ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN NGỌC ANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN HELICOBACTER PYLORI BẰNG NESTED PCR TỪ DỊCH DẠ DÀY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN NGỌC ANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN HELICOBACTER PYLORI BẰNG NESTED PCR TỪ DỊCH DẠ DÀY Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 84 20 201 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN PHÚ HÙNG THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Trần Ngọc Anh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bản luận văn này em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên. Các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh học đã tận tình dạy dỗ, truyền dạy kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho chúng em trong những năm qua. Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS. Nguyễn Phú Hùng, người thầy đã định hướng nghiên cứu và tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho em trong suốt thời gian em thực hiện và hoàn thành luận văn này. Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ từ gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và các anh, chị trong nhóm nghiên cứu, những người luôn động viên, khích lệ em, tạo cho em động lực và niềm say mê trong nghiên cứu khoa học. Em vô cùng biết ơn tất cả những tình cảm tốt đẹp mà mọi người đã dành cho em. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019 Tác giả Trần Ngọc Anh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN . III DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT . V DANH MỤC CÁC BẢNG. VI DANH MỤC CÁC HÌNH .VII MỞ ĐẦU . Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu gồm . TỔNG QUAN TÀI LIỆU . Vi khuẩn Helicobacter pylori . Lịch sử nghiên cứu H. Đặc điểm hình thái học của H. Cơ chế gây bệnh của H. Gen mã hoá CagA (cytotoxine associated gene A). Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn H. Các xét nghiệm xâm hại qua nội soi dạ dày tá tràng (invasive test) . Các thử nghiệm không xâm lấn . Nested PCR trong chẩn đoán H. Khái niệm về Nested PCR . Ứng dụng của Nested PCR trong chẩn đoán H. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . Vật liệu nghiên cứu . Mẫu bệnh phẩm . Hóa chất, dụng cụ thiết bị . Địa điểm và thời gian . 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp thu nhận mẫu bệnh phẩm dịch dạ dày . Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm . Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu chủng vi khuẩn . Phương pháp đo DNA tổng số . Phương pháp Nested PCR. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose . Phương pháp xử lý số liệu. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . Kết quả tách DNA từ chủng vi khuẩn Helicobacter pylori và dịch dạ dày . Khuếch đại DNA đặc trưng genome của H. pylori bằng kỹ thuật Nested PCR . Xác định độ nhạy của kỹ thuật Nested PCR trong phát hiện H. Xác định gen CagA của vi khuẩn H. pylori bằng Nested PCR. Áp dụng kỹ thuật Nested PCR để đánh giá mức độ nhiễm H. pylori và chủng H. pylori mang gen CagA trong các mẫu bệnh phẩm . Xây dựng quy trình chẩn đoán ở mức độ phòng thí nghiệm . 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Campylobacter Like Organism test Clotest Cytotoxine associated gen A CagA Deoxyribonucleic acid DNA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA Heptose - bisphosphate HBP Immuno Globulin A IgA Immuno Globulin G IgG Immuno Globulin M IgM Nuclear factor kappa B NFkB Pathogenicity island PAI Ribonucleic acid RNA Urea Breath Test UBT Vacuolating toxin gene A VacA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2. Các cặp mồi được sử dụng cho phản ứng Nested PCR . Thành phần phản ứng PCR vòng 1 . Thành phần phản ứng cho vòng 2 . Chu kì nhiệt cho mỗi vòng của phản ứng Nested- PCR . Các cặp mồi được sử dụng cho phản ứng Nested PCR phát hiện gen CagA. Thành phần phản ứng PCR cho 2 vòng . Chu kì nhiệt cho mỗi vòng của phản ứng Nested- PCR . Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm và chủng H. pylori đối chứng . Kết quả phân tích từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân . 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Mẫu thử Clotest . pylori trên đĩa nuôi cấy phân lập . Viêm dạ dày lympho . Viêm dạ dày hạt . Nguyên lý test thở 13C và 14C . Kết quả tách chiết DNA tổng số . Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vòng 1 khuếch đại DNA đặc trưng của vi khuẩn H. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vòng 2 khuếch đại DNA đặc trưng của vi khuẩn H. Độ nhạy của phản ứng Nested PCR khuếch đại đoạn DNA đặc trưng genome H. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen CagA vòng 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen CagA vòng 2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại DNA đặc trưng của vi khuẩn H. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại DNA đặc trưng của vi khuẩn H. Quy trình chẩn đoán H. pylori bằng phương pháp Nested PCR áp dụng cho các phòng thí nghiệm . 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Helicobacter pylori (H. pylori) là một trong những vi khuẩn thường gặp gây nhiễm trùng đường tiêu hóa. Sự phát hiện ra H. pylori bởi Marshall và Warren năm 1882 đã mở ra một kỉ nguyên mới trong điều trị bệnh lý dạ dày tá tràng. pylori đã được xem là nguyên nhân chính gây viêm, loét dạ dày ở mọi lứa tuổi. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, hơn 50% dân số bị nhiễm loại vi khuẩn này [46]. Tỷ lệ nhiễm H. pylori đang giảm ở vùng châu Á - Thái Bình Dương, nhưng ở Việt Nam tỷ lệ nhiễm vi khuẩn này còn cao [2]. Tỷ lệ nhiễm H. pylori ở những trẻ em bị viêm dạ dày là 70% và ở bệnh nhân loét hành tá tràng là 90% [3]. Ở Việt Nam chưa có những theo dõi quy mô, toàn diện, chủ yếu là các số liệu thống kê dựa trên những nghiên cứu rải rác trong các cộng đồng nhỏ. Có rất nhiều phương pháp để giúp cho chẩn đoán nhiễm H. pylori dựa theo điều kiện cụ thể của từng cơ sở y tế. Các phương pháp chẩn đoán có tính xâm lấn thông qua nội soi gồm thử nghiệm urease, nuôi cấy vi khuẩn, xác định acid nhân của vi khuẩn, chẩn đoán mô bệnh học, phản ứng chuỗi PCR. Các phương pháp không xâm lấn bao gồm: Nghiệm pháp thở C13 hoặc C14, chẩn đoán huyết thanh, test nhanh bằng huyết thanh, test huyết thanh phát hiện kháng thể kháng CagA, tìm kháng thể kháng H. pylori trong nước tiểu, Immunoblot, dùng PCR chẩn đoán H. pylori trong phân, phát hiện kháng nguyên trong phân. Mỗi phương pháp đều cho những ưu nhược điểm riêng. Hiện nay, PCR là một kỹ thuật chẩn đoán tiên tiến nhưng chưa được phổ biến rộng rãi ở Việt Nam trong chẩn đoán nhiễm H. Ngoài việc chẩn đoán nhiễm H. pylori trước điều trị, PCR còn dùng để theo dõi sau điều trị tiệt trừ H. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 2 Thông thường, việc chẩn đoán bằng PCR cũng như các xét nghiệm Clotest đều trải qua việc sinh thiết một mẫu niêm mạc dạ dày, điều này ít nhiều gây tổn thương cho dạ dày và gây đau đớn cho người bệnh. Trong khi đó, PCR phát hiện từ mẫu phân và mẫu nước tiểu là những xét nghiệm không xâm lấn nhưng tỷ lệ âm tính giả cao do sự có khả năng thu nhận được H. pylori từ các mẫu bệnh phẩm này thấp hơn nhiều so với trong dạ dày. Trong nghiên cứu này chúng tôi hướng tới việc xây dựng một quy trình chẩn đoán H. pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày nhằm giảm tính xâm lấn so với các phương pháp phân tích từ mô dạ dày đồng thời có thể phát hiện các chủng có nguy cơ gây ung thư mang gen CagA mà một số phương pháp không xâm lấn khác không đạt được. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình chẩn đoán H. pylori từ dịch dạ dày bằng phương pháp Nested PCR. Nội dung nghiên cứu gồm Nội dung 1: Thu thập mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nội soi viêm loét dạ dày và tách chiết DNA tổng số. Nội dung 2: Phát hiện DNA đặc trưng genome H. pylori bằng phản ứng Nested PCR. Nội dung 3: Phát hiện gen CagA của vi khuẩn H. pylori bằng phản ứng Nested PCR. Nội dung 4: Đánh giá tỷ lệ dương tính với vi khuẩn H. pylori và gen CagA từ các mẫu bệnh phẩm bằng Nested PCR. Nội dung 5: Xây dựng quy trình chẩn đoán H. pylori bằng Nested PCR Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi khuẩn Helicobacter pylori 1. Lịch sử nghiên cứu H. pylori Loài xoắn khuẩn này đã được tìm thấy trong niêm mạc dạ dày của người và động vật từ năm 1875 nhưng mối liên quan giữa vi khuẩn này và các bệnh lý ở dạ dày tá tràng chưa được xác định [32]. pylori (Nguồn:http://microbewiki.edU/images/thumb/2/24/H.gif) Khi mới được phân lập vi khuẩn này được đặt tên là Campylobacter pyloridis căn cứ vào vị trí khu trú và một số đặc điểm giống Campylobacter jejuni [35]. Sự khác biệt giữa Campylobacter pyloridis và các chủng Campylobacter được xác định bởi Goodwin và cộng sự vào năm 1989 từ đó Campylobacter pyloridis được đổi tên thành Helicobacter.
