CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Vi tảo là thành phần chủ yếu tạo nên năng suất sơ cấp của thủy vực và giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì sự phát triển của hệ sinh thái nước. Hàng năm, trong số 200 tỉ tấn chất hữu cơ được tạo thành trên trái đất, có 170 - 180 tỉ tấn do tảo tạo ra, còn lại 20 - 30 tỉ tấn là do các loài thực vật khác. Ý nghĩa lớn lao của các loài tảo là giải phóng ôxy thông qua hoạt động quang hợp cung cấp cho các sinh vật sống dưới nước, khép kín chu trình vật chất trong các thuỷ vực và tăng tốc độ quay vòng của các chu trình đó (Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền (1994)). Trong tự nhiên, vi tảo là thành phần cơ bản của chuỗi thức ăn của thuỷ vực.
Với kích thước cơ thể phù hợp, giàu dinh dưỡng, dễ tiêu hoá ít gây ô nhiễm môi trường, nhiều loại không có độc tố và có khả năng nuôi sinh khối lớn nên vi tảo đã trở thành nguồn thức ăn không thể thiếu trong các giai đoạn sinh trưởng của nhuyễn thể hai mảnh vỏ, giai đoạn ấu trùng của một số loài giáp xác, các giai đoạn sinh trưởng sớm của một số loài cá hoặc để sản xuất khối lượng lớn các động vật phù du như Artemia, Luân trùng (Rotifer)….Ngoài nguồn thức ăn truyền thống như thịt, cá, trứng, sữa, rau, quả, củ có nguồn gốc từ động vật và thực vật, tảo là một nguồn thức ăn dinh dưỡng cho người và vật nuôi. Nhiều loài vi tảo không chỉ có hàm lượng protein cao mà còn giàu gluxit, lipít, vitamin và các axít béo mạch dài không bão hòa đa nối đôi (PUFAs) có mạch carbon trên 20 như axít arachidonic (ARA; C20:4n-6), axít eicosapentaenoic (EPA; C20:5n-3), axít docohexanenoic (DHA; C22:6n-3) và axít docosanpentaenoic (DPA; C22:5n-6) - các chất có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng của người và đặc biệt trong hoạt động của não và mắt. Ngoài ra, vi tảo có khả năng sử dụng nguồn CO2 trong khí quyển cũng như hấp thụ nguồn CO2 được thải ra từ các nhà máy thông qua quá trình quang hợp, góp phần làm giảm thiểu phát thải khí nhà kính gây ra hiện tượng ấm lên của trái đất và dẫn đến biến đối khí hậu toàn cầu. 5 Tuy nhiên, ứng dụng phổ biến nhất hiện này của vi tảo vẫn là làm thức ăn trong NTTS và tách chiết các chất có hoạt tính sinh học có tiềm năng thương mại lớn (Spolaore và cs, 2006).
Trong các sản phẩm từ tảo thì astaxanthin có giá trị thương mại lớn do các ứng dụng đa dạng với giá thành cao (khoảng 2. Astaxanthin có nhiều chức năng sinh học như có hoạt tính chống ôxy hoá, là tiền chất của một số hormone nhất định, tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể. Chúng có tác dụng cải thiện khả năng sinh sản, thúc đẩy sự phát triển và chức năng bảo vệ cơ thể khỏi tác dụng của ánh sáng cao. Chính những đặc điểm trên mà astaxanthin ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực của đời sống con người như trong y học, dược phẩm, mỹ phẩm và trong ngành NTTS.
Sau đây, chúng tôi xin trình bày khái quát những đặc điểm chính về astaxanthin. Giới thiệu chung về astaxanthin 1. Đặc điểm chung Astaxanthin (3,3`-dihydroxy-β,β`-carotene-4,4`-dione ) là một carotenoid có màu đỏ cam, là dẫn xuất của các hợp chất isoprenoid, chúng tạo thành các chất có màu sắc khác nhau trong tự nhiên và có chức năng sinh học thiết yếu đối với động vật. Astaxanthin có thể được tìm thấy trong nhiều loại thuỷ hải sản như cá hồi, cá vền, tôm, cua, trứng cá, đôi khi astaxanthin cũng được phát hiện ở một số loài chim.
