Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là một bệnh lý rối loạn di truyền chuyển hóa lipoprotein trên nhiễm sắc thể thường. Bệnh đặc trưng bởi sự tích tụ lipoprotein tỷ trọng thấp (Low-Density Lipoprotein - LDL) trong huyết tương, dẫn đến nồng độ cholesterol tăng cao trong các mô cơ thể, bao gồm lắng đọng tại da, gân và hệ thống động mạch vành. Hậu quả lâm sàng nghiêm trọng nhất của tình trạng này là thúc đẩy quá trình xơ vữa động mạch vành sớm (Atherosclerotic Cardiovascular Disease - ASCVD) và nhồi máu cơ tim. Trước đây, FH thường được xem là bệnh lý hiếm gặp với tần suất mắc trong quần thể khoảng 1/500; tuy nhiên, các công bố khoa học quốc tế ghi nhận tỷ lệ này đã tăng lên mức khoảng 1/250. Về mặt lâm sàng và di truyền, bệnh được phân thành hai dạng chính:

  • Thể đồng hợp (Homozygous FH - HoFH): Tần số xuất hiện trong cộng đồng vào khoảng 1/160.000, nồng độ LDL-Cholesterol (LDL-C) huyết tương thường dao động trong khoảng 650 – 1000 mg/dL.
  • Thể dị hợp (Heterozygous FH - HeFH): Tần số phổ biến hơn, dao động từ 1/200 đến 1/250, với nồng độ LDL-C nằm trong khoảng 350 – 550 mg/dL.

Những bệnh nhân mắc thể dị hợp không được phát hiện và can thiệp kịp thời có nguy cơ mắc bệnh động mạch vành sớm (Coronary Artery Disease - CAD) cao gấp 13 lần, và nguy cơ mắc bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease - CHD) cao gấp 20 lần so với người bình thường.

Nguyên nhân phân tử gây ra bệnh FH chủ yếu bắt nguồn từ các đột biến điểm xuất hiện trên các gen mã hóa protein tham gia trực tiếp vào con đường thu nhận và thoái biến cholesterol trong máu: gen thụ thể LDL (Low-Density Lipoprotein Receptor - LDLR), gen Apolipoprotein B (APOB) và gen Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9 (PCSK9). Trong đó, các đột biến xảy ra trên gen LDLR chiếm tỷ lệ áp đảo (trên 80% đến 90% các trường hợp FH), trong khi đột biến trên gen APOB chiếm khoảng 5 – 10% và gen PCSK9 dưới 1%. Gen LDLR có kích thước 45 kb, gồm 18 exon và 17 intron, định vị trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 19 (19p13.3). Hiện nay, khoảng 2000 dạng biến thể đột biến khác nhau trên gen LDLR đã được ghi nhận trên thế giới. Đột biến phân bố rải rác trên hầu hết các exon, tập trung mật độ cao ở exon 4 (chiếm 19,3% tổng số đột biến, tương ứng 339 biến thể), exon 3 (125 biến thể) và exon 8 (106 biến thể).

Tại Việt Nam, các nghiên cứu chuyên sâu về dịch tễ học phân tử và đặc điểm đột biến gen LDLR ở các bệnh nhân tăng cholesterol máu còn hạn chế. Nhằm làm sáng tỏ mối liên hệ di truyền và bước đầu khảo sát thực nghiệm trên mẫu bệnh phẩm trong nước, đề tài khóa luận được thực hiện với các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

  • Mục tiêu nghiên cứu: Xác định sự tương quan giữa tính chất đột biến trên gen LDLR và bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình thông qua phương pháp phân tích tổng hợp (Meta-analysis), đồng thời khảo sát thực nghiệm tần số xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR (trọng tâm là exon 8) đối với các mẫu bệnh phẩm máu của người Việt Nam.
  • Nội dung và nhiệm vụ nghiên cứu (theo văn bản):
    1. Khai thác dữ liệu trên ngân hàng dữ liệu NCBI và Google Scholar về đặc điểm của các đột biến trên gen LDLR với bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình và một số bệnh lý liên quan khác.
    2. Xác định sự tương quan giữa tỷ lệ đột biến với bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình bằng phương pháp phân tích tổng hợp (Meta-analysis).
    3. Khảo sát thực nghiệm, ứng dụng phương pháp PCR - giải trình tự nhằm khảo sát tính chất đột biến trên exon 8 gen LDLR đối với mẫu bệnh phẩm máu của bệnh nhân Việt Nam.
  • Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
    • Đối tượng nghiên cứu: Gen LDLR ở người (tập trung vào vùng exon 8 và intron lân cận); các công trình nghiên cứu đoàn hệ đã công bố trên thế giới về đột biến gen LDLR; 3 mẫu bệnh phẩm máu ngoại vi của các bệnh nhân có nồng độ cholesterol máu cao (>5 mmol/L).
    • Phạm vi không gian: Thực nghiệm sinh học phân tử được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh; giải trình tự Sanger được thực hiện tại Công ty Cổ phần Công nghệ TBR; dữ liệu tổng hợp được khai thác từ các bệnh nhân trên phạm vi toàn cầu và các bệnh viện tại Thành phố Hồ Chí Minh.
    • Phạm vi thời gian: Khóa luận được hoàn thành vào tháng 5 năm 2019; dữ liệu thứ cấp và dữ liệu trình tự được thu thập và cập nhật đến tháng 4 năm 2019.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và tiêu chuẩn chẩn đoán