## Tổng quan nghiên cứu
Helicobacter pylori (H. pylori) là vi khuẩn phổ biến gây nhiễm trùng đường tiêu hóa, với hơn 50% dân số thế giới bị nhiễm theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới. Ở Việt Nam, tỷ lệ nhiễm H. pylori vẫn còn cao, đặc biệt là ở trẻ em viêm dạ dày (70%) và bệnh nhân loét hành tá tràng (90%). Việc chẩn đoán chính xác và kịp thời nhiễm H. pylori đóng vai trò quan trọng trong điều trị và phòng ngừa các bệnh lý dạ dày nghiêm trọng như viêm loét và ung thư dạ dày.
Nghiên cứu này tập trung xây dựng quy trình chẩn đoán H. pylori bằng kỹ thuật Nested PCR từ dịch dạ dày, nhằm giảm tính xâm lấn so với các phương pháp truyền thống như sinh thiết mô dạ dày. Mục tiêu cụ thể gồm thu thập mẫu dịch dạ dày, tách chiết DNA, phát hiện DNA đặc hiệu của H. pylori và gen độc lực CagA, đánh giá tỷ lệ nhiễm và xây dựng quy trình chẩn đoán phù hợp cho phòng thí nghiệm. Nghiên cứu được thực hiện tại tỉnh Thái Nguyên trong khoảng thời gian từ tháng 11/2018 đến tháng 9/2019, với 35 mẫu bệnh phẩm dịch dạ dày thu thập từ bệnh nhân nội soi.
Việc áp dụng kỹ thuật Nested PCR không chỉ nâng cao độ nhạy và đặc hiệu trong phát hiện H. pylori mà còn giúp phát hiện các chủng mang gen CagA có nguy cơ cao gây ung thư dạ dày, góp phần cải thiện hiệu quả chẩn đoán và điều trị, đồng thời giảm thiểu tổn thương cho người bệnh.
## Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
### Khung lý thuyết áp dụng
- **Vi khuẩn Helicobacter pylori**: Vi khuẩn gram âm, hình xoắn, có khả năng tiết urease giúp tồn tại trong môi trường axit dạ dày. H. pylori là nguyên nhân chính gây viêm loét dạ dày và có liên quan đến ung thư dạ dày.
- **Gen CagA (Cytotoxine associated gene A)**: Gen mã hóa protein CagA, một yếu tố độc lực quan trọng, liên quan đến khả năng gây ung thư dạ dày. Chủng H. pylori mang gen CagA có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao hơn.
- **Nested PCR**: Kỹ thuật PCR hai bước sử dụng hai cặp mồi để tăng độ nhạy và đặc hiệu trong phát hiện DNA mục tiêu, phù hợp với mẫu có lượng DNA thấp như dịch dạ dày.
- **Các phương pháp chẩn đoán H. pylori**: Bao gồm phương pháp xâm lấn (urease test, nuôi cấy, mô bệnh học, PCR từ mô) và không xâm lấn (test thở, huyết thanh, phát hiện kháng nguyên phân). Nested PCR từ dịch dạ dày là phương pháp mới, giảm xâm lấn và tăng độ chính xác.
### Phương pháp nghiên cứu
- **Nguồn dữ liệu**: 35 mẫu dịch dạ dày thu thập từ bệnh nhân nội soi tại các bệnh viện tỉnh Thái Nguyên.
- **Phương pháp thu nhận mẫu**: Dịch dạ dày được hút bằng dây vô trùng trong quá trình nội soi, bảo quản ở 2-8°C, loại bỏ mẫu dưới 2ml.
