ĐẶT VẤN ĐỀ Familial hypercholesterolaemia (FH) - bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình là một dạng bệnh lý rối loạn di truyền, gồm các triệu chứng lâm sàng như tích tụ LDL trong máu, nồng độ cao cholesterol trong da, gân và động mạch vành dẫn tới chứng xơ vữa động mạch vành (Atherosclerotic Cardiovascular Disease - ASCVD) (Marais et al., 2004; Maglio et al. Nồng độ cholesterol trong máu cao bất thường là do suy giảm chức năng của thụ thể LDL hoặc rối loạn chức năng của Apolipoprotein B-100 (Zakharova et al. Mặc dù FH thường được xem là dạng bệnh hiếm gặp nhưng tần số mắc bệnh FH trên thế giới vào khoảng 1/500 (Marais et al. Đến năm 2016, nhiều công bố nghiên cứu ghi nhận trên thế giới tăng lên khoảng 1/250 (Henderson et al., 2016; Abul-Husn et al., 2016; Benito-Vicente et al.
FH được chia làm hai loại: HoFH (Homozygous FH) - thể đồng hợp và HeFH (Heterozygous FH) - thể dị hợp (Henderson et al. Trong đó, tần số mắc bệnh thể HoFH trong khoảng 1/160.000 và thể HeFH trong khoảng là 1/200 – 1/250 (Henderson et al. Theo nghiên cứu của Klose và cộng sự (2014), Wiegman và cộng sự (2015) và Maya và cộng sự (2017) ghi nhận bệnh lý FH là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến bệnh xơ vữa động mạch và nhồi máu cơ tim. Theo các nghiên cứu của Abul-Husn và cộng sự (2016) và Benito-Vicente và cộng sự (2018) cho thấy nguyên nhân dẫn đến FH chủ yếu là do tính chất đột biến điểm xuất hiện trên các gen mã hóa protein tham gia vào cơ chế chuyển hóa cholesterol trong máu: Low density lipoprotein receptor (LDLR), Apolipoprotein B (APOB) và Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9).
Trong đó, các dạng đột biến xuất hiện trên gen LDLR chiếm hơn 90% đột biến được tìm thấy ở các bệnh nhân FH (Benito-Vicente et al., 2018), đột biến được thống kê ở gen ApoB là khoảng 5% và gen PCSK9 là <1% (Henderson et al. Gen LDLR có chiều dài là 45 kb (kilobases) bao gồm 18 exon và 17 intron, nằm trên nhiễm sắc thể 19p13.3 và có khoảng 2000 dạng đột biến trên gen này dẫn tới bệnh lý FH (Benito-Vicente et al. Các dạng đột biến hiện diện trải vi BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP dài ở hầu hết trên tất cả các exon, điển hình là ở exon 4 (19.3%) (Shu et al.7%), exon 10 (11%) (Al-Khateeb et al. Kế thừa kết quả của cùng nhóm nghiên cứu, chúng tôi thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp: “PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ: ĐỘT BIẾN TRÊN EXON 8 GEN LDLR BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ ĐỐI VỚI MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM MÁU CỦA NGƯỜI VIỆT NAM”.
Mục tiêu: Xác định sự tương quan giữa tính chất đột biến trên gen LDLR và bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình thông qua phương pháp phân tích tổng hợp và khảo sát thực nghiệm về tần số xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR trên các mẫu bệnh phẩm máu của các quần thể bệnh nhân trên thế giới và ở Việt Nam. Nội dung nghiên cứu: - Khai thác dữ liệu trên ngân hàng dữ liệu NCBI và Google Scholar về đặc điểm của các đột biến trên gen LDLR với bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình và một số bệnh lý liên quan khác. - Xác định sự tương quan giữa tỷ lệ đột biến với bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình bằng phương pháp phân tích tổng hợp Meta – analysis. - Khảo sát thực nghiệm, ứng dụng phương pháp PCR – giải trình tự nhằm khảo sát tính chất đột biến trên exon 8 gen LDLR đối với mẫu bệnh phẩm máu của bệnh nhân Việt Nam.
vii BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU I. Bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) I. Cholesterol và Lipoprotein Cholesterol là thành phần chủ yếu trong cấu trúc màng tế bào, là tiền chất để gan sản xuất acid mật và ruột sản xuất lypoprotein trong tế bào nhân thật (Marais et al.
