Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Khuẩn và Ức Chế Nitric Oxid Từ Đẹn Ba Lá (Vitex trifolia L.)

Nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn và ức chế nitric oxid từ Đẹn ba lá (Vitex trifolia L.) đang thu hút sự chú ý… 83 trang · Trường Đại học Dược Hà Nội · 2024.

• Tác giả: Võ Tùng Lâm
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thanh Tùng
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa Dược
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Khuẩn và Ức Chế Nitric Oxid Từ Đẹn Ba Lá (Vitex trifolia L.)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, phương tiện nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Phương tiện nghiên cứu
• 2.4. Trang thiết bị nghiên cứu
• 2.5. Nội dung nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Thu tinh dầu và cao chiết methanol từ Đẹn ba lá
• 2.6.2. Phân tích thành phần tinh dầu Đẹn ba lá bằng GC-MS
• 2.6.3. Đánh giá tác dụng kháng Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) của tinh dầu Đẹn ba lá bằng phương pháp vi pha loãng
• 2.6.4. Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid của cao chiết Đẹn ba lá trên đại thực bào phúc mạc
• 2.6.5. Nghiên cứu docking các thành phần trong tinh dầu và cao chiết Đẹn ba lá với các đích tương ứng
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Kết quả phân tích thành phần tinh dầu
• 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng kháng S.
• 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid của cao chiết Đẹn ba lá trên đại thực bào phúc mạc
• 3.4. Kết quả nghiên cứu docking phân tử các hợp chất trong tinh dầu Đẹn ba lá trên các đích protein của S.
• 3.5. Kết quả nghiên cứu docking phân tử các hợp chất trong cao chiết Đẹn ba lá trên các đích protein ức chế sản sinh Nitric oxid
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Khuẩn Từ Đẹn Ba Lá

Nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn và ức chế nitric oxid từ Đẹn ba lá (Vitex trifolia L.) đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Đẹn ba lá được biết đến như một loại thảo dược truyền thống với nhiều ứng dụng trong y học. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng Đẹn ba lá có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Staphylococcus aureus và giảm sản sinh nitric oxid, một yếu tố gây viêm trong cơ thể. Việc tìm hiểu sâu về các hợp chất có trong Đẹn ba lá sẽ mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các loại thuốc kháng khuẩn tự nhiên.

1.1. Đẹn Ba Lá Đặc Điểm Thực Vật và Phân Bố

Đẹn ba lá là cây nhỏ hoặc cây bụi, có thể cao tới 3m. Cây ưa sáng và có khả năng chịu hạn tốt. Phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là ở Việt Nam, nơi cây thường gặp ở các tỉnh ven biển và vùng núi thấp.

1.2. Thành Phần Hóa Học Trong Đẹn Ba Lá

Đẹn ba lá chứa nhiều hợp chất hóa học như terpenoid, flavonoid và acid béo. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất này có khả năng kháng khuẩn và chống viêm, góp phần vào tác dụng sinh học của cây.

II. Vấn Đề và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Khuẩn

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn của Đẹn ba lá, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định chính xác cơ chế hoạt động của các hợp chất trong cây. Việc phân lập và xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học cao là một trong những vấn đề lớn. Ngoài ra, việc đánh giá hiệu quả của các hợp chất này trong điều trị lâm sàng cũng cần được nghiên cứu kỹ lưỡng.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Phân Tích Thành Phần Hóa Học

Phân tích thành phần hóa học của Đẹn ba lá gặp khó khăn do sự đa dạng của các hợp chất có trong cây. Việc sử dụng các phương pháp hiện đại như GC-MS là cần thiết để xác định chính xác các hợp chất này.

2.2. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Lâm Sàng

Nghiên cứu lâm sàng về tác dụng của Đẹn ba lá còn hạn chế. Cần có nhiều thử nghiệm lâm sàng hơn để xác định hiệu quả và độ an toàn của các hợp chất trong điều trị các bệnh lý liên quan đến vi khuẩn.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Khuẩn Từ Đẹn Ba Lá

Nghiên cứu sử dụng phương pháp docking phân tử để xác định khả năng tương tác của các hợp chất trong Đẹn ba lá với các đích protein liên quan đến tác dụng kháng khuẩn và ức chế nitric oxid. Phương pháp này cho phép mô phỏng và dự đoán khả năng liên kết của các hợp chất với các protein mục tiêu, từ đó giúp xác định các hợp chất tiềm năng cho việc phát triển thuốc.

3.1. Phương Pháp Docking Phân Tử

Phương pháp docking phân tử được sử dụng để mô phỏng sự tương tác giữa các hợp chất trong Đẹn ba lá và các protein mục tiêu. Điều này giúp xác định các hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn.

3.2. Đánh Giá Tác Dụng Kháng Khuẩn Qua Thử Nghiệm In Vitro

Các thử nghiệm in vitro được thực hiện để đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu và cao chiết từ Đẹn ba lá. Kết quả cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus là đáng kể.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Khuẩn Từ Đẹn Ba Lá

Kết quả nghiên cứu cho thấy Đẹn ba lá có khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ đối với Staphylococcus aureus và có tác dụng ức chế sản sinh nitric oxid. Các hợp chất chính trong tinh dầu như caryophyllene và eucalyptol đã được xác định là có hoạt tính sinh học cao. Những phát hiện này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên cho y học.

4.1. Kết Quả Đánh Giá Tác Dụng Kháng Khuẩn

Kết quả thử nghiệm cho thấy tinh dầu Đẹn ba lá có khả năng ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thấp, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị nhiễm khuẩn.

4.2. Kết Quả Nghiên Cứu Ức Chế Nitric Oxid

Nghiên cứu cho thấy cao chiết từ Đẹn ba lá có khả năng ức chế sản sinh nitric oxid trên đại thực bào phúc mạc, góp phần vào tác dụng chống viêm của cây.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Khuẩn

Nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn và ức chế nitric oxid từ Đẹn ba lá mở ra nhiều triển vọng trong việc phát triển các sản phẩm y tế từ thiên nhiên. Các hợp chất trong Đẹn ba lá không chỉ có khả năng kháng khuẩn mà còn có tác dụng chống viêm, bảo vệ sức khỏe con người. Cần tiếp tục nghiên cứu để khai thác tối đa tiềm năng của Đẹn ba lá trong y học.

