Phân tích đặc điểm phân tử đột biến trên exon 8 gen ldlr bằng phương pháp pcr kết hợp giải trình tự đối với một số mẫu bệnh phẩm máu của người việt nam

Nghiên cứu đột biến exon 8 gen LDLR ở người Việt bằng PCR và giải trình tự. Phân tích đặc điểm phân tử trên mẫu bệnh phẩm máu, phục vụ chẩn đoán và điều trị.

• Tác giả: Mai Thị Tiền Phi
• Người hướng dẫn: ThS. Trương Kim Phượng
• Trường học: Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Y Dược
• Đề tài: Phân Tích Đặc Điểm Phân Tử: Đột Biến Trên Exon 8 Gen LDLR Bằng Phương Pháp PCR Kết Hợp Giải Trình Tự Đối Với Một Số Mẫu Bệnh Phẩm Máu Của Người Việt Nam
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2.1. BỆNH TĂNG CHOLESTEROL CÓ TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH (FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA - FH)
• 2.2. Cholesterol và Lipoprotein
• 2.3. Bệnh lý Familial Hypercholesterolemia
• 2.4. GEN LOW DENSITY LIPOPROTEIN RECEPTOR (LDLR)
• 2.5. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÀ MỘT SỐ BỆNH LÝ DI TRUYỀN
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. PHƯƠNG PHÁP
• 3.1.1. Khai thác dữ liệu (Data – mining) và trích xuất dữ liệu vào phân tích tổng hợp
• 3.1.2. Phân tích tổng hợp (Meta-analysis). Phương pháp khảo sát trên máy tính (In silico). Phương pháp thực nghiệm
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. KẾT QUẢ THU THẬP DỮ LIỆU VÀ PHÂN TÍCH TỔNG HỢP GEN LDLR
• 4.1.1. PHÂN TÍCH TỶ LỆ XUẤT HIỆN TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN TRÊN GEN LDLR TRÊN BỘ DỮ LIỆU NGHIÊN CỨU ĐOÀN HỆ. KHẢO SÁT IN SILICO GEN LDLR
• 4.1.1.1. Kết quả thu thập trình tự gen LDLR
• 4.1.1.2. Kết quả thu thập dữ liệu mồi của trình tự exon 8 trên gen LDLR
• 4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM
• 4.2.1. Kết quả tách chiết DNA
• 4.2.2. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự exon 8 gen LDLR
• 4.2.3. Phân tích kết quả giải trình tự bằng công cụ tin sinh
• 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Đột Biến Gen LDLR Exon 8 ở Người Việt

Bệnh tăng cholesterol máu gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là một rối loạn di truyền với các triệu chứng như tích tụ LDL trong máu, cholesterol cao trong da, gân và động mạch vành, dẫn đến xơ vữa động mạch. Nồng độ cholesterol trong máu cao là do suy giảm chức năng của thụ thể LDL hoặc rối loạn chức năng của Apolipoprotein B-100. Mặc dù FH hiếm gặp, tần số mắc bệnh trên thế giới khoảng 1/500, một số nghiên cứu còn ghi nhận 1/250. FH được chia làm hai loại: HoFH (thể đồng hợp) và HeFH (thể dị hợp). Gen LDLR, mã hóa thụ thể LDL, là nguyên nhân chính gây ra FH. Nghiên cứu tập trung vào đột biến exon 8 LDLR ở người Việt thông qua PCR và giải trình tự nhằm xác định sự tương quan giữa đột biến gen và bệnh FH. Một nghiên cứu cho thấy các dạng đột biến xuất hiện trên gen LDLR chiếm hơn 90% đột biến được tìm thấy ở các bệnh nhân FH. Gen LDLR có chiều dài là 45 kb (kilobases) bao gồm 18 exon và 17 intron, nằm trên nhiễm sắc thể 19p13.3 và có khoảng 2000 dạng đột biến trên gen này dẫn tới bệnh lý FH.

1.1. Tìm hiểu về Bệnh Tăng Cholesterol Máu Gia Đình FH

FH là bệnh rối loạn di truyền do đột biến trên các gen mã hóa protein chuyển hóa lipid, cholesterol trong máu. Biểu hiện đặc trưng là nồng độ cholesterol trong máu tăng cao bất thường (350 – 500mg/dL). Brown và Goldstein (1985) chứng minh nồng độ LDL tăng liên quan đến đột biến gen LDLR. Bệnh được xác định dựa vào nồng độ LDL trong máu: HoFH (650 – 1000 mg/dL), HeFH (350 – 550 mg/dL). Một nghiên cứu cho thấy nguy cơ mắc bệnh động mạch vành sớm ở bệnh nhân FH thể dị hợp không được chữa trị cao gấp 13 lần so với người không mắc FH. Tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các bệnh nhân FH lần lượt là > 80% trên gen LDLR, 5 – 10% trên gen APOB và < 1% trên gen PCSK9.

1.2. Vai trò của Gen Low Density Lipoprotein Receptor LDLR

Gen LDLR dài 45 kb, gồm 18 exon và 17 intron, nằm trên nhiễm sắc thể 19p13.3. Các đột biến LDLR là nguyên nhân di truyền chính của FH, với hơn 2000 dạng biến thể xuất hiện ở 90% ca bệnh FH. Các đột biến trên gen LDLR được chia làm 5 loại, dựa trên ảnh hưởng chức năng: không biểu hiện protein LDLR, sai hỏng cấu trúc protein, cản trở tương tác LDLR với APOB, cản trở tương tác LDLR và LDL, rối loạn quá trình tái thiết lập LDLR trên bề mặt tế bào. Henderson (2016) ghi nhận số lượng đột biến trên exon 4 chiếm tỷ lệ cao nhất. Các exon có số lượng biến thể khoảng 100 – 110 là exon 7, 9, 10, 14…

II. Cách Phát Hiện Đột Biến Gen LDLR Exon 8 Phương Pháp PCR

Các phương pháp sinh học phân tử phù hợp xác định tính chất đột biến gen liên quan đến các bệnh lý di truyền. PCR kết hợp giải trình tự khuếch đại đoạn DNA mục tiêu và xác định biến thể trong trình tự DNA. Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP) phát hiện đột biến chưa công bố hoặc lệch khung. Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis (DGGE) phát hiện nhanh đột biến điểm, dựa trên nhiệt độ nóng chảy và tốc độ di chuyển trên gel. Ngoài ra, còn các phương pháp như Allele Specific PCR (AS-PCR), Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).

2.1. Ưu điểm của Phương Pháp PCR trong Phân Tích Đột Biến

PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật khuếch đại DNA chọn lọc. Ưu điểm của PCR bao gồm tính đặc hiệu cao, khả năng khuếch đại nhanh chóng lượng DNA mục tiêu, và tính linh hoạt trong việc thiết kế mồi (primer). PCR được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đột biến gen bởi khả năng phát hiện các biến đổi nhỏ trong trình tự DNA, bao gồm cả đột biến điểm, đột biến chèn/mất đoạn và đột biến chuyển vị. Phương pháp này cung cấp một công cụ mạnh mẽ để xác định các yếu tố di truyền liên quan đến bệnh tật.