  1. Sinh lý lipoprotein và thụ thể LDLR: Cholesterol là thành phần cấu trúc màng tế bào và tiền chất sinh tổng hợp acid mật, hormon steroid. Lipoprotein đảm nhận chức năng vận chuyển lipid trong hệ tuần hoàn, bao gồm HDL (tham gia vận chuyển cholesterol ngược về gan), LDL (vận chuyển 60 – 70% tổng cholesterol huyết tương), VLDL (vận chuyển triglyceride nội sinh) và IDL. Thụ thể LDLR trên bề mặt màng tế bào gan đóng vai trò nhận diện và liên kết đặc hiệu với phối tử APOB-100 trên phân tử LDL, đưa phức hợp này vào tế bào theo cơ chế nhập bào qua túi bọc clathrin để thoái biến. Khi thụ thể này suy giảm số lượng hoặc mất chức năng, nồng độ LDL-C trong tuần hoàn gia tăng nghiêm trọng.
  2. Cơ chế phân tử và phân loại đột biến: Bệnh FH di truyền theo tính trạng trội trên nhiễm sắc thể thường (ADH) do tổn thương tại các gen LDLR, PCSK9 (gây thoái biến thụ thể LDLR) hoặc APOB (gây hội chứng khiếm khuyết ApoB-100 gia đình - FDB). Ngoài ra, dạng di truyền lặn (ARH) liên quan đến các gen LDLRAP1, APOE, SREBP2, STAP1, LIPA. Đột biến gen LDLR được chia thành 5 nhóm chức năng (theo phân loại của Hobbs và cộng sự, 1992):
    • Loại 1: Đột biến vô hiệu hóa hoàn toàn sự biểu hiện của protein LDLR.
    • Loại 2: Protein được tổng hợp nhưng bị sai hỏng cấu trúc trong quá trình vận chuyển nội bào từ mạng lưới nội chất đến bộ máy Golgi và màng tế bào.
    • Loại 3: Protein đến được màng tế bào nhưng suy giảm hoặc mất khả năng liên kết đặc hiệu với phối tử APOB-100.
    • Loại 4: Protein thụ thể liên kết được với LDL nhưng không thể thực hiện quá trình nhập bào qua các hố bọc clathrin.
    • Loại 5: Rối loạn quá trình phân ly thụ thể và phối tử trong endosome, ngăn cản sự tái thiết lập thụ thể trở lại bề mặt tế bào.
  3. Tiêu chuẩn chẩn đoán lâm sàng: Các hệ thống chẩn đoán quốc tế được áp dụng phổ biến gồm tiêu chí Simon Broome (Anh), MEDPED (Mỹ) và DLCN (Dutch Lipid Clinic Network - Hà Lan). Thang điểm DLCN phân loại khả năng mắc bệnh dựa trên 5 nhóm tiêu chí: tiền sử gia đình (1 – 2 điểm), tiền sử lâm sàng bệnh tim mạch/mạch máu não sớm (1 – 2 điểm), dấu hiệu khám thể trạng như u vàng gân hoặc cung giác mạc (4 – 6 điểm), nồng độ cholesterol máu tăng cao (1 – 8 điểm) và kết quả phân tích DNA xác định đột biến (8 điểm). Điểm tổng >8 khẳng định chắc chắn mắc bệnh FH.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tích hợp ba hướng tiếp cận bổ trợ lẫn nhau:

Khai thác dữ liệu & Phân tích tổng hợp (Meta-analysis)
        ↓
Khảo sát tin sinh học trên máy tính (In silico)
        ↓
Thực nghiệm sinh học phân tử (Wet-lab: Tách chiết - PCR - Giải trình tự)

  • Khai thác dữ liệu (Data mining) và Phân tích tổng hợp (Meta-analysis):

