-R2, G-Rb1, G-Rg1, G-Rd.
  • Liệt kê thông số kỹ thuật của hệ thống thiết bị phân tích: Cân phân tích Precisa 262SMA-FR (độ chính xác 0,0001 g), máy cô quay Buchi Rotavapor R-100, máy siêu âm Power Sonic 405, hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity trang bị detector UV-DAD.
  • Mô tả chi tiết các bước thực hiện chiết xuất phân đoạn cao butanol từ 200 mg mẫu rễ tóc khô (thu được 11,4 mg cao phân đoạn).
  • Thiết lập quy trình phân tích HPLC với chương trình rửa giải gradient dung môi Acetonitril - Nước và xây dựng công thức tính toán hàm lượng hoạt chất từ nồng độ dịch thử và diện tích pic thu được.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả phân tích định tính, định lượng và thảo luận chuyên sâu về thành phần hóa học của mẫu rễ tóc:

  • Phân tích sắc ký mẫu chuẩn: Ghi nhận thời gian lưu ($t_R$) của từng chất chuẩn đơn lẻ và hỗn hợp chuẩn trên cột ZORBAX Eclipse XDB-C18: G-Rg1 ($t_R = 16,528$ phút), M-R2 ($t_R = 18,261$ phút), G-Rb1 ($t_R = 31,514$ phút), G-Rd ($t_R = 36,373$ phút). Các pic của G-Rg1, G-Rb1 và G-Rd thể hiện độ đối xứng, sắc nét và tách rời hoàn toàn. Riêng M-R2 có cường độ tín hiệu thấp trên detector UV-DAD do cấu trúc không chứa hệ liên kết đôi liên hợp mang màu.
  • Định tính mẫu rễ tóc: Sắc ký đồ phân đoạn butanol của mẫu rễ tóc xuất hiện 3 pic có thời gian lưu tương ứng hoàn toàn với các chất chuẩn: G-Rg1 ($t_R = 16,723$ phút), G-Rb1 ($t_R = 31,399$ phút) và G-Rd ($t_R = 36,321$ phút). Tín hiệu pic của M-R2 không quan sát thấy rõ ràng trên sắc ký đồ (diện tích pic ghi nhận xấp xỉ 0).
  • Định lượng sơ bộ: Tính toán nồng độ và hàm lượng phần trăm của 3 saponin trong mẫu rễ tóc Sâm Việt Nam nuôi cấy.
  • Bàn luận: So sánh hàm lượng các ginsenosid thu được với sâm tự nhiên; phân tích hạn chế quang phổ của detector UV đối với nhóm saponin ocotillol và đề xuất hướng sử dụng kỹ thuật khối phổ phân giải cao (LC-MS/MS) để phát hiện và định lượng M-R2.
Tên saponin Thời gian lưu chuẩn $t_R$ (phút) Nồng độ chuẩn $C_{\text{chuẩn}}$ (mg/ml) Diện tích pic chuẩn $S_{\text{chuẩn}}$ (mAU*s) Thời gian lưu thử $t_R$ (phút) Diện tích pic thử $S_{\text{thử}}$ (mAU*s) Nồng độ dịch thử $C_{\text{thử}}$ (mg/ml) Hàm lượng trong dược liệu khô (%)
Ginsenosid-Rg1 (G-Rg1) 16,528 0,325 5007,3 16,723 4429,1 0,287 0,144
Majonosid-R2 (M-R2) 18,261 0,534 - - 0 - Chưa xác định
Ginsenosid-Rb1 (G-Rb1) 31,514 0,113 1042,4 31,399 1040,4 0,113 0,056
Ginsenosid-Rd (G-Rd) 36,373 0,110 947,4 36,321 656,0 0,076 0,038

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã thu được các kết quả thực nghiệm định lượng cụ thể trên mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam:

  • Xác định sự hiện diện của 3 hợp chất saponin chính thuộc nhóm protopanaxadiol và protopanaxatriol trong mẫu rễ tóc nuôi cấy: Ginsenosid-Rg1, Ginsenosid-Rb1 và Ginsenosid-Rd.
  • Hàm lượng của các hợp chất trong mẫu dược liệu rễ tóc khô được định lượng sơ bộ lần lượt là: G-Rg1 đạt 0,144%, G-Rb1 đạt 0,056% và G-Rd đạt 0,038%.
  • Đối với hợp chất Majonosid-R2 (thuộc nhóm ocotillol), do đặc thù cấu trúc phân tử không có liên kết đôi mang màu nên khả năng hấp thụ tử ngoại tại bước sóng 196 nm rất yếu, chưa ghi nhận được tín hiệu pic định lượng rõ ràng trên hệ thống HPLC/UV-DAD.

So sánh với sâm tự nhiên thu hái tại vùng núi Ngọc Linh (vốn có hàm lượng G-Rg1 từ 1,02% đến 1,37%, G-Rb1 khoảng 2,01%, G-Rd khoảng 0,87% và M-R2 đạt 5,29%), hàm lượng các saponin trong mẫu rễ tóc nuôi cấy ở giai đoạn thử nghiệm ban đầu thấp hơn. Tuy nhiên, kết quả này chứng minh mẫu rễ tóc in vitro đã có khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất saponin đặc trưng của Sâm Việt Nam.