2.2. Giải Trình Tự DNA Xác Định Chính Xác Vị Trí Đột Biến

Sau khi khuếch đại DNA bằng PCR, bước tiếp theo là giải trình tự DNA để xác định trình tự nucleotide chính xác của đoạn DNA mục tiêu. Kỹ thuật giải trình tự Sanger là phương pháp phổ biến, cho phép xác định trình tự DNA một cách chính xác và đáng tin cậy. Tuy nhiên, với sự phát triển của công nghệ, giải trình tự thế hệ mới (NGS) đã trở thành một lựa chọn mạnh mẽ, cho phép giải trình tự đồng thời nhiều đoạn DNA với độ chính xác cao. Kết quả giải trình tự cung cấp thông tin chi tiết về vị trí và loại đột biến trong gen LDLR, từ đó giúp xác định nguyên nhân di truyền của bệnh FH.

III. Phân Tích Đột Biến Exon 8 LDLR Nghiên Cứu trên Người Việt

Nghiên cứu tập trung vào exon 8 của gen LDLR vì đây là một trong những vùng có tần suất đột biến cao, ảnh hưởng đến chức năng của thụ thể LDL. Việc phân tích đột biến tại exon 8 trên quần thể người Việt giúp xác định các biến thể gen đặc trưng và đóng góp vào việc chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa bệnh FH. Nghiên cứu sử dụng mẫu bệnh phẩm máu của bệnh nhân người Việt để tiến hành PCR và giải trình tự, từ đó phân tích đặc điểm phân tử của đột biến exon 8. Theo một báo cáo khoa học của Henderson và cộng sự (2016) ghi nhận số lượng đột biến trên exon 4 chiếm tỷ lệ cao nhất khoảng 339 biến thể, bên cạnh đó còn một số exon có số lượng đột biến đáng kể như exon 8 (106 biến thể).

3.1. Tại sao Lại Chọn Exon 8 của Gen LDLR để Nghiên Cứu

Exon 8 của gen LDLR là một vùng quan trọng trong việc mã hóa chức năng của thụ thể LDL. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến tại exon 8 có thể gây ra những thay đổi đáng kể trong cấu trúc và chức năng của protein LDLR, dẫn đến sự giảm khả năng hấp thụ LDL từ máu và gây ra bệnh FH. Việc tập trung vào exon 8 giúp các nhà nghiên cứu tập trung vào một vùng cụ thể, từ đó tăng cường khả năng phát hiện và phân tích các đột biến quan trọng có liên quan đến bệnh FH.

3.2. Ý Nghĩa của Nghiên Cứu trên Quần Thể Người Việt

Mỗi quần thể có thể có những biến thể gen đặc trưng riêng. Việc nghiên cứu đột biến exon 8 LDLR trên quần thể người Việt giúp xác định các đột biến phổ biến trong cộng đồng này và đánh giá mức độ ảnh hưởng của chúng đến bệnh FH. Thông tin này có giá trị quan trọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh FH phù hợp với đặc điểm di truyền của người Việt. Ngoài ra, nghiên cứu này còn đóng góp vào việc xây dựng cơ sở dữ liệu về đột biến gen ở Việt Nam và cung cấp thông tin cho các nghiên cứu di truyền học khác.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đặc Điểm Đột Biến Gen LDLR ở Người Việt

Nghiên cứu đã xác định các dạng đột biến điểm trên exon 8 của gen LDLR trong mẫu bệnh phẩm máu của bệnh nhân người Việt. Phân tích tin sinh học giúp đánh giá ảnh hưởng của các đột biến này đến cấu trúc và chức năng của protein LDLR. Kết quả cho thấy một số đột biến có thể gây ra sự thay đổi cấu trúc protein, làm giảm khả năng liên kết với LDL và dẫn đến tăng nồng độ cholesterol trong máu. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng về cơ chế gây bệnh FH ở người Việt.

4.1. Các Dạng Đột Biến Điểm Thường Gặp ở Exon 8 LDLR

Nghiên cứu đã xác định được một số đột biến điểm thường gặp trên exon 8 của gen LDLR ở người Việt. Các đột biến này bao gồm các thay đổi nucleotide như thay thế base, chèn hoặc mất đoạn nucleotide. Mỗi loại đột biến có thể gây ra những ảnh hưởng khác nhau đến cấu trúc và chức năng của protein LDLR. Việc xác định các đột biến phổ biến giúp các nhà nghiên cứu và bác sĩ tập trung vào việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh FH hiệu quả hơn.

4.2. Ảnh Hưởng của Đột Biến Đến Cấu Trúc và Chức Năng LDLR

Phân tích tin sinh học đã được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các đột biến exon 8 LDLR đến cấu trúc và chức năng của protein LDLR. Kết quả cho thấy một số đột biến có thể gây ra sự thay đổi cấu trúc protein, làm giảm khả năng liên kết với LDL và dẫn đến tăng nồng độ cholesterol trong máu. Các đột biến khác có thể ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein hoặc vận chuyển LDLR đến bề mặt tế bào. Việc hiểu rõ cơ chế ảnh hưởng của đột biến giúp các nhà nghiên cứu phát triển các phương pháp điều trị bệnh FH nhắm vào mục tiêu cụ thể.

V. Ứng Dụng và Ý Nghĩa của Nghiên Cứu Đột Biến Gen LDLR Exon 8

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán sớm bệnh FH ở người Việt. Thông tin về các đột biến gen LDLR đặc trưng giúp phát triển các xét nghiệm di truyền chính xác và hiệu quả. Chẩn đoán sớm cho phép can thiệp điều trị kịp thời, giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân. Nghiên cứu cũng cung cấp cơ sở khoa học cho tư vấn di truyền và phòng ngừa bệnh FH trong gia đình.

5.1. Phát Triển Xét Nghiệm Di Truyền Chẩn Đoán Sớm FH

Thông tin về các đột biến gen LDLR exon 8 đặc trưng ở người Việt có thể được sử dụng để phát triển các xét nghiệm di truyền chẩn đoán sớm bệnh FH. Các xét nghiệm này có thể được thực hiện trên mẫu máu hoặc DNA để xác định sự hiện diện của các đột biến liên quan đến bệnh. Chẩn đoán sớm cho phép can thiệp điều trị kịp thời, giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân.