    • Nguồn dữ liệu: Khai thác các bài báo khoa học trên PubMed, PubMed Central (NCBI) và Google Scholar sử dụng chuỗi từ khóa: LDLR, Cholesterol, Familial Hypercholesterol.
    • Tiêu chí PICO: Xây dựng khung trích xuất gồm Đối tượng (Participant - bệnh nhân có cholesterol máu cao được chẩn đoán theo tiêu chuẩn Simon Broome hoặc DLCN), Tác động (Intervention - mang đột biến trên gen LDLR), So sánh (Comparator), và Kết quả (Outcomes - tỷ lệ xuất hiện đột biến).
    • Mô hình thống kê: Sử dụng phần mềm MedCalc® để tính toán chỉ số tỷ lệ (Proportion - PR%) kèm khoảng tin cậy 95% (95% CI). Tính bất đồng nhất giữa các nghiên cứu được đánh giá qua thuật toán Chi bình phương và chỉ số bất đồng nhất $I^2$ (Index of Heterogeneity). Theo tiêu chí Cochrane (2014), khi $I^2 < 50%$ và $P \ge 0,1$, áp dụng mô hình ảnh hưởng cố định (Fixed effects model theo Mantel-Haenszel); khi $I^2 > 50%$ và $P < 0,1$, áp dụng mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model theo DerSimonian). Kiểm định sai lệch xuất bản được thực hiện qua đồ thị phễu (Funnel plot), biểu diễn kết quả phân bố tỷ lệ qua biểu đồ rừng (Forest plot).

  • Khảo sát trên máy tính (In silico):

    • Thu nhận trình tự tham chiếu gen LDLR từ GenBank (NCBI) gồm các mã số NC_000019.10, NG_009060.1, NM_000527.4 và cơ sở dữ liệu LOVD.
    • Đánh giá ba cặp mồi khuếch đại vùng exon 8 từ các nghiên cứu công bố (Leren và cộng sự, 1997; Cheng và cộng sự, 2018; Jensen và cộng sự, 1996) bằng công cụ trực tuyến OligoAnalyzer 3.1 (IDT), Annhyb 4.946 và BLASTN (NCBI).
    • Tiêu chí lựa chọn: Chiều dài mồi 17 – 28 nucleotide; tỷ lệ GC trong khoảng 40 – 60%; nhiệt độ nóng chảy ($T_m$) giữa hai mồi chênh lệch dưới 5°C; mức năng lượng tự do ($\Delta G$) hình thành cấu trúc kẹp tóc (hairpin), self-dimer và hetero-dimer thấp; độ đặc hiệu bắt cặp trên trình tự đích đạt 100%.

  • Phương pháp thực nghiệm sinh học phân tử:

    • Tách chiết DNA tổng số: Áp dụng phương pháp Phenol/Chloroform (Chomczynski & Sacchi, 1987) từ 50 µl mẫu máu toàn phần. Mẫu được ly giải bằng đệm chứa NaCl 0,45 M, Tris-HCl 10 mM (pH = 8,2), EDTA 1 M (pH = 8), SDS 10% và Proteinase K (20 mg/ml) ở 56°C trong 1 giờ; làm sạch protein bằng hỗn hợp Phenol:Chloroform (tỷ lệ 1:1) và Chloroform nguyên chất; tủa acid nucleic bằng Ammonium acetate 5 M và Ethanol 100% lạnh ở -20°C; rửa tủa bằng Ethanol 70% và hòa tan trong dịch đệm Tris-EDTA (pH = 8).
    • Định lượng và đánh giá độ sạch DNA: Đo độ hấp thụ quang phổ tại bước sóng 260 nm ($A_{260}$) và 280 nm ($A_{280}$). Độ tinh sạch đạt yêu cầu khi tỷ số $A_{260}/A_{280}$ nằm trong khoảng 1,8 – 2,0. Nồng độ DNA được tính theo công thức: $$C \text{ (µg/ml)} = 50 \times A_{260} \times d$$ (với $d$ là hệ số pha loãng).
    • Khuếch đại PCR: Thực hiện trên máy PCR trong thể tích phản ứng 50 µl gồm: 21,5 µl nước cất hai lần, 25 µl Master mix 2X (BioLine), 0,5 µl mồi xuôi LDLR_F2 (10 µg/ml), 0,5 µl mồi ngược LDLR_R2 (10 µg/ml), 2,5 µl DNA khuôn. Chu trình luân nhiệt: Biến tính ban đầu ở 95°C trong 5 phút; tiếp nối 35 chu kỳ gồm biến tính (95°C trong 30 giây), bắt cặp mồi (60°C trong 30 giây), kéo dài (72°C trong 30 giây); kéo dài kết thúc ở 72°C trong 10 phút.
    • Điện di gel agarose: Sản phẩm PCR được nạp vào bản gel agarose có bổ sung chất nhuộm GelRed, điện di ở hiệu điện thế 70 V trong 30 phút trong dung dịch đệm thích hợp. Đọc và chụp ảnh gel dưới ánh sáng tia tử ngoại bằng hệ thống Gel Doc XR; đối chiếu kích thước bằng thang chuẩn DNA 50 bp hoặc 100 bp.
    • Giải trình tự Sanger và phân tích tin sinh: Các sản phẩm PCR đạt kích thước lý thuyết (367 bp) được gửi giải trình tự hai chiều theo phương pháp Sanger tại Công ty Cổ phần Công nghệ TBR. Dữ liệu sắc ký đồ được kiểm tra bằng Chromas Lite 2.6, gióng hàng và phân tích biến thể bằng CodonCode Aligner 8.2 đối chiếu với trình tự chuẩn NC_000019.10 và NM_000527.4. Các biến thể được chuẩn hóa tên gọi theo danh pháp quốc tế HGVS.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan nghiên cứu