5.1. Triển Vọng Phát Triển Sản Phẩm Từ Đẹn Ba Lá

Với những kết quả khả quan, Đẹn ba lá có thể trở thành nguồn nguyên liệu quý giá cho việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn tự nhiên, phục vụ cho nhu cầu điều trị bệnh.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần có thêm nhiều nghiên cứu lâm sàng và thử nghiệm để xác định rõ hơn về hiệu quả và độ an toàn của Đẹn ba lá trong điều trị các bệnh lý liên quan đến vi khuẩn và viêm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nghiên cứu các hoạt tính sinh học từ nguồn dược liệu tự nhiên đang là một định hướng trọng tâm trong lĩnh vực Hóa dược và Dược học nhằm tìm kiếm các phân tử hoạt tính mới có nguồn gốc thực vật phục vụ điều trị bệnh lý ở người. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, được ghi nhận là một trong những quốc gia có độ đa dạng sinh học cao trên thế giới (xếp thứ 16 toàn cầu, chiếm khoảng 6,5% tổng số loài sinh vật hiện hữu). Trong đó, nhiều loài cây thuốc bản địa và cây mọc hoang dại vẫn chưa được khai thác toàn diện về mặt thành phần hóa học cũng như giá trị trị liệu.

Đẹn ba lá (Vitex trifolia L.), hay còn gọi là Mạn kinh, Quan âm, Từ bi biển, là loài cây bụi phân bố phổ biến tại các vùng bờ biển và vùng đồi núi thấp của Việt Nam. Trong y học cổ truyền, quả của cây (Mạn kinh tử) đã được sử dụng từ lâu đời trong các bài thuốc chủ trị cảm mạo, đau đầu, đau mắt đỏ, viêm vú và hỗ trợ điều trị viêm tai giữa. Các nghiên cứu hiện đại trên thế giới cho thấy chiết xuất từ loài này có tiềm năng thể hiện nhiều tác dụng sinh học như chống viêm, bảo vệ gan, chống co thắt và kháng khuẩn. Đứng trước thực trạng gia tăng sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và sự liên quan mật thiết của phản ứng viêm qua trung gian phân tử tín hiệu Nitric oxid (NO) trong nhiều quá trình bệnh lý, tác giả Võ Tùng Lâm đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp cử nhân Hóa dược với đề tài: "Sàng lọc các hợp chất có tác dụng kháng S. aureus và ức chế sản sinh Nitric oxid từ Đẹn ba lá (Vitex trifolia L.) sử dụng docking phân tử".

Khóa luận được triển khai nhằm thực hiện ba mục tiêu cụ thể:

1. Sàng lọc các hợp chất trong tinh dầu Đẹn ba lá có tác dụng kháng S. aureus.
2. Sàng lọc các hợp chất trong cao chiết Đẹn ba lá có tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid.
3. Sử dụng phương pháp docking phân tử làm sáng tỏ các khả năng tác dụng của các hợp chất.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là phần trên mặt đất (bao gồm thân, lá và quả) của loài Vitex trifolia L., được thu hái tại Vườn Quốc gia Xuân Thủy, huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định (tọa độ địa lý: 20°13,702'N; 106°33,781'E). Tiêu bản thực vật khô được giám định và lưu giữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với mã số QTBY - XT16. Nghiên cứu thực nghiệm và tính toán mô phỏng được hoàn thành vào năm 2024 tại Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội và Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Về mặt danh pháp và vị trí phân loại học, theo hệ thống phân loại của nhóm phát sinh chủng loài thực vật hạt kín APG IV (2016), chi Bình linh (Vitex L.) được xếp vào họ Hoa môi (Lamiaceae), thay thế cho việc phân loại vào họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) trong các tài liệu phân loại thực vật truyền thống trước đây.

Cơ sở lý thuyết về hoạt tính sinh học tập trung vào hai cơ chế bệnh sinh:

• Khả năng ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus (chủng vi khuẩn Gram dương gây nhiều nhiễm trùng nguy hiểm trên lâm sàng). Các enzym đích sinh học được lựa chọn để nghiên cứu cơ chế kháng khuẩn gồm có Tyrosyl-tRNA synthetase (xúc tác gắn tyrosine vào tRNATyr trong tổng hợp protein vi khuẩn, mã PDB: 1JIJ), Dihydrofolate reductase (xúc tác khử dihydrofolat thành tetrahydrofolat cần thiết cho sinh tổng hợp acid nucleic, mã PDB: 2W9S và 3SRW), và Dehydrosqualene synthase (tham gia tổng hợp sắc tố bảo vệ staphyloxanthin – yếu tố độc lực của vi khuẩn, mã PDB: 2ZCQ).
• Khả năng chống viêm thông qua việc ức chế sản sinh Nitric oxid (NO) – một chất trung gian hóa học được tổng hợp bởi enzym Nitric oxide synthase (NOS, mã PDB: 3E7G). Ở nồng độ cao trong đáp ứng viêm mạn tính hoặc sốc nhiễm khuẩn, NO đóng vai trò như một tác nhân độc tế bào gây tổn thương mô.

Nghiên cứu sử dụng kết hợp các phương pháp chiết xuất, phân tích dụng cụ, thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro và mô phỏng tính toán in silico:

• Phương pháp thu nhận mẫu: Tinh dầu Đẹn ba lá được chiết xuất từ 1 kg cành mang lá tươi bằng phương pháp cất kéo hơi nước sử dụng bộ dụng cụ Clevenger theo quy định của Dược điển Việt Nam V, đun duy trì trong 2 giờ, làm khan bằng natri sulfat khan ($Na_2SO_4$) và bảo quản ở nhiệt độ -5°C trong bóng tối. Cao chiết methanol thu được từ 1 g bột dược liệu khô bằng kỹ thuật chiết siêu âm với methanol 99% ở 50°C trong 15 phút (thực hiện lặp lại 3 lần), ly tâm 3500 vòng/phút trong 5 phút, gộp dịch chiết và cô quay giảm áp ở 40°C.
• Phương pháp phân tích thành phần hóa học: Thành phần tinh dầu được định tính và bán định lượng bằng hệ thống sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC-MS) Thermo Scientific Trace 1310 kết hợp đầu dò bẫy ion ITQ 900, sử dụng cột mao quản TG-5MS (kích thước 30 m × 0,25 µm × 0,25 mm), khí mang Heli. Chương trình nhiệt độ lò cột: giữ 60°C trong 2 phút, tăng nhiệt với tốc độ 4°C/phút đến 220°C và giữ đẳng nhiệt 10 phút. Thành phần chất được xác định dựa trên thư viện phổ khối lượng chuẩn NIST và so sánh chỉ số lưu giữ tính toán ($RI$) đối chiếu dãy ankan đồng đẳng $C_9$ - $C_{20}$.
• Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) trên chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus 33591 (do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia cung cấp) bằng phương pháp vi pha loãng trên đĩa 96 giếng theo khuyến cáo của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI), sử dụng môi trường lỏng có bổ sung chất diện hoạt Tween 80 4%, mật độ vi khuẩn ban đầu $1,5 \times 10^6$ CFU/mL, ủ ở 37°C trong 20 giờ.
• Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh NO: Thực hiện trên tế bào đại thực bào sơ cấp phúc mạc chuột nhắt trắng chủng Swiss (đực, 10–12 tuần tuổi, khối lượng 28–30 g do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp). Đại thực bào được kích thích huy động bằng cách tiêm phúc mạc 1 mL thioglycollat 4%, thu hoạch sau 3 ngày bằng dung dịch đệm HBSS và ly giải hồng cầu bằng đệm RBC lysis buffer 2X. Tế bào nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS và 1% penicillin/streptomycin. Sau khi tiền xử lý với mẫu thử ở các nồng độ pha loãng khác nhau trong 2 giờ, tế bào được kích thích tạo đáp ứng viêm bằng Lipopolysaccharid (LPS, 100 ng/mL) trong 24 giờ. Đo hàm lượng nitrit tích lũy bằng phản ứng Griess ở bước sóng 535 nm trên máy quang phổ đọc đĩa Variaskan LUX. Chất đối chứng dương là L-NAME ($N^{(\gamma)}$-nitro-L-arginin methyl este). Giá trị $IC_{50}$ được xử lý và tính toán bằng phần mềm GraphPad Prism 8.2 theo mô hình hồi quy phi tuyến.
• Phương pháp mô phỏng Docking phân tử: Cấu trúc không gian của các protein đích được tải từ Ngân hàng Dữ liệu Protein (PDB). Cấu trúc 3D của các phân tử phối tử được thu thập từ PubChem hoặc dựng bằng phần mềm ChemDraw. Chuẩn bị thụ thể, xác định khoang gắn kết (bằng công cụ Site Finder), tối ưu hóa cấu trúc phân tử và gán trường lực Amber99 cùng điện tích bán kinh nghiệm AM1-BCC trên phần mềm MOE (Molecular Operating Environment). Mỗi phối tử được lắp ghép với 100 cấu hình, chọn 10 cấu hình có trạng thái năng lượng thấp nhất và trực quan hóa tương tác 2D/3D thông qua phần mềm Discovery Studio 2021.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện các dữ liệu khoa học về loài Vitex trifolia L. Tác giả trình bày vị trí phân loại học cập nhật theo APG IV (2016) và các đặc điểm thực vật học chi tiết: loài cây bụi cao tới 3 m, thân non có 4 cạnh mang lông xám, cành già tròn màu nâu; lá kép mọc đối mang 3 lá chét (đôi khi có loại 1 lá chét); cụm hoa chùy tận cùng mang hoa màu lam nhạt hoặc tím; quả hình bầu dục có rãnh mang đài hoa phát triển bao bọc. Cây phân bố rộng từ Châu Phi, Nam Á đến Đông Nam Á và mọc rải rác dọc bờ biển miền Trung Việt Nam.

Về thành phần hóa học, tài liệu ghi nhận Đẹn ba lá là nguồn dược liệu phong phú các hợp chất tự nhiên:

• Tinh dầu: Chứa chủ yếu các monoterpen và sesquiterpen như caryophyllen, sabinen, eucalyptol.
• Flavonoid: Phân lập được nhiều dẫn chất như pachypodol, vitegnoside, chrysosplenol-D, artemetin, vitexicarpin (chất thể hiện tính đối kháng histamin và ổn định dưỡng bào mast), persicogenin, luteolin, penduletin.
• Terpenoid: Nhóm labdan diterpenoid rất phong phú với 53 dẫn chất đã được công bố, bao gồm các cấu trúc mới như vitetrolin A–D từ quả và diterpenoid alkaloid chứa dị vòng 2-cyano-pyrrol như vitepyrroloid A–D từ lá; nhóm triterpenoid và phytosterol gồm lupeol, betulinic acid, $\beta$-sitosterol, stigmasterol, campesterol.

Về dược lý thực nghiệm, các công trình trước đây chỉ ra chiết xuất từ Đẹn ba lá có hoạt tính chống oxy hóa dọn gốc tự do DPPH ($IC_{50}$ từ 40,0 đến 226,7 µg/mL); bảo vệ gan chống tổn thương do $CCl_4$ ở chuột tương đương thuốc đối chứng silymarin qua việc hạ men gan SGOT, SGPT, ALP; chống co thắt phế quản; giảm phản ứng phù tai do xylen (giảm 60,49%) và phù chân do carrageenan (giảm 43%); ức chế tế bào ung thư vú T47D đạt 88,7% ở nồng độ 25 µg/mL; cải thiện trí nhớ trên mô hình mê cung chữ T; có tác dụng diệt ấu trùng muỗi, kháng khuẩn thông qua vitrifolin A, kháng virus Herpes simplex, ức chế enzyme phiên mã ngược của HIV-1 trên 90% ở nồng độ 200 µg/mL, và có tiềm năng chống sốt rét. Đồng thời, tác giả tổng thuật các bài thuốc cổ truyền dùng Mạn kinh chữa đau đầu mờ mắt, đau mắt đỏ, viêm vú và viêm tai giữa.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu, hóa chất, chủng vi sinh vật và hệ thống trang thiết bị phục vụ đề tài. Dược liệu thu hái tại Nam Định được chuẩn hóa mã tiêu bản bảo tàng. Tác giả trình bày tường minh các quy trình kỹ thuật:

• Kỹ thuật cất tinh dầu bằng bộ Clevenger đạt chuẩn Dược điển và quy trình chiết xuất cao methanol bằng sóng siêu âm.
• Thông số vận hành thiết bị sắc ký khí kết nối khối phổ GC-MS (cột TG-5MS, nhiệt độ buồng tiêm 260°C, nhiệt độ detector 240°C, tốc độ tăng nhiệt 4°C/phút). Công thức toán học tính toán chỉ số lưu giữ $RI$ dựa vào thời gian lưu của dãy đồng đẳng ankan chuẩn ($C_9$–$C_{20}$).
• Thử nghiệm kháng vi sinh vật in vitro bằng kỹ thuật pha loãng bậc 2 trong môi trường lỏng để xác định giá trị MIC và MBC trên đĩa 96 giếng.
• Kỹ thuật phân lập sơ cấp đại thực bào màng bụng chuột nhắt trắng Swiss tiêm thioglycollat, ủ mẫu thử kết hợp LPS (100 ng/mL) và phản ứng so màu Griess đo độ hấp thụ tại 535 nm để tính tỷ lệ phần trăm ức chế giải phóng NO theo công thức: $$I% = \frac{C_{LPS} - C_{thu}}{C_{LPS}} \times 100$$
• Quy trình mô phỏng Docking phân tử: Tải và xử lý cấu trúc các đích 1JIJ, 2W9S, 2ZCQ, 3SRW, 3E7G; chuẩn bị 49 phối tử từ tinh dầu và 18 phối tử từ cao chiết; thiết lập thông số trường lực, khoang liên kết và chấm điểm năng lượng tự do liên kết ($S$, đơn vị kcal/mol) trên phần mềm MOE và Discovery Studio 2021.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được đối chiếu với các nghiên cứu tiền hàm:

1. Thành phần hóa học tinh dầu: Phân tích GC-MS đã định danh được 49 hợp chất trong tinh dầu lá Đẹn ba lá. Caryophyllen chiếm tỷ lệ áp đảo với 66,25% diện tích pic, tiếp theo là sabinen (10,58%). Các thành phần có tỷ lệ trên 1% khác gồm alloaromadendren (2,04%), rimuen (1,95%), isophyllocladen (1,79%), terpinen-4-ol (1,65%), isoaromadendren epoxid (1,46%) và $\beta$-pinen (1,01%). Tác giả phân tích sự khác biệt: caryophyllen ở mẫu nghiên cứu cao hơn hẳn các nghiên cứu tại Ấn Độ (8,9–38,36%) hoặc nghiên cứu khác tại Việt Nam (14,5%), trong khi eucalyptol chỉ chiếm tỷ lệ thấp (khoảng 0,5%), cho thấy sự biến động thành phần tinh dầu theo sinh cảnh và vị trí địa lý.
2. Hoạt tính kháng S. aureus: Tinh dầu thể hiện tác dụng kháng khuẩn với nồng độ ức chế tối thiểu MIC = 1/128 (tương đương 0,8% hay 8 mL/L) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC = 1/64 (tương đương 1,6% hay 16 mL/L). Do giá trị MBC lớn hơn MIC, tác giả kết luận tinh dầu Đẹn ba lá mang đặc tính kìm khuẩn đối với chủng vi khuẩn thử nghiệm.
3. Hoạt tính ức chế sản sinh NO: Cao chiết methanol thể hiện khả năng ức chế giải phóng NO phụ thuộc vào nồng độ (ở 40 µg/mL đạt tỷ lệ ức chế 104,64%; ở 2,5 µg/mL đạt 27,42%). Giá trị $IC_{50}$ của cao chiết được xác định là 4,965 µg/mL với khoảng tin cậy 95% từ 3,249 đến 7,069 µg/mL (chất đối chứng dương L-NAME có $IC_{50} = 0,599$ µM, khoảng tin cậy 95%: 0,473–0,765 µM).
4. Nghiên cứu Docking phân tử:

• Trên các đích protein của S. aureus: So sánh với chất ức chế đồng kết tinh, tại đích 2W9S (Trimethoprim có năng lượng liên kết là -5,489 kcal/mol), có tới 47/49 hợp chất trong tinh dầu đạt năng lượng liên kết âm hơn (liên kết bền chặt hơn chất chứng), tiêu biểu là caryophyllen (-7,364 kcal/mol), sabinen (-5,628 kcal/mol) và alloaromadendren (-7,214 kcal/mol). Tại đích 3SRW (chất ức chế đồng kết tinh là -6,312 kcal/mol), toàn bộ 26 hợp chất thuộc các phân nhóm sesquiterpen, sesquiterpenoid, diterpen và diterpenoid đều cho năng lượng liên kết thấp hơn chất đối chiếu. Ngược lại, tại hai đích 1JIJ và 2ZCQ, không có phối tử nào trong tinh dầu vượt qua được ái lực của chất đồng kết tinh.
• Trên đích ức chế sản sinh NO (3E7G): Cả 18 hợp chất khảo sát từ cao chiết đều cho giá trị năng lượng liên kết dao động từ -7,198 đến -11,545 kcal/mol, vượt trội hơn so với chất ức chế đồng kết tinh AR-C95791 (-6,166 kcal/mol). Nhóm triterpen và steroid thể hiện ái lực gắn kết mạnh nhất, trong đó dẫn đầu là $\beta$-sitosterol (-11,545 kcal/mol), lupeol (-11,015 kcal/mol), campesterol (-10,542 kcal/mol), 6$\beta$-hydroxystigmast-4-en-3-on (-10,527 kcal/mol) và betulinic acid (-10,473 kcal/mol). Phân tích tương tác không gian cho thấy các chất này tạo liên kết hydro bền vững với các acid amin quan trọng tại tâm hoạt động như Trp372, Tyr489 và các tương tác kỵ nước alkyl, pi-alkyl với chuỗi acid amin xung quanh.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã cung cấp hệ thống số liệu thực nghiệm đầy đủ về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và cơ chế phân tử của dược liệu Đẹn ba lá thu hái tại miền Bắc Việt Nam:

Chỉ tiêu nghiên cứu	Phương pháp đánh giá	Kết quả thực nghiệm / Giá trị đo lường	Chất đối chứng / Ghi chú
Thành phần chính tinh dầu	GC-MS (Cột TG-5MS, ghép bẫy ion ITQ 900)	Caryophyllen: 66,25% Sabinen: 10,58% Alloaromadendren: 2,04%	Xác định tổng cộng 49 hợp chất; caryophyllen chiếm ưu thế vượt trội
Hoạt tính kháng S. aureus	Vi pha loãng trên đĩa 96 giếng	$\text{MIC} = 1/128$ (0,8% hay 8 mL/L) $\text{MBC} = 1/64$ (1,6% hay 16 mL/L)	Chủng S. aureus 33591; thể hiện tính chất kìm khuẩn (MBC > MIC)
Ức chế sản sinh NO	Định lượng qua phản ứng Griess trên đại thực bào chuột	$IC_{50} = 4,965$ µg/mL (Khoảng tin cậy 95%: 3,249 ÷ 7,069 µg/mL)	L-NAME ($IC_{50} = 0,599$ µM; khoảng tin cậy: 0,473 ÷ 0,765 µM)
Docking kháng khuẩn (đích 2W9S)	Năng lượng liên kết MOE (kcal/mol)	Caryophyllen: -7,364 Alloaromadendren: -7,214 Sabinen: -5,628	Chất đồng kết tinh (Trimethoprim): -5,489 kcal/mol (47/49 chất có ái lực mạnh hơn)
Docking kháng khuẩn (đích 3SRW)	Năng lượng liên kết MOE (kcal/mol)	Agathadiol: -9,635 Kolavelool: -9,348 Caryophyllen: -7,040	Chất đồng kết tinh: -6,312 kcal/mol (26 hợp chất có ái lực mạnh hơn)
Docking ức chế NO (đích 3E7G)	Năng lượng liên kết MOE (kcal/mol)	$\beta$-sitosterol: -11,545 Lupeol: -11,015 Campesterol: -10,542 Betulinic acid: -10,473	Chất đồng kết tinh (AR-C95791): -6,166 kcal/mol (Toàn bộ 18/18 chất đều liên kết mạnh hơn)

Về mặt đóng góp khoa học, đề tài lần đầu tiên chỉ ra rằng tinh dầu Đẹn ba lá thu hái tại Vườn Quốc gia Xuân Thủy có tỷ lệ caryophyllen rất cao (66,25%), mở ra triển vọng sử dụng loài này như một nguồn nguyên liệu tự nhiên giàu caryophyllen (chất chủ vận chọn lọc thụ thể phytocannabinoid có tiềm năng ứng dụng bảo vệ thần kinh và giảm đau). Nghiên cứu đồng thời xác nhận tác dụng kìm khuẩn S. aureus của tinh dầu và tác dụng ức chế sản sinh NO của cao chiết trên mô hình tế bào đại thực bào sơ cấp. Bằng việc kết hợp phương pháp docking phân tử, khóa luận đã lý giải được cơ chế gắn kết của các nhóm sesquiterpenoid, diterpenoid trên enzyme đích vi khuẩn (2W9S, 3SRW) cũng như ái lực vượt trội của các triterpen và phytosterol trên tâm hoạt động của enzyme Nitric oxide synthase (3E7G).

Tác giả kiến nghị tiếp tục mở rộng việc nghiên cứu các tác dụng sinh học khác của loài Đẹn ba lá kết hợp công cụ docking phân tử, đồng thời ứng dụng rộng rãi quy trình sàng lọc kết hợp in vitro - in silico này cho các đề tài nghiên cứu dược liệu tương tự.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận còn một số điểm hạn chế gắn liền với phạm vi nghiên cứu được phản ánh trong văn bản:

• Đánh giá hoạt tính kháng viêm ức chế NO mới chỉ dừng lại ở mức độ cao chiết methanol toàn phần chứ chưa thực hiện phân lập các hợp chất tinh khiết để thử nghiệm thực nghiệm sinh học in vitro độc lập, mà mới chỉ đánh giá từng phân tử qua mô hình mô phỏng tính toán.
• Khoảng tin cậy 95% của giá trị $IC_{50}$ đối với ức chế NO ở cao chiết còn tương đối rộng (3,249 đến 7,069 µg/mL), cho thấy mức độ ổn định của mẫu cao toàn phần chưa cao so với chất chuẩn đơn phân tử L-NAME.
• Mô hình docking phân tử sử dụng là mô hình gắn kết tĩnh, chưa bao gồm các mô phỏng động lực học phân tử (Molecular Dynamics simulation) để đánh giá độ ổn định và thay đổi cấu hình không gian của phức hợp phối tử - protein theo thời gian.

Hướng nghiên cứu tiếp theo mà tác giả đề xuất là tiếp tục khai thác các hoạt tính dược lý khác của loài Vitex trifolia L., mở rộng quy mô chiết tách đơn chất và áp dụng mô hình docking phân tử trên các hệ enzyme đích tiềm năng khác.

Giá trị tham khảo

Bản khóa luận là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Dược học, Hóa dược, Hóa hợp chất thiên nhiên và Tin sinh học (CADD - Thiết kế thuốc có sự trợ giúp của máy tính).

Những nội dung có giá trị tham khảo ứng dụng cao bao gồm:

• Quy trình phân tích định tính và tính toán chỉ số lưu giữ ($RI$) chuẩn hóa cho các thành phần tinh dầu thực vật trên hệ thống sắc ký khí khối phổ GC-MS.
• Quy trình thực nghiệm phân lập đại thực bào phúc mạc chuột sơ cấp bằng thioglycollat và kỹ thuật định lượng Nitric oxid bằng phản ứng Griess trên đĩa nuôi cấy 96 giếng.
• Phương pháp luận thiết lập sàng lọc ảo docking phân tử bằng phần mềm MOE và Discovery Studio trên các đích phân tử enzym vi sinh vật và enzyme liên quan đến viêm.

Câu hỏi thường gặp

1. Thành phần hóa học của tinh dầu Đẹn ba lá thu hái tại Vườn Quốc gia Xuân Thủy có đặc điểm gì khác biệt so với các công bố trước đây?
Trong nghiên cứu này, tinh dầu lá Đẹn ba lá chứa caryophyllen với tỷ lệ áp đảo lên tới 66,25% diện tích pic và sabinen đạt 10,58%, trong khi eucalyptol chỉ chiếm tỷ lệ nhỏ (khoảng 0,5%). Ở các nghiên cứu trước đây tại Ấn Độ và một số vùng khác của Việt Nam, caryophyllen chỉ dao động trong khoảng từ 8,9% đến 38,36%, còn eucalyptol thường chiếm tỷ lệ cao từ 15,7% đến 25,72%. Sự sai khác này phản ánh ảnh hưởng rõ rệt của vị trí địa lý, sinh cảnh và điều kiện thu hái đến hàm lượng các chất trong tinh dầu.