5.2. Tư Vấn Di Truyền và Phòng Ngừa Bệnh FH trong Gia Đình

Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho tư vấn di truyền và phòng ngừa bệnh FH trong gia đình. Các thành viên trong gia đình có người mắc bệnh FH có thể được xét nghiệm di truyền để xác định xem họ có mang đột biến gen LDLR hay không. Tư vấn di truyền giúp các gia đình hiểu rõ nguy cơ di truyền bệnh cho con cái và đưa ra các quyết định phù hợp về sinh sản. Ngoài ra, các biện pháp phòng ngừa như thay đổi lối sống và điều trị bằng thuốc có thể được áp dụng để giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch ở những người có nguy cơ cao.

VI. Tương Lai Nghiên Cứu Giải Mã Gen LDLR Toàn Diện ở Người Việt

Nghiên cứu này là bước đầu trong việc tìm hiểu về đột biến gen LDLR ở người Việt. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc giải trình tự toàn bộ gen LDLR để xác định tất cả các đột biến có liên quan đến bệnh FH. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu dịch tễ học để đánh giá tần suất mắc bệnh FH và phân bố đột biến gen trong cộng đồng người Việt. Thông tin này sẽ giúp xây dựng các chương trình sàng lọc và phòng ngừa bệnh FH hiệu quả hơn.

6.1. Giải Trình Tự Toàn Bộ Gen LDLR Tìm Kiếm Đột Biến Mới

Trong tương lai, cần tập trung vào việc giải trình tự toàn bộ gen LDLR ở người Việt để xác định tất cả các đột biến có liên quan đến bệnh FH. Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS) cho phép phân tích toàn bộ gen LDLR một cách nhanh chóng và hiệu quả. Việc tìm kiếm đột biến mới giúp các nhà nghiên cứu hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh FH và phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh tiên tiến hơn.

6.2. Nghiên Cứu Dịch Tễ Học Đánh Giá Tần Suất Mắc Bệnh FH

Cần có các nghiên cứu dịch tễ học để đánh giá tần suất mắc bệnh FH và phân bố đột biến gen LDLR trong cộng đồng người Việt. Các nghiên cứu này sẽ cung cấp thông tin quan trọng về mức độ phổ biến của bệnh FH và các yếu tố nguy cơ liên quan. Thông tin này giúp xây dựng các chương trình sàng lọc bệnh hiệu quả và định hướng các nguồn lực y tế để giảm gánh nặng bệnh FH cho cộng đồng.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là một rối loạn di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi sự suy giảm thanh thải lipoprotein tỷ trọng thấp (Low-Density Lipoprotein - LDL) trong huyết tương. Tình trạng này dẫn đến sự tích tụ cholesterol nghiêm trọng trong mạch máu, tạo thành mảng vữa xơ động mạch (Atherosclerotic Cardiovascular Disease - ASCVD) và gây nhồi máu cơ tim sớm. Theo các báo cáo dịch tễ học quốc tế, tỷ lệ mắc bệnh thể dị hợp (Heterozygous FH - HeFH) chiếm khoảng 1/250 dân số thế giới, trong khi thể đồng hợp (Homozygous FH - HoFH) hiếm gặp hơn với tần suất khoảng 1/160.000. Bệnh nhân HeFH nếu không được chẩn đoán và điều trị sớm có nguy cơ mắc bệnh động mạch vành (Coronary Artery Disease - CAD) cao gấp 13 lần và nguy cơ tử vong do bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease - CHD) cao gấp 20 lần so với người bình thường.

                   +------------------------------------------+
                   |  Rối loạn chuyển hóa Cholesterol (FH)     |
                   |  (Tần suất toàn cầu: 1/200 - 1/250)      |
                   +------------------------------------------+
                                        |
               +------------------------+------------------------+
               |                                                 |
+------------------------------+                 +-------------------------------+
| Đột biến gen LDLR (>90%)     |                 | Các gen khác (<10%)           |
| - Chiều dài: 45 kb, 18 Exon  |                 | - APOB (~5%)                  |
| - Exon 8: Điểm nóng đột biến |                 | - PCSK9 (<1%)                 |
|   (106 biến thể đã công bố)  |                 | - LDLRAP1, APOE, SREBP2       |
+------------------------------+                 +-------------------------------+

Tại Việt Nam, các công bố về dịch tễ phân tử và đặc điểm đột biến gen gây bệnh FH còn rất hạn chế. Phần lớn các ca bệnh chỉ được phát hiện ở giai đoạn muộn dựa trên triệu chứng lâm sàng như u vàng (xanthoma) ở gân, cung giác mạc hoặc khi nồng độ cholesterol toàn phần đã vượt ngưỡng 190–500 mg/dL. Hơn 90% trường hợp FH phát sinh từ các đột biến trên gen thụ thể LDL (Low-Density Lipoprotein Receptor - LDLR), nằm trên nhiễm sắc thể 19p13.3 với cấu trúc 18 exon và 17 intron trải dài 45 kb. Trong đó, exon 8 là một trong những vùng chức năng quan trọng chịu trách nhiệm mã hóa cho các cầu nối lặp lại liên kết phối tử và cấu trúc homology với tiền chất EGF (Epidermal Growth Factor).

Mục tiêu của dự án:

1. Phân tích tổng hợp (Meta-analysis): Khai thác dữ liệu toàn cầu từ 35 công trình nghiên cứu đoàn hệ (gồm 7.435 bệnh nhân FH) nhằm xác định tỷ lệ xuất hiện đột biến (Proportion - PR) trên gen LDLR và phân bố đột biến trên exon 8 với độ tin cậy $95%\text{ CI}$.
2. Khảo sát điện toán (In silico): Đánh giá tính chất hóa lý, nhiệt động học và độ đặc hiệu của các bộ mồi khuếch đại vùng exon 8 và ranh giới intron 8 trên trình tự tham chiếu chuẩn NC_000019.10.
3. Thực nghiệm phân tử (In vitro): Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA bộ gen từ mẫu máu toàn phần, thực hiện phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) và phân tích giải trình tự Sanger (Sanger Sequencing) trên các mẫu bệnh nhân Việt Nam có nồng độ cholesterol cao bất thường.

Phạm vi đề tài tập trung vào việc chuẩn hóa quy trình phát hiện đột biến điểm trên exon 8 và các vùng lân cận thuộc intron 8 của gen LDLR, cung cấp cơ sở dữ liệu phân tử ban đầu cho chẩn đoán di truyền y học tại Việt Nam.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Chẩn đoán FH hiện nay trên lâm sàng dựa vào ba hệ thống thang điểm chính: Dutch Lipid Clinic Network (DLCN), Simon Broome (Anh Quốc) và Make Early Diagnosis to Prevent Early Deaths (MEDPED, Hoa Kỳ). Tuy nhiên, các tiêu chí lâm sàng này có độ nhạy không đồng đều khi áp dụng trên các nhóm chủng tộc châu Á. Về mặt kỹ thuật di truyền, các phương pháp phát hiện đột biến truyền thống bộc lộ nhiều hạn chế về độ phân giải và chi phí:

Phương pháp	Ưu điểm	Nhược điểm	Chi phí & Thời gian	Độ chính xác phát hiện SNV
PCR-Sanger Sequencing	Tiêu chuẩn vàng, độ chính xác $>99,9%$, xác định chính xác vị trí và bản chất nucleotide biến đổi.	Khó phát hiện mất/lặp đoạn lớn (CNV), thông lượng đọc trung bình ($500 - 800\text{ bp}$/phản ứng).	Chi phí thấp/trung bình, thời gian xử lý: 24–48h.	Cao nhất (Gold Standard)
SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism)	Chi phí đầu tư thấp, quy trình thực hiện đơn giản trên gel polyacrylamide.	Độ nhạy phụ thuộc kích thước đoạn DNA ($<300\text{ bp}$), tỷ lệ âm tính giả cao ($15 - 30%$).	Chi phí thấp, thời gian xử lý: 12–24h.	Trung bình ($70 - 85%$)
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)	Phát hiện nhanh biến đổi nhiệt độ nóng chảy ($T_m$) của đoạn gen.	Thiết lập dải biến tính hóa học phức tạp, khó phân biệt các đột biến điểm liền kề.	Chi phí trung bình, thời gian xử lý: 24h.	Khá ($80 - 90%$)
Targeted NGS (Next-Generation Sequencing)	Thông lượng cao, đọc đồng thời 18 exon gen LDLR, APOB và PCSK9.	Chi phí đầu tư thiết bị và hóa chất đắt đỏ, đòi hỏi hạ tầng tin sinh học phức tạp.	Chi phí rất cao, thời gian xử lý: 3–7 ngày.	Cao ($>99%$)

Phân loại yêu cầu hệ thống theo mô hình MoSCoW:

• Must have: Quy trình tách chiết DNA đạt độ tinh sạch $A_{260}/A_{280} = 1,8 - 2,0$; cặp mồi khuếch đại đặc hiệu cho sản phẩm kích thước $367\text{ bp}$ bao phủ toàn bộ exon 8; phần mềm phân tích chromatogram phát hiện biến thể dị hợp (heterozygous).
• Should have: Bộ dữ liệu Meta-analysis phân tầng theo chủng tộc, phương pháp phân tích và tiền sử gia đình (Proband vs Family).
• Could have: Đánh giá cấu trúc không gian protein LDLR đột biến bằng các công cụ dự đoán in silico (SIFT, PolyPhen-2).
• Won't have (lần này): Giải trình tự toàn bộ 18 exon và 17 intron của gen LDLR trên quy mô quần thể lớn ($N > 100$).

Thiết kế hệ thống

Quy trình kỹ thuật tổng thể kết hợp giữa phương pháp dịch tễ phân tử dựa trên bằng chứng (Evidence-Based Meta-Analysis), công nghệ sinh học tính toán (Bioinformatics) và sinh học phân tử thực nghiệm (Molecular Biology):

[ Cơ sở dữ liệu NCBI/PubMed ] --------> [ Meta-Analysis (MedCalc v18.2) ]
                                                        |
[ GenBank: NC_000019.10 ] ------------> [ In Silico Primer Design & BLAST ]
                                                        |
[ Mẫu máu bệnh nhân (n=3) ] -----------> [ Tách chiết DNA (Phenol/Chloroform) ]
                                                        |
                                        [ Đo quang phổ UV-Vis (A260/A280) ]
                                                        |
                                        [ Phản ứng PCR khuếch đại Exon 8 ]
                                                        |
                                        [ Điện di Gel Agarose 1.5% ]
                                                        |
                                        [ Giải trình tự Sanger (ABI 3730xl) ]
                                                        |
                                        [ Phân tích biến thể (CodonCode / Chromas) ]

Danh mục công nghệ và công cụ sử dụng:

• Thống kê y sinh: MedCalc® Software v18.2.1 (thuật toán DerSimonian-Laird Random Effects Model, kiểm định bất đồng nhất $I^2$, Funnel plot, Forest plot).
• Cơ sở dữ liệu: GenBank (NCBI), Leiden Open Variation Database (LOVD), HGMD (Human Gene Mutation Database).
• Thiết kế & Đánh giá mồi: NCBI BLASTN, IDT OligoAnalyzer 3.1, Annhyb v4.946.
• Phân tích trình tự gen: Chromas Lite v2.6, CodonCode Aligner v8.2.
• Hóa chất & Thiết bị thực nghiệm: BioLine 2X Master Mix, Proteinase K ($18,5\text{ mg/mL}$), Máy luân nhiệt PCR BIO-RAD T100, Hệ thống chụp gel Gel Doc XR (Bio-Rad), Máy đo quang phổ phân tích DNA/RNA UV-Vis.

Methodology

Nghiên cứu áp dụng quy trình chuẩn hóa theo 3 giai đoạn:

$$\text{Quy trình} = \text{Meta-Analysis (PICO)} \longrightarrow \text{In Silico Screening} \longrightarrow \text{In Vitro Validation}$$

1. Giai đoạn 1 - Meta-analysis: Xây dựng tiêu chí chọn lọc PICO (Population, Intervention, Comparison, Outcome). Xác định mức độ bất đồng nhất bằng chỉ số Higgins $I^2$: $$I^2 = \max\left(0, \frac{Q - \text{df}}{Q}\right) \times 100%$$ Khi $I^2 > 50%$ ($P < 0,1$), mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random Effects Model) của DerSimonian-Laird được áp dụng để tính toán tỷ lệ gộp (Pooled Proportion - PR) cùng khoảng tin cậy $95%\text{ CI}$.
2. Giai đoạn 2 - In Silico Optimization: Khảo sát năng lượng tự do Gibbs ($\Delta G$) cho các cấu trúc thứ cấp của mồi (hairpin, self-dimer, hetero-dimer) nhằm triệt tiêu hiện tượng mồi bắt cặp không đặc hiệu.
3. Giai đoạn 3 - Chuẩn hóa thực nghiệm: Kiểm soát chất lượng mẫu DNA đầu vào thông qua định lượng quang phổ ở bước sóng $260\text{ nm}$ và $280\text{ nm}$. Nồng độ DNA được tính theo công thức: $$C;(\mu\text{g/mL}) = 50 \times A_{260} \times d$$ (trong đó $d$ là hệ số pha loãng).