Chương này hệ thống hóa các kiến thức cơ sở về chuyển hóa lipid, bệnh sinh học phân tử của FH và các phương pháp sinh học phân tử phát hiện biến thể di truyền:

  • Trình bày chi tiết vai trò của 4 phân lớp lipoprotein huyết tương (HDL, LDL, VLDL, IDL), làm rõ thụ thể LDLR là trung tâm điều hòa nồng độ LDL trong cơ thể.
  • Phân tích cơ chế bệnh lý của FH thể trội (ADH) và thể lặn (ARH), thống kê tỷ lệ đột biến trên các gen ứng viên (LDLR chiếm >80%, APOB chiếm 5 – 10%, PCSK9 <1%).
  • Trình bày 3 bộ tiêu chuẩn chẩn đoán lâm sàng quốc tế gồm DLCN (Hà Lan), Simon Broome (Anh) và MEDPED (Mỹ).
  • Mô tả cấu trúc phân tử của gen LDLR (kích thước 45 kb, 18 exon, 17 intron trên dải nhiễm sắc thể 19p13.3) và 5 nhóm cơ chế đột biến làm mất chức năng thụ thể theo phân loại của Hobbs (1992).
  • Khái quát các kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong chẩn đoán đột biến di truyền: PCR kết hợp giải trình tự trực tiếp (phương pháp tiêu chuẩn vàng phát hiện đột biến điểm), kỹ thuật điện di biến tính trên gel (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis - DGGE), tính đa hình cấu hình sợi đơn (Single Strand Conformational Polymorphism - SSCP), RT-PCR và AS-PCR.

Chương II: Vật liệu và phương pháp

Chương này mô tả toàn bộ công cụ, hóa chất, thiết bị và các bước thực hiện nghiên cứu:

  • Liệt kê các cơ sở dữ liệu và phần mềm ứng dụng: NCBI, Google Scholar, BLAST, Annhyb 4.946, MedCalc®, OligoAnalyzer 3.1, Chromas Lite 2.6, CodonCode Aligner 8.2.
  • Thiết lập quy trình 5 bước thực hiện phân tích tổng hợp (Meta-analysis) theo thang chuẩn PICO, định nghĩa các ngưỡng bất đồng nhất $I^2$ và tiêu chí chọn mô hình thống kê (ảnh hưởng ngẫu nhiên hoặc cố định) theo Cochrane (2014).
  • Trình bày quy trình sàng lọc và tối ưu hóa bộ mồi trên máy tính (In silico) dựa trên trình tự tham chiếu NC_000019.10.
  • Chi tiết hóa quy trình thực nghiệm phòng thí nghiệm: Công thức hóa chất và các bước tách chiết DNA máu bằng Phenol/Chloroform; nguyên lý đo quang phổ $A_{260}/A_{280}$; thành phần hóa chất cho phản ứng PCR thể tích 50 µl sử dụng Master mix BioLine 2X; chu trình luân nhiệt 35 chu kỳ với nhiệt độ bắt mồi 60°C; phương pháp điện di trên gel agarose 70 V trong 30 phút và quy trình giải trình tự Sanger.

Chương III: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày các phát hiện định lượng và thực nghiệm của đề tài qua 3 nhóm nội dung chính:

1. Kết quả thu thập dữ liệu và phân tích tổng hợp gen LDLR

Từ 72 công trình khoa học thu thập được trên PubMed và Google Scholar, tác giả đã sàng lọc được 35 công trình nghiên cứu đoàn hệ đạt tiêu chuẩn chất lượng đưa vào phân tích tổng hợp. Bộ dữ liệu bao gồm tổng số 7.435 mẫu máu của các bệnh nhân FH được chẩn đoán theo tiêu chuẩn Simon Broome và DLCN.

Kết quả kiểm định tính bất đồng nhất cho thấy mức độ không đồng nhất giữa các nghiên cứu là rất cao ($I^2 = 97,43%$, $P < 0,0001$). Do đó, mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model) được lựa chọn. Tỷ lệ xuất hiện đột biến chung trên gen LDLR ở các bệnh nhân FH đạt 51,27% (95% CI: 43,699 – 58,812%).