2. Tinh dầu Đẹn ba lá thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus aureus ở mức độ nào và là dạng kìm khuẩn hay diệt khuẩn?
Tinh dầu Đẹn ba lá thể hiện nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 1/128 (tương đương nồng độ thể tích 0,8% hay 8 mL/L) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) là 1/64 (tương đương 1,6% hay 16 mL/L). Do giá trị MBC cao hơn giá trị MIC, thử nghiệm chứng minh tinh dầu Đẹn ba lá có đặc tính kìm khuẩn đối với chủng vi khuẩn S. aureus 33591.

3. Khả năng ức chế sản sinh Nitric oxid (NO) của cao chiết Đẹn ba lá trên đại thực bào phúc mạc đạt kết quả ra sao?
Cao chiết methanol từ Đẹn ba lá có khả năng ức chế tổng hợp và giải phóng NO phụ thuộc vào nồng độ, đạt tỷ lệ ức chế tối đa trên 100% ở nồng độ từ 20 đến 40 µg/mL. Giá trị $IC_{50}$ tính toán được là 4,965 µg/mL (với khoảng tin cậy 95% là 3,249 đến 7,069 µg/mL), chứng minh cao chiết có tác dụng ức chế sản sinh NO hiệu quả, mặc dù cần nồng độ cao hơn và khoảng tin cậy rộng hơn so với chất đối chứng dương L-NAME ($IC_{50} = 0,599$ µM).

4. Khi mô phỏng docking phân tử trên các đích protein của S. aureus, những phân tử nào trong tinh dầu Đẹn ba lá thể hiện ái lực mạnh nhất?
Tại đích Dihydrofolate reductase (2W9S), có 47 trên tổng số 49 hợp chất trong tinh dầu cho năng lượng liên kết thấp hơn chất ức chế đồng kết tinh Trimethoprim (-5,489 kcal/mol), trong đó ba hợp chất chính gồm caryophyllen (-7,364 kcal/mol), alloaromadendren (-7,214 kcal/mol) và sabinen (-5,628 kcal/mol) đều có tương tác chặt chẽ tại tâm hoạt động. Tại đích 3SRW, caryophyllen (-7,040 kcal/mol), alloaromadendren (-7,042 kcal/mol) cùng các diterpenoid như agathadiol (-9,635 kcal/mol) và kolavelool (-9,348 kcal/mol) thể hiện ái lực liên kết vượt trội so với chất đồng kết tinh (-6,312 kcal/mol).

5. Nhóm hợp chất nào trong cao chiết Đẹn ba lá có ái lực gắn kết mạnh nhất với enzym Nitric oxide synthase (đích 3E7G)?
Nhóm phytosterol và triterpenoid thể hiện năng lượng liên kết âm nhất (tương ứng ái lực liên kết mạnh nhất), vượt trội hơn nhóm flavonoid và chất ức chế đối chiếu AR-C95791 (-6,166 kcal/mol). Sáu hợp chất có giá trị năng lượng thấp nhất gồm $\beta$-sitosterol (-11,545 kcal/mol), lupeol (-11,015 kcal/mol), campesterol (-10,542 kcal/mol), 6$\beta$-hydroxystigmast-4-en-3-on (-10,527 kcal/mol), betulinic acid (-10,473 kcal/mol) và stigmasterol (-10,260 kcal/mol), nhờ vào việc tạo liên kết hydro với Trp372, Tyr489 và mạng lưới tương tác alkyl, pi-alkyl dày đặc trong khoang hoạt động của enzym.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Võ Tùng Lâm đã thực hiện thành công việc phân tích thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học của Đẹn ba lá (Vitex trifolia L.) thu hái tại Vườn Quốc gia Xuân Thủy. Kết quả thực nghiệm khẳng định tinh dầu của loài rất giàu caryophyllen (66,25%), có hoạt tính kìm khuẩn trên chủng Staphylococcus aureus 33591 (MIC = 1/128), và cao chiết methanol thể hiện khả năng ức chế giải phóng Nitric oxid rõ rệt trên đại thực bào phúc mạc ($IC_{50} = 4,965$ µg/mL). Thông qua mô phỏng docking phân tử trên 5 cấu trúc protein đích, công trình đã làm sáng tỏ cơ chế liên kết mức độ phân tử của các hợp chất terpene, phytosterol và flavonoid, cung cấp luận cứ khoa học tin cậy cho việc phát triển các chế phẩm kháng khuẩn và kháng viêm từ nguồn dược liệu này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Tác dụng sinh học của các loài thực vật hiện đang là vấn đề được nghiên cứu nhiều nhất gần đây trên khắp thế giới bởi sự đa dạng về các loài thực vật cũng như ứng dụng của chúng đến việc điều trị các bệnh lý của con người. Việt Nam, với khí hậu nhiệt đới gió mùa là một trong những quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất trên thế giới. Theo tài liệu thống kê, Việt Nam xếp thứ 16 về mức độ đa dạng sinh học (chiếm 6,5% số loài có trên thế giới)[44], trong số đó có rất nhiều loài chưa được biết đến, nhiều loài được coi là loài xâm lấn chưa tìm ra được tác dụng thật sự. Chính vì thế mà việc nghiên cứu tác dụng sinh học của các loài thực vật luôn là đề tài nóng hổi tại Việt Nam.