---

Implementation và kết quả

Development process

1. Thiết kế và khảo sát mồi Exon 8 gen LDLR

Trình tự vùng gen mã hóa LDLR được trích xuất từ mã định danh chuẩn NC_000019.10 (vị trí 11.200.038 - 11.244.516). Cặp mồi tối ưu LDLR_F2 và LDLR_R2 được lựa chọn dựa trên các thông số nhiệt động học:

Vị trí khuếch đại: NC_000019.10 (22.030 bp -> 22.397 bp)
Kích thước sản phẩm dự kiến: 367 bp (Bao gồm Exon 8: 126 bp và ranh giới Intron 8: 241 bp)

Forward Primer (LDLR_F2): 5'- GCTGTTTCCTTGATTACATCTC -3' (22 nt, Tm = 58.28°C, GC% = 40.9%)
Reverse Primer (LDLR_R2): 5'- GATATGAGTCTGTGCAAAGTTC -3' (22 nt, Tm = 57.85°C, GC% = 40.9%)

# Mô phỏng thuật toán tính nồng độ và kiểm tra chất lượng DNA
def evaluate_dna_quality(a260: float, a280: float, dilution_factor: float = 40.0) -> dict:
    purity_ratio = a260 / a280 if a280 > 0 else 0.0
    concentration_ug_ml = 50.0 * a260 * dilution_factor
    is_pure = 1.8 <= purity_ratio <= 2.0
    
    return {
        "A260/A280": round(purity_ratio, 3),
        "Concentration_ug_ml": round(concentration_ug_ml, 2),
        "Purity_Status": "PASSED" if is_pure else "WARNING: Contaminated"
    }

# Kết quả kiểm tra mẫu bệnh phẩm máu bệnh nhân
sample_1 = evaluate_dna_quality(a260=0.048, a280=0.025, dilution_factor=40.0)
print(sample_1) # Output: {'A260/A280': 1.92, 'Concentration_ug_ml': 96.0, 'Purity_Status': 'PASSED'}

2. Thiết lập chu trình nhiệt PCR

Phản ứng PCR được tối ưu hóa với tổng thể tích $50,\mu\text{L}$ gồm: $25,\mu\text{L}$ 2X BioLine Master Mix, $0,5,\mu\text{L}$ mồi F ($10,\mu\text{M}$), $0,5,\mu\text{L}$ mồi R ($10,\mu\text{M}$), $2,5,\mu\text{L}$ DNA khuôn ($~100\text{ ng}$) và $21,5,\mu\text{L};\text{ddH}_2\text{O}$.

Giai đoạn	Nhiệt độ (°C)	Thời gian	Số chu kỳ	Chức năng sinh học
Biến tính ban đầu	95°C	5 phút	1	Tách hoàn toàn cấu trúc xoắn kép của DNA bộ gen.
Biến tính chu kỳ	95°C	30 giây	\multirow{3}{*}{35 chu kỳ}	Tách mạch khuôn đơn.
Bắt cặp mồi (Annealing)	60°C	30 giây	Mồi LDLR_F2/R2 liên kết đặc hiệu với mạch khuôn.
Kéo dài chuỗi (Extension)	72°C	30 giây	Taq Polymerase tổng hợp mạch mới ($~1.000\text{ bp/phút}$).
Kéo dài cuối cùng	72°C	10 phút	1	Hoàn thiện quá trình kéo dài các phân tử DNA khuếch đại.
Bảo quản	4°C	$\infty$	1	Giữ ổn định sản phẩm sau phản ứng.

Testing và validation

1. Kiểm định sản phẩm khuếch đại: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose $1,5%$ với chất nhuộm GelRed ở hiệu điện thế $70\text{V}$ trong 30 phút. Đối chiếu thang chuẩn DNA ($50\text{ bp} - 100\text{ bp}$ DNA Ladder), cả 3 mẫu bệnh phẩm đều cho băng sản phẩm đơn, sắc nét, đúng kích thước lý thuyết $367\text{ bp}$, không xuất hiện dimer mồi hay băng phụ không đặc hiệu.
2. Kiểm tra chất lượng giải trình tự Sanger: Dữ liệu chromatogram từ thiết bị ABI 3730xl được kiểm tra trên phần mềm Chromas Lite 2.6. Tín hiệu đỉnh sóng (peak) huỳnh quang đồng đều, tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu ($S/N > 40$), không có hiện tượng chồng đỉnh bất thường ở các nucleotide bình thường.

                    Sanger Sequencing Alignment Map:
Reference (NC_000019.10):  ... G  T  C  A ... (Vị trí 22320 - 22323)
Patient Samples (Hetero):  ... K  S  M  R ...
                               |  |  |  |
                               T>G G>C C>A A>G (Double Peaks on Chromatogram)

Kết quả đạt được

Kết quả Meta-analysis trên 35 nghiên cứu đoàn hệ ($N = 7.435$ mẫu)

• Tỷ lệ phát hiện đột biến chung trên gen LDLR ở bệnh nhân FH đạt $51,27%$ ($95%\text{ CI}: 43,70% - 58,81%$, mô hình Random Effects, $I^2 = 97,43%$).
• Phân nhóm theo phương pháp: Phương pháp PCR – Giải trình tự đạt tỷ lệ phát hiện đột biến lên tới $62,46%$ ($95%\text{ CI}: 51,70% - 72,63%$), vượt trội hơn hẳn so với các phương pháp quét đột biến khác ($45,19%$).
• Phân bố đột biến theo exon: Exon 4 chiếm tỷ lệ cao nhất ($13,59%$), tiếp theo là exon 12 ($9,85%$), exon 9 ($8,81%$) và exon 8 chiếm $6,05%$ ($95%\text{ CI}: 3,62% - 9,04%$, tương ứng 106 biến thể đã được ghi nhận trong y văn).

Meta-Analysis Subgroup Results (Proportion % [95% CI]):
-------------------------------------------------------------------------------
[All Studies (n=35)]         |============== 51.27% ==============|
[PCR - Sequencing (n=15)]    |=================== 62.46% ===================|
[Other Methods (n=20)]       |============ 45.19% ============|
[Exon 8 LDLR (n=16)]         |=== 6.05% ===|
-------------------------------------------------------------------------------
0%                          20%                          50%                 100%

Kết quả phân tích phân tử trên mẫu bệnh nhân Việt Nam

Khi gióng hàng trình tự với trình tự tham chiếu NC_000019.10 và NM_000527.4 bằng công cụ CodonCode Aligner 8.2:

• Vùng mã hóa exon 8 ($126\text{ bp}$) không ghi nhận đột biến thay thế axit amin nào trên 3 mẫu khảo sát.
• Phát hiện cụm 4 biến thể dị hợp liên tiếp mới trên vùng Intron 8 (ngay sau vị trí nucleotide cuối cùng của exon 8):

STT Mẫu	Vị trí biến thể (NC_000019.10)	Danh pháp HGVS (NM_000527.4)	Kiểu gen	Trạng thái công bố
Mẫu 1, 2, 3	$22320\text{T}>\text{G}$	c.1186+43T>G	Dị hợp (Heterozygous)	Biến thể mới tại Việt Nam
Mẫu 1, 2, 3	$22321\text{G}>\text{C}$	c.1186+44G>C	Dị hợp (Heterozygous)	Biến thể mới tại Việt Nam
Mẫu 1, 2, 3	$22322\text{C}>\text{A}$	c.1186+45C>A	Dị hợp (Heterozygous)	Biến thể mới tại Việt Nam
Mẫu 1, 2, 3	$22323\text{A}>\text{G}$	c.1186+46A>G	Dị hợp (Heterozygous)	Biến thể mới tại Việt Nam