Tác giả đã phân tích chuyên sâu chỉ số Proportion theo các phân hạng đặc trưng:

Phân hạng phân tích Tiểu nhóm Số bài báo ($N$) Mô hình thống kê Chỉ số bất đồng nhất $I^2$ (%) Giá trị $P$ Tỷ lệ đột biến: Proportion (%) [95% CI]
Tổng thể Toàn bộ dữ liệu 35 Random (R) 97,43 < 0,0001 51,27 [43,699 – 58,812]
Phương pháp PCR – Giải trình tự 15 Random (R) 89,74 < 0,0001 62,462 [51,702 – 72,633]
Phương pháp khác (SSCP, MLPA...) 20 Random (R) 97,97 < 0,0001 45,191 [35,910 – 54,645]
Châu lục Châu Âu 20 Random (R) 98,20 < 0,0001 55,599 [45,420 – 65,545]
Châu Phi 2 Fixed (F) 0,00 = 0,7366 76,583 [58,953 – 89,334]
Châu Mỹ 4 Random (R) 74,55 = 0,0081 45,623 [33,921 – 57,594]
Châu Á 9 Random (R) 92,78 < 0,0001 38,289 [26,061 – 51,321]
Loại bệnh FH 32 Random (R) 97,26 < 0,0001 52,023 [44,276 – 59,721]
ADH 3 Random (R) 93,65 < 0,0001 55,582 [27,629 – 81,735]
Yếu tố phả hệ Bệnh nhân riêng lẻ (Proband) 28 Random (R) 97,59 < 0,0001 56,125 [47,339 – 64,722]
Tiền sử gia đình (Family) 7 Random (R) 94,24 < 0,0001 31,540 [19,305 – 45,241]

Song song đó, phân tích tần số xuất hiện đột biến trên từng exon riêng lẻ của gen LDLR từ các nghiên cứu đoàn hệ đã xác lập bức tranh phân bố biến thể trên toàn bộ chiều dài gen:

Vị trí Exon Số nghiên cứu ($N$) Mô hình $I^2$ (%) Giá trị $P$ Tỷ lệ Proportion (%) [95% CI]
Exon 1 9 Fixed 44,26 0,0730 3,187 [2,325 – 4,255]
Exon 2 12 Random 78,83 < 0,0001 4,068 [2,245 – 6,399]
Exon 3 13 Random 87,47 < 0,0001 4,736 [1,996 – 8,566]
Exon 4 22 Random 82,88 < 0,0001 13,586 [9,879 – 17,778]
Exon 5 15 Random 92,87 < 0,0001 6,888 [2,961 – 12,289]
Exon 6 13 Random 76,49 < 0,0001 5,295 [3,189 – 7,895]
Exon 7 15 Random 81,18 < 0,0001 5,404 [3,137 – 8,241]
Exon 8 16 Random 80,67 < 0,0001 6,047 [3,623 – 9,042]
Exon 9 18 Random 72,54 < 0,0001 8,805 [5,707 – 10,835]
Exon 10 19 Random 62,27 0,0002 4,507 [2,970 – 6,345]
Exon 11 11 Random 87,51 < 0,0001 5,591 [2,678 – 9,484]
Exon 12 16 Random 92,40 < 0,0001 9,848 [5,139 – 15,869]
Exon 13 11 Random 55,64 0,0126 2,658 [1,466 – 4,188]
Exon 14 14 Random 77,16 < 0,0001 5,861 [3,678 – 8,514]
Exon 15 9 Random 58,28 0,0139 4,464 [2,228 – 7,421]
Exon 16 6 Random 54,64 0,0509 2,149 [0,509 – 4,886]
Exon 17 12 Random 90,12 < 0,0001 4,063 [3,178 – 5,110]

Kết quả chỉ ra rằng ba exon có tỷ lệ đột biến cao nhất là exon 4 (13,586%), exon 12 (9,848%) và exon 9 (8,805%). Tuy nhiên, exon 8 thể hiện tỷ lệ đột biến đáng kể là 6,047% (95% CI: 3,623 – 9,042%) với 106 biến thể đã được ghi nhận trên cơ sở dữ liệu thế giới (Henderson và cộng sự, 2016). Kế thừa chuỗi đề tài của nhóm nghiên cứu, tác giả quyết định chọn exon 8 làm đích khảo sát thực nghiệm.