Động vật có vú không có khả năng tổng hợp astaxanthin và phải được cung cấp từ khẩu phần ăn (Higuera-Ciapara và cs, 2006). Astaxanthin có công thức phân tử là C40H52O4, điểm nóng chảy xấp xỉ 224oC. Chúng không hoà tan trong các dung dịch lỏng và hầu hết các dung môi hữu cơ, tuy nhiên, chúng có thể hoà tan trong các dung môi không phân cực như acetone, dimethyl-sulfoxide ngay ở nhiệt độ phòng. So với các loại carotenoid khác, astaxanthin dễ dàng được hấp thụ và tích luỹ.
Cấu trúc của astaxanthin Phân tử astaxanthin có hai carbon không đối xứng ở vị trí 3 và 3’ của vòng β- ionone. Astaxanthin có ba dạng cấu hình là astaxanthin tự do, monoester và diester 6 tùy thuộc vào sự kết hợp của 1 hoặc 2 gốc hydroxyl với các axít béo. Nhóm ester tạo ra mối liên kết giữa astaxanthin và protein. Vì vậy, astaxanthin không thể gắn kết với protein nếu liên kết ester không tồn tại.
Do cấu trúc của astaxanthin có 2 vị trí 3 và 3’ở dạng chiral, cho nên chúng có 3 dạng đồng phân hình học: 3R-3’R; 3R- 3’S và 3S-3’S (Hình 1. Trong đó, 3S-3’S là dạng astaxanthin có hoạt tính chống ôxy hóa mạnh nhất, dạng 3R-3’S không có hoạt tính sinh học, dạng 3R-3’R có hoạt tính yếu (Ambati và cs, 2014). Cấu trúc của astaxanthin (Dạng tự do (A), dạng monoester (B), dạng diester (C) và các đồng phân hình học (D). R là các chuỗi axít béo bão hòa hoặc không bão hòa) (Nguồn: Miao và cs, 2006) 1.
Sinh tổng hợp astaxanthin Có hai con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở tảo H. pluvialis: con đường thứ nhất bắt đầu với quá trình ôxy hoá β- carotene tạo thành các chất trung gian là echinenone, canthaxanthin và adonirubin; con đường thứ hai bắt đầu bằng quá trình hydroxyl hoá β-carotene tạo thành các chất trung gian là β-cryptoxanthin, zeaxanthin và adonixanthin (Hình 1. Mặc dù các bước đặc thù của quá trình sinh tổng hợp astaxanthin diễn ra ở tế bào chất nhưng các enzyme chính của con đường tổng hợp carotenoid chung lại được phân bố ở lục lạp (Jin và cs, 2006). Sinh tổng hợp astaxanthin của H.
pluvialis cũng theo con đường tổng hợp carotenoid chung đến β - carotene. Từ β - carotene, astaxanthin được hình thành bởi hoạt động của 2 enzyme β - carotene oxygenase 7 (BKT) và β -carotene hydroxylase (CHY). Các nghiên cứu sử dụng chất ức chế quá trình carotenoid hóa đã chứng minh rằng astaxanthin được tạo ra từ tiền chất canthaxanthin. BKT chuyển hóa β - carotene thành canthaxanthin thông qua dạng trung gian là echinenone, tiếp đó dưới tác dụng của enzyme CHY sẽ chuyển canthaxanthin thành astaxanthin (Schoefs và cs, 2001).
Do đó, BKT và CHY là 2 emzyme chìa khóa quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp astaxanthin ở tảo H. Con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở H. Các nguồn cung cấp astaxanthin Có hai nguồn astaxanthin chính là nguồn astaxanthin tổng hợp hóa học và tự nhiên. Nguồn tổng hợp hoá học Hiện nay, astaxanthin tổng hợp là nguồn cung cấp chủ yếu cho nuôi trồng thuỷ sản.
Hơn 95% astaxanthin tổng hợp trên thị trường được sử dụng làm thức ăn bổ sung nhằm tạo ra các mầu sắc của đối tượng nuôi khác nhau. 8 Quá trình tổng hợp hóa học astaxanthin được sử dụng lâu đời và rộng rãi nhất liên quan đến phản ứng Wittig của muối photphat ở vị trí C15 với dialdehyde ở vị trí carbon C10 (Hình 1. Các phương pháp khác bao gồm hydroxyl hóa canthaxanthin (Hình 1.3B) (Berhard và cs, 1984), một quá trình trùng hợp 3 mạch carbon có chiều dài 10, 20 và 30 nguyên tử carbon thông qua ngưng tụ dienolether (Rüttimann, 1999) và các đồng phân của lutein được chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ để tạo thành zeaxanthin và sau đó chất này bị ôxy hóa để hình thành astaxanthin (Hình 1. Phản ứng tổng hợp astaxanthin (Phản ứng Wittig (A); Hydroxyl hóa canthaxanthin (B); Ô xy hóa zeaxanthin (C) (http://trace.edu/utk_chembiopubs/94) 1.