---

Đổi mới và đóng góp

1. Quy trình kết hợp Meta-Bioinformatics-InVitro: Đề tài đã xây dựng thành công đường ống phân tích từ việc tổng hợp bằng chứng y học chứng cứ trên $7.435$ ca bệnh toàn cầu đến thiết kế mồi in silico và tối ưu hóa phản ứng thực nghiệm PCR-Sanger.
2. Bằng chứng định lượng về độ nhạy phương pháp: Chứng minh phương pháp PCR – Giải trình tự có tỷ lệ phát hiện đột biến ($62,46%$) cao hơn $38,2%$ so với các kỹ thuật quét biến thể truyền thống như SSCP/DGGE ($45,19%$).
3. Phát hiện đặc điểm phân tử mới ở người Việt: Lần đầu tiên ghi nhận cụm biến thể nucleotide c.1186+43T>G, c.1186+44G>C, c.1186+45C>A, c.1186+46A>G tại ranh giới splicing của intron 8 trên bệnh nhân người Việt Nam có chỉ số cholesterol máu cao ($>5\text{ mmol/L}$).
4. Chuẩn hóa bộ công cụ chẩn đoán giá thành thấp: Cặp mồi LDLR_F2/R2 được chứng minh có độ đặc hiệu $100%$ cho kích thước $367\text{ bp}$, loại bỏ hoàn toàn các cấu trúc thứ cấp cản trở phản ứng khuếch đại.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

[ Bệnh nhân nghi ngờ FH (LDL-C >= 190 mg/dL) ]
                      |
                      v
      [ Thu nhận 2 mL máu chống đông EDTA ]
                      |
                      v
[ Tách chiết DNA & Định lượng quang phổ UV-Vis ]
                      |
                      v
     [ PCR Khuếch đại Exon 8 (Cặp mồi LDLR_F2/R2) ]
                      |
                      v
    [ Gửi giải trình tự Sanger 2 chiều (F/R) ]
                      |
                      v
 [ Đọc Chromatogram & Đối chiếu mã HGVS chuẩn ]
                      |
                      v
[ Tư vấn di truyền & Sàng lọc gia đình (Cascade Screening) ]

• Sàng lọc phân tử trong bệnh viện: Ứng dụng trực tiếp tại các trung tâm xét nghiệm y khoa, khoa tim mạch và các viện nghiên cứu di truyền để xác nhận chẩn đoán FH mức độ phân tử, hỗ trợ phân tầng nguy cơ bệnh tim mạch sớm.
• Sàng lọc tầng bậc (Cascade Screening): Xác định thành viên gia đình mang gen đột biến để can thiệp hạ lipid máu (Statin/Ezetimibe hoặc ức chế PCSK9) trước khi xuất hiện biến cố xơ vữa mạch vành.
• Tối ưu chi phí y tế: Chi phí cho một xét nghiệm PCR-Sanger một exon ước tính chỉ khoảng $200.000 - 350.000\text{ VNĐ}$, thấp hơn 10 lần so với việc giải trình tự toàn bộ gen bằng NGS, hoàn toàn phù hợp với điều kiện bảo hiểm y tế và khả năng chi trả của người bệnh tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng phát triển

• Hạn chế:
  • Kích thước mẫu thực nghiệm còn hạn chế ($N = 3$), chủ yếu phục vụ việc chuẩn hóa quy trình kỹ thuật.
  • Nghiên cứu chỉ tập trung vào exon 8 và một phần intron 8, chưa bao quát toàn bộ 18 exon của gen LDLR cũng như các gen phối hợp ($APOB, PCSK9, LDLRAP1$).
• Hướng phát triển:
  • Mở rộng quy mô khảo sát trên cỡ mẫu lớn ($N \ge 100$) bao gồm cả nhóm bệnh nhân và nhóm đối chứng người Việt khỏe mạnh.
  • Thực hiện giải trình tự toàn bộ 18 exon của gen LDLR bằng kỹ thuật Multiplex PCR kết hợp NGS thế hệ mới.
  • Thực hiện các thử nghiệm chức năng (Functional Assay) và phân tích biểu hiện RNA (RT-PCR) để đánh giá ảnh hưởng của cụm đột biến intron 8 đến quá trình cắt nối phân tử (alternative splicing) và nồng độ thụ thể LDLR trên bề mặt tế bào gan.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên Y Sinh: Nguồn tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình kết hợp Meta-analysis, Tin sinh học và Sinh học phân tử thực nghiệm.
• Kỹ thuật viên phòng Lab Di truyền: Quy trình PCR chuẩn hóa, thành phần phản ứng, chu trình nhiệt và thông số mồi có thể áp dụng trực tiếp trong xét nghiệm lâm sàng.
• Bác sĩ Tim mạch & Nội tiết: Bằng chứng khoa học về tỷ lệ đột biến và các biến thể di truyền đặc trưng trên quần thể bệnh nhân để xây dựng phác đồ điều trị cá thể hóa.
• Cộng đồng bệnh nhân FH: Cơ hội được chẩn đoán sớm ở mức độ gen, phòng ngừa biến cố nhồi máu cơ tim và đột quỵ từ độ tuổi thanh thiếu niên.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật tối thiểu để triển khai quy trình PCR-Sanger exon 8 gen LDLR là gì? Phòng thí nghiệm cần trang bị máy ly tâm lạnh ($13.000\text{ rpm}$), máy quang phổ đo nồng độ DNA/RNA, máy luân nhiệt PCR 96 giếng, hệ thống điện di ngang kèm nguồn $70\text{V}$, buồng chụp gel UV/Blue light và kết nối dịch vụ giải trình tự Sanger mao quản ABI 3730xl.

2. Tại sao cụm biến thể intron 8 (c.1186+43 đến c.1186+46) lại đáng chú ý dù không nằm trong exon? Các biến thể nằm gần ranh giới cắt nối (splice donor/acceptor site) có thể làm thay đổi nhận diện của phức hợp spliceosome, dẫn đến hiện tượng bỏ sót exon (exon skipping) hoặc giữ lại intron (intron retention), tạo ra chuỗi mRNA phiên mã sai hỏng và protein LDLR mất hoạt tính.

3. Phương pháp này có tích hợp được với các hệ thống phân tích tự động hiện nay không? Có. File dữ liệu thô định dạng .ab1 từ máy Sanger tương thích hoàn toàn với các phần mềm phân tích biến thể tự động như CodonCode Aligner, Mutation Surveyor hoặc các pipeline phân tích mã nguồn mở trên nền tảng Python/Biopython.

4. Tần suất kiểm chuẩn và bảo trì hệ thống PCR cần thực hiện như thế nào? Cần hiệu chuẩn nhiệt độ máy PCR định kỳ 6 tháng/lần, kiểm tra độ đồng đều nhiệt giữa các giếng bằng nhiệt kế chuẩn điện tử. Mỗi mẻ phản ứng PCR bắt buộc phải chạy kèm mẫu chứng âm (Negative Control - NTC) để kiểm soát ngoại nhiễm.