2. Kết quả khảo sát In silico bộ mồi khuếch đại Exon 8

Dữ liệu đối chiếu thu nhận từ NCBI xác định mã số tham chiếu NC_000019.10. Ba cặp mồi khuếch đại exon 8 từ các công trình trước được phân tích tính chất vật lý và độ tương đồng:

Cặp mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Chiều dài (nt) Kích thước sản phẩm (bp) $T_m$ (°C) %GC Tài liệu tham khảo
LDLR_F1
LDLR_R1		 CCAAGCCTCTTTCTCTCTCTTCCAG
CCACCCGCCGCCTTCCCGTGCTACC		 25
26		 176 58,28 48,0
69,2		 Leren và cộng sự (1997)
LDLR_F2
LDLR_R2		 GCTGTTTCCTTGATTACATCTC
GATATGAGTCTGTGCAAAGTTC		 22
22		 367 53,2
54,2		 40,9
40,9		 Cheng và cộng sự (2018)
LDLR_F3
LDLR_R3		 CATTGGGGAAGAGCCTCCCC
GCCTGCAAGGGGTGAGGCCG		 20
20		 220 - 65,0
75,0		 Jensen và cộng sự (1996)

Kết quả khảo sát bằng công cụ Annhyb và BLAST cho thấy cặp mồi LDLR_F2/LDLR_R2 có thông số tối ưu nhất: Mồi xuôi F2 định vị tại vị trí 22.030, mồi ngược R2 định vị tại 22.375 trên trình tự NC_000019.10; vùng khuếch đại trải từ nucleotide 22.009 đến 22.375 tạo sản phẩm dài 367 bp, bao quát trọn vẹn exon 8 và vùng ranh giới intron 8 kế cận mà không xuất hiện các cấu trúc kẹp tóc hay dimer gây cản trở phản ứng PCR.

3. Kết quả khảo sát thực nghiệm trên mẫu bệnh phẩm Việt Nam

  • Tách chiết DNA: Các mẫu bệnh phẩm máu thu nhận từ bệnh nhân có cholesterol máu cao (>5 mmol/L) tại các bệnh viện ở TP. Hồ Chí Minh được tách chiết DNA đạt độ tinh sạch cao với tỷ số $A_{260}/A_{280}$ dao động trong khoảng 1,8 – 2,0.
  • Khuếch đại PCR và điện di: Sản phẩm PCR của 3 mẫu bệnh phẩm ký hiệu (1), (2), và (3) khi điện di trên gel agarose đều hiển thị một băng duy nhất sáng, gọn, đặc hiệu, kích thước hoàn toàn phù hợp với dự đoán lý thuyết là 367 bp; giếng chứng âm không xuất hiện băng tạp.
  • Phân tích kết quả giải trình tự: Sau khi gửi giải trình tự Sanger và đối chiếu bằng Chromas Lite 2.6 và CodonCode Aligner 8.2 với trình tự chuẩn NC_000019.10 và NM_000527.4:
    • Trên vùng mã hóa của exon 8: Không phát hiện dạng đột biến điểm nào trên cả 3 mẫu bệnh phẩm.
    • Trên vùng không mã hóa của intron 8: Phát hiện một cụm gồm 4 biến thể thay thế nucleotide liên tiếp ở trạng thái dị hợp tử trên cả 3 mẫu bệnh phẩm máu (1), (2) và (3):
Mẫu Vị trí trên NC_000019.10 Vị trí chuẩn hóa trên NM_000527.4 Dạng biến thể Trạng thái di truyền
(1), (2), (3) 22320 c.1186+43 T > G Dị hợp tử
(1), (2), (3) 22321 c.1186+44 G > C Dị hợp tử
(1), (2), (3) 22322 c.1186+45 C > A Dị hợp tử
(1), (2), (3) 22323 c.1186+46 A > G Dị hợp tử

Tác giả so sánh các biến thể tìm được với các công bố quốc tế trước đây về biến thể trên intron 8 gen LDLR:

Tác giả công bố Dạng biến thể trên Intron 8
Leigh và cộng sự (2016) c.1186+5G>A
Amsellem và cộng sự (2002) c.1186+11G>A
Alharbi và cộng sự (2005) c.1186+11G>A
Al-Khateeb và cộng sự (2011) c.1186+41T>A
Wang và cộng sự (2001) c.1187-10G>A
Amsellem và cộng sự (2002) c.1187-10G>A
Punzalan và cộng sự (2005) c.1187-10G>A

Các biến thể đã biết trước đây chỉ xuất hiện ở các vị trí từ +5 đến +41 hoặc -10. Cụm 4 biến thể thay thế nucleotide liên tiếp c.1186+43T>G, c.1186+44G>C, c.1186+45C>A và c.1186+46A>G được phát hiện trong nghiên cứu này là các dạng biến thể mới, chưa từng được công bố trên các cơ sở dữ liệu di truyền quốc tế cũng như tại Việt Nam.