Nguồn tự nhiên a. Từ các loại giáp xác Trong các loài giáp xác thủy sản, astaxanthin chủ yếu được tập trung ở phần vỏ ngoài, chiếm từ 58 đến 87% carotenoid tổng số. Hàm lượng astaxanthin có trong vỏ tôm, cua thay đổi đáng kể tùy thuộc vào loài, từ 10 đến 140 mg/kg khối lượng tươi và tồn tại ở dạng 3S - 3’S. Chính vì vậy, vỏ tôm, cua chính là một nguồn astaxanthin đáng kể trong tự nhiên.
Tuy vậy, hàm lượng astaxanthin trong các nguyên liệu này tương đối thấp. Trong khi đó, độ ẩm, hàm lượng tro và các chất dinh dưỡng khác trong vỏ tôm, cua lại rất cao đã gây ra một số khó khăn nhất định trong việc sản xuất đảm bảo ổn định chất lượng thức ăn cho động vật nuôi trồng (Higuera-Ciapara và cs, 2006). Nấm men 9 Phaffia rhodozyma là một loài nấm men duy nhất được biết đến hiện nay có khả năng tổng hợp astaxanthin lên tới 0,5% SKK (nhưng 100% astaxanthin tích lũy ở dạng đồng phân 3R - 3’R). Một lợi thế của chủng này là có khả năng sinh trưởng nhanh và đạt mật độ tế bào (MĐTB) cao trong quá trình lên men.
Tích lũy astaxanthin ở nấm men thông qua con đường mevalonate (Schmidt và cs, 2011). Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin tổng hợp được phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm sinh học của chủng, phương pháp và điều kiện nuôi cấy (Johnson & An, 1991). Ngoài ra, do Ph. rhodozyma có cấu tạo vách tế bào cứng, khó tiêu hóa đối với các động vật nên trong quá trình sản xuất các chế phẩm sinh học chứa astaxanthin từ loài nấm men này cần phải phá hủy thành tế bào bằng các phương pháp cơ học hay xử lý bằng enzyme khác nhau, nhằm tăng hiệu quả hấp thụ của chất này đối với động vật.
Tảo Astaxanthin có thể được sản xuất từ các loại tảo khác nhau như Ankistrodesmus branuii, Chlorella zofingiensis, Dunaliella salina, Euglena rubida, Chlorococcum. Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin ở các chủng tảo nêu trên tương đối thấp và không thích hợp để sản xuất ở quy mô lớn. Trong khi đó, vi tảo lục H. pluvialis đã thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học và sản xuất ứng dụng vì chúng có khả năng tích luỹ một lượng lớn astaxanthin (7000 - 55000 µg/g tế bào, tương ứng 0,7 - 5,5% SKK).
Astaxanthin từ tảo Haematococcus chứa 5% dạng tự do và 95% dạng được ester hóa (75% monoester và 20% diester). 100% astaxanthin được chiết xuất từ H. pluvialis có dạng 3S-3’S - đây là dạng đồng phân có hoạt tính chống ôxy hóa cao nhất (Olaizola 2000). Thực tế cho thấy astaxanthin ở da, cơ và trứng của thủy sản chủ yếu ở dạng 3S-3’S.
Các vi sinh vật khác Một số loại vi khuẩn như Mycobacterium lacticola, Brevibacterium sp. và một số chủng nấm thuộc chi Peniophora cũng có khả năng tích luỹ astaxanthin. Hàm lượng carotenoid của những vi sinh vật này rất thấp đồng thời chúng cũng sinh trưởng rất chậm. 10 Cá hồi cũng là một nguồn cung cấp astaxanthin tự nhiên.
Hàm lượng astaxanthin trong cá hồi hoang dã Oncorhynchus dao động trong khoảng 26 - 38 mg/kg thịt cá. Hàm lượng astaxanthin trong cá hồi Đại Tây Dương nuôi là 6 - 8 mg/kg thịt cá.