5. Chi phí đầu tư xét nghiệm và thời gian thu hồi vốn (ROI) cho cơ sở y tế? Chi phí đầu tư hóa chất cho mỗi phản ứng khoảng $15 - 20\text{ USD}$. Với quy mô phòng xét nghiệm thực hiện 50–100 mẫu/tháng, cơ sở y tế có thể tối ưu hóa quy trình và đạt điểm hòa vốn trong vòng 6–12 tháng vận hành.

---

Kết luận

Đề tài đã hoàn thành xuất sắc việc xây dựng bức tranh toàn cảnh về dịch tễ học phân tử của gen LDLR trong bệnh lý tăng cholesterol máu gia đình thông qua phân tích tổng hợp trên $7.435$ bệnh nhân toàn cầu, đồng thời chuẩn hóa thành công quy trình thực nghiệm PCR – Giải trình tự Sanger cho exon 8 trên người Việt Nam. Việc phát hiện cụm 4 biến thể mới tại vùng intron 8 mở ra hướng nghiên cứu quan trọng về cơ chế bệnh sinh phân tử đặc thù của quần thể người Việt. Quy trình xét nghiệm có độ chính xác cao, chi phí hợp lý, sẵn sàng chuyển giao cho các cơ sở y tế để nâng cao hiệu quả chẩn đoán sớm và bảo vệ sức khỏe tim mạch cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Familial hypercholesterolaemia (FH) - bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình là một dạng bệnh lý rối loạn di truyền, gồm các triệu chứng lâm sàng như tích tụ LDL trong máu, nồng độ cao cholesterol trong da, gân và động mạch vành dẫn tới chứng xơ vữa động mạch vành (Atherosclerotic Cardiovascular Disease - ASCVD) (Marais et al., 2004; Maglio et al. Nồng độ cholesterol trong máu cao bất thường là do suy giảm chức năng của thụ thể LDL hoặc rối loạn chức năng của Apolipoprotein B-100 (Zakharova et al. Mặc dù FH thường được xem là dạng bệnh hiếm gặp nhưng tần số mắc bệnh FH trên thế giới vào khoảng 1/500 (Marais et al. Đến năm 2016, nhiều công bố nghiên cứu ghi nhận trên thế giới tăng lên khoảng 1/250 (Henderson et al., 2016; Abul-Husn et al., 2016; Benito-Vicente et al.

FH được chia làm hai loại: HoFH (Homozygous FH) - thể đồng hợp và HeFH (Heterozygous FH) - thể dị hợp (Henderson et al. Trong đó, tần số mắc bệnh thể HoFH trong khoảng 1/160.000 và thể HeFH trong khoảng là 1/200 – 1/250 (Henderson et al. Theo nghiên cứu của Klose và cộng sự (2014), Wiegman và cộng sự (2015) và Maya và cộng sự (2017) ghi nhận bệnh lý FH là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến bệnh xơ vữa động mạch và nhồi máu cơ tim. Theo các nghiên cứu của Abul-Husn và cộng sự (2016) và Benito-Vicente và cộng sự (2018) cho thấy nguyên nhân dẫn đến FH chủ yếu là do tính chất đột biến điểm xuất hiện trên các gen mã hóa protein tham gia vào cơ chế chuyển hóa cholesterol trong máu: Low density lipoprotein receptor (LDLR), Apolipoprotein B (APOB) và Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9).

Trong đó, các dạng đột biến xuất hiện trên gen LDLR chiếm hơn 90% đột biến được tìm thấy ở các bệnh nhân FH (Benito-Vicente et al., 2018), đột biến được thống kê ở gen ApoB là khoảng 5% và gen PCSK9 là <1% (Henderson et al. Gen LDLR có chiều dài là 45 kb (kilobases) bao gồm 18 exon và 17 intron, nằm trên nhiễm sắc thể 19p13.3 và có khoảng 2000 dạng đột biến trên gen này dẫn tới bệnh lý FH (Benito-Vicente et al. Các dạng đột biến hiện diện trải vi BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP dài ở hầu hết trên tất cả các exon, điển hình là ở exon 4 (19.3%) (Shu et al.7%), exon 10 (11%) (Al-Khateeb et al. Kế thừa kết quả của cùng nhóm nghiên cứu, chúng tôi thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp: “PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ: ĐỘT BIẾN TRÊN EXON 8 GEN LDLR BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ ĐỐI VỚI MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM MÁU CỦA NGƯỜI VIỆT NAM”.

Mục tiêu: Xác định sự tương quan giữa tính chất đột biến trên gen LDLR và bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình thông qua phương pháp phân tích tổng hợp và khảo sát thực nghiệm về tần số xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR trên các mẫu bệnh phẩm máu của các quần thể bệnh nhân trên thế giới và ở Việt Nam. Nội dung nghiên cứu: - Khai thác dữ liệu trên ngân hàng dữ liệu NCBI và Google Scholar về đặc điểm của các đột biến trên gen LDLR với bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình và một số bệnh lý liên quan khác. - Xác định sự tương quan giữa tỷ lệ đột biến với bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình bằng phương pháp phân tích tổng hợp Meta – analysis. - Khảo sát thực nghiệm, ứng dụng phương pháp PCR – giải trình tự nhằm khảo sát tính chất đột biến trên exon 8 gen LDLR đối với mẫu bệnh phẩm máu của bệnh nhân Việt Nam.

vii BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU I. Bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) I. Cholesterol và Lipoprotein Cholesterol là thành phần chủ yếu trong cấu trúc màng tế bào, là tiền chất để gan sản xuất acid mật và ruột sản xuất lypoprotein trong tế bào nhân thật (Marais et al.

Lipoprotein là một phức hợp của lipid và protein chuyên biệt, có chức năng vận chuyển chất béo (triglyceride, cholesteryl ester…) từ gan theo hệ bạch huyết tới các tế bào đích để cung cấp năng lượng cho các quá trình sinh hóa diễn ra trong tế bào người. Thêm vào đó, lipoprotein có vai trò tham gia vào cơ chế đông máu, làm lành vết thương và một số cơ chế miễn dịch (Wansan et al. Lipoprotein được chia thành các dạng như sau: - Lipoprotein mật độ cao (High density lipoprotein – HDL) gồm 3 phân lớp HDL – 1, HDL – 2, HDL – 3 với sự khác nhau về kích thước và tỷ lệ protein và chất béo. HDL mang cholesterol (HDL – C) dư thừa trong thể dịch (máu) sẽ được hấp thu vào gan theo cơ chế “vận chuyển cholesterol ngược”.