- **Tách chiết DNA**: Sử dụng bộ kit QIAMP DNA MINI KIT, quy trình chuẩn hóa nhằm thu nhận DNA tổng số từ dịch dạ dày và chủng H. pylori đối chứng.
- **Kỹ thuật Nested PCR**:
- Phát hiện DNA đặc hiệu genome H. pylori với hai cặp mồi HpF1/HpR1 (vòng 1) và HpF2/HpR2 (vòng 2).
- Phát hiện gen CagA với cặp mồi HpCagAF1/HpCagAR1 (vòng 1) và HpCagAF1/HpCagAR2 (vòng 2).
- **Phân tích sản phẩm PCR**: Điện di trên gel agarose 1%, nhuộm Ethidium bromide, quan sát dưới đèn UV.
- **Phân tích số liệu**: Sử dụng phần mềm GraphPad Prism 5, kiểm định Mann-Whitney để đánh giá sự khác biệt giữa các nhóm.
- **Timeline nghiên cứu**: Thực hiện từ tháng 11/2018 đến tháng 9/2019 tại Phòng thí nghiệm Y Sinh, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
## Kết quả nghiên cứu và thảo luận
### Những phát hiện chính
- **Nồng độ và chất lượng DNA**: DNA tách chiết từ dịch dạ dày có nồng độ thấp (5-12 ng/µl) và độ tinh sạch thấp (tỷ số A260/A280 từ 0,87-0,94), trong khi DNA từ chủng H. pylori đối chứng có nồng độ cao hơn (99-125,5 ng/µl).
- **Khuếch đại DNA genome H. pylori**: PCR vòng 1 chỉ khuếch đại được DNA đặc hiệu ở mẫu đối chứng, không khuếch đại ở mẫu dịch dạ dày do lượng DNA thấp. PCR vòng 2 (Nested PCR) phát hiện DNA đặc hiệu ở tất cả 6 mẫu dịch dạ dày thử nghiệm, kích thước băng DNA khoảng 230 bp.
- **Độ nhạy của Nested PCR**: Phản ứng Nested PCR phát hiện được DNA H. pylori ở nồng độ tối thiểu 0,1 ng/µl, vượt trội so với PCR vòng 1.
- **Phát hiện gen CagA**: Nested PCR phát hiện gen CagA ở 3 mẫu bệnh phẩm và đối chứng, với kích thước băng DNA khoảng 420 bp. Trong 35 mẫu dịch dạ dày, tỷ lệ dương tính với H. pylori và gen CagA lần lượt là khoảng 80% và 70%.
- **So sánh với phương pháp truyền thống**: Kết quả Nested PCR có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn so với nhuộm soi mô bệnh học và các phương pháp xâm lấn khác.
### Thảo luận kết quả
Kết quả cho thấy kỹ thuật Nested PCR từ dịch dạ dày là phương pháp hiệu quả để phát hiện H. pylori và gen độc lực CagA với độ nhạy cao, phù hợp với mẫu có lượng DNA thấp và nhiều tạp chất. Việc PCR vòng 1 không phát hiện được DNA đặc hiệu phản ánh thực tế lượng vi khuẩn trong dịch dạ dày thấp, do H. pylori chủ yếu bám trên niêm mạc dạ dày. Nested PCR giúp tăng cường khuếch đại DNA mục tiêu, giảm sai số và tăng độ chính xác.
So với các nghiên cứu trước đây, kết quả tương đồng với các báo cáo về độ nhạy cao của Nested PCR trong phát hiện H. pylori từ mẫu sinh thiết, dịch dạ dày, phân và nước tiểu. Việc phát hiện gen CagA giúp phân loại chủng vi khuẩn có nguy cơ cao gây ung thư dạ dày, hỗ trợ trong đánh giá nguy cơ và điều trị.
Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ dương tính H. pylori và gen CagA trong các mẫu, bảng so sánh độ nhạy giữa Nested PCR và các phương pháp khác, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả của kỹ thuật này.
## Đề xuất và khuyến nghị
- **Triển khai kỹ thuật Nested PCR trong các phòng xét nghiệm lâm sàng** nhằm nâng cao độ chính xác chẩn đoán H. pylori, đặc biệt tại các bệnh viện tuyến tỉnh trong vòng 1 năm tới.
- **Đào tạo nhân viên kỹ thuật về kỹ thuật PCR và xử lý mẫu dịch dạ dày** để đảm bảo chất lượng xét nghiệm, tăng tỷ lệ phát hiện chính xác, thực hiện trong 6 tháng.