Lipoprotein là một phức hợp của lipid và protein chuyên biệt, có chức năng vận chuyển chất béo (triglyceride, cholesteryl ester…) từ gan theo hệ bạch huyết tới các tế bào đích để cung cấp năng lượng cho các quá trình sinh hóa diễn ra trong tế bào người. Thêm vào đó, lipoprotein có vai trò tham gia vào cơ chế đông máu, làm lành vết thương và một số cơ chế miễn dịch (Wansan et al. Lipoprotein được chia thành các dạng như sau: - Lipoprotein mật độ cao (High density lipoprotein – HDL) gồm 3 phân lớp HDL – 1, HDL – 2, HDL – 3 với sự khác nhau về kích thước và tỷ lệ protein và chất béo. HDL mang cholesterol (HDL – C) dư thừa trong thể dịch (máu) sẽ được hấp thu vào gan theo cơ chế “vận chuyển cholesterol ngược”.
HDL có thể cản trở quá trình vận chuyển cholesterol tới các mô theo phương thức liên kết với các thụ thể LDL (LDLR) gan trên bề mặt tế bào (Clark et al. - Lipoprotein mật độ thấp (Low density lipoprotein – LDL) chiếm khoảng 60 - 70% tổng lượng cholesterol trong huyết tương, là chất mang cholesterol chủ yếu trong huyết tương và có khả năng thấm qua thành mạch. Khi có sự liên kết giữa LDL – Cholesterol với thụ thể LDL trên bề mặt gan và các cơ quan khác sẽ chuyển cholesterol về lại tế bào gan. Thiếu hụt thụ thể LDL dẫn đến giảm sự chuyển hóa cholesterol, gây tăng bất thường lượng choleterol trong máu.
Do đó, khi có sự bất hoạt hoặc suy giảm chức năng của thụ thể LDL dẫn đến bệnh lý FH với các triệu chứng như nồng độ cholesterol trong máu tăng cao khoảng 350 – 500mg/dL, xuất hiện gân xanthoma và bệnh tim mạch vành (Clark et al. 1 BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - Lipoprotein mật độ rất thấp (Very low density lipoproteins – VLDL) là loại lipoprotein chính được tiết ra từ gan và có chức năng chính trong việc vận chuyển triglyceride nội sinh từ gan đến các tế bào mô trong cơ thể (Wansan et al. - Lipoprotein mật độ trung bình (Intermediate density lipoprotein – IDL) là loại lipoprotein được hình thành bởi cholesteryl ester và triglyceride trong cơ chế vận chuyển và thoái biến triglyceride. Sau đó, IDL được biến đổi và chuyển vào gan thông qua cơ chế tương tác với thụ thể LDL, hoặc biến đổi thành LDL (Wansan et al.
Bệnh lý Familial Hypercholesterolemia Familial Hypercholesterolemia (FH) là bệnh lý rối loạn di truyền, xảy ra trên nhiễm sắc thể thường, thường do các dạng đột biến tập trung trên các gen mã hóa protein chuyển hóa lipid, cholesterol trong máu. Biểu hiện đặc trưng của bệnh FH là nồng độ cholesterol trong máu tăng cao bất thường (350 – 500mg/dL) (Clark et al. Nghiên cứu đoạt giải Nobel năm 1985 của Brown và Goldstein – nhóm tác giả đầu tiên chứng minh được nồng độ LDL tăng bất thường trong huyết tương có liên quan đến đột biến trên gen LDLR (Pears et al. Bệnh FH được xác định chủ yếu dựa vào nồng độ LDL trong máu, cụ thể nồng độ LDL – Cholesterol (LDL – C) ở bệnh nhân HoFH trong khoảng 650 – 1000 mg/dL, nồng độ LDL – Cholesterol (LDL – C) ở bệnh nhân HeFH trong khoảng 350 – 550 mg/dL (Goldberg et al.