Kết quả và đóng góp

  • Kết quả định lượng từ phân tích tổng hợp: Xác lập tỷ lệ xuất hiện đột biến gen LDLR trên quy mô toàn cầu ở bệnh nhân FH là 51,27% (95% CI: 43,699 – 58,812%) dựa trên tổng hợp 35 nghiên cứu đoàn hệ với 7.435 bệnh nhân. Định lượng được phương pháp PCR kết hợp giải trình tự cho tỷ lệ phát hiện đột biến cao nhất đạt 62,462% so với các kỹ thuật sinh học phân tử khác (45,191%). Đồng thời xác định chính xác tỷ lệ phân bố đột biến trên từng exon, trong đó exon 8 đạt 6,047% (95% CI: 3,623 – 9,042%).
  • Xây dựng và chuẩn hóa quy trình phân tử: Khảo sát thành công trên máy tính và thẩm định thực nghiệm cặp mồi LDLR_F2/LDLR_R2, thiết lập hoàn chỉnh quy trình tách chiết DNA từ máu toàn phần và quy trình luân nhiệt PCR khuếch đại đặc hiệu đoạn DNA 367 bp chứa trọn vẹn exon 8 và vùng biên intron 8.
  • Phát hiện các biến thể phân tử mới tại Việt Nam: Lần đầu tiên ghi nhận sự hiện diện đồng thời của 4 biến thể thay thế nucleotide mới ở trạng thái dị hợp tử trên vùng intron 8 gen LDLR gồm: c.1186+43T>G, c.1186+44G>C, c.1186+45C>A và c.1186+46A>G trên các mẫu bệnh phẩm máu của bệnh nhân tăng cholesterol tại Việt Nam.
  • Đóng góp so với các nghiên cứu trước: Bổ sung dữ liệu phân tử thực nghiệm đầu tiên về exon 8 và intron 8 gen LDLR trên quần thể người Việt Nam; cung cấp bằng chứng cho thấy vùng ranh giới exon 8 - intron 8 có thể là vị trí đa hình hoặc mang tính chất biến thể đặc trưng của nhóm bệnh nhân trong nước, đặt nền móng cho các nghiên cứu dịch tễ di truyền tim mạch tiếp theo.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu:
    • Cỡ mẫu thực nghiệm còn rất nhỏ, chỉ dừng lại ở 3 mẫu bệnh phẩm máu từ các bệnh nhân có cholesterol máu cao, do đó chưa đủ ý nghĩa thống kê để khái quát hóa thành tần số alen của quần thể người Việt Nam.
    • Nghiên cứu chưa thiết lập được mối tương quan nhân quả xác thực giữa cụm biến thể mới trên intron 8 (c.1186+43T>G đến c.1186+46A>G) với cơ chế sinh bệnh học của FH hay mức độ tăng cholesterol máu.
    • Chưa mở rộng khảo sát thực nghiệm trên các exon có tần suất đột biến cao hơn như exon 4, exon 12 hay exon 9 theo dữ liệu phân tích tổng hợp.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Mở rộng thu thập cỡ mẫu bệnh phẩm máu trên quy mô đoàn hệ lớn hơn tại nhiều bệnh viện trong nước.
    • Tiến hành giải trình tự tầm soát các exon trọng điểm khác (đặc biệt là exon 4 với tỷ lệ đột biến 13,586% và exon 12 với 9,848%).
    • Thực hiện các thử nghiệm chức năng chuyên sâu (in vitro functional assays hoặc phân tích biểu hiện RNA) nhằm đánh giá tác động của cụm 4 biến thể trên intron 8 đối với quá trình cắt nối hoàn thiện (splicing) tiền mRNA của gen LDLR.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng sử dụng: Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học Y Dược, Di truyền học Y học, Sinh học Phân tử và Bệnh học Tim mạch.
  • Nội dung giá trị phục vụ học thuật và thực hành:
    • Phương pháp luận phân tích tổng hợp (Meta-analysis): Cung cấp quy trình bài bản từ bước xây dựng khung PICO, trích xuất dữ liệu y sinh đến cách thức vận hành phần mềm MedCalc® để xử lý các mô hình ảnh hưởng cố định và ảnh hưởng ngẫu nhiên, biểu diễn đồ thị phễu và đồ thị rừng.
    • Quy trình kỹ thuật phòng thí nghiệm: Cung cấp chi tiết các thông số thiết kế mồi, điều kiện luân nhiệt PCR tối ưu cho đoạn 367 bp trên gen LDLR, cùng kỹ thuật xử lý sắc ký đồ Sanger bằng phần mềm Chromas Lite và CodonCode Aligner.
    • Cơ sở dữ liệu đột biến: Cung cấp bảng dữ liệu tham chiếu tổng hợp tỷ lệ đột biến trên từng exon của gen LDLR và hồ sơ trình tự các biến thể intron 8 mới ghi nhận trên mẫu bệnh phẩm Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Chỉ số tỷ lệ đột biến gen LDLR trên toàn cầu được xác lập trong nghiên cứu này là bao nhiêu và phụ thuộc vào phương pháp phân tích như thế nào?
Dựa trên phân tích tổng hợp 35 công trình nghiên cứu đoàn hệ với 7.435 bệnh nhân FH, tỷ lệ đột biến chung trên gen LDLR là 51,27% (95% CI: 43,699 – 58,812%). Khi phân hạng theo phương pháp kỹ thuật, phương pháp PCR kết hợp giải trình tự trực tiếp cho tỷ lệ phát hiện đột biến đạt 62,462% (95% CI: 51,702 – 72,633%), cao hơn rõ rệt so với nhóm các phương pháp sinh học phân tử khác như SSCP, MLPA hay DGGE (chỉ đạt 45,191%).