Đẹn ba lá (Vitex trifolia L.) từ xa xưa đã được biết đến và được sử dụng như một phương thuốc cổ của ông cha ta nhằm chữa các bệnh như đau đầu, sung vú hay thuốc làm đen tóc. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về Đẹn ba lá và cho thấy đây là loài cây có tiềm năng chứa nhiều đặc tính sinh học quý giá như chống viêm, bảo vệ gan, chống co thắt,…[20]. Qua các thử nghiệm in vitro cho thấy Đẹn ba lá có tác dụng ức chế trên chủng vi sinh vật Stphylococcus areus và ức chế sản sinh nitric oxid. Do đó hướng đến việc lựa chọn đề tài “Sàng lọc các hợp chất có tác dụng kháng S.

aureus và ức chế sản sinh Nitric oxid từ Đẹn ba lá (Vitex trifolia L.) sử dụng docking phân tử” và được thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Sàng lọc các hợp chất trong tinh dầu Đẹn ba lá có tác dụng kháng S. Sàng lọc các hợp chất trong cao chiết Đẹn ba lá có tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid. Sử dụng phương pháp docking phân tử làm sáng tỏ các khả năng tác dụng của các hợp chất.

Tên khoa học và vị trí phân loại Đẹn ba lá hay Mạn kinh, Quan âm, Từ bi biển, Vạn kim tử, Mác nim (Tày) [3] có tên khoa học là Vitex trifolia L.[1], [2], [3] Đẹn ba lá thuộc chi Bình linh (Vitex L. Trong một số tài liệu cũ, sách báo Việt Nam cũng như quốc tế, chi Vitex L. được phân loại vào họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae)[2]. Theo hệ thống phân loại của nhóm phát sinh chủng loài thực vật hạt kín APG IV 2016 (Angiosperm Phylogeny Group), và các nghiên cứu gần đây trên thế giới vị trí phân loại của chi Vitex L.

như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida) Bộ: Hoa môi (Lamiales) Họ: Hoa môi (Lamiaceae) Chi: Bình linh (Vitex L.) Loài: Vitex trifolia L. Đặc điểm thực vật và vị trí phân bố 1. Đặc điểm thực vật Đẹn ba lá là cây nhỏ hay cây bụi, mùi thơm, có thể cao tới 3m [1], [3]. Cành non có 4 cạnh, có lông mềm, màu xám nhạt; cành già tròn, nhẵn, màu nâu.

Lá kép mọc đối, 3 lá chét (lá ở gần ngọn có hoa thường đơn), có loại có 1 lá chét [3], lá chét hình trứng, gốc tròn, đầu tù hoặc hơi nhọn, mép nguyên, mặt trên nhẵn và đen lại khi khô, mặt dưới phủ đầy lông trắng, lá chét giữa lớn hơn , cuống lá dài 1-3cm [1]. Cụm hoa là một chùy tận cùng, dài 13-14mm nhiều khi phía dưới có lá, có lông dày[3]; mang nhiều xim mọc đối, mỗi xim có 2-3 hoa màu tím nhạt hoặc lam nhạt; lá bắc nhỏ, hình dài; đài hình chuông, có lông trắng, 5 răng nhỏ đều; tràng hình trụ có lông ở mặt ngoài trừ phần gốc, môi trên có 2 thùy ngắn, môi dưới có 3 thùy, thùy giữa lớn hơn hai thùy bên; nhị 4, thò ra ngoài[1]. Quả hình bầu dục có rãnh, đầu hơi dẹt, rộng chừng 6mm, được che kén quá nửa bởi đài phát triển và tồn tại[3]. Cây ưa sáng và có thể chịu được hạn, do có hệ thống rễ cọc phát triển cắm sâu xuống đất.

Cây phân cành nhiều, ra hoa quả đều hàng năm [1]. Mùa hoa quả thường vào tháng 5-7, mùa quả thường vào tháng 9-11 [1], [3]. Vị trí phân bố Chi Vitex L. là một trong những chi quan trọng và lớn nhất thuộc họ Lamiaceae với khoảng 750 loài [29], [37], phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Châu Á, Mỹ Latinh và Châu Phi [29] Đẹn ba lá có nguồn gốc ở Nam Phi, vùng phân bố từ Madagasca đến Xrilanca, Afghanistan, Ấn Độ, Myanma, Nam Trung Quốc, Nhật Bản xuống các nước vùng Đông - Nam Á đến các vùng Bắc Australia và phía động Caledonia [1].

Ở Việt Nam, Đẹn ba lá phân bố rải rác khắp các tỉnh vùng núi thấp đến trung du và đôi khi gặp ở cả đồng bằng, loại 1 lá chét rất phổ biến ở dọc các bờ biển tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh [1], [3]. Thành phần Trong Đẹn ba lá bao gồm nhiều thành phần hóa học như terpenoid (labdan diterpenoid), phytosterol, flavonoid, acid béo và các hợp chất khác trong đó terpenoid và flavonoid được xác định là các hợp chất chiếm hàm lượng chính[7], [11], [20] 1. Tinh dầu Các thành phần được tìm thấy trong tinh dầu Đẹn ba lá chủ yếu là các terpenoid chia thành các nhóm: monoterpen, monoterpenoid, sesquiterpen, sesquiterpenoid, diterpen, diterpenoid và các hợp chất khác [17], [30] Năm 2019, tại Ấn Độ, Thomas đã tìm ra 16 hợp chất trong tinh dầu Đẹn ba lá trong đó thành phần chính là caryophyllene (38,36%) và eucalyptol (25,72%) [35]. Cũng tại Ấn Độ theo Chadrasekaran và cộng sự thì eucalyptol (16,35%), sabinen (9,44%) và caryophyllen (8,91%) là các thành phần chính của tinh dầu[43].

Hay ở Việt Nam tinh dầu Đẹn ba lá chứa các thành phần chính là sabinen (19,4%), eucalyptol (15,7%) và caryophylen (14,5%) [30]. Sự khác biệt về thành phần tinh dầu có lẽ đến từ các yếu tố bên trong, bên ngoài và sự tương tác giữa chúng[17] Có thể thấy, mặc dù hàm lượng và thành phần các hợp chất có trong tinh dầu Đẹn ba lá ở các nghiên cứu là khác nhau nhưng tất cả đều cho thấy thành phần chính trong tinh dầu Đẹn ba lá là caryophyllen, sabinen và eucalyptol. Flavonoid Đẹn ba lá chứa khoảng 57,41 mgQE/g flavonoid trong cao chiết ethanol. Trong đó, hàm lượng flavonoid được tính theo microgram quercetin trong 1 mg cao chiết (𝜇gQE/mg)[20].