Nồng độ cholesterol ở bệnh nhân FH ở độ tuổi trưởng thành (trên 20 tuổi) ≥ 190mg/dL và ở độ tuổi trẻ em ≥ 160mg/dL (Goldberg et al. Bệnh FH thể đồng hợp (Homozygous FH – HoFH) thường có tần số là 1/160.000, bệnh FH thể dị hợp (Heterozygous FH – HeFH) lại có tần số người mắc phải là 1/200 – 250 (Henderson et al. Một số báo cáo khoa học ghi nhận nguy cơ mắc bệnh động mạch vành sớm (Coronary Artery Disease – CAD) ở những bệnh nhân FH thể dị hợp không được chữa trị cao gấp 13 lần so với những người không mắc FH (Harada-Shiba et al., 2018), nguy cơ dẫn đến bệnh tim mạch vành 2 BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP sớm (Coronary Heart Disease – CHD) ở các trường hợp mắc FH cao gấp là 20 lần so với những người không mắc FH (Goldberg et al. Công bố khoa học của Ahmad và cộng sự (2016) cho thấy có khoảng 1,5 triệu người có thể mắc bệnh lý FH tại Hoa Kỳ.
Theo công bố khoa học của Bellgard và cộng sự (2017), ước tính có hơn 65.000 người mắc FH ở Úc, tuy nhiên số trường hợp được chẩn đoán không nhiều. Ở Đức, tần suất mắc bệnh FH khoảng 1/500 (Klose et al. Tần suất số người mắc FH kiểu dị hợp ở Nhật Bản là 1/200 – 500 (Harada-Shiba et al. - Nghiên cứu của Di Taranto và cộng sự (2015) xác định FH được chia làm 2 loại dựa vào kiểu hình là dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng trội trên nhiễm sắc thể thường (Autosomal Dominant Hypercholesterolemia – ADH), và dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng lặn trên nhiễm sắc thể thường (Autosomal Recessive Hypercholesterolemia – ARH).
- Công trình nghiên cứu của Pears và cộng sự (2015) xác định các nguyên chính dẫn đến bệnh FH ở dạng FH – ADH bao gồm: (1) Đột biến xuất hiện trên gen thụ thể LDL (Low Density Lipoprotein Receptor – LDLR) dẫn đến LDLR không tương tác với LDL – C, dẫn đến cholesterol không chuyển vào gan, làm tăng nồng độ cholesterol trong huyết tương. (2) Đột biến xuất hiện trên gen Proprotein Convertase Subtilisin / Kexin type 9 (PCSK9) dẫn đến sự sai hỏng protein PCSK9, gây nên sự thoái biến các thụ thể LDL trên tế bào gan. (3) Đột biến điểm trên gen Apolipoprotein B – 100 (APOB – 100) dẫn đến thể Apolipoprotein bị khiếm khuyết dẫn đến sự ngăn cản liên kết giữa LDL với LDLR trong tế bào gan. Hệ quả là sự gia tăng nồng độ cholesterol trong máu (Myant et al., 1993; Pears et al.
Các dạng đột biến này tạo nên bệnh lý FH thuộc thể khiếm khuyết Apolipoprotein B – 100 có tính chất gia đình (Familial Defective Apolipoprotein B – 100 – FDB). Theo công bố khoa học của Alonso và cộng sự (2018), tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các bệnh nhân FH lần lượt là > 80% trên gen LDLR, 5 – 10% trên gen APOB và 3 BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP < 1% trên gen PCSK9 (Alonso et al. Bên cạnh đó, còn có tính chất đột biến xảy ra trên một số gen ở trạng thái allele lặn dẫn đến bệnh lý FH, gồm có: Low – density lipoprotein receptor adaptor protein 1 (LDLRAP1), APOE, SREBP2, STAP1 và LIPA (Alonso et al. - Việc chẩn đoán bệnh FH thường dựa vào sự biểu hiện bệnh theo các tiêu chí: LDL – C ≥ 180 mg/dL; biểu hiện u vàng (xanthoma) trên gân và da và tiền sử mắc bệnh FH hoặc CAD sớm trong gia đình (Harada-Shiba et al.