2. Vì sao tác giả lựa chọn exon 8 để khảo sát thực nghiệm dù exon 4 có tỷ lệ đột biến cao nhất?
Theo kết quả phân tích tổng hợp, exon 4 có tỷ lệ đột biến cao nhất (13,586%), kế đến là exon 12 (9,848%) và exon 9 (8,805%). Tuy nhiên, exon 8 đứng ở mức đáng kể với 6,047% (95% CI: 3,623 – 9,042%) và có tới 106 biến thể đã được ghi nhận trên thế giới. Tác giả chọn exon 8 nhằm kế thừa chuỗi nghiên cứu khảo sát đột biến các exon trên gen LDLR của phòng thí nghiệm, đồng thời bổ sung dữ liệu phân tử cho một vùng gen chưa từng có công bố nào tại Việt Nam.

3. Cặp mồi nào đã được lựa chọn qua khảo sát In silico và sản phẩm khuếch đại có đặc điểm gì?
Cặp mồi được lựa chọn là LDLR_F2 (5’-GCTGTTTCCTTGATTACATCTC-3’) và LDLR_R2 (5’-GATATGAGTCTGTGCAAAGTTC-3’) được tham khảo từ nghiên cứu của Cheng và cộng sự (2018). Cặp mồi có chiều dài 22 nt, nhiệt độ nóng chảy tương đồng ($T_m$ lần lượt là 53,2°C và 54,2°C), tỷ lệ GC 40,9%, khuếch đại đoạn trình tự 367 bp trải dài từ nucleotide 22.009 đến 22.375 trên trình tự tham chiếu NC_000019.10, bao quát trọn vẹn exon 8 và một phần intron 8.

4. Kết quả giải trình tự trên các mẫu bệnh phẩm máu của người Việt Nam đã phát hiện những biến thể cụ thể nào?
Nghiên cứu không phát hiện đột biến điểm trên vùng mã hóa của exon 8. Thay vào đó, trên vùng intron 8 của cả 3 mẫu bệnh phẩm máu (1), (2) và (3), tác giả đã phát hiện đồng thời 4 biến thể thay thế nucleotide mới ở trạng thái dị hợp tử gồm: c.1186+43T>G, c.1186+44G>C, c.1186+45C>A và c.1186+46A>G (tương ứng với các vị trí 22320T>G, 22321G>C, 22322C>A và 22323A>G trên NC_000019.10).

5. Vì sao mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model) được sử dụng cho phần lớn các chỉ tiêu phân tích tổng hợp?
Vì chỉ số bất đồng nhất giữa 35 nghiên cứu đoàn hệ đạt mức rất cao ($I^2 = 97,43%$ với giá trị $P < 0,0001$). Theo tiêu chuẩn của Cochrane (2014), khi $I^2 > 50%$ và $P < 0,1$, các nghiên cứu không chia sẻ một kích thước hiệu ứng đồng nhất, do đó bắt buộc phải sử dụng mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên theo phương pháp của DerSimonian để đảm bảo độ tin cậy của ước lượng thống kê.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu đề ra khi định lượng được tỷ lệ đột biến gen LDLR toàn cầu ở bệnh nhân tăng cholesterol máu có tính chất gia đình đạt 51,27% thông qua phân tích tổng hợp 35 công trình nghiên cứu đoàn hệ trên 7.435 ca bệnh. Bằng việc ứng dụng thành công công cụ tin sinh học in silico kết hợp phương pháp PCR và giải trình tự Sanger, tác giả đã thiết lập được quy trình chuẩn khuếch đại đoạn gen 367 bp chứa exon 8 và intron 8 trên mẫu bệnh phẩm máu người Việt Nam. Mặc dù không ghi nhận đột biến trên exon 8 ở 3 mẫu bệnh phẩm khảo sát, nghiên cứu đã phát hiện một cụm gồm 4 biến thể nucleotide mới ở trạng thái dị hợp tử trên vùng intron 8 (từ c.1186+43 đến c.1186+46), cung cấp nguồn dữ liệu phân tử khởi đầu có giá trị định hướng cho các nghiên cứu sâu rộng hơn về di truyền học bệnh tim mạch tại Việt Nam.