Đóng góp khoa học của đề tài bao gồm việc thiết lập thành công quy trình xử lý, chiết xuất phân đoạn saponin từ khối lượng mẫu nhỏ (200 mg) và chương trình sắc ký pha đảo HPLC rửa giải gradient tối ưu hóa thời gian chạy 71 phút trên cột C18. Kết quả cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về thành phần hóa học của mẫu rễ tóc Sâm Việt Nam nuôi cấy, làm tiền đề khoa học cho các nghiên cứu tối ưu hóa công nghệ sinh học nhằm tạo nguồn dược liệu thay thế.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự ghi nhận các hạn chế thực nghiệm và đề xuất định hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Hạn chế: Nghiên cứu mới dừng lại ở bước đầu định lượng sơ bộ trên 01 mẫu rễ tóc nuôi cấy đơn lẻ, kết quả mang tính chất tham khảo bước đầu; chưa tiến hành thẩm định đầy đủ phương pháp phân tích (độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ); chưa phân tích định lượng được Majonosid-R2 do hạn chế của đầu dò tử ngoại UV-DAD.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    1. Khảo sát và tối ưu hóa quy trình phân tích, xây dựng quy trình định lượng đầy đủ các saponin chính bằng HPLC.
    2. Sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LC-MS/MS) có độ nhạy và độ chọn lọc cao hơn để định tính và định lượng nhóm saponin ocotillol (đặc biệt là M-R2).
    3. Mở rộng phân tích các hợp chất khác có trong sinh khối rễ tóc (polyacetylen, acid amin, acid béo, nguyên tố vi lượng).
    4. Nghiên cứu điều chỉnh các yếu tố môi trường nuôi cấy (thành phần dinh dưỡng, chất kích thích sinh tổng hợp elicitor) nhằm nâng cao hàm lượng saponin tích lũy trong rễ tóc.
    5. Đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ tóc trên các mô hình dược lý thực nghiệm.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên môn hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Dược học, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất, cũng như Công nghệ sinh học Dược liệu:

  • Cung cấp quy trình chiết xuất vi lượng và thu nhận phân đoạn cao butanol chứa saponin từ mẫu sinh khối thực vật nhỏ.
  • Cung cấp các thông số kỹ thuật chi tiết về điều kiện vận hành HPLC (cột ZORBAX Eclipse XDB-C18, chương trình gradient Acetonitril - Nước, bước sóng 196 nm) phục vụ định tính và định lượng nhóm ginsenosid trong các đối tượng mẫu sâm và sản phẩm chế biến từ sâm.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu rễ tóc nuôi cấy Sâm Việt Nam trong nghiên cứu có nguồn gốc từ đâu và được xử lý ban đầu ra sao?
Mẫu rễ tóc do PGS.TS Lê Hùng Lĩnh (Bộ môn Sinh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, Hà Nội) cung cấp vào tháng 12 năm 2021. Dược liệu được bảo quản trong túi bọc kín tránh ẩm ở nhiệt độ 4 °C và lưu trữ tiêu bản tại Khoa Dược – Trường Đại học PHENIKAA.

2. Quy trình chiết xuất phân đoạn saponin từ mẫu rễ tóc được thực hiện với các thông số nào?
200 mg rễ tóc khô được ngâm chiết siêu âm 2 lần với methanol (mỗi lần 4 ml trong 30 phút), cất quay thu hồi dung môi ở 50 °C thu cao tổng. Cao tổng được phân tán trong nước cất, lắc chiết phân bố lỏng - lỏng với n-butanol và cô áp suất giảm thu được 11,4 mg cao phân đoạn n-butanol (tương ứng nồng độ pha mẫu chạy HPLC là 11,4 mg/ml).

3. Khóa luận đã định lượng được những saponin nào và hàm lượng cụ thể là bao nhiêu?
Nghiên cứu định lượng được 3 saponin chính trong mẫu rễ tóc khô: Ginsenosid-Rg1 đạt 0,144%, Ginsenosid-Rb1 đạt 0,056% và Ginsenosid-Rd đạt 0,038%.

4. Tại sao hợp chất Majonosid-R2 (M-R2) chưa định lượng được trên hệ thống HPLC trong đề tài này?
Majonosid-R2 thuộc nhóm saponin ocotillol, trong cấu trúc không chứa liên kết đôi liên hợp và không có nhóm mang màu nên khả năng hấp thụ bức xạ UV tại bước sóng 196 nm rất yếu. Do đó, đầu dò UV-DAD không ghi nhận được tín hiệu pic rõ nét, tác giả đề xuất sử dụng phương pháp LC-MS/MS cho các nghiên cứu tiếp theo.

5. Điểm khác biệt chính giữa kết quả saponin trong rễ tóc nuôi cấy và sâm tự nhiên là gì?
Hàm lượng 3 ginsenosid (G-Rg1, G-Rb1, G-Rd) trong mẫu rễ tóc nuôi cấy thấp hơn so với sâm tự nhiên tại núi Ngọc Linh (sâm tự nhiên chứa G-Rg1 khoảng 1,02–1,37%, G-Rb1 khoảng 2,01%, G-Rd khoảng 0,87% và M-R2 khoảng 5,29%). Tuy nhiên, hệ thống rễ tóc có ưu thế về tốc độ sinh trưởng nhanh và tạo nguồn sinh khối sạch không chứa dư lượng chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phùng Tiến Hải đã ứng dụng thành công kỹ thuật chiết xuất phân đoạn kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC/UV-DAD) để phân tích thành phần hóa học của mẫu rễ tóc Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) nuôi cấy in vitro. Kết quả bước đầu xác định và định lượng được 3 ginsenosid chính gồm Ginsenosid-Rg1 (0,144%), Ginsenosid-Rb1 (0,056%) và Ginsenosid-Rd (0,038%), đồng thời chỉ ra đặc điểm đáp ứng quang phổ của Majonosid-R2 trên đầu dò DAD. Công trình cung cấp các dữ liệu thực nghiệm ban đầu có giá trị khoa học, tạo cơ sở cho việc tiếp tục hoàn thiện quy trình phân tích và tối ưu hóa công nghệ sinh học nhằm phát triển nguồn dược liệu Sâm Việt Nam thay thế trong tương lai.