Trên thế giới đã có nhiều hợp chất flavonoid được phân lập từ Đẹn ba 3 lá và được nghiên cứu nhiều tác dụng sinh học[7]. Các hợp chất flavonoid đã được nghiên cứu phổ biến như (Bảng 1. Các hợp chất flavonoid được tìm thấy từ Đẹn ba lá STT Tên hợp chất CTPT Mw TLTK 1 Pachypodol C18H16O7 344,3 [23] 2 Vitegnoside C22H20O12 476,4 [23], [33] 3 Chrysosplenol-D C18H16O8 360,3 [23], [47] 4 Artemetin C20H20O8 388,4 [18], [23], [47] 5 Vitexicarpin C19H18O8 374,3 [18], [47] 6 Persicogenin C17H16O6 316,3 [47] 7 Luteolin C15H10O6 284,2 [47] 8 Penduletin C18H16O7 344,3 [47] Trong đó, Vitexicarpin (5) là hợp chất được nghiên cứu cho thấy cơ chế hoạt động dường như là đối kháng không cạnh tranh với Histamin và ổn định màng tế bào Mast[25]. Terpenoid Không chỉ tinh dầu Đẹn ba lá mà cả quả và lá của cây cũng được nghiên cứu cho thấy chúng là những nguồn dồi dào các terpenoid đặc biệt là ladbdan diterpenoid[20].

Đã có tổng cộng 53 dẫn chất labdan diterpenoid khác nhau được mô tả với mức độ phong phú bậc nhất trong số các loài thực vật. Và gần đây nhất, các nhà nghiên cứu khoa học đã xác định ra 4 hợp chất labdan diterpenoid mới từ chiết xuất ethanol của quả cây Đẹn ba lá và đặt tên lần lượt là Vitetrolin A, B, C, D (Bảng 1. Năm 2017, Pan Lou cùng cộng sự đã xác định được từ chiết xuất ethanol của lá loài Đẹn ba lá 4 hợp chất labdan diterpenoid alkaloid chứa dị vòng 2-cyano-pyrrol mới và đặt tên lần lượt là Vitepyrroloid A, B, C, D (Bảng 1. Các labdan diterpenoid mới được tìm thấy từ quả Đẹn ba lá STT Tên hợp chất CTPT Mw TLTK 9 Vitetrolin A C24H38O6 422,27 [22] 10 Vitetrolin B C29H38O8 514,26 [22] 11 Vitetrolin C C20H34O4 338,25 [22] 12 Vitetrolin D C22H36O6 396,25 [22] 5 Bảng 1.

Các labdan diterpenoid alcaloid được tìm thấy từ lá Đẹn ba lá STT Tên hợp chất CTPT Mw TLTK 13 Vitepyrroloid A C21H32N2O 328,25 [32] 14 Vitepyrroloid B C27H42N2O3 442,32 [32] 15 Vitepyrroloid C C27H40N2O5 472,28 [32] 16 Vitepyrroloid D C25H38N2O4 430,27 [32] Ở lá của Đẹn ba lá, các triterpenoid (17-22) chủ yếu tồn tại ở các dạng oleanan, ursan, lupan và taraxeran. Thêm vào đó ở loài này còn chứa các dẫn xuất sterol (23-29), đặc biệt là các phytosterol (Bảng 1. Một số hợp chất triterpenoid và phytosterol từ lá Đẹn ba lá STT Tên hợp chất CTPT Mw TLTK 17 3-Oxotaraxer-14-en-30-al C30H46O2 438,3 [28] 18 Taraxeron C30H48O 424,7 [28] 19 3-epiursolic acid C30H48O3 456,7 [28] 20 2𝛼,3𝛽 C30H48O4 472,7 [28] -dihydroxyurs-12-en-28-oic acid 21 Lupeol C30H50O 426,7 [28] 22 Betulinic acid C30H48O3 456,7 [28] 23 𝛽-sitosterol C29H50O 414,7 [18], [28] 24 3𝛼-Hydroxylanosta-8,24E-dien-26-oic C30H48O3 456,7 [31] acid 25 Stigmast-4-ene-3,6-dion C29H46O2 426,7 [6] 26 6𝛽-hydroxystigmast-4-en-3-on C29H48O2 428,7 [6] 27 20-Hydroxyecdyson C27H44O7 480,6 [23] 28 Stigmasterol C29H48O 412,7 [18] 29 Campesterol C28H48O 400,7 [18] 1. Acid béo và các hợp chất khác Các anthraquinon, physcion chỉ được hình thành thông qua con đường polyketide (quá trình chuyển hóa xảy ra trong quả Đẹn ba lá).

Các dẫn xuất Benzoic acid được phân lập từ các bộ phận khác nhau của cây[21]. Các acid béo mạch dài no-không no và các rượu được tìm thấy từ lá và cành cây[20]. Tác dụng sinh học 1. Tác dụng chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa của loài Đẹn ba lá được thử nghiệm bằng cách sử dụng chiết xuất ethanol từ loài cho tiếp xúc với 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) trong 30 phút.

Kết quả cho ra phạm vi hoạt động chống oxy hóa của Đẹn ba lá nằm trong khoảng 60,87% đến 89,99% với giá trị IC50 trong khoảng 40,0 đến 226,7 𝜇g/mL[39]. Ngoài ra, Đẹn ba lá thể hiện giá trị IC50 bằng 64,5 𝜇g/mL ở khả năng làm sạch gốc tự do DPPH. Kết quả này giúp cho Đẹn ba lá như một phương thuốc truyền thống chữa ngộ độc cá biển[36]. Tác dụng bảo vệ gan Nghiên cứu cho thấy chiết xuất ethanol của Đẹn ba lá với liều dùng 200mg trên mỗi cân nặng cơ thể thể hiện khả năng bảo vệ gan một cách đáng kể chống lại CCl4 gây tổn thương gan ở chuột sau 7 ngày điều trị.

Quan sát khả năng ở trên được cho là tương đương với tác dụng của một thuốc đạt tiêu chuẩn khác là Silymarin với liều dùng 100mg trên mỗi cân nặng cơ thể cũng trong 7 ngày điều trị. Sự tương đồng này thể hiện rõ ở việc làm giảm đáng kể nồng độ của các men gan quan trọng trong huyết thanh, cụ thể như glutamat pyruvat transaminase (SGPT), glutamat oxaloacetat transaminase (SGOT) và phosphat kiềm (ALP).