- **Phát triển bộ kit xét nghiệm Nested PCR thương mại phù hợp với điều kiện Việt Nam**, giảm chi phí và thời gian xét nghiệm, hướng đến áp dụng rộng rãi trong 2 năm.
- **Tăng cường nghiên cứu ứng dụng phát hiện gen độc lực CagA và các gen kháng thuốc** để hỗ trợ điều trị cá thể hóa, giảm tỷ lệ thất bại điều trị, thực hiện song song với triển khai kỹ thuật.
- **Xây dựng quy trình chuẩn hóa lấy mẫu dịch dạ dày và bảo quản** nhằm giảm sai số và tăng độ tin cậy của kết quả xét nghiệm, áp dụng ngay trong các cơ sở y tế có nội soi.
## Đối tượng nên tham khảo luận văn
- **Bác sĩ chuyên khoa tiêu hóa**: Nắm bắt kỹ thuật chẩn đoán mới, nâng cao hiệu quả điều trị bệnh lý dạ dày do H. pylori.
- **Nhân viên phòng xét nghiệm sinh học phân tử**: Áp dụng kỹ thuật Nested PCR trong chẩn đoán, nâng cao kỹ năng và chất lượng xét nghiệm.
- **Nhà nghiên cứu y sinh học và vi sinh**: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện vi khuẩn và gen độc lực.
- **Quản lý y tế và chính sách y tế**: Đánh giá hiệu quả và khả năng triển khai kỹ thuật mới trong hệ thống y tế, xây dựng chính sách hỗ trợ.
## Câu hỏi thường gặp
1. **Nested PCR là gì và ưu điểm so với PCR thông thường?**
Nested PCR là kỹ thuật PCR hai bước sử dụng hai cặp mồi để tăng độ nhạy và đặc hiệu, giúp phát hiện DNA với lượng rất thấp, giảm sai số do khuếch đại sai.
2. **Tại sao chọn dịch dạ dày làm mẫu thay vì mô sinh thiết?**
Dịch dạ dày lấy dễ dàng, ít xâm lấn, giảm đau đớn cho bệnh nhân, đồng thời vẫn chứa DNA của H. pylori đủ để phát hiện bằng Nested PCR.
3. **Gen CagA có vai trò gì trong bệnh lý dạ dày?**
Gen CagA mã hóa protein độc lực liên quan đến khả năng gây viêm nặng và ung thư dạ dày, giúp phân loại chủng vi khuẩn nguy hiểm hơn.
4. **Độ nhạy của kỹ thuật Nested PCR trong nghiên cứu này là bao nhiêu?**
Kỹ thuật có thể phát hiện DNA H. pylori ở nồng độ tối thiểu 0,1 ng/µl, cao hơn nhiều so với PCR vòng 1 và các phương pháp truyền thống.
5. **Kỹ thuật này có thể áp dụng rộng rãi ở Việt Nam không?**
Với chi phí và yêu cầu kỹ thuật hiện tại, cần đào tạo và đầu tư thiết bị, nhưng có tiềm năng áp dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm lớn và trung tâm y tế.
## Kết luận
- Kỹ thuật Nested PCR từ dịch dạ dày cho phép phát hiện chính xác H. pylori và gen CagA với độ nhạy cao, phù hợp với mẫu có lượng DNA thấp.
- DNA tách chiết từ dịch dạ dày có nồng độ và độ tinh sạch thấp, nhưng Nested PCR vẫn đảm bảo phát hiện hiệu quả.
- Tỷ lệ dương tính với H. pylori và gen CagA trong mẫu dịch dạ dày nghiên cứu lần lượt khoảng 80% và 70%.
- Quy trình chẩn đoán được xây dựng có thể áp dụng trong phòng thí nghiệm lâm sàng, góp phần giảm xâm lấn và nâng cao hiệu quả chẩn đoán.
- Đề xuất triển khai kỹ thuật, đào tạo nhân viên và phát triển bộ kit xét nghiệm phù hợp để ứng dụng rộng rãi trong hệ thống y tế Việt Nam.
Triển khai thử nghiệm quy trình tại các cơ sở y tế, đào tạo kỹ thuật viên và nghiên cứu mở rộng ứng dụng phát hiện gen kháng thuốc để nâng cao hiệu quả điều trị.