HDL có thể cản trở quá trình vận chuyển cholesterol tới các mô theo phương thức liên kết với các thụ thể LDL (LDLR) gan trên bề mặt tế bào (Clark et al. - Lipoprotein mật độ thấp (Low density lipoprotein – LDL) chiếm khoảng 60 - 70% tổng lượng cholesterol trong huyết tương, là chất mang cholesterol chủ yếu trong huyết tương và có khả năng thấm qua thành mạch. Khi có sự liên kết giữa LDL – Cholesterol với thụ thể LDL trên bề mặt gan và các cơ quan khác sẽ chuyển cholesterol về lại tế bào gan. Thiếu hụt thụ thể LDL dẫn đến giảm sự chuyển hóa cholesterol, gây tăng bất thường lượng choleterol trong máu.

Do đó, khi có sự bất hoạt hoặc suy giảm chức năng của thụ thể LDL dẫn đến bệnh lý FH với các triệu chứng như nồng độ cholesterol trong máu tăng cao khoảng 350 – 500mg/dL, xuất hiện gân xanthoma và bệnh tim mạch vành (Clark et al. 1 BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - Lipoprotein mật độ rất thấp (Very low density lipoproteins – VLDL) là loại lipoprotein chính được tiết ra từ gan và có chức năng chính trong việc vận chuyển triglyceride nội sinh từ gan đến các tế bào mô trong cơ thể (Wansan et al. - Lipoprotein mật độ trung bình (Intermediate density lipoprotein – IDL) là loại lipoprotein được hình thành bởi cholesteryl ester và triglyceride trong cơ chế vận chuyển và thoái biến triglyceride. Sau đó, IDL được biến đổi và chuyển vào gan thông qua cơ chế tương tác với thụ thể LDL, hoặc biến đổi thành LDL (Wansan et al.

Bệnh lý Familial Hypercholesterolemia Familial Hypercholesterolemia (FH) là bệnh lý rối loạn di truyền, xảy ra trên nhiễm sắc thể thường, thường do các dạng đột biến tập trung trên các gen mã hóa protein chuyển hóa lipid, cholesterol trong máu. Biểu hiện đặc trưng của bệnh FH là nồng độ cholesterol trong máu tăng cao bất thường (350 – 500mg/dL) (Clark et al. Nghiên cứu đoạt giải Nobel năm 1985 của Brown và Goldstein – nhóm tác giả đầu tiên chứng minh được nồng độ LDL tăng bất thường trong huyết tương có liên quan đến đột biến trên gen LDLR (Pears et al. Bệnh FH được xác định chủ yếu dựa vào nồng độ LDL trong máu, cụ thể nồng độ LDL – Cholesterol (LDL – C) ở bệnh nhân HoFH trong khoảng 650 – 1000 mg/dL, nồng độ LDL – Cholesterol (LDL – C) ở bệnh nhân HeFH trong khoảng 350 – 550 mg/dL (Goldberg et al.

Nồng độ cholesterol ở bệnh nhân FH ở độ tuổi trưởng thành (trên 20 tuổi) ≥ 190mg/dL và ở độ tuổi trẻ em ≥ 160mg/dL (Goldberg et al. Bệnh FH thể đồng hợp (Homozygous FH – HoFH) thường có tần số là 1/160.000, bệnh FH thể dị hợp (Heterozygous FH – HeFH) lại có tần số người mắc phải là 1/200 – 250 (Henderson et al. Một số báo cáo khoa học ghi nhận nguy cơ mắc bệnh động mạch vành sớm (Coronary Artery Disease – CAD) ở những bệnh nhân FH thể dị hợp không được chữa trị cao gấp 13 lần so với những người không mắc FH (Harada-Shiba et al., 2018), nguy cơ dẫn đến bệnh tim mạch vành 2 BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP sớm (Coronary Heart Disease – CHD) ở các trường hợp mắc FH cao gấp là 20 lần so với những người không mắc FH (Goldberg et al. Công bố khoa học của Ahmad và cộng sự (2016) cho thấy có khoảng 1,5 triệu người có thể mắc bệnh lý FH tại Hoa Kỳ.

Theo công bố khoa học của Bellgard và cộng sự (2017), ước tính có hơn 65.000 người mắc FH ở Úc, tuy nhiên số trường hợp được chẩn đoán không nhiều. Ở Đức, tần suất mắc bệnh FH khoảng 1/500 (Klose et al. Tần suất số người mắc FH kiểu dị hợp ở Nhật Bản là 1/200 – 500 (Harada-Shiba et al. - Nghiên cứu của Di Taranto và cộng sự (2015) xác định FH được chia làm 2 loại dựa vào kiểu hình là dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng trội trên nhiễm sắc thể thường (Autosomal Dominant Hypercholesterolemia – ADH), và dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng lặn trên nhiễm sắc thể thường (Autosomal Recessive Hypercholesterolemia – ARH).

- Công trình nghiên cứu của Pears và cộng sự (2015) xác định các nguyên chính dẫn đến bệnh FH ở dạng FH – ADH bao gồm: (1) Đột biến xuất hiện trên gen thụ thể LDL (Low Density Lipoprotein Receptor – LDLR) dẫn đến LDLR không tương tác với LDL – C, dẫn đến cholesterol không chuyển vào gan, làm tăng nồng độ cholesterol trong huyết tương. (2) Đột biến xuất hiện trên gen Proprotein Convertase Subtilisin / Kexin type 9 (PCSK9) dẫn đến sự sai hỏng protein PCSK9, gây nên sự thoái biến các thụ thể LDL trên tế bào gan. (3) Đột biến điểm trên gen Apolipoprotein B – 100 (APOB – 100) dẫn đến thể Apolipoprotein bị khiếm khuyết dẫn đến sự ngăn cản liên kết giữa LDL với LDLR trong tế bào gan. Hệ quả là sự gia tăng nồng độ cholesterol trong máu (Myant et al., 1993; Pears et al.

Các dạng đột biến này tạo nên bệnh lý FH thuộc thể khiếm khuyết Apolipoprotein B – 100 có tính chất gia đình (Familial Defective Apolipoprotein B – 100 – FDB). Theo công bố khoa học của Alonso và cộng sự (2018), tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các bệnh nhân FH lần lượt là > 80% trên gen LDLR, 5 – 10% trên gen APOB và 3 BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP < 1% trên gen PCSK9 (Alonso et al. Bên cạnh đó, còn có tính chất đột biến xảy ra trên một số gen ở trạng thái allele lặn dẫn đến bệnh lý FH, gồm có: Low – density lipoprotein receptor adaptor protein 1 (LDLRAP1), APOE, SREBP2, STAP1 và LIPA (Alonso et al. - Việc chẩn đoán bệnh FH thường dựa vào sự biểu hiện bệnh theo các tiêu chí: LDL – C ≥ 180 mg/dL; biểu hiện u vàng (xanthoma) trên gân và da và tiền sử mắc bệnh FH hoặc CAD sớm trong gia đình (Harada-Shiba et al.